一种修饰树突细胞以增强对抗原应答反应的方法

本发明涉及一种通过抑制树突细胞(DC)中恒定链蛋白(li)的表达来增 强其对抗原细胞应答的方法。

树突细胞(DC)是一种专门将抗原呈递给未成熟或者休眠T细胞的细胞， 因此在T细胞、B细胞免疫中都起到重要作用。由肿瘤抗原引起的DC免疫是一 种有效的诱导抗肿瘤免疫的方法。一种将DC与肿瘤抗原装载在一起的有效方法 是将DC与重组病毒载体一起转导或将其转染编码肿瘤抗原的mRNA。已有研究证 明，小鼠和人类的DC与mRNA转染在体内外都能够刺激细胞毒T淋巴细胞(CTL) 反应。用肿瘤RNA转染的DC荷瘤小鼠后，肿瘤转移降低，存活率提高。I 期临床试验中，通过利用前列腺特异性抗原(PSA)mRNA转染DC前列腺癌 症患者，患者体内的PSA特异性T细胞应答被激活。在小鼠和人体内用mRMA转 染DC来刺激免疫并产生保护性免疫的效果已经得到证实。将mRNA转染DC技术 的关键优势在于，mRNA可以从几个细胞中放大并由此有足够的，可能是无限的 抗原从少量的肿瘤组织产生。因此，用肿瘤衍生的mRNA转染的DC接种提供了 一种有效且可以广泛应用的转移癌方式，该方法不需要每个病人的相关抗 原特征，也不会受到抗原制备所需的肿瘤组织的限制。

在抗肿瘤免疫反应中，CD8+细胞毒T细胞是一个重要的效应器，诱导强有 力的CTL反应已经发展为癌症免疫的一个主要目标。然而，越来越多的证 据有力地表明，在肿瘤免疫中CD4+T细胞的反应也起到了关键作用，CD4+T 细胞为CD8+T细胞CTL的诱导，持久性和扩展提供了重要作用。此外，CD4+T 细胞通过分泌效应细胞因子，如IFN-γ，使肿瘤细胞对CTL敏感而胞溶。CD4+T 细胞在肿瘤部位刺激免疫系统并抑制局部血管生成。CD4+T细胞反应在肿瘤免 疫中的重要性已在小鼠研究中得到证明：CD4+T细胞在缺少CD8+T细胞的情况 下可以消除肿瘤。在抗肿瘤反应中，CD4+T细胞可能构成了占主导地位的效应 臂。因此，最佳的抗肿瘤免疫反应可能需要同时激活的CD4+和CD8+T细胞的免 疫反应臂。

内源表达的抗原，如DC表达的抗原与mRNA共转染，将被优先引导到I类 加工途径以激活CD8+T细胞的免疫反应臂。在细胞质内合成后被运送到溶酶体 内的抗原的亚型可产生用于装载II类分子的小肽，刺激微弱的CD4+T细胞反 应，接种mRNA转染DC通常不会产生强有力的CD4+T细胞反应。MHC I类阴性 肿瘤细胞与II类cDNA表达质粒转染增强了小鼠的抗肿瘤免疫原性，这可能是 由从呈递II类限制抗原获得的能力并刺激肿瘤特异性CD4+T细胞应答引起的。 恒定链的共表达、II类反式作用因子(CIITA)或者用IFN-γ作用于肿瘤细胞 能够废除II类转染肿瘤细胞的免疫原性。这可能是由于在许多肿瘤细胞中， CIITA的表达或者IFN-γ的孵育同时上调了II类小肽和恒定链的表达。这一结 果反映了li的自然作用是用来防止内涵体或高尔基体中内源性派生II类小肽 与新生的II类分子产生联系。这个结果与在缺少li的情况下，内源性小肽的 呈递更受到能表达II类分子的细胞青睐的结果保持一致。

已有专利公开了一种逆转录基因结构，它可与恒定链mRNA杂交并抑制其翻 译。对于抗原呈递细胞，尤其是恶性抗原呈递细胞，如白血病，淋巴瘤，黑 素瘤，该基因结构很有效性。另有专利公开了MHC II类抗原呈递细胞含有能抑制 li蛋白表达的寡核苷酸。这些方法对增强内源性抗原的MHC II类呈递很有效， 但对于抗原呈递细胞自然产生的抗原却缺乏效果。因此，需要开发一种新的能 够增强DC细胞对抗原刺激应答产生的方法，以应对各种各样的肿瘤和传染性病 原体的抗原决定簇。

本抗原搭载的DC能被用于激发对抗传染性因子和肿瘤的保护性免疫。用编 码期望得到的抗原的核酸转染DC，该DC表达的抗原能够优先进入I类处理程序 以产生有效的CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。CD4+T细胞应答的产生则 受到限制。该发明提供了一种用抗原搭载的DC来增强其对抗原刺激应答的产生 方法，该DC的恒定链表达受到抑制。

本方法所用DC可以是从病人自身提取的，也可以从配对的捐献者或者体外 细胞培养中获得。

本发明提供的可增强对抗原刺激应答的方法和反义结构可以优先刺激CD8+ T细胞应答。这是用恒定链抑制剂处理DC达到的。恒定链抑制剂包括任何可以 影响DC中li的数量和活性的试剂。Li抑制剂可能通过li的表达下降或者防止 li和MHC II类分子的相互作用来发挥作用。

通过将反义寡核苷酸或者反义结构和DC共同孵育，可以将其通过自然吸收 导入DC内。也可通过脂类/脂质体，电穿孔或者其他方式辅助吸收。

根据本发明，DC能够首先被抗原搭载，或者li抑制剂能首先被引入。或者 这两个可以同时发生。

被导入DC的li抑制剂的数量能够根据抑制剂和DC的性质决定。本领域技 术人员可以很容易地确定最佳用量。

本发明所用的DC对于目前所知的肿瘤或者防止肿瘤的形成具有很好的 疗效。免疫原性组合物包括的DC携带有能够编码一个抗原和一个li抑制剂的 核酸，还包括一个可接受的载体或者辅剂。普遍来说，在肿瘤负荷在低水平时 进行最为有效，并持续直至情况得到改善。然而，即使肿瘤已经形成 了，本发明所提供的方法仍然适用。用本发明的方法一名病人时，理想的 剂量决定于病人的体重，癌症的严重性，抗原的性质等因素。病人使用DC 的药学可接受剂量是106-107个细胞/kg体重。细胞可通过癌症常用的注射 方式注入病人体内。本领域技术人员可以通过监测患者的疾病症状，容易地确 定该患者的最佳剂量和并相应地调整手段。该手段还包括注射有 丝分裂原或者淋巴因子来增强T细胞增殖。本发明提供的方法还可用于与其他 癌症手段，如放疗、化疗等联合使用。

在本发明的一个示例性实施例中，用能够编码至少一个肿瘤抗原的mRNA转 染DC。DC可用完整的肿瘤mRNA转染。恒定链的功能或者表达被抑制，以增强 MHC II类分子相关肿瘤抗原表位的呈递。在一个实施例中，反义RNA或者RNAi 阻断了li的mRNA翻译。

本发明中的修饰的DC可能对某些自身免疫性疾病的也有效果。有文献 报道基因修饰li蛋白，如CLIP核心区域被T辅助细胞表位取代了的髓鞘碱性 蛋白，可以在体外通过HLA-DR表达细胞系处理并呈递给T细胞克隆。当修饰的 蛋白通过腹腔注射以耐受性的方式释放，该蛋白消除抗原特异T细胞增殖的能 力比消除等量的肽的能力更强。他们在体内实验中有了类似的发现，通过蛋白 的耐受诱导有效地防止蛋白质的自身免疫反应的后续演变。对自体抗原的耐受 已被证明主要是由一个被称为调节性CD25+CD4+T细胞的CD4+T细胞亚 操控的。因此，用li活性已被改变的编码自体抗原的mRNA转染DC可能对调节 性T细胞的产生是有利的。

显而易见，本发明的免疫原性组合物和方法对于人和动物的免疫应答的修 饰和疾病是有效的。本文所用的术语“免疫原性”是指在免疫应答中的移 位。某些免疫细胞的数量或者活性可能被增强或者减弱，或者有可能涉及细胞 类型的接入。

本发明还提供了一套制备DC的工具，包括抗原编码mRNA和li抑制剂，还 有促进抗原编码mRNA和li抑制剂吸收的试剂，还包含有用法指示。在一个优 选的实施方案中，使用的是肿瘤mRNA。

上述公开概括地描述了本发明。通过参考下列具体实施例可以获得更完整 的理解。描述这些实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。 拟在形式和等同替代变化的情况下可能会建议或渲染权宜。虽然本文已经采用 特定的术语，但这样的术语意在描述性的意义，而不是为了限制的目的。本发 明涉及但未清楚描述的免疫学和分子生物学方法，在科学文献中已有报道，对 于本技术领域的技术人员来说是公知的。

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1A是用流式细胞分析绿荧光蛋白(GFP)转染细胞。

图1B是将卵清蛋白(OVA)mRNA或者GFP的mRNA通过电穿孔导入DC后，DC中 的主要I类MHC限制的OVA表位的呈递。

图2A是和反义寡核苷酸(AS ODN)共同孵育以抑制DC的恒定链表达(CD74)。

图2B是用PE标记的抗CD II c和FITC标记的抗CD74，CD40，CD80，CD86或者 MHC II类抗体(I-Ab)对DC进行双染。

图3A是主要MHCII类限制的OVA表位的呈递。

图3B是通过对应的T细胞杂交瘤阐述主要MHC I类限制的OVA表位的呈递。

图4A是用OVA的mRNA转染的DC免疫小鼠以诱导CD4+T细胞应答。

图4B是用OVA的mRNA转染的DC免疫小鼠以诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)应 答。

图5A是用li的AN ODN处理的DC来免疫小鼠，以增强保护性抗肿瘤免疫力。

图5B是用TRP2mRNA，Flu M1mRNA或者B16/F10.9肿瘤RNA中任意一个，以 及li AS(AE40)或者对照ODNs(SE40)转染的DC免疫后，对肿瘤的效果。

图6是用li的AN ODN处理的DC来免疫小鼠，对肿瘤消退起到了促进作用。

实施例1

抗原的MHC I类呈递：通过电穿孔技术将GFP mRNA导入到DC中，24小时 候用流式细胞仪检测到GFP的表达。mRNA的电穿孔技术是一种在人源DC中高效 的表达和呈递抗原的方法。如图1A所示，GFP的mRNA有效地转染骨髓衍生的 小鼠DC。电压和电穿孔的持续时间影响转染效率。如图1B证明了DC中主要的 MHC I类限制的OVA肽的呈递，所用DC已用电穿孔技术将OVA mRNA或者GFP mRNA 导入胞内。用RF33.70T-杂交瘤细胞进行呈递检测。在DMRIE-C的脂质的存在 情况下进行OVA对DC的转染，或者用MHC I类限制的OVA或VSV肽进行脉冲。 如图1B显示了用编码鸡OVA cDNA的mRNA电穿孔导入DC的过程以及将主要的 OVA表位呈递给相应的T-杂交瘤细胞。通过转染的DC的OVA呈递效率与通过基 因表达检测到的电穿孔的效率相关。

实施例2

给予DC反义寡核苷酸处理以抑制其恒定链表达：用两个磷酸化修饰的反义 寡核苷酸(ODNs)抑制小鼠DC中li的表达。第7天时通过电穿孔将OVA mRNA 和50nM的li AS ODN(AE40)或者对照ODN(SE40)导入DC。48h后，用FITC 标记的抗小鼠CD74(li)抗体对细胞进行染，以检测细胞表面li的表达。结 果如图2A所示。黑直方图显示了用li AS ODN处理的结果，空白直方图则代 表对照ODN处理的结果。虚线直方图代表了用FITC标记的同种类型的抗体染 的DC。对用抗体染之前对细胞进行可渗透化处理以检测li的总表达。图2A 显示了DC与反义寡核苷酸共孵育后，其表面li(CD74)的表达量显著降低，而 对照组和ODN组则没有降低，然而在胞内和细胞表面都检测到了li的表达被部 分抑制了。用反义引物和对照ODN处理得到累死的结果。胞内和细胞表面li的 表达量的不同意味着细胞表面的转运率高于胞内。图2B显示了用PE标记的抗 CDII c和FITC标记的抗CD74，CD40，CD80，CD86或者MHCII类抗体(I-Ab)对 DC进行双染，证明了li AS ODNs的特异性。在用li特异性反义寡核苷酸与 DC共同孵育后，为检测到CD40，CD80，CD86或者MHC II类I-A被抑制。

实施例3

MHC I类和II类OVA表位的呈递：通过OVA mRNA转染DC，抑制了li的合 成，从而增强OVA的MHC II类呈递。所用DC是用OVA mRNA或者剪切的OVA mRNA (tOVA)转染的，所用tOVA的前40个核酸被剪切了。OVA mRNA转染的DC同样 与AE40或SE40共同孵育。OVA mRNA转染的DC的I类和II类表位的加工处理和 呈递是有所用的特异性针对各自表位的T杂交瘤细胞决定的。C57BL/6(H-2B) 小鼠提供了一个H-2Kb I类限制的抗原表位，以及一个I-Ab限制的II类表位。 如图3A所示，tOVA组中为检测到II类抗原表位的表达。与此相反，对于天然的 和分泌的OVA来说，II类抗原表位经过加工处理呈递给I I类限制性T-杂交瘤 细胞。将li反义引物与OVA mRNA转染的DC共同孵育，可以增强II类OVA表位 的表达，但对照组ODN无效果。如图3B所示，并未检测到反义引物对主要的OVA  I类抗原表位的表达有影响。这说明li在于DC共培养后，其表达被短暂地抑制 了，这增强了内源性OVA抗原的II类抗原表位的表达，但对I类抗原表位的表 达无影响。

实施例4

用OVA mRNA转染li的表达被抑制的DC，将该DC免疫小鼠，诱导其产生 CD4+T细胞应答和细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答：为了检测在体内环境中，抑 制li的表达能否影响OVA特异性CD4+T细胞应答的激活，用OVA mRNA转染的 DC免疫小鼠，DC用li AS ODNs或者空白对照试剂处理，使用标准增殖测定方 法检测免疫小鼠脾细胞中OVA特异性CD4+T细胞应答。图4A表示CD4+T细 胞增殖测定的结果。给小鼠静脉注射2-4×105的用OVA mRNA或者流感细胞(Flu M1)mRNA转染的DC，使其发生免疫。OVA mRNA转染的DC同样与AE40或SE40 共同孵育。8天后采集脾细胞，并分离CD4+T细胞。CD4+T细胞与I-Ab限制 的OVA258-2776或者VSV小肽脉冲的DC共培养3天。图4A说明，只有当小鼠 用li AS ODN处理的DC进行免疫，OVA mRNA转染的DC才能表现出OVA特异性 CD4+T细胞增殖反应。在体外环境中用Flu M1mRNA或对照VSV小肽转染或者 刺激DC，背景上未显示有增生，这证明了该应答的特异性。在次试验中CD4+T 细胞增殖显示出一个很高的水平，这可能代表了在FCS存在情况下培养的DC会 引起一个抗FCS应答。用li反义引物处理的DC使小鼠发生免疫，诱导其发生 CD4+T细胞应答，为了测定这是否有生理学意义，对li抑制CTL应答的促发以 及刺激肿瘤免疫的效果进行评估。CD4+T细胞协助CTL诱发的作用是有据可查 的。因此，我们开展了实验，以确定将OVA mRNA转染的DC与li AS ODNs共同 孵育是否会影响已在免疫小鼠内预处理的OVS CTL的强度。用2.5×105的OVA  mRNA转染的DC与AE40或者SE共同孵育。免疫8天后分离脾细胞，然后直接 测定OVA CTL(一次反应)，或者先在体外与OVA mRNA转染的DC共同培养，之 后再测定OVA CTL(二次反应)。如图4B所示，用li AS ODNs处理的DC组，OVA  CTL升高；用对照ODNs或者未用ODNs处理组，则无变化。

实施例5

用li AS ODN处理DC使小鼠发生免疫，对保护性抗肿瘤免疫的增强作用： 为了确认介导抑制DC中li合成的反义引物是否具有抗肿瘤免疫作用，每周用 mRNA转染的DC和如上所述的ODNs对小鼠进行两次免疫。在二次免疫10天后， 皮下注射肿瘤细胞以激发小鼠。结果如图5A和5B所示。柱表示平均每个组的 肿瘤体积。根据图5A所示，用OVA或Flu M1mRNA转染的DC去免疫小鼠，或 用PBS免疫对照组，DC用li AS ODNs(AE54或AE40)或者对照ODNs(SE46或 SE54)处理，用B16/F10.9-OVA肿瘤细胞激发。第25天时检测肿瘤体积。用OVA  mRNA转染的DC免疫的小鼠，肿瘤的生长得到了明显的抑制。用OVA mRNA转染 的DC与两种li AS ODNs共同孵育，明显增强了其抗肿瘤作用。为了检测抑制 了li的表达是否同样对自然肿瘤抗原具有抗肿瘤免疫能力，用TRP-2mRNA或 总F10.9肿瘤RNA对小鼠进行免疫，用F10.9肿瘤激发。TRP-2是B16黑素瘤 肿瘤中的一种黑素细胞特异性肿瘤抗原。用TRP2mRNA，Flu M1mRNA或者总 B16/F10.9肿瘤RNA转染的DC免疫小鼠，DC用AE40或者SE40ODNs处理，用 B16/F10.9肿瘤细胞激发。第23天时检测肿瘤体积。结果如图5B所示，用li AS  ODN与DC共同孵育，再用TRP2或者F10.9mRNA转染该DC，用该DC接种后， 抗肿瘤作用增强。

实施例6

用li AS ODN处理DC的小鼠体内肿瘤消退的增强：为了检测抑制了li的 表达是否同样能增强已发生肿瘤情况下的保护性免疫，小鼠被皮下注入3×104 的B16/F10.9肿瘤细胞，2天后用OVA或者Flu M1mRNA转染已用li AS或对照 DONs处理过的DC。肿瘤植入后第18时，测定肿瘤体积。结果如图6所示，与 用Flu M1mRNA转染的DC免疫小鼠组相比，用OVA mRNA转染的DC免疫小鼠体 内肿瘤生长得到了一直。用OVA mRNA转染已用li AS ODNs处理过的DC，会增 强其对肿瘤生长的抑制作用。

序列表