一株具有抗病毒活性的海洋放线菌及其应用

本发明涉及一株抗病毒的链霉菌属(Streptomyces)放线菌HA12284，属于微生物技术领域。

病毒(Virus)是一类原始的、有生命特征的、能自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生 物。作为一类主要的致病微生物，近年来病毒感染性疾病呈现快速上升趋势，严重威胁着人 类健康。而目前对病毒感染缺乏特异、有效的预防和手段，几乎还没有哪种药物能够真 正有效的控制病毒感染，仅有为数不多的几种药物应用于临床，如阿洛昔韦、齐多夫定、阿 糖腺苷、六环鸟苷、干扰素等。因此，研究特异性抗病毒药物具有十分重要的现实意义。流 感病毒引起的流行性感冒是一种急性病毒性呼吸道传染病，传染速度快，尤其是H1N1流感 病毒在全世界范围内未得到有效控制，严重威胁人类的生命安全。寻新的有效的抗病毒药， 特别是对病毒具有高度选择性、而对宿主细胞无毒副作用的药物是当前迫切而重要的任务。

放线菌是自然界分布最广泛的微生物类之一，是微生物药物的主要来源。目前的微生 物药物主要由放线菌产生，如：利巴韦林是由略黄拟诺卡氏菌(Nocardiopsisflavidus)产生 的间型霉素(formycin)改造的衍生物，抗疱疹病毒及乙肝病毒的阿糖腺苷也可由放线菌产 生。目前对抗病毒放线菌的研究报道相对较少，从放线菌中筛选抗病毒抗生素仍是当前研究 的热点之一。

红树林生长于热带、亚热带海岸潮间带，受周期性潮水浸淹，是重要的湿地类型，同时 也是陆地向海洋过渡的特殊生态系统。该生境具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富 等特征，蕴藏着丰富且独特的微生物资源。从红树林底泥中分离的放线菌，可产生许多重要 的次生代谢产物，成为人类寻和开发具有药用或其他用途天然产物的重要源泉。

本发明要解决的技术问题是提供一株能够产生抗病毒活性物质的链霉菌。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株能抗病毒的链霉菌属(Streptomyces)放线菌HA12284，保藏号为CGMCCNo.11079。

放线菌HA12284是从红树林根际底泥中分离得到。

放线菌HA12284具有以下微生物特性：

(1)形态与培养特性

菌株HA12284在高氏一号、燕麦汁、土豆汁、酵母粉-淀粉、无机盐-淀粉、甘油天门冬 素培养基上均生长良好。菌丝长，微曲(图1)。基内菌丝生长丰富，浅蓝至蓝黑；气生 菌丝绒状，浅灰至棕灰；能产生浅蓝至蓝黑可溶性素，培养特征见表1。

表1菌株HA12284的培养特征

(2)生理生化特征

菌株HA12284能利用蔗糖、D-棉子糖、D-木糖、D-葡萄糖、甘油、L-阿拉伯糖、丁二酸、 柠檬酸，不能利用L-阿拉伯糖和山梨酸，产生淀粉水解酶，产生黑素和H2S，牛奶不凝固 不胨化，可还原硝酸盐，纤维素上不能生长，不能使明胶液化。

(3)本发明所述的菌株HA12284，其16SrDNA序列在GenBank的登录号为JQ820204，

具体序列如下：

本发明涉及的菌株HA12284，经分类鉴定，确定为链霉菌属的一个种，暂命名为 Streptomycessp.HA12284，已于2015年7月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCCNo.11079。保存 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

本发明的优点是：该菌产生的次生代谢产物对多种病毒有较强的抑制作用，尤其对H1N1 流感病毒有明显抑制作用。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

图1为本发明所述菌株的菌丝及孢子丝形态，400×。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：菌株HA12284CGMCCNo.11079的分离

底泥样品采集于海南省东寨港红树林保护区，于通风橱中风干5-7天。取5g风干后的土 壤样品，放入无菌三角瓶中，添加45mL的灭菌海水，置于30℃、180r/min的恒温摇床中振 荡1h。采用平板稀释涂布法，吸取原液1mL，用无菌海水10倍逐级稀释，选择适当梯度吸 取100μL，涂布于放线菌分离培养基，静置培养于28℃的恒温培养箱中。适时挑取形态、 颜不同的菌落进行划线纯化。对于已纯化的放线菌，根据菌落形态学特征，排除相同菌株， 转入斜面4℃保存，编号，留作菌株筛选用。

实施例2：菌株HA12284CGMCCNo.11079的培养

(1)斜面培养：培养6天。培养基：可溶性淀粉10g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫 酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，陈海水配制，pH7.2。

(2)种子培养：从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养基，28℃、180r/min培养48小 时。培养基：葡萄糖1％，大豆粉1％，酵母膏1％，可溶性淀粉0.5％，磷酸氢二钾0.025％， 天然陈海水(新鲜海水静置一周后)配制，pH7.2。

(3)发酵培养：按8％的接种量接入种子培养液，28℃、180r/min摇瓶培养6天。培养基： 葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，大豆粉1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.025％，用75％天 然陈海水与25％蒸馏水配制，pH7.2。

实施例3：菌株HA12284CGMCCNo.11079抗H1N1病毒活性检测

按实施例2的方法进行发酵培养，收集发酵6天的发酵产物，10000r/min离心10min， 取上清液，再用0.22μm无菌滤膜过滤，备用。

发酵液按CPE+MTT结合法进行抗H1N1病毒活性检测：培养MDCK犬肾细胞，待细胞 长成单层后，接种H1N1病毒液50μL，37℃、5％CO2孵育2h，弃上清，加入稀释20倍的 发酵液50μL，37℃、5％CO2孵育，于倒置显微镜下观察试验细胞病变(cytopathiceffect； CPE)情况。CPE的记录方法为：无CPE为“-”；25％细胞出现病变为“+”；25％～50％细 胞病变为“++”；50％～75％细胞病变为“+++”；75％～100％的细胞病变为“++++”。待 病毒对照出现“+++～++++”时，将待检的细胞孔弃上清，每孔加入5mg/mL的MTT溶液 50μL，置37℃孵育2h，弃上清，加入DMSO50μL，室温放置10min后，震荡混匀，用 酶标仪于570nm波长下测定吸光度(A)值。50μg/mL的利巴韦林作为阳性对照，实验设置病 毒对照和细胞对照，每一发酵液均做3个重复。根据以下公式计算病毒抑制率：

病毒抑制率％＝(试验组平均A值-病毒对照组平均A值)/(细胞对照组平均A值-病毒对 照组平均A值)×100％

结果表明，菌株HA12284发酵液稀释20倍时对H1N1抑制率为72.1％。

实施例4.菌株HA12284CGMCCNo.11079抗其他病毒活性检测

菌株HA12284按实施例2的方法进行发酵培养，检测方法参照实施例3。菌株HA12284 发酵液对H1N1同一系列其他病毒有较强的抑制作用，对HIV和HBV也存在一定的抑制， 稀释20倍时抗病毒活性结果如表2。

表2菌株HA12284发酵液稀释20倍时抗病毒活性测定