一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

本发明属于微生物学、生物技术和生物防治技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

近年来，随着我国对蔬菜的需求量增加，导致很多蔬菜种植区连作障碍问题比较严重，再加上大量施用化肥，土壤有机肥缺失，蔬菜的病虫害现象逐年加重，尤其是立枯病、根腐病、枯萎病、灰霉病等土传病害更为严重。

目前，我国的植物病虫害绿防控技术覆盖率仍然较低，主要以化学防治为主要防治措施，然而长期滥用化学农药不但会产生耐药病原物增大病害防治的难度，而且污染生态环静、危及人类健康、阻碍农业的可持续发展。为降低化学农药的使用量，发展植物病虫害绿防控利用技术，保护农产品质量安全，促进农业可持续发展，我国多年来一直重视生物农药（利用微生物生产的活菌制剂或者微生物代谢产物）的研发。

生物防治药剂不仅可以直接作用于病原菌，还可诱导植物产生抗药性，从而提高植物对病原的抵御能力而达到防治或减轻病害的目的。目前已有木霉菌、枯草芽孢杆菌、沙雷氏菌、链霉菌等多种微生物被用于灰霉病的防治。因此，通过从不同的农业生态环境中筛选能够对灰霉病菌相拮抗的微生物，并将其研制成微生物菌剂逐渐成为了灰霉病害防治研究的重点。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23。

本发明另有一个目的是提供贝莱斯芽孢杆菌的培养方法。

本发明再有一个目的是提供贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23菌株的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23（后文简称BST23），其分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis 2021TIBBST23被保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M 2022307，保藏时间为：2022年03月24日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

贝莱斯芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

所述的贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23菌株接种于LB培养基进行培养，获取发酵液。

优选的是，所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养方法中，培养中，培养温度为37℃，培养时间为72 小时以上。

所述的贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23菌株的应用，为如下任一种应用：

在抑制植物病原真菌活性中的应用；

在抑制植物病原细菌活性中的应用；

在促进植物侧根数中的应用；

在提高植物生物量累积中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述农业领域包括农作物病害生物防治领域。

优选的是，所述的应用中，所述应用为在生防菌剂制备中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述应用包括抑制如下病原菌的生长：尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病型、青枯雷尔氏菌和茄病狄科氏菌。

优选的是，所述的应用中，所述农作物为茄科类作物。

优选的是，所述的应用中，所述茄科类作物为番茄。

优选的是，所述的应用中，所述应用包括在促进农作物种子发芽率提高和生根能力提高中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23及其在农业中的应用。该菌株已于2022年3月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，样品名称为2021TIBBST23，登记入册编号为CCTCC NO：M 2022307。该菌株2021TIBBST23具有产生抗菌活性物质和挥发性物质的功能，不仅对番茄疮痂病菌、番茄青枯病菌及黑胫病菌等细菌病原菌具有显著的抑制作用，而且对包括番茄灰霉病菌、枯萎病菌及立枯丝核菌在内的真菌病原菌也有明显的抑制作用。本发明结果表明该菌株具有广谱的抑菌效果，为防治番茄等茄科类作物上的病害，尤其是番茄/烟草灰霉病，提供了良好的生防资源，在农业领域具有重要的意义。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

图1为本发明实施例中两株具有抑菌效果的平板拮抗试验（拮抗菌vs Xcv）。

图2为本发明实施例中基于16S rDNA的系统发育分析图。

图3为本发明实施例中菌株BST23具有最佳抑菌效果的时间筛选图。

图4为本发明实施例中菌株BST23具有最佳抑菌效果的抑菌效果图。

图5为本发明实施例中菌株BST23对三种真菌及三种细菌病原菌的抑制效果图。

图6为本发明实施例中在烟草叶片上的防治效果（灰霉病菌）图。

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

以下实例中涉及的菌株及来源如下：

表1病原菌及其来源

实施例1 菌株BST23的分离筛选及鉴定

1、菌株BST23的分离筛选

2021年从北京市延庆区采集土壤。取1 g土壤与99 mL 1×PBS缓冲液混匀（稀释倍数

102），200 rpm、37 ℃摇培30 min。静置20 min后，取土壤悬浊液上清液进行梯度稀释，并分别取稀释倍数102、103、104的稀释液100 µL均匀涂布于LB固体培养基（酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉15 g/L）平板上，37 ℃培养箱倒置培养24 h-48h，用无菌移液头挑取形态不一的细菌单菌落在LB固体培养基平板上划线纯化后，于LB液体培养基中扩繁，混合灭菌甘油（工作浓度25%）保存于-80 ℃冰箱备用。

采用平板对峙培养法检测分离菌株的生防效果，选择拮抗对象为可引起番茄细菌性疮痂病的野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病型（Xanthomonas campestris pv.vesicatoria，Xcv）。将病原菌Xcv菌悬液（浓度为109 CFU/mL）按照1:100的比例均匀混入LB固体培养基中，吸取2 µL待测菌株菌悬液（浓度为109 CFU/mL）滴加至带菌LB固体培养基平板中央，37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径。每株待测菌株3个重复。

从5个土壤样品中共分离保存31株单克隆纯培养菌株，并经平板对峙实验初筛选出2株对番茄疮痂病有抑制作用的芽孢杆菌，抑菌效果如图1所示。然后经过复筛选出抑菌效果显著的菌株BST23进行后续试验。

2、菌株鉴定

对包括BST23在内的31株单克隆培养菌株进行分子生物学的鉴定，通过使用细菌通用引物对27F/1492R（表2）扩增其16S rDNA序列（碱基序列如SEQ ID NO:1所示）进行初步的鉴定。25 μL反应体系如表3。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min。

对菌株BST23进行全基因组测序分析。对BST23菌悬液进行DNA提取后送美格基因进行细菌框架图的测序构建。主要流程包括三个部分：DNA文库构建、高通量测序（Illumina）和基因组组装及后续分析。组装完成的细菌框架图通过平均核苷酸相似度（ANI）分析进一步鉴定细菌基因组亲缘关系，当ANI>95%时表示两个基因组属于同一个物种。基因组同参考组的ANI分析结果表4。

表2菌株鉴定所用引物

表3聚合酶链式反应体系

表4.平均核苷酸相似度分析结果

QueryID ReferenceID ANI Mapped_fragment Query_fragment Taxon BST23 GCA_006965525.1 99.305 1244 1293 Bacillus velezensis

将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的条带后送北京擎科生物科技有限公司测序，获得的测序结果使用SnapgeneViewer和MEGA11进行分析，同时在NCBI网站上进行BLAST比对，确定菌株分类，结果显示菌株BST23与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）相似性高达99%，最后对所获的单克隆菌株构建系统进化树，结果如图2。

根据菌体的形态特征，结合进化分析及平均核苷酸相似性分析结果，将菌株BST23鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株BST23在LB固体培养基上的形态呈边缘为锯齿状的不规则圆形，表面略有皱褶无隆起。

实施例2 菌株BST23最佳抑菌效果的时间测定

将菌株BST23接种于LB液体培养基中37℃、200 rpm过夜培养。移取2 µl菌悬液滴加在LB固体培养基中心，晾干待用。分别于滴加拮抗菌后的0、1、2、3、4 days喷接病原菌菌悬液（1 ml 109 CFU/ml + 19 ml灭菌水）。培养基于37℃培养箱黑暗培养，分别于病原菌接菌后的1天进行抑菌圈测量。并对培养时间和抑菌圈直径绘制曲线。

结果如图3和图4所示，菌株培养72小时以内，抑菌效果跟培养时间成正相关关系，72小时之后，抑菌效果逐渐趋于平稳。

实施例3抑菌谱的测定

采用对峙培养法检测菌株BST23的抑菌谱。分别测定其对三种真菌病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），三种细菌病原菌野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病型（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、茄病狄科氏菌（Dickeyasolani）。针对真菌的对峙实验，首先将病原菌在PDA平板上活化，用5 mm打孔器制作病原菌菌病，接种于PDA平皿中央，用移液移取2 μL菌株BST23菌悬液（109 CFU/mL）于距离菌病2 cm处，25℃培养4-7天，分别测量对照组和处理组病原菌直径，计算抑制率，计算公式为抑制率=（对照菌落直径-处理组菌落拮抗菌方向直径）/对照菌落直径。针对细菌病原菌，对峙方法按照实例1中拮抗菌初筛方法。

结果表明菌株BST23具有广谱抑菌性，对三种真菌病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抑制率分别为84.28%、63.64%及84.31%（表5），抑菌效果见图5。

表5. BST23的抑菌谱

实施例4 BST23对灰霉病菌侵染烟草叶片的抑制效果

选用叶龄相同、叶片大小基本一致的健康烟草叶片，用无菌水清洗干净并晾干后使用菌株48小时发酵液进行后续处理。发酵液准备方法如下：将保存于-80℃的原始菌株活化于LB固体培养基，37℃过夜培养后，挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，于37℃200 rpm摇床中进行摇培繁殖作为种子发酵液，然后以1:100的比例将种子发酵液接种于500 mL LB液体培养基中于37℃ 200 rpm摇床中摇培48 h。使用发酵液时，先将菌株发酵液活菌数稀释至108 CFU/mL，并均匀喷洒于叶片上，以叶面刚好溢水为准；晾干后，在每个叶片中间接种1个直径为3 mm的灰霉病病原菌菌饼，25℃保湿培养3天。以卓润有效菌株QST713菌株发酵液为阳性对照，以无菌水为阴性对照，处理方式和用量同BST23菌剂。每个处理含6个叶片，重复3次。统计每个辣椒叶片发病面积。并按照公式计算对灰霉的防效。

病斑扩展面积（mm2）=病斑总面积-菌饼面积

结果显示BST23在离体叶片上对烟草灰霉病的防治效果很好（图6）。与已商品化的菌株QST713相比无显著差异（表5），与空白对照相比，BST23完全抑制了烟草叶片灰霉病的发生，防效高达100%。

表6. BST23在烟草叶片上对灰霉病的防治效果

处理 发病面积（cm²） 防效（%） 对照 4.95±1.81 - 卓润QST713 0.03±0.05 99.4% BST23 0 100%

实施例5 BST23促生能力检测

制作MS+LB拼接培养基，具体做法为；按照配方（MS培养基：MS 4.44 g/L、蔗糖 30g/L、琼脂 7 g/L ，KOH调pH至5.6-5.8；LB固体培养基：酵母浸粉 5 g/L、氯化钠 10 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、琼脂 15 g/L）分别配置好MS和LB固体培养基，121℃灭菌20 min后，将LB固体培养基倒入10 cm×10 cm方形培养皿，待LB固体培养基凝固后，移除一半，并倒入MS培养基进行填补，待MS培养基凝固后便制成MS+LB拼接培养基，该培养基可在同一空间下同时满足拟南芥和菌株的生长。将拟南芥种子于4℃进行春化48 h后，使用无水乙醇消毒3 min并用无菌水冲洗3次，消毒后将拟南芥种子移入MS+LB拼接培养基的MS培养基部分，LB培养基部分接种菌株BST23，计算发芽率。同时，将拟南芥种子移入MS培养基中催芽用于后续菌株对拟南芥生长状况的影响。具体做法为：待种子发芽生根后，将主根伸长约1 cm时、生长一致的拟南芥幼苗移至MS+LB拼接培养基的MS培养基部分，根伸长方向朝向菌株，每隔4 mm放置一株拟南芥，在LB培养基部分接种菌株BST23。以接种QST713为阳性对照，接种LB液体培养基为阴性对照。每个处理20株拟南芥。待接种后每日观察拟南芥根系变化，7天后测量主根长度、侧根数目及生物量。

结果显示，BST23相对于阴性对照及商品化产品菌株QST713提高了发芽率，且侧根数和生物量明显增加（表7）

表7.拟南芥生理变化指数

根长 侧根数 生物量 发芽率 CK 2.13±0.26 2.12±1.36 2.27±0.40 82.61 BST23 2.2±0.22 3.39±1.48 2.78±0.90 89.47 QST713 2.05±0.18 1.82±1.13 1.13±0.39 81.82

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1385

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis

<400> 1

aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac 60

aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt 120

cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg attggcttaa 180

cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 240

aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct 300

tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta 360

acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg 420

aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc 480

gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 540

gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta 600

aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat 660

ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg 720

ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca 780

ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg 840

gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca 900

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tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt 1080

gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140

ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca 1200

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cccat 1385

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27F-16S rDNA上游引物

<400> 2

agagtttgat cctggtcaga acgaacgct 29

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1492R-16S rDNA下游引物

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28