生物材料及其用途

生物材料及其用途

本申请是申请日为2006年12月8日，申请号为200680051213.0，题目 为“生物材料及其用途”的分案申请。

本发明涉及与细胞凋亡诱导有关的分子和用于诱导细胞凋亡的药物组 合物、方法及其用途。

目前，抗体不但是用于靶向癌症的选择性蛋白剂，也用于其他的症候(Brekke et al.Nat Rev Drug Discov 2003：2：52‑62)。抗体工程的出现为从合成噬菌体文库中产生人抗体提供了工具。由于人源的性质和更好的多样性，其表现出了降低的免疫原性且增高的特异性和亲和性(Weiner et al.Nat Biotechnol 2005；23：556‑7)。天然文库(library)特别引人注目，因为它们不依赖于新文库的免疫和重建，而可用于分离任何特异性的抗体，包括自身抗原(Griffiths et al.Embo J1993；12：725‑34)。细胞表面受体目前组成了最成功的一类被当前剂靶向的抗原，所述剂包括小分子抑制剂和抗体。特别有意思的是细胞表面受体，其在靶细胞中独特表达或表现出增加的表达水平，并且另外能够向细胞中转死亡或生存信号。这种具有内在信号特性的、差异表达的受体使基于抗体靶向微生物感染的细胞、转化的细胞或其它的功能障碍的细胞成为可能。

对于肿瘤的，能在靶标肿瘤细胞中诱导细胞凋亡但不伤害正常组织 的抗体特别有用。几种此类单抗已经被使用，其已在美国食品和药品管理局 登记并且为常规的癌症如淋巴瘤(利妥昔单抗(rituximab)靶向CD20)或 乳腺癌(妥珠单抗(trastuzumab)或西妥昔单抗(cetuximab)分别靶向Her‑2和 EGFR)提供了替代。

目前，在临床研究中，也存在其他的具有细胞凋亡诱导作用的抗体。然 而，即便这些抗体在患者或者动物试验中显示有益作用，但仍然存在未能满 足的临床需要。

靶向B细胞肿瘤的抗独特型的免疫球蛋白是第一个实施于人的单克隆抗 体(Miller et al.N Engl J Med 1982；306：517‑22)。已经表明通过被动抗体 施用(Riechmann et al.Nature 1988；332：323‑7)或者用患者自身的肿瘤免疫球 蛋白的主动接种(Kwak et al.N Engl J Med 1992；327：1209‑15)方法的肿瘤细 胞破坏，赋予患有不同类型B细胞恶性肿瘤的患者肿瘤消退(tumour  regression)或肿瘤休眠(tumour dormancy)。最近的一篇文献描述了使用转基 因小鼠产生完全的人抗独特型抗体(Suarez et al.MoI Immunol 2004； 41：519‑26)，该小鼠在产生小鼠抗体和表达选择的人抗体链式基因座(human  antibody chain loci)方面是有缺陷的。

在本发明中，使用了竞争生物淘洗(competition biopanning)法，其中将全细胞形式的靶细胞抗原和膜囊(membrance vesicles)形式的过量相减细胞抗原(excess subtractor cell antigen)同时暴露于天然的抗体噬菌体文库(WO 2004/023140；Soderlind et al.Nat Biotechnol 2000；18：852‑6)，以重新得到并随后试验具有良好的B淋巴瘤靶细胞选择性的抗体片段。而且，试验的抗体在靶细胞但不是在非靶细胞中诱导细胞凋亡的能力，证明了所选择的结合分子的功能性。

鉴定的特异性抗体包括HLA‑DR/DP(本发明的B1抗体)和表面IgM(本 发明的C11抗体)，以及ICAM‑1(本发明的B11抗体)，其是以前与细胞凋亡 诱导无关的粘附分子。分离的抗体在亚纳摩尔(subnanomolar)到纳摩尔 (nanomolar)的范围内都具有亲和性，直接使他们成为用于靶向抗体法的 可能的选择。

发明概述

一方面，本发明提供了在靶细胞中诱导细胞凋亡的方法，其包括下列步 骤：

a.提供一种或多种展示细胞表面抗原ICAM‑1的靶细胞；

b.提供一种或多种结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM‑1结合，且 一旦结合ICAM‑1，则诱导靶细胞的细胞凋亡；

c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的结合法分子中，诱导靶细胞的细胞凋亡。

优选，结合分子是抗体分子。

第二方面，本发明提供了在靶细胞中诱导细胞凋亡的方法，其包括下列 步骤：

a.提供一种或多种展示细胞表面抗原HLA‑DR/DP和/或表面IgM的靶 细胞；

b.提供一种或多种抗体，其选择性地与细胞表面HLA‑DR/DP和/或表面 IgM结合，且一旦结合HLA‑DR/DP和/或表面IgM，则诱导靶细胞的细胞凋 亡；

c.将(a)的靶细胞暴露于(b)的抗体分子中，以诱导靶细胞的细胞凋亡。

第三方面，本发明提供了结合分子，其选择性地与细胞表面ICAM‑1结 合，一旦结合ICAM‑1，则诱导靶细胞的细胞凋亡。或结合分子是选择性地 与细胞表面HLA‑DR/DP和/或表面Ig M结合的抗体分子。

ICAM‑1也称为CD54，但出于本发明的目的，使用ICAM‑1。

结合分子可来源于抗体并以在许多文库中已经广泛使用的抗体支架 (antibody scaffold)为基础[Clackson T et al，Nature.1991Aug 15； 352(6336)：624‑8，Marks JD et al，J MoI Biol.1991Dec 5；222(3)：581‑97]，但结 合分子也可以来自其他的分子支架，如纤连蛋白支架[Weng S et al.， Proteomics.2002Jan；2(1)：48‑57]和蛋白A支架[Nord K，et ah，Nat Biotechnol 1997Aug；15(8)：772‑7，Hogbom M et al，Proc Natl Acad Sci U S A.2003Mar 18；100(6)：3191‑6]。这些支架中的每一个根据应用，有其自身的优势，例如， 抗体支架可有利地用于产生难以与天然变异区分的变异。

对抗体的基本结构，即最常用的支架，已经了解的相当透彻。大体上， 框架区，其包括顺序排列成二个折叠片的β链，表现为一组可变环，就是所 谓的互补决定区(CDRs)，其具有结合抗原分子的能力。尽管抗体在支架结构 中可以变化，但最广泛的变异性见于CDRs中。抗体间良好的变异性是它们 以特异性方式与大体上所有类型的分子结构相互作用的能力的基础。由于这 种能力，抗体已经广泛用于产生在疾病的诊断/预后中具有适用性的特异粘合 分子(specific binder)，并作为对确定的靶结构具有特异性的剂 [Borrebaeck CA and Carlsson R，Curr Opin Pharmacol.2001Aug；l(4)：404‑8]。

另外，用于本发明的其他非抗体结合分子，是具有支架结构的分子，所 述支架结构具有高度稳定性但允许在某些位置引入变异。另一个结合分子的 实例是容忍变异的纤连蛋白结构域和58个氨基酸的大蛋白质A结构域。也 有其他的允许某种程度变异的分子折叠。此类实例包括I型和II型主要组织相 容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子，以及最近鉴定的一 类新颖的分子，即所谓的防卫素，其在基本结构上相似，而仍然在基因家族 成员之间具有广泛的序列变异性，这表明它们适宜作为具有分子多样性的支 架。另外，在ICAM‑1作为靶分子的情况下，天然配体如LFA‑1或其重组变 体组成能在靶细胞中诱导细胞凋亡的特异性结合分子。

而且，结合分子可以是选择性结合靶细胞的细胞表面ICAM‑1的任何分 子，并且一旦结合，则诱导靶细胞的细胞凋亡。

结合分子优选是抗体分子。

在一个实施方案中，细胞表面抗原是ICAM‑1。

本发明的筛选重新获得对ICAM‑1特异的抗体(B11)，其是一个以前认为 与细胞凋亡无关且认为在细胞中无助于固有的负信号特性(intrinsic negative  signaling properties)的受体。

确定ICAM‑1作为细胞凋亡诱导分子是经设计以分离针对在靶细胞和非 靶细胞之间差异表达的所有表面受体的特异性而筛选的直接结果，而无论并 在没有它们各自的同一性的先前了解的情况下。已证实ICAM‑1诱导的细胞 凋亡为主动凋亡过程，该过程与线粒体膜的去极化有关。对于依赖和不依赖 半胱氨酸蛋白酶caspase的细胞凋亡两者的线粒体膜的去极化已有记载(Nagy  et al.J MoI Med 2003；81：757‑65)。

本发明的发现还表明，被B11抗体结合的表位在不同来源的B淋巴瘤组 织中表达，并且与其他的外周血白细胞相比，其在某些B淋巴瘤细胞中被上 调。重要的是，除了B淋巴瘤细胞外，表达ICAM‑1的癌细胞在体外遭受 ICAM‑1特异性B11抗体时也经历了细胞凋亡(参阅实施例6)。

以前的研究已经证明ICAM‑1在正常人组织中的限制表达(Smith et al.J  Clin Pathol 1990；43：893‑900)。ICAM‑1与细胞和细胞的粘附有关，并通过与 其受体LFA‑1结合在免疫应答和炎症中起重要作用。针对ICAM‑1的抗体已 用于干扰病理免疫应答和炎症。已经表明小鼠抗ICAM‑1mAb在猕猴 (cyhomolgus monkey)的体内施用(Cosimi et al J Immunol 1990；144：4604‑12)， 或在患有风湿性关节炎患者或者接受了肾移植患者的临床试验中的使用，没 有明显的毒性(Kavanaugh et al.Arthritis Rheum1994；37：992‑9；Haug et al. Transplantation 1993；55：766‑72)。

ICAM‑1靶向可导致细胞凋亡这一新的发现表明，只要不同来源的癌症 表达抗原，利用ICAM‑1的特异性结合分子如抗体来所述癌症是可能的。

基于ICAM‑1的表达，可潜在地用细胞凋亡诱导抗ICAM‑1抗体如B11 的癌症类型包括：B淋巴瘤、骨髓瘤(Huang et al.(1993)Hybridoma 12 p661‑75；Huang et al.，(1995)Cancer Res 55p610‑6；Smallshaw et al，(2004)J  Immunother 27p419‑24)、胃癌(Maruo et al，(2002)Int J Cancer 100p486‑90)、 乳腺癌(Rosette et al，(2005)Carcinogenesis 26p943‑50)、肝癌(Sun et al，(1999) J Cancer Res Clin Oncol 125p28‑34)、肺癌(Grothey et al，(1998)Br J Cancer 77 p801‑7)、黑素瘤(Wang et al，(2005)Int J Cancer 27p419‑24)、膀胱癌 (Roche et al，(2003)Thromb Haemost 891089‑97)以及前列腺癌(Aalinkeel et al， (2004)Cancer Res 64p5311‑21)。在肿瘤转移中，已确定了ICAM‑1的表达， 如同Maruo等(Maruo et al，2002)、Rosette等(Rosette et al，2005)、Sun等(Sun  et al，1999)、Grothey等(Grothey et al，1998)、Aalinkeel等(Aalinkeel et al，2004) 所证明的，指出利用ICAM‑I特异性抗体干扰转移过程是可能的。

在另一个实施方案中，细胞表面抗体是HLA‑DR/DP。

HLA‑DR/DP通常存在于例如B细胞上，并发现在B淋巴瘤细胞中被上 调。

到目前为止，三种不同的HLA‑DR特异性单克隆抗体已经进入临床试验阶段。其中最近增加的是完整的人IgG₄ 1D09C3，其分离自与相比大小相似的天然噬菌体文库，但对纯化的抗原使用固相淘洗(solid phase panning)(Nagy et at.Nat Med 2002；8：801‑7)。

在本发明中，已经确定了针对HLA‑DR/DP的新的人抗体(B1)，其快速 和高效地在血多B淋巴瘤细胞系中诱导细胞凋亡，据此，证明HLA‑DR/DP 与靶细胞中细胞凋亡的诱导有关。

B1抗体结合许多不同来源的B淋巴瘤细胞系(参阅实施例1和表1)，并 且表示其在表达HLA‑DR/DP抗原的细胞中诱导细胞凋亡。而且，当在Raji B 淋巴瘤细胞系中试验时，所述B1抗体比利妥昔单抗更高效。当使用B1抗体 的IgG₄形式时，这点特别明显(图8)。

根据已经获得的数据，这种抗体具有表达HLA‑DR/DP的B淋巴瘤 细胞系的适宜特征。另外，与利妥昔单抗靶向风湿性关节炎和SLE相似， B1抗体可有效消除处于障碍中的激活的B细胞，其中，表达HLA‑DR/DP 的B细胞是有害的。

在另一个实施方案中，细胞表面抗原是表面IgM。

游离形式的IgM以大的四聚体结构存在，其较高的分子量倾向于将其限 制于血管内。

单聚体IgM可发现于B淋巴细胞的细胞壁上，并且作为抗原识别的抗体 受体起作用。

本发明的C11抗体，一旦和表达在B淋巴细胞上的表面IgM结合，则 快速并高效地诱导细胞凋亡(参阅实施例1和表1)。与以前在B淋巴瘤 的临床中使用的独特型特异性抗IgM抗体相反，C11抗体与表达在来自不同 供体的B细胞上的非多态性表位结合，因此适宜用于患有B淋巴瘤的患 者，而不管B淋巴瘤的独特型。

特别地，效应物分子例如抗IgM抗体也可能是任何类型的特异结合分 子，其在不同独特型的表达IgM的细胞中引起细胞凋亡。

B1、B11和C11 IgG诱导的细胞凋亡的动力学非常快速，已观察到在一 些细胞系中3小时后具有最大功效。快速的效应物功能对功效非常重要， 因为其由例如缺乏肿瘤抗原表达(Uyttenhove et al.J.Exp.Med.1983； 157：1040‑52；Kennedy et al.Br J Haematol 2002；119：412‑6)或表位突变(Weiner  et al.J Immunol 1989；142：343‑51；Bai et al.J.Clin.Invest.2003；111：1487‑96) 而导致的肿瘤侵入的风险降至最低，并且潜在地限制持续时期和副作用 (Robert et al Lancet Oncol 2005；6：491‑500)。

优选地，靶细胞是免疫细胞或上皮细胞，并且有利地该免疫细胞是B淋 巴细胞。

方便地，该靶细胞与疾病有关。优选地，所述疾病选自下组：癌症、自 身免疫病(包括但不限于风湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败 血症以及包括但不限于HIV的传染性疾病。

有利地，所述疾病是选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝 癌、肺癌、黑素瘤、膀胱癌、脉络丛癌(chorioid cancer)、胰腺癌(pancreatic  cancer)、结肠癌和前列腺癌中的癌症。

如在本发明的定义部分所限定的，出于方便而使用术语抗体分子，除了 其他的以外，还包括抗体、抗体片段和抗体衍生物。

方便地，抗体分子是IgG。IgG可以是任何的IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄， 但优选是任何的IgG₁和IgG₄。抗体分子优选是人源化的或人的。

方便地，本发明的结合分子或抗体分子具有图9‑11的可变区序列，或具 有其功能上等同的同源物中任一个的序列。

在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有图9的可变区 序列，或具有其功能上等同的同源物。

在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有图10的可变 区序列，或具有其功能上等同的同源物。

在本发明的一个实施方案中，该结合分子或抗体分子具有图11的可变 区序列，或具有其功能上等同的同源物。

第四方面，本发明提供了核酸，所述核酸具有编码任何以上的权利要求 所要求保护的结合分子或抗体分子的核苷酸序列。

通常，该核酸分子具有图9‑11中任一个的核苷酸序列。

第五方面，本发明提供了如本发明的第一或第二方面所限定的结合分子 或抗体分子在诊断和/或和/或预防需要破坏靶细胞的疾病中的用途。也 提供了如本发明的第一或第二方面所限定的结合分子或抗体分子在制备用 于和/或预防需要破坏靶细胞的疾病的药物中的用途。

在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。

方便地，待的疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病(包括但不限于风 湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败血症和包括但不限于HIV 的传染性疾病。

方便地，待的疾病选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、 肝癌、肺癌、黑素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列腺癌 中的癌症。

在本发明的一个实施方案中，所述结合分子或抗体分子特异性地与 ICAM‑1结合和/或具有图10的序列并且用于上文所述的疾病。

在本发明的另一个实施方案中，该抗体分子特异性地与HLA‑DR/DP结 合，和/或具有图9的序列，并且用于淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺 癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列 腺癌疾病中。

第六方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的结合分子或抗体 分子和药学可接受载体、赋形剂或稀释剂。

在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。

第七方面，本发明提供了体外诱导靶细胞细胞凋亡的方法，其包括下列 步骤：

(i)提供一种或多种靶细胞；

(ii)提供一种或多种如本发明的第一个实施方案所限定的结合分子或抗 体分子；

(iii)将(i)的靶细胞暴露于(ii)的结合分子或抗体分子中，以诱导靶细胞的 细胞凋亡。

在优选的实施方案中，该结合分子是抗体分子。

优选地，(i)中提供的靶细胞是面向细胞或上皮细胞。有力地，所述免 疫细胞是B淋巴细胞。

方便地，靶细胞与疾病有关，并且其中所述疾病选自下组：癌症、自身 免疫疾病(包括但不限于风湿性关节炎和SLE)、急性和慢性炎症性疾病、败 血症和包括但不限于HIV的传染性疾病。

通常，所述疾病选自淋巴瘤(白血病、骨髓瘤)、胃癌、乳腺癌、肝癌、 肺癌、黑素瘤、膀胱瘤、脉络丛癌、胰腺癌、结肠癌以及前列腺癌中的癌 症。

所用术语的涵义

术语“抗体分子”用于指抗体、抗体片段或抗体衍生物中的任何一种。 其意在包括野生型抗体、合成抗体、重组抗体或杂交抗体(antibody hybrids)， 例如，但不限于，由免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示 (phage‑display)所产生的单链修饰抗体分子，或其它的能在本领域技术人员熟 知的免疫测定模式中与抗原结合的免疫相互作用分子。

术语“抗体片段”用于指抗体、抗体片段或抗体衍生物中的任何一种。 其意在包括野生型抗体(即包含4条多肽链的分子)、合成抗体、重组抗体或 杂交抗体，例如，但不限于，由免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的 噬菌体展示所产生的单链修饰抗体分子，或其它的能在本领域技术人员熟知 的免疫测定模式中与抗原结合的免疫相互作用分子。

术语“抗体衍生物”指任何修饰的抗体分子，其能在本领域技术人员所 熟知的免疫测定模式中与抗原结合，如抗体片段(如Fab或Fv片段)，或通过 加入一个或多个氨基酸而修饰的修饰抗体分子，或促进抗体与另一个肽或多 肽、与大的载体蛋白或与固体支持体(如氨基酸酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天 冬氨酸、半胱氨酸和其衍生物，除其它以外还包括NH₂‑乙酰基或COOH‑末 端氨基)偶联的其他分子。

术语“ScFv分子”指任何分子，其中V_H和V_L伴侣结构域经通过弹性寡 肽而连接。

术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换 使用，指核苷酸或这些核苷酸的序列的杂聚物。这些术语也指基因组来源或 合成来源的DNA或RNA，其可以是单链的或双链的，并且代表肽核酸或任 何DNA样或RNA样材料的有义链或反义链。在本发明的序列中，A是腺嘌 呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，N是A、C、G或T(U)。可 预期到是，当多核苷酸是RNA时，在本发明提供的序列中的T(胸腺嘧啶) 用U(尿嘧啶)取代。通常，由本发明提供的核酸片段可由基因组的片段或短 的寡核苷酸连接体、或由一系列寡核苷酸、或由单独的核苷酸组装，来提供 能在重组的转录单元中表达的合成的核酸，所述重组的转录单元包括来源于 微生物或病毒操纵子或真核基因的调控元件。

术语“多肽”或“肽”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白序列 或其片段，并且指天然存在的或合成的分子。多肽“片段”、“部分”或“片 段”是至少5个氨基酸，优选至少约7个氨基酸，更优选至少约9个氨基酸， 最优选至少约17个或更多个氨基酸的氨基酸残基的一段。为了具有活性， 任何多肽必须具有足够的长度来展示生物学和/或免疫学活性。

如本文中所用的，术语“纯化的”或“基本上纯化的”表示：指定的核 酸或多肽基本上不含有其他的生物大分子，如多核苷酸、蛋白质等。在一个 实施方案中，纯化该多核苷酸或多肽，使其组成指定的生物大分子重量的至 少95％，更优选重量的至少99％(但水、缓冲液和其他的小分子，特别是具 有小于1000道尔顿分子量的分子可以存在)。

如本文中所用的术语“分离的”指分离于至少一种其他组分(例如核酸或 多肽的核酸或多肽，该组分与其天然来源中的核酸或多肽一起存在。在一个 实施方案中，仅存在(如果有什么区别的话)溶剂、缓冲液、离子或正常存在 于其溶液中的其他组分时，通常可在该溶液中发现核酸或多肽。术语“分离 的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。

术语“重组体”，当在本发明中用于指多肽或蛋白质时，其意指来自重 组(如微生物的、昆虫的或哺乳动物的)表达体系的多肽或蛋白质。“微生物 的”指在细菌或真菌(如酵母)表达系统中产生的重组多肽或蛋白质。作为产 物，“重组微生物的”指基本上不含天然内源性物质的多肽或蛋白质，并且 不伴随相关的天然糖基化。在大多数细菌培养物(如E.coli)中表达的多肽或 蛋白质没有糖基化修饰；酵母中表达的多肽或蛋白质具有通常不同于哺乳动 物细胞中表达的那些多肽或蛋白的糖基化模式。

术语“选择性结合”和“结合选择性”表示，本发明的抗体的可变区专 有地识别和结合本发明的多肽(即，不管在多肽家族中发现的序列的同一性、 同源性或相似性如何，能从其他相似的多肽中区分本发明的多肽)，但通过与 抗体可变区外的序列(特别是该分子的恒定区中的序列)相互作用，其也可与 其他的蛋白质相互作用(如，金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A 或ELISA技术中的其他抗体)。测定本发明抗体的结合选择性的筛选分析在 本领域中是熟知的并且是按常规实施的。对于此类分析的广泛讨论，参阅 Harlow等编辑的，Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor  Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)，第6章。也思考了识别和结合本 发明多肽片段的抗体，只要所述抗体对上述本发明的全长多肽是首先选择 的。因为抗体对本发明的全长多肽是选择性的，因此，能识别片段的本发明 的抗体是不管于蛋白家族中发现的固有的序列同一性、同源性或相似性如 何，而能从多肽的同一个多肽家族中区分多肽的抗体。

术语“结合亲和性”包括抗体分子和抗原之间的结合强度的涵义。

通过术语“免疫细胞”，我们意指与宿主免疫应答或炎症应答有关的任 何细胞，包括但不限于B细胞和T细胞。

通过术语“上皮细胞”，我们意指上皮的细胞。上皮是由一层细胞组成 的组织。上皮可发现附在身体的内自由表面(如内皮，其附在血管内侧直线排 列)或外自由表面(如皮肤)上。

我们皮肤的最外层是由鳞状上皮细胞组成的，如同衬在口和体腔(body  cavities)内侧的粘膜一样。其他的上皮细胞衬在肺、胃肠道、生殖道和尿道的 内侧，并且构成外分泌腺和内分泌腺。上皮细胞的功能包括分泌、吸收和保 护。上皮细胞位于基膜(basal lamina)上。

优选的实施方式

体现本发明某些优选方面的实施例将参考附图进描述，其中：

图1：通过差异的全细胞/细胞膜囊生物淘洗分离的scFv表现出了高度 的靶细胞特异性

通过差异生物淘洗而分离的scFv克隆在大肠杆菌TOP10细胞中表达并 与Ramos细胞或Jurkat细胞和(A)为进行初级筛选而表达的scFv克隆或(B)72 个随机选择并再表达的scFv克隆一起温育。用抗His MAb和Cy5‑抗小鼠多 克隆Ab检测结合的scFv。用FMAT Macroconfocal Hight Throughput  Screening仪检测细胞的结合。细胞结合图示为靶Ramos细胞(Y轴)对非靶 Jurkat细胞(X轴)的平均荧光强度。(C)7种独特的scFv克隆与Ramos细胞(实 心柱)和Jurkat细胞(空心柱)的结合。对照scFv(ctrl)未与任何细胞结合。

图2：抗Ramos scFv的细胞凋亡诱导

将Ramos淋巴细胞与抗Ramos scFv、抗His mAb和抗小鼠多克隆Ab在 冰上顺序温育(并不间断洗涤以除去过量的未结合抗体)，并在5％CO2、37℃ 的湿润空气中温育24小时。随后收获细胞，并用膜联蛋白V‑AF488(AV) (Annexin V‑AF488(AV))和碘化丙啶(PI)进行组合染。根据不同的AV和PI 染阳性(如图2B中正方形通道(square gates)所定义)，将细胞评价为存活 (AV‑PI‑实心圆，图2C)、早期细胞凋亡(AV+PI‑，空心三角形，图2C)或晚期 细胞凋亡/坏死(AV+PI+，空心菱形图2C)。通过图示(A)针对Side Scatter的 Forward Scatter(FSC‑Height)以及(B)针对PI(FL‑3)的AV(FL‑1)来表示结果。 也表示了scFv B1和F1的滴定效果(C)。将7种独特的scFv与各种浓度的(D) Ramos或(E)Raji B淋巴细胞在37℃一起温育24小时，并研究对细胞凋亡诱 导的作用。三种scFv，B1、B11和C11表现出了对两种细胞系的滴定活性， 而scFv B10、C10和G12的细胞凋亡诱导能力局限于Ramos B淋巴瘤细胞。

图3：分离的抗体的特异性包括HLA‑DR/DP、IgM和ICAM‑1

A)用0.5％v/v的非离子去污剂Triton X‑1000裂解50‑600×10⁶个Raji B 淋巴瘤细胞，并用100μg B1(泳道1)和B11(泳道11)的完整人IgG1形式免疫 沉淀，随后用蛋白A琼脂糖(Protein A Sepharose)进行交联。来自50×10⁶个 细胞的Ramos B淋巴瘤细胞裂解物用于沉淀20μg C11(泳道3)。切除抗体特 异性条带并进行胰蛋白酶消化并通过MALDI‑TOF进行分析。

B)分别通过与抗HLA‑DR/DP、抗ICAM‑1或抗IgM抗体一起预温育封 闭与B淋巴瘤细胞结合的B1 IgG、B11 IgG和C11 IgG。

为了证实抗体克隆B1、B11和C11的重新得到的MALDI‑TOF抗原的 同一性，进行用购买的抗体进行的封闭研究，并用流式细胞术进行分析。与 多于10倍摩尔(与人抗体相比)的物种匹配的封闭抗体(species‑matched  blocking antibodies)一起预温育1小时，随后加入任何分离的人抗体克隆。30 分钟后，洗涤细胞，并通过PE‑共轭的羊抗人IgG(Caltag Laboratories， Burlingame，CA，USA)，检测人抗体与细胞的结合。在该研究中，对于B1， 所用的封闭抗体是小鼠单克隆抗HLA DR(Sigma，clone HKl4)或抗CD40 (Beckton Dickinson，clone 5C3)；对于B11，所用封闭抗体是兔多克隆抗 ICAM‑1(Abeam，ab7815‑250)或抗CD22(Abeam，ab25135‑100)；对于C11， 所用的封闭抗体是羊多克隆抗IgM(Zymed，South San Francisco，CA，USA， 62‑7500)或抗IgG(Zymed，62‑8400)。

图4：ICAM‑1是能介导细胞程序性死亡的B淋巴瘤相关的细胞表面受 体

A.将2μg/ml B11或抗FITC‑8(对照)IgG₁加入至4×10⁵个CL‑01B淋 巴瘤细胞，在冰上温育2小时，随后加入10μg/ml交联的第二Fab′2羊抗人 Fc抗体。细胞在37℃下温育6小时，通过两个独立的细胞凋亡分析，测定 抗体温育的效果。通过与上文所述相似的AV/PI(上组)或通过与5μg/ml线 粒体膜区极化试剂JC‑1在RT下一起温育30分(下组)，来染细胞。通过红 (y轴)/绿(x轴)荧光强度比的降低，可检测细胞凋亡的诱导。(B)显示了B11 抗体与B淋巴瘤组织代表性结合的组织切片。将从患有间变性大细胞淋巴瘤 (Anaplastic Large Cell B Lymphoma)获得的冰冻保存的组织用B11或 FITC‑8(对照)scFv抗体染。用DAB(褐)检测抗体的结合。插入的图片显 示用对照scFv进行的染。(C)将CD45‑PerCp‑Cy5.5mAb预标记的Ramos 细胞与供给来源的PBMCs混合，并用荧光燃料共轭的CD特异抗体和Alexa  Flour 647Zenon预标记的B11 IgG1或对照FITC‑8IgG1对不同的细胞进行 染。在FL‑4通道中记录与不同细胞结合的IgG B11。

图5：IgG B1和IgG B11对B淋巴瘤细胞的亲和性

在存在或不存在0.2mg/ml对应的未标记IgG蛋白的情况下，将Raji(左 组，IgG B1)或Ramos细胞(右组，IgG B11)与渐增量的放射性碘标记IgG B1 或放射性碘标记的IgG B11蛋白一起温育。通过从总的结合中减去在存在未 标记的竞争性蛋白情况下的结合，测定特异性结合。结合的IgG B1或IgG B11 蛋白的量随着游离IgG蛋白量的增加而增加，分别在～30nM IgG B1和～1nM IgG B11时(上组)，达到饱和结合。Rosenthal‑Scatchard图分析(较下的组)证 明了对于IgG B1，～30nM的解离常数和每一个Raji细胞400,000个功能结 合位点，以及对于IgG B11(Raji细胞)，～0.3nM的解离常数和每一个Raji 细胞47，400个功能结合位点，

图6：B1、B11、C11IgG₁与不同来源的肿瘤细胞系的结合

通过流式细胞术，研究了B1、B11、C11抗体靶向的抗原在不同癌细胞 系中的抗原分布。柱状图显示了利妥昔单抗抗CD20Mab(第一行前面的大部 分峰)、B1 IgG₁(第二行的峰)、B11 IgG₁(第三行的峰)或C11 IgG₁(第四行后 面大部分的峰)与MCF‑7乳腺癌细胞、HPAC胰腺癌、PC‑3前列腺癌细胞、 LS174T结肠直肠癌细胞以及THP‑1单细胞白血病细胞的结合，如所示的。

图7：B11 IgG₁在癌细胞中的细胞凋亡诱导

在6孔板中，在完全培养基(Complete Growth Medium，RPMI 1640，补充 了10％FCS、10mM HEPES以及2mM L‑谷氨酸)内将前列腺癌细胞系培养 至80％的融合(confluency)。将前列腺癌细胞系DU145培养于具有Earl’s盐 的MEM中，其补充了10％FCS、1mM丙酮酸钠以及1mM非必须氨基酸， 并且将癌细胞系MDA MB 435的衍生物培养于补充了10％FCS的DMEM 中。

对于细胞凋亡分析，在PBS中洗涤细胞，并将连续稀释的B11 IgG₁(或 B1 IgG₁、妥珠单抗或用于对照的阴性对照抗体)加入到每个孔中，并且使结合 在4℃下1‑2个小时的温育。洗涤细胞，加入完全培养基，该培养基含有10 μg/ml的交联抗体、Fab’2羊抗人Fab’2。将细胞在37℃、具有5％的CO₂的 空气中温育16‑24小时。通过胰蛋白酶化作用，收集细胞，并用Alexa Fluor 488‑膜联蛋白V(AF488‑AV)和碘化丙啶(PI)根据制造商的说明书进行染。 以下列公式，计算凋亡细胞的百分比：％凋亡细胞＝100‑％AF488‑ AV/PV‑/‑。

A)等高图(contour plots)显示用2μg/ml IgG B11或IgG B1如上述温育 后，作为膜联蛋白V和碘化丙啶阳性的函数的PC‑3细胞的相对分布。

B)柱状图显示，与连续稀释的B11 IgG₁或20μg/ml B1 IgG₁一起温育后， 凋亡的PC‑3细胞的平均百分比。

C)柱状图显示，与无抗体的对照、10μg/ml阴性对照抗体、连续稀释的 B11 IgG₁或10μg/ml妥珠单抗IgG₁一起温育后，凋亡的MDA MB435细胞 的平均百分比。

D)柱状图显示，与无抗体的对照、10μg/ml阴性对照抗体、连续稀释的 B11 IgG₁或10μg/ml妥珠单抗IgG₁一起温育后，凋亡的DU145细胞的平均 百分比。

图8：在缺少交联剂的情况下，B1 IgG₁和B1 IgG₄诱导对Raji B淋巴 瘤细胞的直接细胞毒性

将Raji细胞与20、6.7或2.2μg/ml的B1 IgG、B1 IgG₄、利妥昔单抗IgG₁ 或对照CT‑17IgG₁一起温育24小时。收获细胞，并将存活力测定为膜联蛋 白V和碘化丙啶的双重阴性细胞(double negative cells)。

图9：B1抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)

图10：B11抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)

图11：C11抗体的VH和VL的序列(核苷酸和氨基酸序列)

实施例1：具有对与细胞表面受体有关的B淋巴瘤特异性的细胞凋亡诱 导抗体的切片和筛选(生物淘洗)

细胞培养

除非另有说明，在本研究中所用的细胞系是从ATCC(Manassas，VA， USA)或Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) GmbH(Braunschweig，Germany)获得的，并培养于补充了10％FCS、2mM L‑ 谷氨酸、10mM HEPES和1mM丙酮酸钠(均来自Invitrogen，Carlsbad，CA， USA)的RPMI 1640培养基中。Jurkat T白血病细胞系(clone E6‑1、TIB‑152、 ATCC)、B淋巴瘤细胞系DOHH‑2(ACC47，DSMZ)、SC‑I(ACC558，DSMZ)、 WSU‑NHL(ACC58，DSMZ)、JVM‑2(ACC12，DSMZ)、Jeko‑1(ACC553， DSMZ，培养于20％FCS中)、Rec‑1(ACC 584，DSMZ)、SP‑53(Daibata et al  Cancer 1989；64：1248‑53)、RL(CRL‑2261，ATCC)、Granta 519(DSMZ)、 NCEB‑I(Saltman et al.Blood 1988；72：2026‑30)、BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975；22：276‑84)、Ramos(CRL‑1596，ATCC)、Raji(CCL‑86， ATCC)、Daudi(CCL‑213，ATCC)、CL‑01(Cerutti et al.J Immunol 1998； 160：2145‑57)、前B细胞淋巴瘤KM‑3/Reh(CRL‑8286，ATCC)以及多发性骨 髓瘤UCICAK(CRL‑8083，ATCC，培养于补充了20％FCS的IMDM (Invitrogen)中)均不含支原体，将其培养于37℃、5％CO₂的湿润空气中。将 细胞维持在2×10⁵‑1×10⁶个细胞/ml之间。

Juarkat细胞膜囊的制备

通过在500ml桶(bucket)(Corning Inc.Life Sciences，New York，USA)中， 以300×g离心15分钟，收获细胞，在Dulbecco’s PBS(Invitrogen)中洗涤， 并重悬浮于缓冲液A(1mM NaHCO₃，1.5mM MgAc，pH 7.4)中。细胞的浓度 大约是5×10⁷个Jurkat细胞/ml(在100ml缓冲液A中，是5×10⁹个细胞)。

通过在冰上10‑30分钟的高渗透性休克处理(缓冲液A)，实现细胞破碎， 随后用氮空化弹(Nitrogen cavilation bomb，(Parr Instrument Company，Moline， IL，USA)对其进行氮空化。将细胞置于0℃、40bar(4,000kPa)的恒压下15 分钟。

将破碎的细胞收集于含有500μl的0.5M EDTA的50ml Sarstedt管(Sarstedt AG & Co，Germany)中，来产生终浓度为2.5nM的EDTA。加入EDTA预防膜囊的聚集。将均浆(100ml)分配于4×25ml的Beckman厚壁离心管(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA，USA)中，将其在4℃以1900×g(在Sorvall SS34离心机中4,000rpm)离心10分钟，以除去未破碎的细胞、细胞核以及重线粒体。

收集上清液，并将颗粒状物重悬浮于含有1mM EDTA的25ml NaHCO₃ 缓冲液中，并再次离心(进一步回收颗粒状的粗Jurkat膜)。将Jurkat膜与来 自第一次离心的膜合并。用Beckman 45Ti型离心机40,000rpm(约200,000× g)在4℃，将含有粗Jurkat膜囊的上清液超离心2.5小时。倒出上清液，通过 依靠着棉纸(例如Kleenex^TM)倾斜试管的边缘，除去剩余的缓冲液。

在金属棒的辅助下，将粗膜颗粒物转移至Dounce匀浆机中，并通过在 匀浆机中几次小心的敲打，将其重悬浮于2.5mlHES缓冲液(10mM Hepes，1 mM EDTA，0.25M蔗糖，pH 7.4)中。从而获得含有80‑100mg蛋白质的、浓 度相当于2×10⁹cells/ml的膜悬浮物。

通过全细胞/细胞膜囊竞争生物淘洗选择噬菌体Abs

将约2×10¹³个噬菌体颗粒在37℃预热15分钟，并间断地混合，14,000 ×g离心15分钟以除去沉淀，将上清液转移至新鲜的Eppendorf管中。加入 脱脂奶，至2％的终浓度(w/v)。将来源于2×10⁹个细胞(第一轮选择；第二 轮和第三轮选择，2×10⁸个细胞)的Jurkat膜囊制备物在冰上解冻，并与封闭 的噬菌体颗粒混合。将该混合物在冰上温育15分钟。

通过4℃、1,200rpm离心6分钟，收获5×10⁷(5×10⁶第二轮和第三轮) 个Ramos细胞。丢弃上清液并将Ramos细胞重悬浮于奶‑噬菌体‑Jurkat膜囊 混合物中。将悬浮液在10℃、缓慢完全旋转的条件下温育4小时。

将细胞/细胞膜囊/噬菌体混合物转移至15ml的Falcon管(BD Biosciences， Bedford，MA，USA)中，该Falcon管含有在底部的0.5ml 100％(台盼蓝染 的)Ficoll‑Paque PLUS(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)以及2％ (w/v)BSA/PBS(Ficoll‑柱)中覆盖的40％(v/v)的Ficoll 9.5ml。于4℃、1,500 rmp，将试管离心10分钟。将试管从离心机中拿走并旋上试管的盖子并进行 不透气密封。

使用雪茄切碎机(cigar‑chopper)切掉含有100％Ficoll的Falcon管的底部 尖端。从而，从试管中除去了包括膜囊片和细胞核的密度非常高的物质。随 后，小心地打开试管的盖子，从而破坏试管内的真空并打开(切割)使得液体 通过在试管底部开孔逐滴排出。

将收获的细胞悬浮液在PBS中洗涤一次，以除去多余的Ficoll。将颗粒 物重悬浮于1ml的PBS中(不要在最终的洗涤后进行)，并将悬浮液重新装载 于新鲜Ficoll柱的上部，重复洗涤方法(在第二轮和第三轮中2次)。

通过在PBS中加入150μl 76mM的柠檬酸(pH 2.5)，从细胞中洗提噬菌 体，随后在室温下温育5分钟。通过加入200μl的1M Tris‑HCl，Ph 7.4，中 和该混合物。在将细胞200×g沉淀5分钟后，保存洗提的噬菌体的上清液。 通过在1ml胰蛋白酶中，在室温下将细胞颗粒物重悬浮并温育10分钟进一 步洗提噬菌体。

在用40μl1mg/ml抑酶肽灭活后，离心细胞，保存含有洗提的噬菌体的 上清液。洗提的噬菌体用于感染大肠杆菌HB101F’，并将该细菌涂布于含有 适当抗生素和葡萄糖的TB培养基上。计数细菌的菌落，从平板中刮下，并 用作下一轮淘洗的接种体。

向scFv模式的转化、scFv的表达、纯化以及细胞结合的分析

将三轮选择后获得的噬菌粒库用EagI消化，以除去基因III。将所得的 载体再连接。通过用EcoRI酶消化，将含有再连接的、未切割的基因III的片 段线性化。用由此而产生的scFv载体库基本上按更早时的描述(Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000；18：852‑6)转化E.coli TOP10细胞。

将细菌涂布于大的500cm²琼脂平板上，挑选单个克隆，转移至96孔板 中，并使用自动化的系统(Hallborn Biotechniques 2002；Suppl：30‑7)，通过 37℃、220rpm过夜培养，在TB培养基上表达。在含有适当抗生素的TB培 养基中产生重组scFv片段。

对于与Raomos靶细胞(target Raomos cells)和Jurkat非靶细胞(Jurkat  non‑target cells)结合的sc Fv克隆的初级筛选，将5,000个Ramos细胞或Jurkat 细胞与960个scFv克隆的任一个一起温育，所述scFv来自第三轮选择并如 上文所述而产生。将细胞与0.5μg/ml抗6xHis mAb(R&D Systems， Minneapolis，MN₅ USA)和0.7μg/ml Cy5‑共轭的羊抗小鼠试剂(Amersham  Biosciences)一起温育。在8200Cellular Detection System Fluorescence  Macroconfocal High Throughput Screening(FMAT)仪(Applied Biosystems， Foster City，CA，USA)中检测细胞的结合。

初级筛选后，随机挑选(即，不管在初级筛选中，靶细胞对非靶细胞的反 应性)72个细菌克隆用于如以前所述的DNA测序(Soderlind et al.Nat  Biotechnol 2000，18：852‑6.)(Soderlind et al，2000)。为了通过流式细胞术评估 细胞表面结合，将Ramos细胞和Jurkat细胞(每个试验，两者都加入2×10⁵ 个细胞)与在含有0.5％w/v BSA(DPBS‑B)的PBS(Invitrogen)中、浓度为 2‑10μg/ml的单个scFv克隆一起温育1小时。

通过在300×g离心60分钟，洗涤细胞。随后将细胞分别与FITC共轭 的CD19mAb和PE共轭的CD3mAb(BD)一起温育，从而使随后的靶细胞 和非靶细胞的鉴定成为可能。在与生物素化的抗6xHis mAb一起温育后，通 过与RPE‑Cy5‑链霉抗生素(Dako Cytomation，Glostrup，Denmark)一起温育， 实现scFv结合的检测。将细胞与第二和第三试剂分别一起温育40分钟和15 分钟。所有的温育在冰上使用冰冷的溶液进行。

差异的全细胞/细胞膜囊淘洗

本研究利用了新的淘洗方案，以分离靶向在其天然细胞表面构型中差异 表达的抗原的抗体。三轮竞争生物淘洗后，利用来源于Jurkat T白血病细胞 的全Ramos B淋巴瘤细胞和膜囊，分离重组的噬菌体scFv。将它们转化为可 溶的scFv并在E.coli TOP10细胞中表达。

将重组scFv与靶(Ramos)或非靶(Jurkat)全细胞一起温育，并检测细胞的 结合。抗体克隆对靶细胞抗原的特异性是显著的，因为已显示表达的482个 scFv克隆以微弱至非常强烈范围内的强度选择性地与Ramos靶细胞结合(图 1A)。仅确定了微弱地染Jurkat非靶细胞的两个克隆(图1A)。

我们接下来测定分离的噬菌体展示的scFv的基因型多样性。随机挑选 (即，不管如初级筛选中所测定的结合取向)72个scFv克隆用于DNA测序。

通过FMAT技术，以靶细胞的特异性(Ramos对Jurkat)同时对克隆进行 再表达和再评估，如图18所述。通过它们不同的CDRH3和CDRL3序列(数 据为显示)所测定，鉴定了7种不同的抗体基因型。

与等量的Ramos细胞和Jurkat细胞一起温育并通过抗标签抗体的方式检 测scFv的结合后，通过三流式细胞术分析，证实了抗Ramos scFv的高度 特异性(图1C)。

使用荧光染料共轭的CD特异性单克隆抗体，分别通过CD19和CD3的 表达，鉴定靶细胞和非靶细胞。当与阴性对照scFv相比时，7种基因型独特 的scFv显示了与Ramos靶细胞的高度且可变的结合强度，但与Jurkat非靶 细胞没有结合。

细胞凋亡分析

使用Detoxigel柱，根据制造商的说明书(Pierce Biotechnology，Rockford， IL，USA)，降低重组产生的scFv片段的脂多糖水平。通过LAL阿米巴样细 胞的溶解产物分析(Cambrex Bioscience，Walkersville，MD，USA)，对剩余的内 毒素水平进行定量。

发现所有的样品含有不到0.1IU/ml的脂多糖。嵌合的抗CD20抗体 Mabthera^TM (利妥昔单抗)购买自隆德大学医院(Lund University Hospital  (Lund，Sweden))。将2×10⁵个B淋巴瘤细胞(Raji或Ramos)或Jurkat T细 胞与连续稀释且消毒的scFv’s一起在在培养基中，冰上温育1小时。

将细胞顺序地与第二抗6xHis mAb(5μg/ml)和第三羊Fab′2抗小鼠Fab′2 抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA，USA)一起 温育。间断地洗涤确保除去过量的未结合的抗体试剂。在37℃、5％CO₂的 湿润空气中温育细胞24小时。

当用全IgGs进行细胞凋亡诱导时，用与非IgG抗体同种型具有最小交 叉反应性的羊Fab′2抗人Fcγ抗体(Jackson ImmunoResearch)取代交联剂(为 了避免内源性B淋巴瘤相关的表面免疫球蛋白的非特异性交联)，并如上文 所述温育6小时。

除非另有说明，通过用膜联蛋白V Alexa Fluor 4S8(AV)和碘化丙啶(PI) (两者都来自Invitrogen的分子探针)组合染以及随后的流式细胞术分析， 来检测凋亡的细胞。将细胞鉴定为可变的(AV‑/PI‑)、早期凋亡的(AV+/PI‑) 晚期凋亡的/坏死的(AV+/PI+)。使用FACSCAlibur仪(BD Biosciences)，分别 在FL1和FL2或FL3通道中记录AV和PI信号(如在下文中所表示的)。

为了研究分离的scFv的功能性，基于用scFv和交联剂顺序地温育和洗 涤细胞，我们建立了高通量细胞凋亡筛选分析。在图2A‑C中，证明了在细 胞凋亡分析中对scFv克隆和浓度的依赖，其中，将选择的scFv克隆B1的 凋亡作用和scFv克隆F1的凋亡作用做了比较，该scFv克隆F1未显示细胞 凋亡诱导。在用任何检查的scFv处理后，缺乏靶抗原表达的Jurkat细胞未死 于细胞凋亡，证明细胞凋亡诱导依赖于与靶抗原的结合(未显示数据)。

利用已建立的scFv‑细胞凋亡分析，我们对Ramos和Raji B淋巴瘤细胞 以细胞调亡筛选克隆。将scFv诱导的凋亡作用与利妥昔单抗抗CD20mAb诱 导的凋亡作用进行了比较(图2D)。鉴定三个scFv克隆‑B1、B11和C11， 其诱导Ramos细胞和Raji细胞两者的显著细胞凋亡(图2D和E)。通过scFv 诱导Raji细胞的细胞凋亡和与这些细胞的结合相关(图2D)，因为不能结合 Raji细胞的scFv克隆未诱导细胞凋亡。

将B1、B11和C11克隆转化至完整的人IgG1抗体。重构型后，它们的 特异性和功能性保持完整，如通过它们对广泛的B淋巴瘤细胞系的强烈结合 和有力的细胞毒性(表1)所证明。值得注意的是，细胞凋亡的诱导是快速的， 几个细胞系在3‑6小时后就达到膜联蛋白V阳性凋亡细胞的最大百分数(表1 以及未显示的数据)。

IgG的产生和内毒素筛选分析

通过克隆至修饰的pCDNA3载体将scFv抗体片段转化为全长的人IgG1λ 形式(Norderhaug et al，J Immunol Methods 1997；204：77‑87)，并用 Lipofectamine 2000试剂根据制造商(Invitrogen)说明书转染至HEK293细胞。

在MabSelect蛋白A柱(Amersham Biosciences)上，从失去效能的培养基 (spent cultivation medium)中纯化人IgG。通过SDS‑PAGE分析所测定的制剂 的纯度＞98％。筛选抗体制剂，并通过LAL阿米巴样细胞溶解产物试验所测 定的(Cambrex Bioscience)发现其在本发明所用的浓度中含有＜0.1IU/ml的内 毒素。

实施例2：抗体特异性分析

抗原鉴定

通过B淋巴瘤细胞裂解物的免疫沉淀鉴定靶向抗原的特性。通过离心收 获细胞(根据抗体和细胞系50‑600×10⁶个/ml溶解缓冲液)，在PBS中冲洗两 次，并温育于含有0.5％v/v去污剂Triton X‑100(Sigma‑Aldrich，St.Louis，MO， USA)的裂解缓冲液(Lysis Buffer，(25mM Tris‑HCl，pH 7.5，150mM NaCl，5 mM EDTA，以及完全的EDTA‑free蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics  GmbH，Mannheim，Germany))中。

将细胞碎片在常规的台式离心机中以16,000×g、15分钟旋转沉降，通 过旋转，用Protein A Sepharose 4Fast Flow(Amersham Biosciences)(1/10反 应体积)预先除去杂质。对于每一个样品，用20‑100μg任何人抗体将1ml 预先除去杂质的细胞溶解产物免疫沉淀2小时。再次加入Protein A Sepharose 4Fast Flow，并温育30分钟，其中，在裂解缓冲液中对免疫复合物 (immuno‑complexes)彻底洗涤后，煮沸5分钟，最后重悬浮于样品缓冲液(IX NuPAGE LDS Sample Buffer，IX NuPAGE Sample Reducing Agent)中，并在 NuPAGE Novex 4‑12％Bis‑Tris Gel(均来自Invitrogen)中进行分离。

染(Simply Blue Safestain，Invitrogen)后，将目标蛋白条带从SDS‑PAGE 中切除并进行胰蛋白酶消化，如Edvardsson等所述(Edvardsson et al. Electrophoresis 1999；20：935‑42)。

简单来说，对凝胶块(gel plugs)脱，并通过在搅拌的情况下，用200μl 50％乙腈(ACN)洗涤3次来平衡。在SpeedVac浓缩器(Savant，Farmingdale， NY，USA)中干燥15分钟后，通过加入25μl 10mM DTT/100mM NH₄HCO₃， 还原样品，并在56℃温育1小时，并且通过加入25μl 55mM乙酰胺/100mM NH₄HCO₃进行烷基化，随后在室温下温育45分钟。

两次在100mM NH₄HCO₃中洗涤10分钟的额外步骤，随后在50％v/v CAN洗涤一次后，在SpeedVac浓缩器内干燥凝胶块，并再膨大，并在含有 15μl 15ng/μl胰蛋白酶(Promega Corporation，Madison，WI，USA)的25mM NH₄HCO₃中37℃消化过夜。通过加入50％v/v ACN/1％v/v TFA并在室 温下温育10分钟，来提取肽。将1μl提取物点样于MALDI样品平板上并进 行干燥。将1μl基质溶液(5mg/ml α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸(CHCA)溶解于75％ v/v ACN/1％v/v TFA中)点样于肽的上面。

用Applied Biosystems 4700Maldi Workstation测定肽质量。使用Mascot 搜索工具(Matrixscience，UK)，通过肽质量指纹数据搜索，鉴定肽。使用相似 的方法，鉴定B10、C10和G12克隆的抗原特异性，除了scFv’s和抗His包 被的磁微珠(Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，Germany)用于免疫沉 淀外。

转化为完整的抗体形式后，B1、B11和C11 IgG用于从Raji和Ramos B 淋巴瘤细胞中沉淀抗原。IgG B1沉淀了分别为大约28kDa和34kDa的两条 带(图3A，泳道1)。制备含有这些条带的凝胶切片，用胰蛋白酶消化，并通 过质谱测定法(mass spectrometry)进行分析，从而将HLADR/DP鉴定为靶抗 原。

通过使用购买获得的单克隆抗体的western印迹法和HLA‑DR/DP蛋白 检测，以及通过将细胞与商业上购买的HLA‑DR特异性单克隆抗体一起预温 育后，阻抑B1 IgG的结合，都证明了IgG B1对HLA‑DR/DP的特异性(图3B)。

用相似的方法，确定IgG B11和C11限定的抗原的特性。发现IgG C11 沉淀68kDa的蛋白带，其被鉴定为B细胞受体μ链的膜结合形式(图3A， 泳道3)。IgG B11沉淀90kDa的蛋白带，其被鉴定为细胞内细胞粘附分子 1(ICAM‑1)(图3A，泳道2)。利用购买获得的抗体，通过MS‑MS分析、抗 体阻抑研究(图3B)和western印迹分析(数据未显示)，证实了IgG B11对 ICAM‑1以及C11 IgG对IgM的特异性。

利用scFv和用于免疫沉淀的抗His包被的磁微珠，测定克隆B10、C10 和G12的特异性。三个scFv克隆沉淀了68kDa的蛋白条带，而且含有这些 条带的胰蛋白酶消化的凝胶切片的MS分析，表明它们对表面IgM的特异性。 推测这些抗体识别Ramos IgM独特型，因为它们中的任何一个都不与外周血 B淋巴细胞或其他的IgM阳性B细胞系交叉反应。

实施例3：抗体的亲和性分析

B1和B11免疫球蛋白的体外碘化

用Iodogen预包被的碘化管(Pierce)，在PBS中用[¹²⁵I]NaI碘化1mg/ml的 IgG₁ B1或IgG₁ B11蛋白10分钟。通过在PD‑10柱(Amersham Biosciences) 上脱盐，除去游离的[¹²⁵I]NaI，产生1000‑1600cpm/ng蛋白的特异放射活性。 [¹²⁵I]IgG₁ B1和[¹²⁵I]IgG₁ B11用于测定抗体的亲和性。

IgG B1和IgG B11亲和性常数的测定

放射性碘标记的IgG B1或IgG B11与B淋巴瘤细胞DPBS‑B‑hIgG(含有 0.2mg/ml人IgG的DPBS‑B)在间断混合的情况下一起在冰上温育2小时。 如果适合，在存在0.2mg/ml未标记的IgG B1或IgG B11蛋白的情况下，测 定非特异性结合。分析进行3次重复。

将细胞装载于单个试管中的40％v/v Ficoll/DPBS‑B垫(cushion)上，4℃、 400×g离心6分钟。将样品在‑80℃冰冻。将试管切割为两半后，分离细胞 颗粒物和细胞上清液，并在在γ计数器(gamma counter)中分别分析¹²⁵I‑IgG 蛋白含量。

如之前所述(Brix et al.J.Clin.Invest.1998；102：283‑93)，依照Rosenthal 等(Anal Biochem 1967；20：525‑32)、Bylund和Yamamura(Methods in  Neurotransmitter Analysed.New York：Raven Press Ltd.，1990)以及Marquardt (J.Soc.Indust.Appl.Math 1963；11：431‑41)，根据Scatchard图法分析 (Scatchard plot analysis)，测定每个细胞的抗体亲和性常数(Kd值)和表位数。

在存在或不存在0.2mg/ml对应的未标记的IgG蛋白的情况下，通过在 4℃时，将放射性碘标记的蛋白与Raji细胞或Ramos细胞一起温育，表征与 HLA‑DR和ICAM‑1结合的IgG₁和IgG B11。通过从总的结合中减去非特异 性结合(存在过量的未标记的IgG时的结合)，计算[¹²⁵I]IgG与细胞表面的特 异性结合。

在～30nM IgG B1时，达到与Raji细胞的特异性IgG B1结合的饱和。 Rosenthal‑Scatchard图分析(Rosenthal‑Scatchard plot analysis)表明，～3nM解 离常数和4000,000功能结合位点/Raji细胞，呈现二价表位‑IgG相互作用(图 5)。同样，测定IgG B11的解离常数为～0.2nM和47,400个受体/Ramos细 胞。

表1.完整的人B1、B11、和C11 IgG抗体显示动态结合模式以及在各种B淋巴瘤 细胞系中诱导细胞凋亡

^a细胞凋亡诱导；与任何和羊抗人(gamma)Fc特异性抗体交联的人抗体温育6小时后， 通过存活细胞的百分比测定；‑，未感染的存活力；+，95‑80％；++，79‑60％；+++，59‑40％ 存活的细胞，与对照(人FITC‑8IgG₁)相比。结果基于三次独立试验中的两份样品。

^bMFI；第二RPE‑共轭的羊抗人IgG抗体的平均荧光强度。从每一个人抗体的MFI中 减去对照人FITC‑8IgG抗体的细胞系依赖MFI值。

实施例4：ICAM‑1是具有细胞凋亡诱导特性的B淋巴瘤相关抗原

与Ramos细胞结合的IgG的流式细胞术分析

通过在冰上温育45分钟，用CD‑45‑PerCp‑Cy5.5mAb染Ramos细胞 (13×10⁶)，在DPBS‑B中洗涤，并保存于冰上直到与未标记的纯化的PBLs 混合。

从隆德大学医院获得来自两位健康自愿者的淡黄表皮(buffy coats)。将 淡黄表皮以1∶2稀释在PBS中，通过500×g(1500rpm Beckman Spinchron 离心机)离心10分钟洗涤，完全抽出上清液并重悬浮于含有1％热失活的FCS (DPBS‑HI)的DPBS中。洗涤重复两次。通过与红细胞裂解液(BD Biosciences) 在室温下温育15分钟，以裂解红细胞。通过60×g(667rpm Beckman  spinchron centrifuge)离心10分钟，洗涤细胞，并小心地抽出上清液。用台盼 蓝染并排除出死细胞后，在Bürker室中对细胞进行计数，在DPBS‑HI中 洗涤、沉淀，并重悬浮于含有200μg/ml纯化的人IgG的DPBS‑B中(封闭 Fc receptors)。

对于每一个捐赠人和试验条件，将大约2.5×10⁶个白细胞与1.6×10⁵个 PerCpCy5.5预标记的Ramos细胞混合。加入鼠单克隆CD3‑FITC、CD56‑PE 以及CD19‑PerCpCy5.5抗体(BD Biosciencese)，将混合物温育于冰上，直到 加入标记的人IgG。根据制造商的说明书，用AF647Fab片段(Molecular  Probes，Invitrogen)标记n‑CoDeR人IgG抗体和阳性对照抗CD20鼠人嵌合 抗体利妥昔单抗。

简单来说，将4μg每一个IgG B1、B11、C11和利妥昔单抗抗体与20μ Laf647‑Fab标记试剂在室温下一起温育5分钟。加入20μl人IgG封闭剂和 另外温育5分钟后，将AF647标记的IgG连续三倍稀释在DPBS‑B中，将 稀释的IgG蛋白加入混合的Ramos/PBL细胞溶液中。

温育样品1小时，洗涤，重悬浮于DPBS‑B中，适当校对和补偿四分 析仪器后，通过流式细胞术分析与不同细胞亚的结合。Ramos细胞鉴定为 明显区别B淋巴细胞PerCpCy5.5^low种的PerCpCy5.5^hight种。

免疫组织化学

从隆德大学病理系(Department of Pathology at Lund University(Lund， Sweden)获得患有间变性大细胞B淋巴瘤(Anaplastic Large Cell B  lymphoma)(一位患者)、中心母细胞/中心细胞B非霍奇金淋巴瘤 (Centroblastic/Centrocytic B non‑Hodgkin lymphoma)(三位患者)和B细胞慢性 淋巴细胞白血病(一位患者)患者的冷冻淋巴节活组织检查。将冷冻保存的组 织的8μm切片在4℃下在丙酮中固定10分钟。通过用抗生物素和生物素(抗 生物素/生物素封闭试剂盒，Invitrogen)依次各处理20分钟，封闭内源性生物 素结合活性。

将组织与5μg/ml对照scFv或B11scFv一起温育1小时。洗涤后，将切 片与生物素共轭的小鼠抗His mAb(R&D Systems)一起温育30分钟。用ABC Complex/HRP试剂(Dako Cytomation)处理30分钟后且随后与DAB一起温育 5分钟后，检测scFv的结合，

使用在上部装置了Leica DMR可见光/荧光显微镜的Leica DC 300F数 字照相机对切片照相。

人组织的操作遵循隆德大学医院当地的伦理委员会的建议。

线粒体膜去极化分析

如以前所述(Kim et al.MoI Biol Cell 2004；15：420‑34)，进行线粒体膜去 极化分析。简单来说，将抗体处理的细胞与5μg/ml的JC‑1试剂(Molecular  Probes)混合，室温下温育30分钟。在冰冷的PBS中将细胞洗涤2次，悬浮 于300μl的PBS中，并在FACS Aria(BD Biosciences)上分析。分别通过 494/518nm(FL‑1)和595/615nm(FL‑2)带通滤波器(bandpass filters)，收集绿 和红荧光。

ICAM‑1是免疫球蛋白超家族的糖蛋白(Marlin et al.Cell 1987； 51：813‑9)，该蛋白家族能诱导双向信号(Rothlein et al.J Immunol 1994； 152：2488‑95；Vyth‑Dreese et al Blood 1995；85：2802‑12)。以前并未证明ICAM‑ 1与B淋巴瘤细胞的程序性死亡有关。

因此，我们想证实IgG B11诱导的细胞死亡是主动过程，其通过除细胞 膜磷脂酰丝氨酸易位以外的方式。

选择线粒体膜去极化作为对细胞凋亡的确认，因为其是依赖或不依赖半 胱氨酸蛋白酶caspase的细胞凋亡的共有特征，其可通过用5，5′，6，6′‑四氯‑ 1，1’，3，3′四乙基苯并咪唑‑羰花青碘化物 (5，5’，6，6’‑tetrachloro‑1，1’，3，3’‑tetraethylbenzimidazolyl‑carbocyanine iodide) (JC‑I试剂)染细胞，来监控。

与我们的膜联蛋白V/碘化丙啶分析(图4A，上组)一致，用JC‑1试剂染 后通过流式细胞术分析所测定发现IgG B11在CL‑01B淋巴瘤细胞中诱导 线粒体膜去极化(图4A，下组)。

为了排除这种可能性，即：ICAM‑1的表达是体外假象，是细胞培养期 间全面上调的结果，我们检查了IgG B11与从患有不同的B淋巴瘤的5名不 同患者中获得的组织的结合。

通过免疫组织化学，IgG B11表现出了与五种淋巴瘤组织的强烈结合(tu 4B)，其强度与抗HLA‑DR/DP抗体IgG B1(表1)相当或稍低。

我们接下来检查了相对与剩余的外周血白细胞的结合，IgG B11与B淋 巴瘤的结合。选择Ramos作为代表性的B淋巴瘤细胞系，是基于其低档的 表位表达但仍然对B11诱导的细胞凋亡具有显著敏感性。预标记的Ramos 细胞与全血液外周血白细胞和IgG B1、B11或C11抗体中的任一个混合温育 后，流式细胞术分析表明，IgG B11表现出了与Ramos细胞的强烈结合。

更重要的是，B11表明了，相对正常的外周血白细胞，三种抗体与Ramos B淋巴瘤细胞的差异最大的结合(最强的抗原上调，图4C以及未显示的数据)。 IgG B11结合在0.1μg/ml时已经达到最高点，并且相对单核细胞在Ramos 细胞中被上调3.7倍(MFI 654对176)，相对外周血B淋巴细胞在Ramos细胞 中被上调8.3倍(MFI 654对78)，以及与NK细胞相比被上调23倍。与其他 监控的外周血白细胞子集的结合是阴性的。

表2.ICAM‑1在不同来源的B淋巴瘤组中强烈表达

^cB‑CLL＝B‑慢性淋巴细胞白血病，^dB‑PLL＝B‑前淋巴细胞白血病。+增加的数字表示 更强的染。

实施例5：通过流式细胞术所测定的B1、B11和C11 IgG₁在各种来源 的肿瘤细胞系中的抗原分布

研究了在不同癌细胞系中人抗体靶向的抗原的抗原分布，主要对于B11。 在PBS中洗涤细胞(MCF‑7和MDA MB 435S乳腺癌细胞，JAR和JEG‑3绒 癌细胞，A549肺癌细胞，TCC‑SUP膀胱癌细胞，MDA MB 435黑素瘤细 胞，HPAC、PANC‑1和BxPC‑3胰腺癌细胞，PC‑3和DU145前列腺癌 PANC‑1，LS174T、CaCo₂和Lovo直肠结肠癌细胞，以及THP‑1单核细胞 白血病细胞)，并以4×10⁶个细胞/ml重悬浮于完全培养基中(200,000个细 胞/50μl样品)。将B1 IgG₁、B11 IgG₁、C11 IgG₁、阴性对照FITC‑8IgG₁和 利妥昔单抗抗CD20Mab在完全培养基中(50μl/样品)中进行3‑10倍的连续 稀释(10‑0.1pg/ml)。将细胞与任一抗体在冰上温育1小时，通过在0.5％ PBS/BSA重悬浮来进行洗涤，1200rmp离心5分钟，完全抽取上清液。在冰 上，将细胞与PE共轭的羊F(ab’)2抗‑人IgG(Caltag Laboratories，目录号： H10104)一起温育，在0.5％PBS/BSA中进行1/50稀释，30分钟。重悬浮于 300μl 0.5％PBS/BSA中后，用FACScan仪器，分析细胞的IgG结合。

通过B11 IgG与这些细胞的强烈结合所证明，PC‑3前列腺癌细胞表现出 了强烈的ICAM‑1表达(图6)。也发现，虽然与前列腺癌细胞相比强度较低， 但MCF‑7乳腺癌细胞、HPAC胰腺癌细胞以及LS174T直肠结肠癌细胞表达 ICAM‑1。相反，THP‑1单核细胞白血病细胞不表达ICAM‑1。通过分别缺乏 利妥昔单抗IgG、B1 IgG以及C11 IgG所证明，发现最初试验的所有的癌细 胞系对CD20、HLA‑DR/DP以及IgM的表达是阴性的。对其他癌细胞系的 进一步研究表明，所有检查的细胞是ICAM‑1表达阳性的(表3)。

表3.ICAM‑1在不同来源的癌细胞系中强烈表达

实施例6：在癌细胞中B11 IgG₁的细胞凋亡诱导

在实施例5中显示B11 IgG₁强烈与癌细胞结合。本实施例检查了该抗体 对癌细胞系的细胞凋亡诱导特性。

在开始试验前3天，将细胞接种于具有完全生长培养基的6孔板上。在 试验期，细胞是50‑75％融合的。用冰冷的PBS洗涤细胞，并与如所示的连 续稀释(如图所示的，在1ml完全生长培养基中20‑0.02μg/ml)的B11 IgG₁、 20μg/ml对照B1 IgG₁、10μg/ml阴性对照IgG₁或10μg/ml妥珠单抗IgG₁ 一起在4℃温育1‑2小时。用冰冷的PBS洗涤细胞，并加入第二F(ab’s)羊抗 人F(ab’s)抗体(在完全培养基中稀释为10μg/ml)。将细胞在37℃、5％CO₂ 的湿润空气中温育16‑24小时。通过第一次分离上清液来收集全部的细胞， 随后对剩余的粘附细胞进行PBS洗涤和胰蛋白酶作用。通过重悬浮于含有 10％热失活胎牛血清的PBS中来终止酶促反应。在冰冷的PBS中洗涤细胞， 进行膜联蛋白V/碘化丙啶染，并分析存活力和细胞凋亡，如上述实施例5 所述。

显示B11 IgG₁以特异且可滴定的方式在癌细胞系中诱导细胞凋亡(图7)。 对照IgG B1，其不结合PC‑3细胞(参阅实施例5)，也未在PC‑3细胞中诱导 细胞凋亡。阴性对照IgG₁或妥珠单抗IgG₁也未能在DU145或MDA MB435 细胞中诱导细胞凋亡。

实施例7：药用制剂和施用

另一方面，本发明提供了包含本发明的第一方面的化合物与药学或兽医 学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的药用制剂。

优选地，该制剂是单位剂量，其含有活性组分的每日剂量或单位、每日 亚剂量或其适当的部分。

本发明的化合物通常以下列形式口服施用或通过任何非肠道途径施用： 含有活性组分的药物制剂形式，该活性成分任选为非毒性有机或无机的酸或 碱、或加成盐的形式，制剂为药用可接受剂型。根据待的疾病和患者以 及施用途径，可以多变的剂量施用该组合物。

在人的过程中，可单独施用本发明的化合物，但通常以与适宜的药 用赋形剂、稀释剂或载体混合的形式施用，所述的赋形剂、稀释剂或载体根 据规定的施用途径和表征的药学实践来选择。

例如，本发明的药物可以片剂、胶囊、卵形囊剂(ovules)、酏剂(elixirs)、 溶液或混悬液的形式，口服、口腔或者舌下施用，所述形式可含有调味剂或 着剂，用于速释、缓释或控释用途。本发明的化合物也可以经由阴茎海绵 体注射施用。

此类片剂可含有佐剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸 氢钙和糖胶；崩解剂，如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羧甲淀粉钠 (sodium starch glycollate)、交联羧甲基纤维素纳(croscarmellose sodium)和某些 复合硅酸盐；以及颗粒粘合剂(granulation binders)，如聚乙烯吡咯烷酮、羟 丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)、羟丙基纤维素 (hydroxy‑propylcellulos，HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶。另外，也可包括 润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。

也可使用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊中的填充物。在此情况 下，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖(milk sugar)或高分子量聚 乙二醇。对于含水混悬液和/或酏剂，本发明的化合物也可以与各种甜味剂、 调味剂、着剂或染料组合；与乳化剂和/或悬浮剂组合；以及与稀释剂如水、 乙醇、丙二醇和丙三醇或其组合进行组合。

本发明的化合物也可以非肠道施用，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、 鞘内(intrathecally)、心室内、胸骨内、头颅内、肌肉内或皮下施用，或也可 通过输注技术施用。它们最好以无菌含水溶液的形式使用，所述溶液可含有 其他的物质，如足够的盐或葡萄糖，以使该溶液与血液等渗。如果需要，该 含水溶液可适当地进行缓冲处理(优选处理为pH 3‑9)。在无菌的条件下制备 合适的非肠道制剂可通过本领域熟练的技术人员熟知的标准药学技术来实 现。

适宜非肠道施用的制剂包括水性或非水性的无菌注射溶液，其可含有使 该制剂与既定的接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质；以 及水性和非水性无菌混悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可在单位剂 量或多剂量包装容器内，如密封的安瓿和小瓶，并且保存于在直接使用前仅 需要加入无菌液体载体(例如注射用水)冷冻干燥(冻干)的条件下。可根据上文 所述类型的无菌粉、颗粒和片剂来制备临时注射溶液和混悬液。

对于针对人类患者的口服或非肠道施用，本发明化合物的每日剂量水平 通常是1mg/kg‑30mg/kg。因此，例如，本发明化合物的片剂和胶囊，可含 有一剂的活性化合物，用于一次施用单个或两个或多个单位剂量。医师可在 任何情况下决定试剂的剂量，该剂量最适宜任何单个的患者，并且随着具体 患者的年龄、体重和应答而变化。上述剂量是平均情况的范例。当然，存在 个别的情况，其中更高或更低的剂量范围是应该的，并且在本发明的范围内。

本发明的化合物也可以鼻内施用，或通过吸入施用，并且便利地以干粉 吸入器或气雾剂喷射呈递的形式，用适宜的推进剂从受压的容器、泵、喷雾 器(spray)或雾化器中递送，所述的推进剂为如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、 二氯四氟乙烷、氢氟烷(hydrofluoroalkane)如1，1，1，2‑四氟乙烷(HFA 134A3或 1，1，1，2，3，3，3，‑七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他适宜的气体。在受压 的气雾剂的情况下，可通过阀门递送计量的量来测定剂量单位。受压的容器、 泵、喷雾容器或喷雾器可含有活性化合物的溶液或混悬液，例如，使用乙醇 和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，如山梨醇三油酸酯 (sorbitan trioleate)。可配制在吸入器或吹药器(insufflator)中使用的胶囊和药筒 (cartridges，例如由明胶制备)，其含有本发明的化合物和适宜的粉末基质(如 乳糖、淀粉)的粉末混合物。

优选配制气雾剂制剂或干粉制剂，使得每一次计量的剂量或“喷出”(puff) 递送适当剂量的本发明化合物，向患者递送。应当认识到，气雾剂形式的每 日总剂量针对不同患者而不同，并且在一天内以单个剂量或通常多个分开的 剂量施用。

可选地，以栓剂或阴道栓剂的形式施用本发明的化合物，或它们也可以 以洗剂、溶液、乳剂、软膏(ointment)或撒布剂的形式局部应用。本发明的化 合物也可以透皮施用，例如，通过使用皮肤贴(skin patch)。它们也可以通过 眼睛途径施用，特别是对于眼疾病。

对于眼科应用，本发明的化合物可配制为等渗压的、pH调整的无菌生 理盐水形式的微粉化的混悬液，或优选地，等渗压的、pH调整的无菌生理 盐水形式的溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。可选地，它们也可配制 成药膏，如凡士林药膏。

对于局部应用于皮肤，可将本发明的化合物配制为含有活性化合物的适 宜的软膏，所述的适宜化合物悬浮于或者溶解于例如具有下列一种或多种物 质的混合物中：矿物油、液体凡士林(liquid petrolatum)、白凡士林(white  petrolatum)、丙二醇、聚乙烯聚丙烯化合物、乳化蜡(emulsifying wax)和水。 可选地，可将其配制成适宜的洗剂或乳剂，悬浮或溶解于例如一种或多种下 列物质的混合物中：矿物油、山梨醇单硬脂酸酯(sorbitan monostearate)、聚 乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯/盐60(polysorbate 60)、十六醇酯蜡(cetyl  esters wax)、鲸蜡醇(cetearyl alcohol)、2‑辛基十二烷醇(octyldodecanol)、苯甲 醇和水。

适宜在口腔中局部施用的制剂包括，含有调味成分通常为蔗糖和阿拉伯 树胶或黄芪胶中的活性成分的锭剂(lozenges)；含有处于惰性成分如明胶和丙 三醇或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分的软锭剂(pastilles)；以及含有处于适 宜的液体载体中的活性成分的漱口液(mouth‑washes)。

通常，对于人，口服或局部施用本发明的化合物是优选的途径，因为最 方便。对于接受者受累于吞咽障碍或受累于口服施用后影响药物吸收的情 况，所述药物可非肠道施用，例如舌下或口腔施用。

对于兽医学用途，可依据普通兽医学实践将本发明的化合物作为适宜的 可接受制剂施用，且兽医学外科医生可以决定最适宜于具体动物的剂量方案 和施用途径。