一种中国人肺腺癌细胞系及其应用

本发明涉及微生物医学领域，更具体地说，涉及一种中国人肺腺癌细胞系CAFQ1及 其应用。

肺癌是目前世界范围内死亡率最高的肿瘤之一，在肿瘤引起的死亡中占到 19.4％。在欧洲，随着吸烟中国人数的减少以及女性烟民的增加，男性的发病率在逐年降 低，女性的发病率逐年增加，其中，80％-85％为非小细胞肺癌，5年生存期低于11％。2014年 亚洲地区的肺癌流行病学研究中表明：肺癌中43.4％为女性，平均发病年龄为60岁，52.6％ 无吸烟史，51.4％有EGFR突变。肺癌主要分为：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌 主要分为腺癌、鳞癌、大细胞肺癌，而肺腺癌是肺癌中最常见的类型，占到40％。驱动基因的 突变，例如EGFR、ALK、RET、ROS1等在肺腺癌早期肿瘤的形成中起到至关重要的作用。因此， 以驱动基因为靶点的药物极大的提高了肺癌的效率。但是，在大部分的肺癌并没有 EGFR等基因的突变，靶点类的药物对其作用不大，传统的化疗和放疗依然是此类肺癌的主 要手段。因此，针对此类常见的肺癌，我们应该增加更多的研究投入。

在全球的肺癌的研究中，已建立的稳定、长久传代的细胞系多达百种，但是其遗传 背景和亚洲地区的中国人种相差很大。肿瘤的异质性和复杂性不同种族和地区来源的同一 种组织类型的肿瘤其细胞特性也不相同。为了更加有效的研究中国中国中国人的肺腺癌的 发病机制以及方法，我们采用肿瘤细胞原代培养的方法，新建了一株中国人肺腺癌细 胞系，该株细胞系存在ALK：Kras突变，同时未见EGFR的突变，为中国中国人肺癌研究提供新 的模型，为肺腺癌的机制研究提供更好的平台。

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供中国人肺腺癌细胞系CAFQ1。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备治 疗肺腺癌药物中的应用。

本发明所要解决的第三个技术问题是，提供中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备肺 腺癌诊断试剂中的应用。

本发明所要解决的第四个技术问题是，提供中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备肺 腺癌动物模型中的应用。

本发明所要解决的第五个技术问题是，提供中国人肺腺癌细胞系CAFQ1作为药物 靶点在制备抑制肺腺癌药物中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了中国人肺腺癌细胞系CAFQ1，其特征 在于，其保藏编号为：CCTCC NO：C201774。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备 肺腺癌药物中的应用。

为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备 肺腺癌诊断试剂中的应用。

为了解决上述第四个技术问题，本发明提供了中国人肺腺癌细胞系CAFQ1在制备 肺腺癌动物模型中的应用。

为了解决上述第五个技术问题，本发明提供了中国人肺腺癌细胞系CAFQ1作为药 物靶点在制备抑制肺腺癌药物中的应用。

本发明所要保护的细胞系命名为中国人肺腺癌细胞系CAFQ1，保藏在中国典型培 养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保 藏中心邮编430072)，保藏日期是2017年5月23号，保藏编号为CCTCC NO：C201774。

本发明的有益效果：(1)本发明细胞系与原发肿瘤组织有着相似的蛋白表达，同时 也具有染体异常核型，具有体外成瘤能力的肿瘤特性。(2)本发明的细胞系可在体外连续 传代培养而保持肺腺癌肿瘤细胞的特性不变，适合作为研发肺腺癌相关免疫、诊断和 药物的细胞材料。(3)本发明的细胞系包含ALK:Kras突变，而这两个突变可导致正常的肺上 皮细胞突变，肿瘤的形成，促进肿瘤细胞增殖。因此，此细胞系可以用来作为研究ALK:Kras 为靶标的靶向药物研究的有力的工具细胞。

图1为本发明一种中国人肺腺癌细胞系CAFQ1倒置显微镜下细胞形态(100X)。

图2为本发明一种中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的细胞生长增殖曲线。

图3为本发明一种中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的染体核型分析图。

图4为本发明一种中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的裸鼠皮下成瘤图。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.

原代肿瘤细胞的分离处理

从医院手术台获取的新鲜的中国人肿瘤组织块在应无菌环境下进行肿瘤原代细 胞的分离培养。

1.首先将肿瘤组织块置入50ml离心管中，用含10倍双抗的PBS晃动洗5次，洗到无 血水。将组织块放入培养皿中，切除多余组织，如脂肪或是坏死组织。

2.将组织移至另一平皿中，用交叉手术刀细切成大约1mm3大小的组织块。取70um 的过滤筛，将其置于50ml的离心管上。用注射器的芯轻轻加压使组织通过网孔进入培养基， 吸取培养基吹过筛网将细胞冲下。

3.在余下组织块的培养皿中加入5ml胰酶/胶原酶II,37℃培养箱消化2小时，期间 每间隔15分钟吹打一次。消化完成后，70um滤网过滤1次，滤下的细胞液添加PBS至5ml， 1200rpm，5分钟离心洗涤一次。

4.离心所得细胞转移到培养皿中培养，同时将组织块放入其他培养皿中，静置培 养。绝对静置12-24小时，慢取出培养皿补加培养液，继续培养，静置2-3天。3天后小心取出 培养瓶仔细观察并将漂浮的碎块去除，更换培养液继续培养。

原代肿瘤细胞的体外培养

1.间隔24-48小时。

2.光镜下观察细胞生长情况,适时更换合适培养液。如见贴壁细胞生长后可适当 增加培养液量,以满足细胞生长所需。

3.本发明培养物的培养条件为：在37℃、5％CO2环境下培养,培养基为RPMI1640+ 10％FBS细胞基础培养基。

实施例2.原代肿瘤细胞的单克隆培养

1.细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释至1×10个/mL。具体 不走如下：

a)将消化后的细胞稀释至1×105个/mL。

b)取1×105个/mL细胞悬液200uL，加至20mL，成为1×103个/mL。

c)将1×103个/mL细胞悬液200uL，加至20mL，成为1×10个/mL。

2.在96孔板的微量滴定培养板中加入100uL的1×10个/mL细胞悬液，每孔会形成 一个集落。

3.接种几小时后，通过显微镜出只有一个细胞的培养孔。标出这些孔，跟踪观 察，PH下降代表细胞生长，通过显微镜观察确认。待细胞长满后，胰酶消化接入6孔板进行传 代培养。

实施例3.中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的检测鉴定

1.原代肿瘤细胞株的细胞形态学观察

光镜下肿瘤细胞形态多数呈梭型和卵圆型,少数呈多边型,细胞两极尖细,细胞核 明显,少数呈多核,核仁清晰可见,核浆比例大的特性。对数生长期的细胞铺展好CAFQ1随机 伸展多为椭圆形上皮样细胞，多角形，形态较规则。如图1所示。

2.免疫荧光学检测细胞标记蛋白

1)胰酶消化细胞后1mL的完全培养基悬浮，充分吹打成单细胞悬液，进行细胞计 数。根据需要24孔板接入5×104个细胞。滴加细胞悬液之前先在每孔里加少量的培养基，使 玻片与培养皿粘连在一起减少细胞进入，以防玻片飘起。

2)爬有细胞的玻片新鲜的PBS洗涤两遍。吸干PBS加入4％的多聚甲醛固定40min， 甲醇固定后PBS洗两次，每次5分钟，吸干多余的PBS。0.2％的Triton X-100，溶于PBS中，室 温放置15分钟，进行细胞膜打孔。吸干打孔液，加入PBS，洗两次。滴入山羊血清封闭1h。

3)将一抗溶于山羊血清中，滴到爬有细胞玻片上，4°冰箱过夜孵育。第二天PBS洗 三遍，室温孵育荧光二抗1h，注意避光。PBS洗三遍，用90％的甘油封片。

本发明中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的免疫荧光染结果显示，中国人肺腺癌细胞 系CAFQ1与来源的肺腺癌组织有着相似的蛋白表达都表现为TTF1,CEA,vimentin以及pan- keratin阳性。

2.原代肿瘤细胞株增殖曲线检测

1)细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，用计数板计数细胞悬液浓度后，配制成实验 需要的细胞浓度1×103个/mL。

2)在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃， 5％CO2的条件下)。

3)向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读 数)。

4)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

本发明中国人肺腺癌细胞系CAFQ1的生长曲线如图2所示，其对数生长期为6.5天。

实施例4、

细胞核型分析检测细胞核型特点、染体数量等。

1)将处于对数生长期的细胞加入秋水仙素，使秋水仙素终浓度0.1ug/ml，继续培 养3h；

2)将细胞消化后转入10ml尖头离心管，1000rpm,离心10min，去上清，加入 0.075mol/L的KC110ml，37℃孵育30min后，再向离心管内加入新鲜固定液(冰醋酸：甲醇＝ 3:1)1ml，混匀，1000rpm，离心10min，弃上清；

3)缓缓加入新鲜固定液10ml，轻轻吹匀，室温固定20min，离心，去上清，再固定； 1000rpm，离心10min，弃上清；

4)加入新鲜固定液250ul，轻轻吹匀，在距离载玻片15cm的高度，滴一滴悬液，空气 充分干燥，新鲜Giemsa染，自来水冲洗，晾干后二甲苯透明，中性树脂封闭，镜下观察。

本发明中国人肺腺癌细胞系的染体结构和数目均表现异常，呈异倍体或多倍 体，镜下分析37个中期细胞分裂相，细胞核较多、较大、呈圆形；37个分裂相染体数目为 43-57条不等。如图3所示。

实施例5.

向异种动物体内接种细胞悬液，观察成瘤能力。

1)向编号为1、2、3的3只4周龄的裸鼠消毒的后肢根部皮肤注射中国人肺腺癌细胞 系CAFQ1细胞悬液，每只1x107个细胞，注射后轻轻按压，勿使流出。

2)第12天，3只裸鼠均在细胞注射区域出现了白凸起，第40天，可见肿瘤呈叶状 生长，肿瘤长径为12mm-15mm，麻醉后处死裸鼠。

本发明中国人肺腺癌细胞系可以在裸鼠皮下成瘤，可以制备筛选出具有抑制和杀 伤CAFQ1细胞的抗体，以此抗体作为抗肺腺癌药物的主要成分。

实施例6.

肿瘤细胞全基因组测序

细胞计数1x106个本发明细胞，利用QINGEN的DNA提取试剂盒，提取其DNA，进行深 度测序。

本发明中国人肺腺癌细胞系中检测到ALK:Kras基因突变，未见EGFR的突变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。