C12N15/70 C12N15/50 C12N15/63
1.可在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒E蛋白的表达质粒，保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏号M203047。
2.如权利要求1所述的表达质粒，含有如下序列： ACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGG CTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTT TTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGG CTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTA TACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGA AAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATT GGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCAT CATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTC AATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTT GAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTAT GTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGAT GTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTAT TGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGC TGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGT GGATCCATG TACTCATTCGTTTCGGAAGAAACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTG GTATTCTTGCTAGTCACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTT AACGTGAGTTTAGTAAAACCAACGGTTTACGTCTACTCGCGTGTTAAAAATCTGAACTCTTCTGAAGG AGTTCCTGATCTTCTGGTCCTAA GAATTCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGT GATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGA TGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGGCGCAGCC ATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGC CTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATA ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCC CTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAA AAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGA TCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCGCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGG CGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAAT GACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTA TGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGA CCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAA CCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAAC AACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGG ATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCT GATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG CCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAG ATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACT TTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCAT GACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGA GCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAG CACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTG TCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGG GTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAG CTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGT CGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCG GGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGA AAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCC GCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTA TTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC CGCATAAATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAA ACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCA GTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACC AGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTA CATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTC CAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGG TGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACA ATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGC TGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAAC AGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACC AGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGC ATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGT CCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCA ACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATA TCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAA ACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGG CGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAAT ACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGA CTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGA AACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCC TGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGA GGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTT TCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCG TCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCAT TACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTT GATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTGGAATT
3.一种用权利要求1所述表达质粒pGEX2T-E转化的宿主细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒E蛋白的方法，包括以下步骤：
1)用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒E蛋白DNA片段；
2)用pGEX2T载体构建SARS病毒E蛋白表达质粒pGEX2T；
3)将pGEX2T质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
7.可溶性SARS病毒E蛋白表达产物的纯化方法，包括将细胞裂解液透析、 Glutathione Sepharose 4B柱层析和分子筛纯化。
技术领域
本发明涉及分子和细胞生物学研究领域，具体涉及在宿主细胞中可溶性 SARS病毒小信封蛋白(SARS small envelope E protein)的表达和纯化。
背景技术
自2002年底至2003年初，一种被称为“非典型肺炎(severe acute respiratory syndrome，SARS)”的病例在我国广东省被首次发现，随后在世 界30多个国家和地区爆发，SARS在我国内地的北京、山西、内蒙等25个省 市自治区“肆意横行”，对我国人民众的生命财产构成严重威胁。SARS是一 种传染性强、生存强、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球 累计报告病例已达7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公认为人类的共 同敌人。SARS爆发后，引起了各国政府和研究机构的高度重视，世界卫生组 织(WHO)已派遣技术人员前往疫区指导防治工作，各国科研人员紧密合作， 共同寻SARS的病原体和防治方法。经过多国科研人员的努力，终于发现SARS 冠状病毒(coronavirus)是SARS感染、病人发病和致死的元凶。SARS病毒的 全基因组已分别被加拿大、美国和中国的科学家测定，这对于研究SARS病毒 的致病机理以设计抗SARS药物具有重要意义。
SARS冠状病毒(SARS-Cov)属于巢状病毒目(Order：Nidovirales)，冠 状病毒科(Family：Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)。 根据其基因组结构分类，它属于单链正义病毒[(+)sense，ssRNA virus]，对其 它已知冠状病毒的研究发现，其病毒包膜(envelop)主要包括三种糖蛋白， 分别命名为S蛋白(Spike Protein)、M蛋白(Membrane Protein)、E蛋白 (Envelope Protein)。在部分病毒株中还能到一种HE蛋白(Haemagglutinin -esterase)。其中E蛋白是一种相对较小的蛋白质，主要分布于病毒包膜上。 SARS病毒的E蛋白是最小的结构蛋白，仅有76个氨基酸。它的氨基酸序列如下： MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNS SEGVPDLLV。
和其它冠状病毒一致，SARS-CoV E蛋白包含一个疏水段(残基12-37) 其侧面是带电的残基，而接着是半胱氨酸富集的区域。应用生物信息学分析工 具BLAST和FASTA分析显示E蛋白与其它冠状病毒的E(Envelop)蛋白显著地匹 配。PFAM分析揭示SARS的E蛋白较好地表现了NS3_EnvE蛋白家族中一员的特性。 InterProScan分析显示E蛋白是病毒包膜(Envelop)的组成部分，保守的序列 在其它病毒中也发现，如肠胃炎病毒(gastroenteritis)和鼠肝炎病毒(murine hepatitis)。SignalP分析预计它含有一个跨膜的锚(transmembrane anchor) (可能性达0.939)。Tmpred分析显示SARS的E蛋白含有与其它已知病毒包膜上 的这种蛋白类似的跨膜段，位于残基17-34间。TMHMM分析预计一种由大部分 的亲水(hydrophilic domain)段(46个残基)组成的II型的膜蛋白(a type II membrane protein)和碳末端位于病毒颗粒的表面。
对其它冠状病毒E蛋白功能研究结果也许能对SARS病毒E蛋白的功能认识有 所帮助和指导。一般研究都认为冠状病毒的E蛋白和M蛋白对病毒颗粒的组装是 必需和充分的。为认识鼠肝炎病毒(MHV)E蛋白的作用，有人将其中E蛋白的 带电残基进行了丙氨酸突变，突变的病毒显示出温度敏感型，即使在适合的温 度下绝大部分突变病毒的形态也变得紧缩拉长，无法形成正常的野生型 (wild-type)，可见E蛋白在冠状病毒的形态形成中起了重要的甚至是关键的 作用。也有研究显示一些冠状病毒如可遗传的肠胃炎冠状病毒(TGEV)的E蛋 白是病毒复制所必需的。还有试验显示，在鼠肝炎病毒(MHV)感染的DBT细胞 中E蛋白的表达还会导致DBT细胞的凋亡，而S蛋白、M蛋白和N蛋白的表达却不 会导致细胞的凋亡。最近研究表明，虽然去除E基因使鼠肝炎病毒(MHV)的复 制速度降低了一万倍，但是病毒仍然可以复制，这提示E蛋白在病毒复制中起 着重要作用，但也许不是病毒复制的本质因素。
因此，在体外大量表达和纯化可溶性SARS病毒E蛋白以进一步探索其重要 的生物学功能将具有重要的理论和现实意义。本发明者经过反复实验利用实验 过程中所积累的独特相关技术经验，在大肠杆菌中成功表达和纯化了可溶性 SARS病毒E蛋白，从而完成了本发明。
本发明的一个目的是提供能够在宿主细胞中表达SARS病毒E蛋白的表达 质粒；
本发明的另一个目的是提供可溶性SARS病毒E蛋白在宿主细胞中表达和 纯化的方法。
发明内容
本发明的一个方面提供可在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒E蛋白的表 达质粒pGEX2T-E，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类名称为大 肠杆菌M15/pGEX2T-SARS-E，保藏日2003年5月30日，保藏号CCTCC No.M203047。
本发明的另一个方面提供用质粒pGEX2T-E转化的宿主细胞。所述宿主细 胞可以是原核细胞或真核细胞。
本发明的再一个方面提供在宿主细胞中表达可溶性SARS病毒E蛋白的方 法，包括以下步骤：
1)采用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒E蛋白DNA 片段(TRO2)；
2)用pGEX2T载体构建SARS病毒E蛋白表达质粒pGEX2T-E；
3)将pGEX2T-E质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
本发明的还有一个方面提供可溶性SARS病毒E蛋白表达产物的纯化方法， 包括细胞裂解、裂解液透析、Glutathione Sepharose 4B柱层析和分子筛纯 化。
产业上利用的可能性
利用本发明可在宿主细胞中获得大量的可溶性SARS病毒E蛋白(如，在 大肠杆菌中，每升LB培养基可生产10毫克E蛋白)，利用Glutathione Sepharose 4B柱层析和分子筛提纯方法即可得到纯化的蛋白。本发明具有操 作简单、蛋白纯度高等特点。
利用本发明得到的SARS病毒E蛋白可用于：
1)结构生物学方面的研究
A.培养SARS病毒E蛋白晶体，通过X-射线晶体衍射技术解析SARS 病毒E蛋白晶体结构；
B.开展NMR研究，以探求SARS病毒E蛋白溶液状态下的三维结构。
2)与人体重要蛋白相互作用研究
利用本发明得到的SARS病毒E蛋白以及生物物理技术可开展与人体重 要蛋白(如免疫系统)相互作用研究，以探索SARS病毒感染人体正常细胞 的途径，为抗SARS药物设计提供依据。
3)SARS诊断抗体研究
利用本发明得到的SARS病毒E蛋白与其他生物工程技术相结合，可开展 SARS诊断抗体研究。
附图的简单说明
图1所示为可溶性SARS病毒E蛋白表达质粒(pGEX2T-E)构建示意图。
图2所示为SARS病毒E蛋白PCR产物DNA琼脂糖电泳分析图谱。
图3所示为pGEX2T-E测序报告。
图4所示为SARS病毒E蛋白纯化产物聚丙烯酰胺电泳分析图谱。图中， 1.Glutathione Sepharose 4B柱上的GST-E；2.凝血酶酶切后柱上留有的 GST；3.凝血酶酶切后洗脱后并FPLC纯化后的E蛋白；4.标记物(Marker)。
具体实施方式
试验材料：
pQE30载体，大肠杆菌菌株M15由本室保存。各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、高保真DNA聚合酶等工具酶购自TaKaRa公司。DNA标记物，蛋白 质标记物购自Invitrogen公司。IPTG，氨苄西林和卡那霉素购自Sigma公司。 胶回收试剂盒购自华舜公司。
实施例1 SARS病毒E蛋白表达质粒(pGEX2T-E)的构建
利用PCR技术从SARS病毒cDNA文库中获得SARS病毒E蛋白DNA 片段(基因序列依据TRO2)，按图1所示，构建表达可溶性的SARS病毒E 蛋白的表达质粒(pGEX2T-E)。
1)设计引物，扩增E蛋白的序列
引物序列：
FW：5’ATTA GGATCC ATGTACTCATTCGTTTCG3’
RV：5’TTAA GAATTCTTAGGACCAGAAGATCAGG 3’
PCR扩增反应(100μl)：
模板：2μl；10×PyrobestTM buffer：10μl；dNTP(2.5mM)：8μl；FW：4μl； RV：4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)：1μl；水：71μl。
反应条件：95℃ 8分钟；
(95℃ 30秒；60℃ 30秒；72℃ 30秒)30循环；
72℃ 10分钟。
图2所示为SARS病毒E蛋白PCR产物DNA琼脂糖电泳分析图谱。
2)将E蛋白的PCR产物克隆到pGEX2T载体上
E蛋白的PCR产物和pGEX2T分别用BamHI和EcoRI酶切(实验方法 参照《分子克隆实验指南》，科学出版社，1999年第二版)；用试剂盒(华舜 公司)回收酶切产物(回收E的PCR酶切产物近250bp；pGEX2T酶切产物近 4.9kb)；用T4DNA连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞BL21(DE3)；挑选 正确的克隆(酶切鉴定)。
酶切鉴定(实验方法参照《分子克隆实验指南》，科学出版社，1999年第 二版)：BamHI & EcoRI酶切鉴定，切出228条带的克隆是正确的。
DNA测序报告：pGEX2T-E表达载体测序报告如图3所示，pGEX2T-E DNA 测序结果和E蛋白原DNA序列比较，结果完全一致。
实施例2 可溶性SARS病毒E蛋白的表达
将pGEX2T-E质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG(浓度0.2mM) 诱导，氨苄西林为抗生素，温度18℃，表达时间6小时。在上述表达条件下， 6升LB培养基经4℃、4000rpm离心30分钟后，将得到的10克细菌沉淀物以 每份3克分装，-80℃保存。
实施例3 表达产物的纯化
在4℃下，将3克细菌沉淀物悬浮于15mL裂解缓冲溶液(50mM Tris-HCl ，pH8.0，300mM NaCl，1mM DDT，5mM EDTA，1mM PMSF)中，超声波 破碎(超声强度200～300W；超声环境：冰水混合物；总超声时间15分钟，每 超声1.5分钟，间隙1分钟)。经4℃、15,000rpm超速离心1小时后，弃去沉 淀物。将得到的14mL上清液在4℃下透析(透析缓冲液：PBS，1mM DDT，5mM EDTA，pH7.4)过夜后，用Glutathione Sepharose 4B柱(Pharmacia公司 产品)纯化蛋白，其中：洗涤缓冲液为含1mM DDT、5mM EDTA的PBS(pH7.4)； 酶切体系为PBS+80单位凝血酶；E蛋白洗脱缓冲液为含1mM DDT、5mM EDTA 的PBS(pH7.4)；GST洗脱缓冲液为含50mM还原性谷胱甘肽的50mM Tris-HCl (pH8.0)。将得到的10mL蛋白粗提物经蛋白纯化系统FPLC(Pharmacia 公司产品)分子筛进一步纯化得到纯SARS病毒E蛋白(如图4所示)。
本文发布于:2024-09-24 07:20:08，感谢您对本站的认可！
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