一株产油栅藻及其培养应用

一株产油栅藻及其培养应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种产油栅藻及其培养应用。

背景技术

进入21世纪以来，经济的发展与能源的消耗存在着密切的关系，能源安全问题是各国战略性的问题，寻一种清洁、经济、高效、可再生的新能源成为了当前急需解决的问题。其中生物能源一直作为一个重要储备技术方向，随着能源危机的加剧，它逐渐成为各个国家和藻类学家关注的焦点。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油，因此微藻常被认为是第三代生物燃料的理想原料。

通过选育优良藻株、优化培养条件、改进培养工艺、设计高性能光生物反应器均可以提高微藻油脂的产量，高油脂产量是实现微藻生物柴油产业化的关键。目前，选育性能优越的藻株是开展产油微藻生理研究和产业化培养的基础。

CN201110427579.6公开了一株栅藻藻株(Desmodesmus sp.) ENN2203A，该藻株具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的处理，可用于二氧化碳减排，用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等。但是，该藻株在培养过程中，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，培养进行到第16 天，最终干重达到10.93g/L。在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率。而且当通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx等气体时，也会抑制微藻生长和降低固碳效率。

CN106467897A公开了一种富含油脂的栅藻及其培养应用，该藻株为MH-04，其分类命名为栅藻（Desmodesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10764。该栅藻能够耐受高浓度的CO2和SO2，可利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。

CN107177505A公开了一株栅藻及其培养方法和应用，该藻株为HCS-02，其分类命名为栅藻（Scenedesmus sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10766。该栅藻能够耐受较低的培养温度，培养温度区间大，易于开放式养殖。在不同培养条件下均呈现较快的生物质积累速度，所获取的生物质中富含淀粉、油脂，能够处理后用作饲料或进行生物柴油的生产。

上述两个专利公开的产油微藻是针对耐受SO2、耐低温等特定性能选育的微藻，用于其它方面时效果不太理想，因此还需选育具备更多其它功能的微藻，或者选育具备多功能的微藻，以使其更适于工业应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种产油栅藻及其培养应用。本发明提供的产油栅藻固碳效率高，油脂含量高，特别是同时具备耐受NOx和高温的功能。

本发明提供的产油栅藻TMJ-D3，其分类命名为栅藻（Scenedesmus sp.），已于2018年2月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15299。

本发明提供的栅藻TMJ-D3在显微镜下藻细胞呈绿，常聚集成，体为四个细胞的组成，体细胞排列成一直线。单个细胞为长卵形，内有素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约5-7μm，宽约2-3μm。体两侧细胞的上下两端，各具一长或直或略弯曲的剌，中间部分细胞的两端及两侧细胞的侧面游离部上，均无棘剌。四细胞的体宽15-30微米，剌长10-15微米。

本发明提供的栅藻TMJ-D3能够耐受CO2的浓度可达30v%，能够耐受NOx的浓度可达0.08v%。

本发明提供的栅藻TMJ-D3能够耐受高温，在40-45℃下仍能正常生长，保持较高的生物量。

本发明提供的栅藻TMJ-D3的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的栅藻TMJ-D3与已公布的栅藻藻株的18SrDNA数据存在差异。

本发明的栅藻TMJ-D3在固定CO2中的应用。该藻株能够耐受气体中CO2浓度达到30v%，具有较好的CO2固定效率。

本发明的栅藻TMJ-D3在生产微藻油脂中的应用。该藻株在适宜的生长条件下进行光照自养生长获取富含油脂的藻细胞，藻细胞干重达10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

本发明的栅藻TMJ-D3在净化含CO2和NOx废气或烟气中的应用。废气或烟气中CO2浓度≤30v%，NOx的浓度≤0.08v%。

本发明栅藻TMJ-D3的培养方法，在光生物反应器中，利用BG11培养基、SE培养基等培养，通入CO2含量为1.0v%-30v%的气体培养。进一步的，通入气体中含有NOx，NOx浓度不高于0.08v%。培养条件为：光照强度为1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为20-45℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养至稳定期结束，收获微藻细胞。经检测，藻细胞干重达10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明选育的产油栅藻TMJ-D3能够耐受高浓度CO2，可以利用CO2进行自养生长，固碳效率高，缓解目前工业社会带来的温室效应问题。

（2）该藻株同时具备耐受NOx和高温的功能。在废气中存在NOx时，能够避免微藻利用废气生长时NOx对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。而且能够耐受的温度高达45℃，在高温下培养有利于降低烟气冷却成本。

（3）该藻株生长速率快，生长周期短，最终生物量较高，藻细胞干重达10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，适于生产生物柴油。

生物材料保藏说明

本发明提供的栅藻TMJ-D3（Scenedesmus sp.），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.15299；保藏日期：2018年2月5日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案及其效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。本发明中，v%为体积分数。

实施例1 分离和驯化筛选获得栅藻TMJ-D3

（1）出发藻株的获得：2016年10月从吉林省图们江市图们江取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50mL接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为35℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为35℃，培养约10天后平板上出现绿的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为35℃，光照强度为5000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为TMJ-3。

（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为40℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至30v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。

（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。

（4）NOx的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气中，光照强度为5000Lux，温度为40℃，混合气中注入NO气体对藻种进行耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从0.01v%逐级提高到0.08v%，每天提高0.01%，培养8天结束，反复驯化培养3次，收获耐受NOx的藻液。

（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为TMJ-D3。

实施例2 藻株的鉴定

将获得TMJ-D3藻株的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Scenedesmus sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2562，Max index值为99.3%，可以确定TMJ-D3为栅藻（Scenedesmus sp.）。

实施例3栅藻TMJ-D3的应用

将对数生长期的TMJ-D3的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.25。从反应器底部通入CO2含量为30v%的烟气，其中NO含量0.08v%。培养过程中光照强度为8000Lux，培养温度为35℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，TMJ-D3藻株的生物质产量为10.5g/L，细胞总脂含量占细胞干重的42.89%。

表1 BG11培养基

*表2表1中A5+Co solution的组成

实施例4 TMJ-D3和TMJ-3的培养效果比较

将对数生长期的TMJ-D3和TMJ-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.25。根据试验需要，组配不同含量的CO2、NO混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为8000Lux，温度为35℃，pH值控制在7-8之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重。结果如表3所示。

表3 TMJ-D3和TMJ-3培养效果比较

从表3可以看出，本发明选育的TMJ-D3比初始藻株TMJ-3对NO具有更好的耐受性。同时经过检测排出气体中的NO的含量，去除率均可达80%以上。

实施例5 TMJ-D3和TMJ-3的培养温度比较

将对数生长期的TMJ-D3和TMJ-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.25。从反应器底部通入CO2含量为10v%的烟气，其中NO含量0.02。培养过程中光照强度为8000Lux，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天。培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表4。

表4 TMJ-D3和TMJ-3培养结果对比

从表4可以看出，本发明TMJ-D3比初始藻株TMJ-3具有更好高温耐受性，但二者均不耐受低温。

比较例1

同实施例3，不同在于采用CN106467897A公开的栅藻MH-04（Desmodesmus sp.），保藏编号为CGMCCNo.10764，培养8天结束。经检测，MH-04藻株的生物质产量为3.2g/L，细胞总脂含量占细胞干重的33.5%。

比较例2

同实施例3，不同在于采用CN107177505A公开的栅藻HCS-02（Scenedesmus sp.），保藏编号为CGMCCNo.10766，培养8天结束。经检测，HCS-02藻株的生物质产量为2.1g/L，细胞总脂含量占细胞干重的30.56%。

序列表

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院

<120> 一株产油栅藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> Scenedesmus sp.

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60

tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttggtggta ccttcttact 120

cggaataacc gtaagaaaat tagagctaat acgtgcgtaa atcccgactt ctggaaggga 180

cgtatatatt agataaaagg ccgaccggac tttgtccgac ccgcggtgaa tcatgatatc 240

ttcacgaagc gcatggcctt gtgccggcgc tgttccattc aaatttctgc cctatcaact 300

ttcgatggta ggatgatctg tagccatggt ggtaacgggt gacggaggat tagggttcga 360

ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa 420

ttacccaatc ctgatacggg gaggtagtga caataaataa caataccggg cattttatgt 480

ctggtaattg gaatgagtac aatctaaatc ccttaacgag gatccattgg agggcaagtc 540

tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta 600

aaaagctcgt agttggattt cgggtgggtt tcagcggtcc gcctatggtg agcactgctg 660

tggccttcct tactgtcggg gacctgcttc tgggcttcat tgtccgggac agggattcgg 720

catggttact ttgagtaaat tagagtgttc aaagcaggct tacgccgtga atactttagc 780

atggaataac acgataggac tctgccctat tctgttggcc tgtaggagtg gagtaatgat 840

taagaggaac agtcgggggc attcgtattt cattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat 900

gaaagacgaa ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag 960

ttgggggctc gaagacgatt agataccgtc gtagtctcaa ccataaacga tgccgactag 1020

ggattggcgg acgtttttgc atgactccgt cagcaccttg agagaaatca aagtttttgg 1080

gtttcggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac 1140

caggcgtgga gccgacggct taatttgact caacacggga aaacttacca ggtccagaca 1200

taggaaggat tgacagattg agagctcttt cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg 1260

ttcttagttg gtgggttgtc ttgtcaggtt gattccggta acgaacgaga cctcagcctt 1320

taaatagtca cagtcgcttt ttgcgggtgg tttgacttct tagagggaca gttggcgttt 1380

agtcaacgga agtatgaggc aataacaggt ctagtgatta 1420