一株富含油脂的小球藻及其培养应用

一株富含油脂的小球藻及其培养应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一株富含油脂的小球藻及其培养应用。

背景技术

在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重，除此之外来自石油和化工行业的工业废气中，除了含有高浓度CO2外，SOx、NOx等酸性气体的浓度也很高。微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放。但是在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率；而通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx等气体也会抑制微藻生长并降低固碳效率。目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。

CN102229889A公开了一株小球藻藻株Chlorella sp. MRA-1, MRA-1的生长可适应多种培养基、温度、氮源浓度、CO2浓度条件，在低氮条件下的油脂含量和产率高，其应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产。

CN102703326A公开了一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法，该藻命名为Chlorella sp.Y-1，碳含量增至56.981%，最佳固定浓度达20%(v/v)，固定率高达5.762g/(L·d)，最高耐受浓度为100%(v/v)，对一系列物理化学培养条件有较好的适应性，传代稳定性良好。该发明可以实现废气等高浓度复杂环境下CO2的有效固定，但是在高浓度NOX条件下的CO2固氮效果不佳。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株富含油脂的小球藻及其培养应用。本发明的小球藻能够耐受高浓度的CO2和NOx，固碳效率高，获得的生物质中细胞总脂含量占细胞干重的45%以上。

本发明富含油脂的藻株为SF-B1，其分类命名为小球藻（Chlorella sp.），已经于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11005。

本发明提供的小球藻SF-B1在显微镜下藻细胞为绿，单细胞藻，单生，细胞形状为球形和椭圆形，内有素体，直径为5-6μm。

本发明的小球藻SF-B1能够耐受的CO2浓度可达40v%，能够耐受的NOx的浓度可达700×10-6（v/v）。

本发明提供的小球藻SF-B1的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的小球藻SF-B1与已公布的小球藻的18S rDNA数据存在差异。

本发明富含油脂的小球藻SF-B1的培养方法，在光生物反应器中，利用BG11、SE 、TAP或D1等淡水培养基培养，在光照强度1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为10-30℃下培养。从反应器底部通入CO2含量为5v%-40v%的气体，培养结束后，收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的45%以上。

本发明的小球藻SF-B1在固定CO2中的应用，该藻株能够耐受的CO2含量可达40v%，具有较高的CO2固定效率。

本发明的小球藻SF-B1在生产微藻油脂中的应用。该小球藻在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的45%以上，能够进行生物柴油的生产。

本发明小球藻SF-B1在净化含CO2和NOx的废气或烟气中的应用。该藻株能够利用含CO2和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO2含量不超过40v%，NOx含量不超过700×10-6（v/v）。在光生物反应器中，利用BG11或SE淡水培养基培养，从反应器底部通入CO2含量为5v%-30v%，NO和/或NO2含量为100×10-6-700×10-6（v/v）的废气或烟气，在光照强度1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为10-30℃下处理废气，处理结束后，收获藻细胞，藻细胞干重达到10g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

（1）本发明选育的小球藻SF-B1能够耐受高浓度的CO2和NOx，可以利用废气中的CO2进行自养生长，固定CO2，缓解目前工业社会带来的温室效应问题。特别是能够耐受废气中的NOx，避免了微藻利用废气生长时高浓度的NOx对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。

（2）该藻株在固定烟气中CO2 的同时，可以利用烟气中的部分NOx作为氮源生长使用，高效脱除烟气中的NO，净化烟气。

（3）该藻株耐低温能力强，生长速率快，生长周期短，仅为7天左右，最终生物量较高，细胞干重超过10g/L，生物量产率超过了1.4g/(L·d)，所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题。

生物材料保藏说明

本发明提供的小球藻SF-B1（Chlorella sp.）藻株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 11005；保藏日期：2015年7月6日。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。本发明中，v%为体积分数，v/v为体积比。

实施例1 分离和驯化筛选获得小球藻SF-B1

（1）出发藻株的获得：2011年10月从黑龙江绥芬河取回水样50mL，将水样接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为8000Lux，培养8天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为SF-1。

（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为8000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养8天后结束，反复驯化培养3次。

（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（2），培养至对数生长期。

（4）NOx的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，光照强度为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入NO气体对藻种进行NOx的耐受性培养，培养过程中混合气中NO的含量从100×10-6（v/v）逐级提高到700×10-6（v/v），培养过程中每天提高50×10-6（v/v），培养结束后，反复驯化培养3次，收获耐受NOx的藻液。

（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（2），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为SF-B1。

实施例2 藻株的鉴定

获得的SF-B1藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Chlorella sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2619，Max index值为99%，可以确定SF-B1为小球藻（Chlorella sp.）。

实施例3 小球藻SF-B1的培养应用

将对数生长期的SF-B1的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.2。从反应器底部通入CO2含量为40v%的烟气，其中NO含量700×10-6（v/v）。培养过程中光照强度为8000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。测得培养7天后的SF-B1藻株的生物质产量为10.6g/L，细胞总脂含量占细胞干重的 47.53%。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

实施例4 SF-B1和SF-1的培养效果的比较

将对数生长期的SF-B1和SF-1的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO2和NO混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为8000Lux，温度为28℃，pH值控制在7-8之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为10天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表3。

表3 SF-B1和SF-1培养结果对比

从表3可以看出，本发明筛选的SF-B1比初始藻株SF-1对CO2和NO有更好的耐受性。同时经过检测排出气体中的NO的含量，去除率均可达80%以上。

实施例5 SF-B1和SF-1的耐低温性

将对数生长期的SF-B1和SF-1的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.2。从反应器底部通入CO2含量为10v%的烟气，其中NO含量400×10-6（v/v）。培养过程中光照强度为8000Lux，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为8天。培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表4。

表4 SF-B1和SF-1培养结果对比

从表4可以看出，本发明筛选的SF-B1比初始藻株SF-1对低温具有更好的耐受性。

序列表

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院

<120> 一株富含油脂的小球藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> Chlorella sp

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgctttata 60

ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt acctactact 120

cggatacccg tagtaaatct agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac 180

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