O型口蹄疫病毒NY00株的全基因组序列

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种O型口蹄疫病毒NY00 株的全基因组序列。

背景技术：

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的最烈性传染病之一，也 是对人类健康造成一定危害的人畜共患传染病。口蹄疫呈世界性流 行，黄牛、猪、绵羊、山羊、水牛等家畜均易感。本病传播迅速，覆 盖面广，每次流行几乎都给当地畜牧业带来灾难性损失。因此各国对 于口蹄疫的防疫和检疫高度重视。二十世纪八十年代以来，应用基因 工程技术研究和开发新型口蹄疫疫苗和诊断试剂已成为国内外学者 关注的焦点。而扩增、克隆并测定口蹄疫病毒的基因组的核苷酸序列， 是进行上述研究和开发工作的基础。

技术内容：

本发明的目的是采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、分子克 隆和核酸序列测定技术，对本室分离、保存的中国O型口蹄疫NY00 株的全基因组进行了分段扩增、克隆及序列测定，构建了基因组 cDNA文库，测定了7.6Kb的核苷酸序列。对中国O型口蹄疫NY00 株的全基因组进行分段扩增、克隆及序列测定，并构建基因组cDNA 文库，然后从该文库中亚克隆出免疫相关基因插入表达载体中，制备 安全、高效、可靠的基因工程疫苗和诊断试剂。

本发明提供了中国O型口蹄疫病毒O_NY00株的全基因组核苷酸 序列和氨基酸序列。

将中国O型口蹄疫病毒NY00株基因组分段扩增并克隆到pGEM-T 或pGEM-T Easy载体中，构建了pTL、pTP1、pTP2和pTP3四个质粒， 建立口蹄疫病毒基因组cDNA文库。

将免疫相关基因构建的cDNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿 主细胞中表达出相应基因，可作为预防或诊断口蹄疫的多肽、蛋白质、 基因重组体或重组免疫原。

表达载体可以是原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体、 哺乳动物细胞表达载体、植物表达载体以及相关真核表达载体。

免疫相关基因可以是P1、VP1、2A、2C、3ABC、3D以及人工合成 的核苷酸或氨基酸片段。

本发明的优点和积极效果在于：扩增、克隆并测定了中国O型口 蹄疫O_NY00株基因组的核苷酸序列。同时构建了含该毒株全基因 组的文库。本发明可从该文库中亚克隆出目的基因用于口蹄疫新型疫 苗、诊断试剂以及其他相关基因工程产品的研究和开发。

附图说明：

图1是中国O型口蹄疫病毒NY00株地基因组cDNA文库结构。

具体实施方式：

1、病毒的培养与总RNA的提取

(1)病毒的培养：将保存的1953年牛口蹄疫水泡皮病料，用生 理盐水1∶5研磨，4℃浸毒过夜后，-40℃保存备用。不合实验要求 的病料研磨后，接种3~5日龄乳鼠，连传3~5代，乳鼠出现典型症状 后，将胴体用生理盐水1∶5研磨，4℃浸毒过夜后，-40℃保存备用。

(2)毒型鉴定：采用反向间接红细胞凝集试验(标准抗原和口 蹄疫A、O、C、Asia I、猪水泡病诊断液等购自兰州兽医研究所)鉴 定其血清型为O型，具体方法参考文献进行。

(3)总RNA的提取：用Trizol(INVETROGEN公司，原GIBCO BRL 公司产品)试剂盒提取总RNA。将处理好的病料研磨液，3000rpm离 心5min，取350ul上清与700ul Trizol振荡混匀，冰浴10min。加氯 仿350ul，振荡混匀后静置1Omin待其分层，4℃ 12000rpm离心10min。 收集上清到另一离心管内，加入氯仿350ul，振荡混匀后静置10min 待其分层，4℃12000rpm离心5min。收集上清到另一离心管内，加入 等体积异丙醇，-20℃ 1hour，4℃ 12000rpm离心20min。小心倾去异 丙醇，加入250ul 70％冰预冷乙醇(DEPC水配制)洗涤，弃去。37℃ 干燥后，加入20ul DEPC(二乙酯焦碳酸)水。

2、病毒基因组的分段RT-PCR

(1)病毒RNA的反转录：提取的总RNA加入反转录缓冲液(5 ×)、DNTP、随机引物和RNA酶抑制剂，70℃水浴5min，再加入反转 录酶(Promega公司的AMV)，反应体系总体积为20ul，42℃反应1h。

(2)病毒基因组的分段PCR：取3ul反转录产物加PCR缓冲液、 DNTP、氯化镁、上游引物、下游引物和去离子水和Ex-Taq DNA聚合 酶(TaKaRa公司产品)，总体积为25ul，混匀后进行扩增。具体引物 及扩增程序如下。

5’非编码区：上游引物为5`-AGGGCTGTGACCGCAAGATCATAC-3`， 下游引物为5`-CCAAGTTGCGTGTCCATGGAGTTCT-3`；扩增程序为98℃预 变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个 循环；72℃再延伸10min。片段大小为1361bp。

P1-2A区：上游引物为5`-CATGCAATCTGGCAACACTGGCAGC-3`，下 游引物为5`-CTTAGAAGGGCCCAGGGTTGGACTC-3`；扩增程序为98℃预 变性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个 循环；72℃再延伸10min。片段大小为2231bp。

P2区：上游引物为5`-CCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGAC-3`，下游 引物为5`-CTTGAAAATCGGGTGGCTCGACAC-3`；扩增程序为98℃预变 性5min，94℃变性1min，46.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个 循环；72℃再延伸10min。片段大小为1416bp。

P3区：上游引物为5`-GCATGGCCGTTGAAATGAAGAGAA-3`，下游 引物为5`-CTACCGTGACATCTGAGGGATTAG-3`；扩增程序为98℃预变 性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个循 环；72℃再延伸10min。片段大小为2887bp。

3、目的DNA的克隆与阳性克隆菌鉴定

(1)目的DNA的纯化：用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司 产品)从PCR二扩产物中纯化目的DNA，具体按试剂盒操作说明进行。

(2)目的DNA与载体的连接：纯化的目的DNA与pGEM-T(用于5’ 非编码区、P2区、P3区基因)或pGEM-Teasy(用于P1-2A基因)与 载体连接，具体操作是在离心管中按下列组成调制连接反应液，体系 为15ul；2×快速连接缓冲液7.5ul，载体1ul，PCR回收产物2.5ul， T4 DNA连接酶(3WU/ul)1ul，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15ul； 将反应液混匀；4℃连接过夜。

(3)感受态细胞的制备：感受态细胞工程菌JM109 500ul加入 50ml LB培养基中，37℃震荡培养(250-300rpm)2到3小时；冰浴 10分钟，使菌液冷却；无菌操作转移入50ml离心管中，4℃4000rpm 10分钟；弃上清，加入新配0.1M CaCl2(预冷)20ml，吹打沉淀， 冰浴45分钟；4℃4000rpm 8分钟；弃上清，加入0.1 CaCl2甘油 1-2ml，重悬；按100-200ul每管分装入离心管，-40℃保存。

(4)转化：向200ul感受态细胞中加入连接产物5ul，用Tip头 轻轻搅匀；冰浴30分钟；42℃热击90秒，不振荡，并快速移至冰上 3分钟；加入37℃预热的LB 800ul，37℃振荡培养45分钟；4000rpm 2分钟；弃部分上清，约留200ul，混匀；均匀涂布在加有16ul X-gal (50mg/ul)和4ul IPTG(200mg/ul)LB板上；液体干时，倒放平皿， 37℃过夜。

(5)阳性克隆菌的挑选和鉴定：以α-互补挑选阳性克隆菌。在 涂有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白菌落，接种于有2ml含 AMP(氨卞青霉素)的LB培养基15ml试管中，37℃摇振培养。

(6)小量制备重组质粒：用碱裂解法提取质粒DNA，具体方法是 将细菌沉淀重悬于1OOul冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，充分悬浮， 冰浴1Omin；.加200ul新配置的溶液II，盖紧轻轻倒转3-5次，冰 浴5min；加入150ul冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置于冰上 5-15分钟，必须温和震荡；4℃12000rpm离心10min；将上清液转移 到另一个管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，4 ℃12000rpm离心8min取上层水相；用2倍体积的冷无水乙醇沉淀双 链DNA，-20℃放置2小时或更长时间；4℃12000rpm离心5min弃 上清加入O.5ml 70％乙醇漂洗；小心彻底去上清，用25ul含无DNA 酶的TE重新溶解核酸，震荡，储存于-20℃。

4、病毒基因组核苷酸序列的测定、序列拼接以及序列分析

(1)目的片段的核苷酸序列测定：采用ABI PRISM377型自动核 苷酸序列测定仪进行测序，具体操作由大连宝生物工程有限公司完 成。

(2)基因组序列的拼接以及序列分析：采用DNA Star计算机分 析软件(DNASTAR Inc.USA)进行序列的拼接并与GenBanK中报道的 韩国O型口蹄疫病毒基因组序列O_SKR2000(AF377945)比较结果发 现两者编码区核苷酸序列同源性为97.1％，推导的氨基酸序列同源性 为96.8％。见表2和表3。

证实所获得的基因组序列为中国O型口蹄疫病毒O_NY00株的基 因组序列。

表1：中国O型口蹄疫病毒O_NY00株的全基因组核苷酸序列和氨基酸序列分析
AGGGCTGTGACCGCAAGATCATACCGCCTTTCCCGGCGTTAATTGGATGCAACCACAAGATGAACCTTCACCCGGAAGTAAAACGGCAAA  90
TTCGCCTAGTTTTGCCCGTTTTCAGGAGAAATGGGACGTCTGTGCACGAAACGCGCCGTCGCTTGAGGAAGACTTGTACAAACACGATCT  180
ATTCAGGTTCCCACAACCGACACAAACCGTGTAACTTGAAACTCCGCCTGGTCTTTCCAGGTCTAGAGGGGTGACATTTTGTACTGTGCT  270
TGACTCCACGCTCGGTCCACTGGCGAGTGCTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGGTGGCCGCGGGAACTCCTCCTTGGTA  360
ACAGGGACCCGCGGGGCCGAAAGCCACGTCCTCACGGGCCCACCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCAACTTTACTGTGAAAACCACTTTA  450
AGGTGACACTGATACTGGTACTCAACCACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCTTCAGGTACCCTGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTG  540
AGAAGGGGACTGGGGCTTCTTTAAAAGCGCCTAGTTTAAAAAGCTTCTACGCCTGAATAGGTGACCGGAGGCCGGCACCTTTCTTTTAAA  630
CAACTACTTTTAATGAGCACAACTGACTGTTTCATCGCTTTGTTGCACGCTTTCAGAGAGATTAAAACACTGTTCTTATCACGAGCACAA  720

GGAAAGATGGAGTTCACACTTTACAACGGTGAGAAGAAAACATTCTACTCCAGGCCCAACGACCACGACAACTGCTGGCTGAACACCATC  810
G  K  M  E  F  T  L  Y  N  G  E  K  K  T  F  Y  S  R  P  N  D  H  D  N  C  W  L  N  T  I
CTCCAGTTGTTTAGGTACGTTGATGAACCTTTCTTCGACTGGGTCTACTACTCACCTGAGAACCTCACACTTGATGCTATCAAACGATTG  900
L  Q  L  F  R  Y  V  D  E  P  F  F  D  W  V  Y  Y  S  P  E  N  L  T  L  D  A  I  K  R  L
GAAGAAATTACTGGTCTCGAGCTCCACGAGGGTGGACCACCCGCTCTCGTTATTTGGAACATTAAACACCTGCTCAACACCGGAATCGGC  990
E  E  I  T  G  L  E  L  H  E  G  G  P  P  A  L  V  I  W  N  I  K  H  L  L  N  T  G  I  G
ACCGCTTCGCGACCCAGCGAAGTGTGCATGGTAGACGGGACGGACATGTGTTTGGCTGACTTCCACGCTGGCATCTTCCTGAAAGGACAG  1080
T  A  S  R  P  S  E  V  C  M  V  D  G  T  D  M  C  L  A  D  F  H  A  G  I  F  L  K  G  Q
GAACACGCTGTGTTCGCCTGCGTCACCTCCAACGGGTGGTACGCGATTGATGACGAGGACTTTTACCCCTGGACGCCGGACCCGTCCGAC  1170
E  H  A  V  F  A  C  V  T  S  N  G  W  Y  A  I  D  D  E  D  F  Y  P  W  T  P  D  P  S  D
GTTCTGGTGTTTGTCCCGTACGATCAAGAACCGCTCAACGGAGAATGGAAAGCAAAGGTTCAGAAACGACTCAGAGGTGCCGGGCAATCC  1260
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AGCCCGGCGACTGGGTCACAGAACCAGTCAGGCAACACTGGCAGCATTATCAACAATTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGAC  1350
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ACGCAACTTGGTGACAACGCTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAAT  1440
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GACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTCGCCGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTC  1530
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GAGGACCGCATCCTCACTACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTATGGGTACGCAACAGCTGAG  1620
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GACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTC  1710
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ACCAGTGACCCGTTTGGACGGTGCTACCTGCTGGAACTCCCAGCTGACCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACCGACTCTTATGCTTAC  1800
T  S  D  P  F  G  R  C  Y  L  L  E  L  P  A  D  H  K  G  V  Y  G  S  L  T  D  S  Y  A  Y
ATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCAGTGGGAAATCAGTTCAACGGAGGATGTCTGTTGGTGGCCATGGTGCCAGAACTTTGC  1890
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TCTATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTCACGCTCTTTCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACGGCGCACATCACTGTG  1980
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CCCTTTGTTGGCGTCAACCGCTACGACCAGTACAAGGTACACAAACCTTGGACCCTCGTGGTTATGGTTGTGGCCCCGETGACTGTCAAC  2070
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ACCGAAGGTGCCCCACAGATCAAGGTCTATGCCAACATCGCCCCTACCAACGTGCACGTTGCGGGTGAGTTCCCTTCTAAGGAAGGGATC  2160
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TTCCCCGTGGCATGTAGCGACGGTTACGGTGGTCTGGTGACCACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGCCTACGGGAAAGTGTTTAATCCA  2250
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CCTCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACTTCCTTGATGTGGCTGAGGCGTGTCCTACGTTTCTGCACTTTGAGGGTGACGTGCCG  2340
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TACGTGACCACAAAGACGGACTCAGACAGGGTGCTCGCCCAGTTTGACTTGTCTCTGGCAGCAAAGCACATGTCAAACACCTTYCTGGCA  2430
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GGTCTCGCCCAGTACTACACACAGTACAGCGGCACCATCAACCTGCACTTCATGTTCACAGGACCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATG  2520
G  L  A  Q  Y  Y  T  Q  Y  S  G  T  I  N  L  H  F  M  F  T  G  P  T  D  A  K  A  R  Y  M
ATTGCATACGCCCCCCCTGGCATGGAGCCGCCCAAAACACCTGAGGCGGCCGCTCACTGCATTCATGCGGAGTGGGACACAGGGTTGAAT  2610
I  A  Y  A  P  P  G  M  E  P  P  K  T  P  E  A  A  A  H  C  I  H  A  E  W  D  T  G  L  N
TCAAAATTCACATTTTCAATCCCTTACCTTTCGGCGGCTGATTACGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCGGAGACCACAAATGTACAGGGA  2700
S  K  F  T  F  S  I  P  Y  L  S  A  A  D  Y  A  Y  T  A  S  D  A  A  E  T  T  N  V  Q  G

                                                                                    续上表 TGGGTTTGCCTGTTTCAAATTACACACGGGAATGCTGACGGCGACGCACTGGTCGTTCTAGCTAGCGCCGGCAAGGACTTTGAGCTGCGT  2790 W  V  C  L  F  Q  I  T  H  G  N  A  D  G  D  A  L  V  V  L  A  S  A  G  K  D  F  E  L  R CTGCCAGTTGACGCTCGCACGCAGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACA  2880 L  P  V  D  A  R  T  Q  T  T  S  T  G  E  S  A  D  P  V  T  A  T  V  E  N  Y  G  G  E  T CAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGCGTTGGAC  2970 Q  V  Q  R  R  Q  H  T  D  V  S  F  I  L  D  R  F  V  K  V  T  P  K  D  Q  I  N  A  L  D CTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGATCTAGAAGTGGCAGTGAAACAC  3060 L  M  Q  T  P  A  H  T  L  V  C  A  L  L  R  T  A  T  Y  Y  F  A  D  L  E  V  A  V  K  H GAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGGCAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTC  3150 E  G  N  L  T  W  V  P  N  C  A  P  E  A  A  L  D  N  T  T  N  P  T  A  Y  H  K  A  P  L ACCCGCCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACC  3240 T  R  L  A  L  P  Y  T  A  P  H  R  V  L  A  T  V  Y  N  G  N  C  K  Y  G  E  S  P  V  T AATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCCCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGTGCCATCAAAGCCACTCGG  3330 N  V  R  G  D  L  Q  V  L  A  Q  K  A  A  R  T  L  P  T  S  F  N  Y  G  A  I  K  A  T  R GTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCTGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCGAGCGAAGCTAGACACAAA  3420 V  T  E  L  L  Y  R  M  K  R  A  E  T  Y  C  P  W  P  L  L  A  I  H  P  S  E  A  R  H  K CAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTC  3510 Q  K  I  V  A  P  V  K  Q  L  L  N  F  D  L  L  K  L  A  G  D  V  E  S  N  P  G  P  F  F TTCTCTGACGTCAGGTCAAATTTTTCCAAGTTGGTTGAAACCGTCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTT  3600 F  S  D  V  R  S  N  F  S  K  L  V  E  T  V  N  Q  M  Q  E  0  M  S  T  K  H  G  P  D  F AACCGGTTGGTGTCTGCATTTGAGGAACTGGCCACTGGAGTGAAGGCTATCAGGACCGGTCTCGATGAGGCCAAACCCTGGTACAAGCTC  3690 N  R  L  V  S  A  F  E  E  L  A  T  G  V  K  A  I  R  T  G  L  D  E  A  K  P  W  Y  K  L ATCAAGCTCTTGAGCCGCCTGTCATGCATGGCCGCTGTAGCAGCACGGTCAAAGGACCCAGTCCTTGTGGCCATCATGCTGGCTGACACC  3780 I  K  L  L  S  R  L  S  C  M  A  A  V  A  A  R  S  K  D  P  V  L  V  A  I  M  L  A  D  T GGCCTTGAGATTCTGGACAGTACCTTTGTCGTGAAGAAGATCTCCGACTCGCTCTCCAGTCTCTTTCACGTGCCGGCCCCCGTCTTCAGT  3870 G  L  E  I  L  D  S  T  F  V  V  K  K  I  S  D  S  L  S  S  L  F  H  V  P  A  P  V  F  S TTCGGAGCCCCGATTTTGTTGGCCGGGTTGGTCAAAGTCGCCTCGAGTTTCTTCCGGTCCACACCCGAAGACCTTGAGAGAGCGGAGAAA  3960 F  G  A  P  I  L  L  A  G  L  V  K  V  A  S  S  F  F  R  S  T  P  E  D  L  E  R  A  E  K CAGCTCAAAGCACGTGACATCAATGACATATTCGCCATTCTCAAGAACGGCGAGTGGCTGGTCAAGCTGATTCTTGCCATCCGCGACTGG  4050 Q  L  K  A  R  D  I  N  D  I  F  A  I  L  K  N  G  E  W  L  V  K  L  I  L  A  I  R  D  W ATCAAGGCATGGATCGCCTCAGAAGAAAAGTTTGTCACCATGACAGACCTGGTGCCTGGCATCCTTGAAAAGCAGCGGGATCTCAACGAC  4140 I  K  A  W  I  A  S  E  E  K  F  V  T  M  T  D  L  V  P  G  I  L  E  K  Q  R  D  L  N  D CCAAGCAAGTACAAGGAGGCCAAGGAGTGGCTCGACAACGCGCGCCAAGCGTGTTTGAAGAGCGGGAACATCCACATCGCAAACCTTTGC  4230 P  S  K  Y  K  E  A  K  E  W  L  D  N  A  R  Q  A  C  L  K  S  G  N  I  H  I  A  N  L  C AAAGTGGTTGCCCCAGCACCCAGCAGGTCGAGGCCCGAACCCGTGGTCGTTTGCCTCCGTGGTAAATCGGGCCAGGGCAAGAGTTTCCTT  4320 K  V  V  A  P  A  P  S  R  S  R  P  E  P  V  V  V  C  L  R  G  K  S  G  Q  G  K  S  F  L GCGAACGTGCTTGCACAAGCAATTTCAACCCACTTCACTGGCAGAACCGATTCAGTTTGGTACTGCCCACCTGACCCTGACCACTTCGAC  4410 A  N  V  L  A  Q  A  I  S  T  H  F  T  G  R  T  D  S  V  W  Y  C  P  P  D  P  D  H  F  D GGTTACAACCAGCAGACCGTTGTAGTAATGGATGATTTGGGCCAGAACCCCGACGGGAAGGACTTCAAGTACTTCGCCCAAATGGTTTCA  4500 G  Y  N  Q  Q  T  V  V  V  M  D  D  L  G  Q  N  P  D  G  K  D  F  K  Y  F  A  Q  M  V  S ACTACGGGGTTTATCCCGCCCATGGCTTCACTCGAGGACAAAGGCAAACCTTTCAACAGCAAGGTCATCATCGCCACCACCAACCTGTAC  4590 T  T  G  F  I  P  P  M  A  S  L  E  D  K  G  K  P  F  N  S  K  V  I  I  A  T  T  N  L  Y TCGGGCTTCACCCCGAGAACTATGGTGTGCCCTGATGCACTGAACCGAAGGTTCCACTTTGACATTGACGTGAGCGCCAAGGACGGGTAC  4680 S  G  F  T  P  R  T  M  V  C  P  D  A  L  N  R  R  F  H  F  D  I  D  V  S  A  K  D  G  Y AAAATTAATAACAAATTGGACATCACCAAAGCTCTTGAAGACACCCACACCAACCCAGTGGCAATGTTTCGATACGACTGTGCCCTTCTC  4770 K  I  N  N  K  L  D  I  T  K  A  L  E  D  T  H  T  N  P  V  A  M  F  R  Y  D  C  A  L  L AACGGCATGGCCGTTGAAATGAAGAGAATGCAACAAGATGTGTTCAAGCCGCAACCGCCCCTCCAGAACGTCTACCAGCTTGTTCAGGAG  4860 N  G  M  A  V  E  M  K  R  M  Q  Q  D  V  F  K  P  Q  P  P  L  Q  N  V  Y  Q  L  V  Q  E GTGATTGACCGGGTCGAGCTCCACGAGAAGGTGTCGAGCCACCCGATTTTCAAGCAGATCTCAATTCCTTCCCAAAAGGCTGTGCTGTAC  4950 V  I  D  R  V  E  L  H  E  K  V  S  S  H  P  I  F  K  Q  I  S  I  P  S  Q  K  A  V  L  Y TTTCTCATTGAGAAGGGCCAGCACGAAGCAGCAATTGAATTCTTTGAGGGGATGGTGCATGACTCCATCAAGGAGGAGCTCCGGCCTCTC  5040 F  L  I  E  K  G  Q  H  E  A  A  I  E  F  F  E  G  M  V  H  D  S  I  K  E  E  L  R  P  L

                                                                                     续上表 ATCCAGCAGACCTCATTTGTGAAGCGCGCTTTTAAGCGCCTGAAGGAAAACTTTGAGATAGTTGCCCTGTGTTTGACTCTTTTGGCAAAC  5130 I  Q  Q  T  S  F  V  K  R  A  F  K  R  L  K  E  N  F  E  I  V  A  L  C  L  T  L  L  A  N ATAGTGATCATGATCCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAGATGGTGGATGATGCAGTGAACGAGTACATTGAGAAGGCAAACATCACCACG  5220 I  V  I  M  I  R  E  T  R  K  R  Q  Q  M  V  D  D  A  V  N  E  Y  I  E  K  A  N  I  T  T GATGACAAGACTCTTGACGAGGCGGAAAAGAACCCTCTGGAGACCAGCGGTGCCACCACTGTTGGTTTCAGAGAGAAAACTCTCCCGGGA  5310 D  D  K  T  L  D  E  A  E  K  N  P  L  E  T  S  G  A  T  T  V  G  F  R  E  K  T  L  P  G CACAAGGCGAGTGATGACGTGAACTCCGAGCCCGCCAAACCCATGGAAGAACAACCACAAGCTGAAGGACCCTACACCGGTCCACTCGAG  5400 H  K  A  S  D  D  V  N  S  E  P  A  K  P  M  E  E  Q  P  Q  A  E  G  P  Y  T  G  P  L  E CGTCAAAAACCTCTGAAAGTGAGAGCCAAGCTCCCACAGCAGGAGGGGCCCTACGCTGGTCCGATGGAGAGACAGAAACCGCTGAAAGTG  5490 R  Q  K  P  L  K  V  R  A  K  L  P  Q  Q  E  G  P  Y  A  G  P  M  E  R  Q  K  P  L  K  V AAAGTGAAAGCCCCGGTCGTTAAGGAAGGACCTTACGAAGGACCGGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAACGCAAAGAACTTGATC  5580 K  V  K  A  P  V  V  K  E  G  P  V  E  G  P  V  K  K  P  V  A  L  K  V  N  A  K  N  L  I GTCACTGAGAGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACG  5670 V  T  E  S  G  A  P  P  T  D  L  Q  K  M  V  M  G  N  T  K  P  V  E  L  I  L  D  G  K  T GTGGCCATCTGCTGCGCCACTGGAGTGTTTGGTACTGCCTACCTTGTTCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTG  5760 V  A  I  C  C  A  T  G  V  F  G  T  A  Y  L  V  P  R  H  L  F  A  E  K  Y  D  K  I  M  L GACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAGGGACAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTC  5850 D  G  R  A  M  T  D  S  D  Y  R  V  F  E  F  E  I  K  V  K  G  Q  D  M  L  S  D  A  A  L ATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAGGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGC  5940 M  V  L  H  R  G  N  R  V  R  D  I  T  R  H  F  R  D  V  A  R  M  K  K  G  T  P  V  V  G GTGATCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATTGTAGTGTGCATGGACGGAGACACC  6030 V  I  N  N  A  D  V  G  R  L  I  F  S  G  E  A  L  T  Y  K  D  I  V  V  C  M  D  G  D  T ATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATC  6120 M  P  G  L  F  A  Y  K  A  A  T  K  A  G  Y  C  G  G  A  V  L  A  K  D  G  A  E  T  F  I GTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAATGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCACACATCGAT  6210 V  G  T  H  S  A  G  G  N  G  V  G  Y  C  S  C  V  S  R  S  M  L  L  K  M  K  A  H  I  D CCCGAACCACACCACGAGGGATTGATAGTTGACACCAGAGATGTTGAGGAGCGCGTACATGTTATGCGCAAAACCAAGCTCGCACCCACC  6300 P  E  P  H  H  E  G  L  I  V  D  T  R  D  V  E  E  R  V  H  V  M  R  K  T  K  L  A  P  T GTGGCGCACGGTGTGTTTAACCCCGAATTTGGGCCTGCCGCCTTGTCCAACAAGGACCCGCGCCTGAATGAGGGGGTTGTCCTCGATGAA  6390 V  A  H  G  V  F  N  P  E  F  G  P  A  A  L  S  N  K  D  P  R  L  N  E  G  V  V  L  D  E GCCATCTTCTCCAAACACAAAGGAAACACAAAGATGTCTGAGGAGGACAAAGCGCTGTTCCGCCGCTGTGCTGCTGACTACGCGTCGCGT  6480 A  I  F  S  K  H  K  G  N  T  K  M  S  E  E  D  K  A  L  F  R  R  C  A  A  D  Y  A  S  R CTGCATAGCGTGCTGGGTACGGCAAATGCCCCACTGAGCACTTACGAGGCAATCAAGGGCGTCGACGGACTTGACGCCATGGAACCAGAC  6570 L  H  S  V  L  G  T  A  N  A  P  L  S  T  Y  E  A  I  K  G  V  D  G  L  D  A  M  E  P  D ACCGCGCCTGGTCTCCCCTGGGCTCTCCAGGGGAAACGCCGTGGTGCGCTCATTGACTTCGAGAACGGCACTGTCGGACCCGAGGTTGAA  6660 T  A  P  G  L  P  W  A  L  Q  G  K  R  R  G  A  L  I  D  F  E  N  G  T  V  G  P  E  V  E GCTGCCTTGAAGCTCATGGAGAAAAGAGAGTACAAGTTTGTATGCCAGACCTTCCTGAAGGACGAGATTCGCCCGATGGAGAAGGTACGT  6750 A  A  L  K  L  M  E  K  R  E  Y  K  F  V  C  Q  T  F  L  K  D  E  I  R  P  M  E  K  V  R GCCGGCAAGACTCGCATTGTCGACGTCCTGCCTGTTGAACACATTCTTTACACCAGGATGATGATTGGCAGATTTTGTGCTCAAATGCAC  6840 A  G  K  T  R  I  V  D  V  L  P  V  E  H  I  L  Y  T  R  M  M  I  G  R  F  C  A  Q  H  H TCAAACAACGGACCGCAAATTGGCTCGGCGGTTGGTTGTAATCCTGATGTTGATTGGCAAAGATTTGGCACACATTTTGCTCAGTACAGA  6930 S  N  N  G  P  Q  I  G  S  A  V  G  C  N  P  D  V  D  W  Q  R  F  G  T  H  F  A  Q  Y  R AACGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCCTTTGATGCCAACCACTGCAGTGACGCAATGAACATCATGTTTGAGGAGGTGTTCAACACGGAT  7020 N  V  W  D  V  D  Y  S  A  F  D  A  N  H  C  S  D  A  M  N  I  M  F  E  E  V  F  N  T  D TTTGGTTTCCACCCAAACGCTGAGTGGATCCTGAAAACTCTCGTGAACACTGAACACGCCTATGAGAACAAACGCATCACTGTTGAAGGC  7110 F  G  F  H  P  N  A  E  W  I  L  K  T  L  V  N  T  E  H  A  Y  E  N  K  R  I  T  V  E  G GGGATGCCGTCTGGTTGTTCCGCAACAAGCATCATCAACACAATTTTGAACAACATCTACGTGCTCTACGCCTTGCGTAGACACTATGAG  7200 G  M  P  S  G  C  S  A  T  S  I  I  N  T  I  L  N  N  I  Y  V  L  Y  A  L  R  R  H  Y  E GGAGTTGAGCTGGACTCTTACACCATGATCTCCTACGGAGACGACATCGTGGTTGCAAGTGACTACGATCTGGACTTTGAGGCCCTCAAG  7290 G  V  E  L  D  S  Y  T  M  I  S  Y  G  D  D  I  V  V  A  S  D  Y  D  L  D  F  E  A  L  K CCTCACTTCAAATCCCTTGGTCAAACCATTACTCCAGCTGACAAAAGCGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTCACTCCATTACCGATGTCACT  7380 P  H  F  K  S  L  G  Q  T  I  T  P  A  D  K  S  D  K  G  F  V  L  G  H  S  I  T  D  V  T

                                                                                      续上表
TTCCTCAAAAGACACTCCCACATGGACTATGGAACTGGGTTTTACAAACCTGTGATGGCTTCGAAGACCCTCGAGGCTATCCTCTCCTTT  7470
F  I  V  D  H  C  W  M  D  V  G  T  G  F  V  V  D  V  M  A  C  V  T  I  F  A  T  I  C  F
TTCCTCAAAAGACACTCCCACATGGACTATGGAACTGGGTTTTACAAACCTGTGATGGCTTCGAAGACCCTCGAGGCTATCCTCTCCTTT  7470
F  L  K  R  H  S  H  M  D  Y  G  T  G  F  Y  K  P  V  M  A  S  K  T  L  E  A  I  L  S  F
GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCTACTCTGGACCTGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAG  7560
A  R  R  G  T  I  Q  E  K  L  I  S  V  A  G  L  A  V  Y  S  G  P  D  E  Y  R  R  L  F  E
CCTTTCCAGGGCCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGATGCATAATCCCTCAGA  7650

TGTCACGGTAG 7661

表2 NY00株与O_SKR2000株编码区核苷酸序列同源性比较

表3 NY00株与O_SKR2000株编码区氨基酸序列同源性比较