一种迁移活力增强的基因工程间充质干细胞及在干细胞、干细胞美容中的应用

本发明属于生物领域，涉及基因工程干细胞，具体涉及一种迁移活力增强的基因工程间充质干细胞及在干细胞、干细胞美容中的应用。

间充质干细胞(MSCs)是一类来源于发育早期中胚层和外胚层的多功能干细胞，具有成体干细胞的自我更新和多向分化潜能，可以分化成多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，在体内分布较广泛。MSCs在一定条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，因此在不同的组织中均存在MSCs，如脂肪、胎盘、肌肉、血液、牙髓以及脐带等。MSCs可以自身免疫性疾病、炎症和退行性疾病，且在各种动物模型中应用广泛。研究表明，MSCs具有多向分化能力、免疫调节作用、归巢能力和旁分泌作用，有助于损伤组织修复。MSCs的这些特点使其在干细胞、干细胞美容中越来越被青睐。

对于MSCs发挥上述功能的一个至关重要的特性就是其迁移活力。高迁移活力对于MSCs发挥免疫调节作用、归巢、修复损伤组织等都具有很明显的增益作用。

如何提高MSCs的迁移活力？目前主要方法包括：挑选活力高的MSCs，药物刺激增强MSCs的迁移活力，以及通过基因工程的方法改造获得迁移活力增强的MSCs。

miRNA是由19～25个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其主要参与了细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动，广泛存在于各个生物体中，miRNA的分子结构包括非编码区(UTR)及内含子间隔开的编码区。大量研究表明，miRNA在生物细胞的增殖、分化\病毒感染及肿瘤细胞增殖过程中起关键作用。miRNA的产生是由RNA聚合酶Ⅱ与DNA生成初级转录物(pri-miRNA)，pri-miRNA典型的茎环结构经过核糖核酸酶Ⅲ内切酶加工后由转运蛋白运送到细胞质，生成具有茎环结构的前体miRNA，前体miRNA在细胞质中核酸酶与RNA解旋酶的作用下生成miRNA。miRNA的作用之一为通过与信使RNA编码区及UTR的不完全互补配对，在后续的细胞生长及发育过程中起重要作用。而miRNA的另一作用为通过与靶基因3'UTR非完全配对抑制靶基因翻译(微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展，医学综述，2019年10月)。在迁移过程中miRNA也发挥了重要作用。

miR-619-5p是一种具有多种生物学功能的miRNA，在不同细胞中扮演着不同的角。宋安等发现，miR-619-5p通过调控EGFR/AKT/mTOR信号通路影响HNSCC细胞HN6的增殖能力(miR-619-5P对头颈鳞癌细胞生物学行为的影响，中华口腔医学会会议论文集，2019)。Zhaodi Guo等发现，miR-619-5p与骨髓间充质干细胞的成骨分化相关(Circular RNA Hsa_circ_0006766 targets microRNA miR-4739 to regulate osteogenic differentiationof human bone marrow mesenchymal stem cells.BIOENGINEERED.2021)。

miR-619-5p在脐带间充质干细胞中的作用尚没有研究结果公开，miR-619-5p表达水平的变化对脐带间充质干细胞的生物学行为具有何种影响尚不知道。

本发明是为了通过基因工程的方法提高MSCs的迁移活力，提供一种迁移活力增强的基因工程间充质干细胞及在干细胞、干细胞美容中的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种迁移活力增强的间充质干细胞，该间充质干细胞为miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞。划痕试验显示，miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞比普通的人脐带间充质干细胞具有明显增强的迁移活力。

上述间充质干细胞在干细胞中的应用。

上述间充质干细胞在干细胞美容中的应用。

技术效果：

本发明提供了一种miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞，该人脐带间充质干细胞比普通的人脐带间充质干细胞具有明显增强的迁移活力。本领域技术人员知道，人脐带间充质干细胞的迁移活力强弱对其发挥干细胞、干细胞美容等功能都至关重要。因此，本发明提供的人脐带间充质干细胞在干细胞、干细胞美容方面会具有更好的应用效果和前景。

图1为倒置显微镜下观察到的人脐带间充质干细胞形态，呈长梭形，旋涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点。

图2为各组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p的表达水平(上图为柱状图，下图为琼脂糖凝胶电泳图)；与blank组比，miR-619-5p组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p表达水平明显提高，miR-NC组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p表达水平无明显差异。

图3为各组划痕后0、12h观察到的细胞迁移情况，miR-619-5p组人脐带间充质干细胞的迁移活力明显强于blank组和miR-NC组。

图4为多向分化诱导染结果，miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞在成骨、成脂和成软骨诱导液诱导下成骨、成脂和成软骨分化，维持良好的多向分化能力。

一、试验材料

胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司。青链霉素购自Sigma公司。

流式测定使用的标记的CD44、CD90、CD73、CD105、CD34、CD45购自BD公司。

miR-619-5pmimics、miR-619-5p negative control购自上海吉玛基因。RT-PCR引物委托上海吉玛基因设计合成。

LipofectamineTM3000购自ThermoFisher Scientific公司。

TRIzol试剂、miRNA提取试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。

OneStep RT-PCR Kit试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。

二、试验方法

1、人脐带间充质干细胞分离培养

取足月顺产的新生儿脐带，剥离动脉和静脉血管，剪成约1mm3大小的组织块。将组织块铺在25cm2培养瓶中，加入含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM/F12培养基，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，细胞爬出融合约60％时，弃去组织块，待细胞融合约90％时，胰蛋白酶消化，待镜下观察细胞收缩并悬浮时加入DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞悬液，1000×g离心8min，收获沉淀，加入完全培养基重悬。将原代细胞1:1传代至新的培养瓶中，即为第1代人脐带间充质干细胞，每3d换液1次，当细胞融合约90％时胰酶消化，按1:2传代，即为第2代、第3代，以此类推。取第4代人脐带间充质干细胞，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照；经流式细胞仪进行细胞表型鉴定，CD44、CD90、CD73、CD105抗原阳性表达且CD34、CD45抗原阴性表达，进行后续实验。

2、分组和转染

将第4代人脐带间充质干细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，取生长状态良好的细胞，随机分为：

miR-619-5p组：转染miR-619-5p mimics；

miR-NC组：转染miR-619-5p negative control；

blank组：不转染。

转染操作按照LipofectamineTM3000说明书进行，转染6h后更换新鲜培养基，转染48h进行后续实验。

3、RT-PCR反应

先用TRIzol试剂裂解各组人脐带间充质干细胞，再采用miRNA提取试剂盒提取RNA。根据OneStep RT-PCR Kit试剂盒说明书进行RNA反转以及PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：5×QIAGEN One Step RT-PCR Buffer 10μL，dNTP Mix 2μL，上下游引物各1μL，RNA 1μg，QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix 2μL，RNase-free water补足50μL。扩增条件为50℃反转录30min，PCR预变性95℃15min(变性94℃30s，退火56℃60s，延伸72℃60s，共40个循环)，终延伸72℃10min。以GAPDH为内参。引物序列参考文献(LncRNA ILF3-AS1Promotesthe Progression of Colon Adenocarcinoma Cells Through the miR-619-5p/CAMK1DAxis.OncoTargets and Therapy.2021)设计，具体如下：

miR-619-5p上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGCGGGGTTTTGAGGGCG-3’

miR-619-5p下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’

GAPDH上游引物：5’-CACATCGCTCAGACACCATG-3’

GAPDH下游引物：5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’

按照2—△△Ct法计算各组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p相对表达水平。

4、迁移活力测定

转染48h后长满6孔板，用200μL的移液器头在6孔板各孔中央位置垂直于培养板划一道划痕，使各孔的细胞划痕宽度一致。PBS轻轻漂洗细胞一次，用含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下继续培养。划痕后0、12h观察细胞迁移情况并拍照记录，比较各组细胞迁移活性。

5、多向分化诱导实验

5.1成骨分化诱导

取miR-619-5p组转染48h后的人脐带间充质干细胞，消化后以5×104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔加入2mL成骨诱导液(含10％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C、1％青链霉素的DMEM/F12培养基)，期间每隔3d更换1次诱导液，第14天进行茜素红染，显微镜下观察矿化结节形成情况。

5.2成脂分化诱导

取miR-619-5p组转染48h后的人脐带间充质干细胞，消化后以5×104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔加入2mL成脂诱导液(含10％胎牛血清、1μmol/L地塞米松、60μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、1％青链霉素的DMEM/F12培养基)，期间每隔3d更换1次诱导液，第14天进行油红O染，显微镜下观察脂滴。

5.3成软骨分化诱导

取miR-619-5p组转染48h后的人脐带间充质干细胞，消化后以5×104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔加入2mL成软骨诱导液(武汉普诺赛生命科技有限公司提供的商品化人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基)，期间每隔3d更换1次诱导液，第14天进行甲苯胺蓝染，显微镜下观察染情况。

6、统计学处理

实验数据采用SPSS20.0软件进行分析。实验数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

三、试验结果

1、人脐带间充质干细胞分离培养结果

倒置显微镜下观察到的人脐带间充质干细胞形态如图1所示，呈长梭形，旋涡状生长，符合人脐带间充质干细胞的生长特点；CD44、CD90、CD73、CD105抗原阳性表达且CD34、CD45抗原阴性表达，符合人脐带间充质干细胞的表型特点。

2、转染结果

各组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p的相对表达水平见表1和图2。与blank组比，miR-619-5p组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p表达水平明显提高，miR-NC组人脐带间充质干细胞中miR-619-5p表达水平无明显差异。

表1 miR-619-5p相对表达水平

3、迁移活力测定结果

从图3可以看出各组划痕后0、12h观察到的细胞迁移情况，miR-619-5p组人脐带间充质干细胞的迁移活力明显强于blank组和miR-NC组。

4、多向分化能力测定结果

多向分化诱导染结果见图4，miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞在不同诱导液诱导下分化成不同细胞，维持良好的多向分化能力。

由上述实验结果可知，miR-619-5p高表达的人脐带间充质干细胞比普通的人脐带间充质干细胞具有明显增强的迁移活力，同时依然维持良好的多向分化能力。与普通的人脐带间充质干细胞相比，上述特点决定了本发明提供的人脐带间充质干细胞在干细胞、干细胞美容方面会具有更好的应用效果和前景。

上述实施例仅仅用于具体介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。