转基因自然杀伤细胞及其制备方法和应用

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种转基因自然杀伤细胞及其产生方法 及包含转基因自然杀伤细胞的药物制剂。

自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫中重要的效应细胞，在预防病毒感染和抑制癌 症发展中起重要作用。NK细胞对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且具有非MHC限制性，其对肿瘤 细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。

正常细胞由于其表面的自身MHC-I类分子与NK细胞表面的抑制受体结合，向NK细 胞传递抑制性信号，控制其杀伤功能。肿瘤细胞MHC-1下调，使得其对NK细胞的细胞毒性作 用敏感。但是由于肿瘤逃逸机制的存在，肿瘤细胞在丢失或变构经典的MHC-I类分子(HLA- A、HLA-B、HLA-C)的同时可高表达非经典MHC-I类分子(如HLA-G、HLA-E)，研究发现黑素 瘤、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌组织均表达高水平的HLA-G分子，这种高表达的HLA-G分子可 与抑制性受体KIR结合，导致Src家族蛋白酪氨酸激酶使ITIM序列磷酸化，从而暴露出蛋白 酪氨酸磷酸酶SHP的特异性锚定位点，SHP的募集抑制近膜端酪氨酸的磷酸化，致使经由蛋 白酪氨酸激酶转导的激活性受体的信号被显著抑制，从而抑制NK细胞的杀伤作用。

因此，NK细胞癌症效果有限的关键问题是NK细胞靶向肿瘤细胞杀伤特异性 差，以及其表达抑制性受体导致肿瘤免疫逃逸。抑制性KIR在调节NK细胞活化中发挥重要作 用，因此用以减弱KIR功能的策略可能强化NK细胞在癌症中的活性。SHP磷酸酶是 NK细胞中一系列的抑制性受体的共同信号转导效应分子，因此抑制SHP磷酸酶的作用，能够 阻滞抑制性KIR的功能，从而避免肿瘤免疫逃逸，增强体内NK细胞的抗肿瘤作用。

间皮素(Mesothelin，简称Meso)是一种分子量为40kDa的细胞表面糖蛋白，高表达 于多种恶性实体肿瘤组织中，已有研究表明Meso在TNBC细胞表面有较高的表达水平，但同 时Meso在正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中也有少量表达。

尽管如今出现了一些含有与Meso特异结合的特异受体的转基因NK细胞，但是由于 肿瘤逃逸机制的存在，使得该转基因NK细胞的杀伤作用受到了抑制，使得肿瘤细胞发生了 逃逸，降低了当前转基因NK细胞的杀伤效果。

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种转基因自然杀伤细 胞及其制备方法，以解决当前转基因自然杀伤细胞由于肿瘤逃逸机制导致肿瘤细胞发生了 逃逸，其杀伤作用受到了抑制的技术问题。

本发明实施例的另一目的在于提供一种肿瘤药物制剂，以解决现有采用NK细胞的 生物肿瘤药物制剂疗效不佳的技术问题。

为了实现上述发明目的，作为本发明的一方面，提供了一种转基因自然杀伤细胞。 所述转基因自然杀伤细胞包括靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因和沉默NK细胞酪 氨酸磷酸酶SHP基因。

相应地，本发明实施例提供了一种转基因自然杀伤细胞的制备方法。所述转基因 自然杀伤细胞包括如下步骤：

将NK细胞被第一慢病毒和第二慢病毒同时感染；所述第一慢病毒含有靶向间皮素 抗原特异性嵌合抗原受体基因，所述第二慢病毒含有沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因。

作为本发明的另一方面，提供了一种肿瘤药物制剂。所述肿瘤药物制剂包括本发 明自然杀伤细胞或者由本发明制备方法制备的自然杀伤细胞。

与现有技术相比，本发明转基因自然杀伤细胞由于含有靶向间皮素抗原特异性嵌 合抗原受体基因，使得本发明转基因自然杀伤细胞具有靶向肿瘤细胞特异杀伤性。所含的 沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因能够阻滞本发明转基因自然杀伤细胞抑制性受体功能发 挥作用，避免肿瘤的免疫逃逸。因此，通过所含的靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因 和沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因共同作用，使得本发明转基因自然杀伤细胞具有特异 性靶向识别肿瘤细胞的能力，避免肿瘤的免疫逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

本发明转基因自然杀伤细胞制备方法通过含有靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原 受体基因的第一慢病毒和含有沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因的第二慢病毒对NK细胞感 染，使得感染得到的转基因自然杀伤细胞具有靶向Meso特异性结合域，保证了本发明转基 因自然杀伤细胞对肿瘤特异性识别与杀伤；同时应用RNA干扰技术沉默NK细胞的酪氨酸磷 酸酶SHP，在提高NK细胞靶向肿瘤细胞特异杀伤性的同时阻滞其抑制性受体功能发挥作用， 避免肿瘤的免疫逃逸，增强了本发明转基因自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，而且本 发明制备方法对NK细胞感染率高。

本发明肿瘤药物制剂由于含有本发明转基因自然杀伤细胞，因此，本发明肿瘤药 物制剂对肿瘤具有特异性识别与杀伤，同时能够有效避免肿瘤的免疫逃逸，从而使得本发 明肿瘤药物制剂对肿瘤细胞的杀伤活性高。

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例人工构建的Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因结构图；

图2为本发明实施例入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒酶 切产物的电泳图；

图3为本发明实施重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ转 化菌落PCR电泳条带图；

图4为本发明实施例入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA质粒酶切产物的电泳结果图；

图5为本发明实施例重组慢病毒表达质粒pLenti6.3-siRNA转化菌落PCR产物的电 泳结果图；

图6为本发明实施实时荧光定量PCR检测例SHP基因表达对比图；

图7为本发明实施例NK细胞体外杀伤三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的流式检测 图。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种转基因自然杀伤细胞(即是转基因NK细胞)，更 具体的说是蛋白酪氨酸磷酸酶基因沉默的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。 本发明实施例转基因自然杀伤细胞包括靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因和沉默 NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因。因此，本发明实施例转基因自然杀伤细胞可以表示为Meso- CAR-SHP-siRNA-NK。其中，该沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因更确切的说是沉默NK细胞抑 制性受体如KIP下游酪氨酸磷酸酶SHP基因。由于本发明实施例转基因自然杀伤细胞由于含 有靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因和沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因，这样，本 发明实施例转基因自然杀伤细胞(Meso-CAR-SHP-siRNA-NK)具有针对肿瘤Meso抗原特异性 嵌合域，该抗原特异性嵌合域可靶向Meso抗原，激发NK细胞活化，使得本发明转基因自然杀 伤细胞具有靶向肿瘤细胞特异杀伤性。沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因能够抑制SHP磷酸 酶的表达，以实现降低SHP磷酸酶的含量或者不表达，从而间接实现抑制性受体功能发挥作 用，避免肿瘤的免疫逃逸，并增强本发明实施例转基因自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活 性。

其中，在一实施例中，所述靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因设于Meso/ scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段中。在具体实施例中，所述靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原 受体基因是由含有Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段的病毒感染至NK细胞中，其中， Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段可由下文Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段构建方 法获得。

在另一实施例中，所述沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因由靶向SHP基因的siRNA 提供。当用靶向SHP基因的siRNA正义/反义序列获得的PCR产物经过电泳后，获得2.5kb和 0.1kb条带基因片段，该2.5kb和0.1kb条带基因片段为沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因。 在具体实施例中，所述靶向SHP基因的siRNA的正义、反义序列如下：

正义SHP-siRNA序列为：

5’-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-TCAAGAG-TCTTCTTGAGTATGCTG GGC-TTTTTT-3’；—— SEQ ID NO 1

反义SHP-siRNA序列为：

5’-AAAAAA-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-CTCTTGA-TCTTCTTGAG TATGCTGGGC-3。—— SEQ ID NO 2

由上文所述可知，本发明实施例转基因自然杀伤细胞通过含有靶向间皮素抗原特 异性嵌合抗原受体基因和沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因共同作用，使得本发明转基因 自然杀伤细胞具有特异性靶向识别肿瘤细胞的能力，阻滞本发明转基因自然杀伤细胞抑制 性受体功能发挥作用，避免肿瘤的免疫逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

另一方面，在上文所述的本发明实施例转基因自然杀伤细胞的基础上，本发明实 施例还提供了本发明实施例转基因自然杀伤细胞一种制备方法。本发明实施例制备方法包 括以下步骤：

将NK细胞被第一慢病毒和第二慢病毒同时感染。

其中，所述第一慢病毒含有上文所述的靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基 因。在一实施例中，所述第一慢病毒按照如下方法制备获得：

S11：将Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段与入门载体混合，以使所述Meso/ scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ 基因片段的入门载体；

S12：将所述带有Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段的入门载体与慢病毒质粒混 合重组，以建立间皮素抗原特异性NK细胞受体表达质粒；

S13：将所述间皮素抗原特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒、共转染293T 细胞，获得第一慢病毒。

步骤S11中，Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段获得方法包括如下步骤：

S111：获取Meso抗原免疫总cDNA；

S112：将所述Meso抗原免疫总cDNA与Meso抗体重链可变区VH引物和轻链可变区VL 引物进行PCR，获得Meso VH和Meso VL基因片段；

S113：将所述Meso VH与Meso VL基因片段采用连接肽连接，获得Meso抗体scFv基 因片段；

S114：将所述Meso抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-Meso/sc Fv质 粒；

S115：将按照CD8α、CD28及CD3ζ基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-CD28-CD3ζ 表达框克隆进所述pcDNA-Meso/sc Fv质粒，获得pcDNA-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒，酶 切后获得Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段。

其中，步骤S112中的Meso抗体重链可变区VH引物和轻链可变区VL引物可以根据重 链可变区VH和轻链可变区VL序列按照引物设计原则进行设计，在具体实施例中，重链可变 区VH的引物为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，轻链可变区VL的引物为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6。

SEQ ID NO：3：

5'-AGG T(G/C)(A/C)A(A/G)C TGC AG(G/C)AGT C(A/T)GG-3'；

SEQ ID NO：4：

5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3'；

SEQ ID NO：5：

5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3'；

SEQ ID NO：6：

5'-CCC TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3'。

步骤S113中的连接肽可以是采用的连接肽，针对该重链可变区VH和轻链可变区VL 序列特性，在本实施例中，选用连接肽(Gly4Ser)3，其碱基序列如下SEQ ID NO：7：

5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3'

步骤S114中的pcDNA载体可以是pcDNA载体系列中常用的载体，在具体实施例中， pcDNA载体为pcDNA3.1(+)。

步骤S115中的CD8α、CD28及CD3ζ基因序列可以直接从基因库(Genebank(NCBI))中 获取。根据CD8α、CD28及CD3ζ基因序列设计合成嵌合抗原受体的Hinge-TM-CD28-CD3ζ表达 框，包括较链区(Hinge)和跨膜区(TM)CD8α(aa135-205)、CD28胞内功能区(aa180-220)及 CD3ζ(aa52-163)。因此，Hinge-TM-CD28-CD3ζ表达框也即是CD8-CD28-CD3ζ表达框。另外，合 成Hinge-TM-CD28-CD3ζ表达框可以是按照常规的合成方式合成，如由深圳华大基因科技有 限公司合成该CD8-CD28-CD3ζ表达框。另外，在一实施例中，Hinge的5’端和CD3ζ的3’端可以 分别添加限制性酶切位点BamH I和XhoI，因此，酶切获得Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片 段的过程中，可以直接用Hind III/Xho I酶进行酶切。

另外，在步骤S11中，作为具体实施例，入门载体可以但不仅仅为pENTR/D-TOPO。

上述步骤S12中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，如但不仅仅选用 pLenti6.3/V5-DEST。

上述步骤S13中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如但不仅仅选用 ViraPowerTM包装质粒。

上文转基因自然杀伤细胞制备方法中的所述第二慢病毒含有上文所述的沉默NK 细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因，具体是沉默NK细胞抑制性受体如KIP下游酪氨酸磷酸酶SHP基 因。

在一实施例中，所述第二慢病毒按照如下方法制备获得：

S21：将靶向SHP基因的siRNA正义和反义序列退火处理，再将所述退火处理获得退 火产物与入门载体混合，以使所述退火产物嵌入所述入门载体，而获得带有靶向SHP基因的 siRNA的入门载体；以及

S22：将所述带有靶向SHP基因的siRNA的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立 siRNA慢病毒表达质粒；

S23：将所述siRNA慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，获得第二慢 病毒。

其中，步骤S21中，SHP基因序列引自基因库(Genbank)(序列号：NM_021969.2)。

siRNA正义和反义序列按照siRNA设计原则设计。如应用在线设计软件(http:// www.invivogen/sirnawizard/design.php)来寻靶序列。设计siRNA时不针对5'和3' 端的非编码区，分析获得的序列，选择GC含量在40％-55％之间的靶基因序列作为潜在优选 序列，进而应用BLAST软件(Basic Local Aligllnlent Search Tool)剔除与其他编码序列 同源的siRNA，最后使用RNA结构分析软件(RNAstructure 4.6)分析二级结构，将对应基因 序列位于二级结构的siRNA筛除，最后选出一对siRNA作为目的siRNA。同时选取一对保证与 SHP mRNA没有同源性又与其他基因无同源性的siRNA作为阴性对照。两对siRNA分别命名为 SHP-siRNA和NC-siRNA。结构设计模式为：Sense-loop(TCAAGAG)-Antisense-终止信号。

在具体实施例中，设计的靶向SHP基因的siRNA正义和反应序列如上文所述的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。

在具体实施例中，步骤S21中的退火处理条件为95℃持续1min，72℃持续2min，37 ℃持续2min，25℃持续2min,共两个循环，再缓慢降至4℃。

在具体实施例中，步骤S21中的入门载体可以但不仅仅为pENTR/D-TOPO。

上述步骤S22中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，如但不仅仅选用 pLenti6.3/V5-DEST。

上述步骤S23中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如但不仅仅选用 ViraPowerTM包装质粒。

另外，上述转基因自然杀伤细胞制备方法中的第一慢病毒和第二慢病毒同时感染 NK细胞可以按照正常的慢病毒感染方法进行感染。

因此，本发明实施例转基因自然杀伤细胞制备方法通过含有靶向间皮素抗原特异 性嵌合抗原受体基因的第一慢病毒和含有沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因的第二慢病毒 对NK细胞感染，使得感染得到的转基因自然杀伤细胞具有靶向Meso特异性结合域，保证了 本发明转基因自然杀伤细胞对肿瘤特异性识别与杀伤；同时应用RNA干扰技术沉默NK细胞 的酪氨酸磷酸酶SHP，在提高NK细胞靶向肿瘤细胞特异杀伤性的同时阻滞其抑制性受体功 能发挥作用，避免肿瘤的免疫逃逸，增强了本发明转基因自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤 活性，而且本发明制备方法对NK细胞感染率高。

又一方面，基于上文本发明实施例转基因自然杀伤细胞及其制备方法，本发明实 施例还提供了一种肿瘤药物制剂。所述肿瘤药物制剂包括NK细胞。其中，所述NK细胞为上文 所述的本发明实施例转基因自然杀伤细胞或由上文本发明制备方法制备的转基因自然杀 伤细胞。这样，该肿瘤药物制剂由于含有本发明转基因自然杀伤细胞，由于如上文所述的， 本发明实施例转基因自然杀伤细胞具有靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因，即是具 有可靶向Meso特异性结合域，从而使得本发明肿瘤药物制剂具有靶向肿瘤细胞特异杀伤 性，所含的沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因能够阻滞本发明转基因自然杀伤细胞抑制性 受体功能发挥作用，避免肿瘤的免疫逃逸。因此，本发明肿瘤药物制剂对肿瘤具有特异性识 别与杀伤，同时能够有效避免肿瘤的免疫逃逸，从而使得本发明肿瘤药物制剂对肿瘤细胞 的杀伤活性高。

另外，在本发明实施例肿瘤药物制剂中所含的转基因自然杀伤细胞的含量或者给 药剂量应该是有效剂量的，具体地，该有效剂量是指有效量，是指足以对个体显示益处 或临床意义的本发明的化合物的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及 给药时程将取决于被的疾病的性质和严重性、被的受试者的年龄和一般状况以及 给药方式等。

理所当然的是，在上述药用制剂中还可以包含药学上可接受的载体。在具体实施 例中，该药学上可接受的载体是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何辅 料。

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实验步骤

1.表达Meso抗原特异性scFv-CD8-CD28-CD3ζ嵌合受体的慢病毒

1.1获取Meso抗原免疫小鼠总cDNA

利用Meso抗原对BALB/C小鼠进行免疫，效价符合要求(1:100000以上)时，处死小 鼠，取脾脏，用Trizol法提取小鼠脾脏总RNA。

采用iScript cDNA Synthesis Kit合成总cDNA，反应体系如下表1所示：

表1

试剂 体积

5×iScript reaction mix 4μl

iScript reverse transcriptase 1μl

Nuclease-free water 5μl

总RNA 10μl

总体积 20μl

反应条件：25℃5min→42℃30min→85℃5min→4℃hold。

1.2Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因的获取Meso抗体重链可变区VH及 轻链可变区VL引物序列如下表2所示：

表2

引物名称 引物序列 SEQID NO

VH-F 5'-AGG T(G/C)(A/C)A(A/G)C TGC AG(G/C)AGT C(A/T)GG-3' 3

VH-R 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3' 4

VL-F 5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3' 5

VL-R 5'-CCC TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3' 6

PCR反应体系如下表3所示：

表3

试剂 体积

Taq DNA聚合酶 0.25μl

10×PCR Buffer 5μl

dNTPs(2.5mM) 4μl

Meso抗原免疫小鼠总cDNA 1μl

VH-F(20μM) 1μl

VH-R(20μM) 1μl

ddH 2O 补充至50μl

反应条件如下：94℃预变性5min，94℃45s，60℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃ 延伸5min。

1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因 PCR产物。

1.3Meso抗体scFv片段及质粒的获取

通过多基因片段重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)将1.2中得到的 Meso VH和Meso VL片段用连接肽(Gly4Ser)3(碱基序列：5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3')(SEQID NO 7)连接起来，得到Meso抗体scFv 片段，并在前后端分别引入酶切位点Hind III/BamH I。OE-PCR反应条件如下：(1)步骤1：95 ℃预变性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7个循环，72℃延伸10min；(2)步骤2：95℃ 预变性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。

1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收Meso抗体sc Fv片段，Hind III/BamH I双酶切 回收的片段和pcDNA3.1(+)载体，利用T4DNA连接酶将Meso抗体scFv片段与pcDNA3.1(+)载 体连接，获得pcDNA3.1(+)-Meso/scFv质粒。

1.4Meso抗原特异性scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段的构建

按照Genebank(NCBI)中CD8α、CD28及CD3ζ基因序列设计合成嵌合抗原受体的 Hinge-TM-CD28-CD3ζ表达框，包括较链区(Hinge)和跨膜区(TM)CD8α(aa135-205)、CD28胞 内功能区(aa180-220)及CD3ζ(aa52-163)，在Hinge的5’端和CD3ζ的3’端分别添加限制性酶 切位点BamH I和XhoI，委托深圳华大基因科技有限公司合成整个表达框。

将合成的CD8-CD28-CD3ζ表达框用BamH I/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-Meso/ scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒，然后Hind III/Xho I酶切后 获得Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段，基因结构图如图1所示。

1.5Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ入门克隆的构建

1.51Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ入门克隆TOPO连接反应体系如下表4所示：

表4

Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段 0.5μl

盐溶液 1μl

ddH 2O 3.5μl

pENTR TM/D-TOPO vector 1μl

总体积 6μl

TOPO克隆反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温(21-23℃)下孵育5min。 孵育结束后将反应体系置于冰上以进一步转化感受态细胞，进行扩大培养并提取pENTRTM/ D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒。

1.52入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ的酶切鉴定

1.521酶切体系(Not I/Asc I双酶切体系)如下表5所示：

表5

1.522酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h。

1.523取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入 门克隆是否正确。若入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ正确，Not I/Asc I双酶切得到两条分别为1.7kb和2.5kb的片段。

1.6pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ慢病毒表达质粒的构建

1.61LR反应

LR反应是入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ和目的载体 pLenti6.3/V5-DEST vector发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti6.3/ V5/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ。LR反应体系如下表6所示：

表6

入门克隆pENTR TM/D-TOPO/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ(150ng/反应) 1-7μl

pLenti6.3/V5-DEST vector(150ng/μl) 1μl

TE Buffer，pH 8.0 加至总体积8μl

冰上解冻LR Clonase^TMII Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反
应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。

加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。

1.62LR反应产物的转化

1.621在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻；

1.622加入2-3μl LR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液吹 打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min；

1.623加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基；

1.624将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h；

1.625取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养 箱中孵育过夜。

1.63阳性克隆的筛选与扩增

1.631用头分别少量蘸取3个克隆后，将头置于10μl无菌水中，反复吹打；

1.632吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下表7所示：

表7

菌液 1μl

VH-F引物(20μM) 1μl

V5反向引物(20μM) 1μl

Bio-rad super mix 6.25μl

ddH 2O 15.75μl

总体积 25μl

PCR反应条件如下：

1.633三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.7kb处得到清晰的单 一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养；

1.634用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中 分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ，同时保存菌 种。

1.7pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ慢病毒的制

1.71Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清， 用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+ 1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；

1.72Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的I培养液
(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；

1.732000复合物的制备：

1.731将1.5ml无血清的I培养液加入5ml离心管中，加入9μg
ViraPower^TM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti6.3//Meso/scFv-CD8-CD28-CD3
ζ，轻柔混合；

1.732将1.5ml无血清的I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min；

1.733将1.731和1.732两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀；

1.734室温下孵育20min，得到2000复合物。

1.74将得到的2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并
轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；

1.75 Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培 养箱中孵育48-72h；

1.76 Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g 离心15min；

1.77吸取上清液，收集pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ慢病毒，分装入1ml 冻存管中，置于-80℃长期保存。

2.靶向SHP基因的siRNA慢病毒载体构建与慢病毒制备

2.1靶向SHP基因的siRNA设计

SHP基因序列引自Genbank(序列号：NM_021969.2)，根据siRNA的设计原则，应用在 线设计软件(http://www.invivogen/sirnawizard/design.php)来寻靶序列。设计 siRNA时不针对5'和3'端的非编码区，分析获得的序列，选择GC含量在40％-55％之间的靶 基因序列作为潜在优选序列，进而应用BLAST软件(Basic Local Aligllnlent Search Tool)剔除与其他编码序列同源的siRNA，最后使用RNA结构分析软件(RNAstructure 4.6) 分析二级结构，将对应基因序列位于二级结构的siRNA筛除，最后选出一对siRNA作为目的 siRNA。同时选取一对保证与SHP mRNA没有同源性又与其他基因无同源性的siRNA作为阴性 对照。两对siRNA分别命名为SHP-siRNA和NC-siRNA。结构设计模式为：Sense-loop (TCAAGAG)-Antisense-终止信号。所有序列由深圳华大基因科技有限公司合成。

序列如下：

SHP-siRNA sense：

5’-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-TCAAGAG-TCTTCTTGAGTATGCTG GGC-TTTTTT-3’—— SEQID NO 1

SHP-siRNA antisense

5’-AAAAAA-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-CTCTTGA-TCTTCTTGAGT ATGCTGGGC-3—— SEQID NO 2

NC-siRNA sense：

5’-TGGTCTTCATTCAATAAGT-TCAAGAG-ACTTATTGAATGAAGACCA-TTTTTT-3’——SEQID NO 8

NC-siRNA antisense：

5’-AAAAAA-TGGTCTTCATTCAATAAGT-CTCTTGA-ACTTATTGAATGA AGACCA-3——SEQID NO 9

2.2单链Oligos序列的退火

将两条互补的单链oligos序列退火形成双链DNA结构。退火体系：将寡核苷酸片段 用TE Buffer稀释成l00nmol/ml，两条寡核苷酸片段各取5μl混合加入PCR管中。退火反应： 95℃持续1min，72℃持续2min，37℃持续2min，25℃持续2min,共两个循环，再缓慢降至4℃ 后放-20℃保存备用。

2.3siRNA入门克隆的构建

2.31siRNA入门克隆TOPO连接反应体系如下表8所示：

表8

Oligos退火产物 0.5μl

盐溶液 1μl

ddH 2O 3.5μl

pENTR TM/D-TOPO vector 1μl

总体积 6μl

TOPO克隆反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温(21-23℃)下孵育5min。 孵育结束后将反应体系置于冰上以进一步转化感受态细胞，进行扩大培养并提取pENTRTM/ D-TOPO-siRNA质粒。

2.32入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA的酶切鉴定

2.321酶切体系(Not I/Asc I双酶切体系)如下表9所示：

表9

2.322酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h；

2.323取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入 门克隆是否正确。若入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA正确，Not I/Asc I双酶切得到两条分 别为2.5kb和0.1kb的片段。

2.4pLenti6.3-siRNA慢病毒表达质粒的构建

2.41LR反应

LR反应是入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA和目的载体pLenti6.3/V5-DEST vector 发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti6.3-siRNA。LR反应体系如下表10所 示：

表10

入门克隆pENTR TM/D-TOPO-siRNA(150ng/反应) 1-7μl

pLenti6.3/V5-DEST vector(150ng/μl) 1μl

TE Buffer，pH 8.0 加至总体积8μl

冰上解冻LR Clonase^TMII Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应
体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h；

加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。

2.42LR反应产物的转化

2.421在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻；

2.422加入2-3μl LR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液吹 打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min；

2.423加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基；

2.424将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h；

2.425取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养 箱中孵育过夜。

2.43阳性克隆的筛选与扩增

2.431用头少量蘸取3个克隆后，将头置于10μl无菌水中，反复吹打；

2.432吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下表11所示：

表11

菌液 1μl

siRNA sense引物(20μM) 1μl

V5反向引物(20μM) 1μl

Bio-rad super mix 6.25μl

ddH 2O 15.75μl

总体积 25μl

反应条件如下：

2.433三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在0.1kb处得到清晰的单 一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养；

2.434用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中 分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti6.3-siRNA，同时保存菌种。

2.5pLenti6.3-siRNA慢病毒的制备

2.51Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清， 用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+ 1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；

2.52Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的I培养液
(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；

2.532000复合物的制备：

2.531将1.5ml无血清的I培养液加入5ml离心管中，加入9μg
ViraPower^TM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti6.3-siRNA，轻柔混合；

2.532将1.5ml无血清的I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min；

2.533将2.531和2.532两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀；

2.534室温下孵育20min，得到2000复合物。

2.54将得到的2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并
轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；

2.55Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培 养箱中孵育48-72h；

2.56Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g 离心15min；

2.57吸取上清液，收集pLenti6.3-siRNA慢病毒，分装入1ml冻存管中，置于-80℃ 长期保存。

3.SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞的制备及扩增

3.1分离基因分型HLA-A2+健康志愿者PBMC细胞

3.11抽取HLA-A2+的健康志愿者外周血25ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)； 吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自 体血浆4℃保存备用；

3.12取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装 有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15min)；

3.13吸取白膜层细胞，加入到装有5ml RPMI 1640的50ml离心管中；

3.14RPMI 1640洗涤两次(600g，10min离心)，收集细胞即为PBMC细胞。

3.2嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)的制备

3.21用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆 的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、 37℃、5.0％CO2培养箱中培养；

3.22每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的 Alys505培养液；

3.23第7天，将NK细胞分成6组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中， 100μl/孔，每组设三个复孔；

第1组：只转染Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因，命名为Meso-CAR组；

第2组：只转染SHP-siRNA，命名为SHP-siRNA组；

第3组：只转染NC-siRNA，命名为NC-siRNA组；

第4组：转染Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因和SHP-siRNA，命名为Meso-CAR-SHP- siRNA组；

第5组：转染Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因和NC-siRNA，命名为Meso-CAR-NC- siRNA组；

第6组：空白对照组，命名为NC组。

3.24根据上述分组，按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)加入 含有慢病毒颗粒的原液，进行分组转染，各组取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成 100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。NC组加入100μl Alys-505完全 培养基；

3.25组分别加入终浓度为6μg/ml的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37 ℃，5％CO2培养箱中孵育24h；

3.26第8天，各组细胞分别取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，分别用200μl Alys- 505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液；

3.27第10天，收获成熟的各组细胞用于后续分析。

4.实时荧光定量PCR检测表达情况

4.1细胞总RNA的提取(按照Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)

4.11收集上述第2、3、6组细胞，于1000rpm离心5分钟，去除上清，在细胞沉淀物中 加入1ml Trizol裂解液，反复吹打或剧烈震荡使细胞充分裂解，然后转移至新的EP管中，在 室温15-30℃下静置5分钟；

4.12加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，振荡15s使其充分混匀，在室温下静置10分钟；

4.13于4℃低温离心机离心，12000rpm，15分钟；

4.14用吸管吸取上层水相0.5ml上清转移至另一备用的1.5ml EP管中，同时加入 0.5ml预冷的异丙醇，充分混匀后于4℃放置10分钟；

4.15于4℃，12000rpm离心10分钟后，小心弃去上清液，可见在管壁底部附着有少 量白片状物即为RNA；

4.16加入1ml 75％用DEPC处理过的新鲜配制的乙醇，洗涤沉淀；

4.17垂直震荡后于4℃，10000rpm离心5分钟，倒掉大部分上清；

4.18于4℃，10000rpm再次离心5分钟，吸去上清；

4.19室温干燥；

4.110待RNA基本透明时，加入20μl DEPC处理过的水，至沉淀物完全溶解，紫外分 析测定所抽提RNA的浓度。

4.2逆转录合成cDNA

以提取的各组细胞RNA为模板，根据miScript逆转录试剂盒操作步骤，逆转录体系 如下：

漩涡震荡混匀后，至PCR仪上反应，反应条件：37℃15min，85℃5s。

4.3Real-time PCR

4.31Real-time PCR检测所用引物如下表12：

表12

序号 引物名称 引物序列 SEQID NO

1 GAPDH-F CAGCGACACCCACTCCTC 10

2 GAPDH-R TGAGGTCCACCACCCTGT 11

3 SHP-F CAAGAGGAGAAGGGTTG 12

4 SHP-R GACTCGTCATACTCCTGC 13

4.32反应体系如下：

混匀各管混合物，置于荧光定量PCR仪中，两步法real-time PCR，程序：95℃2min， 1个循环；95℃15s，65℃50s，40个循环。得出各组扩增曲线和溶解曲线进行统计学分析。

5.SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞体外抗肿瘤活性检测

5.1以上述各组细胞作为效应细胞，CFSE标记的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞作 为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀，置于5％CO2，37℃培养箱 中孵育。

5.2 24h后，加入1μg/ml PI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检 测CFSE+PI+细胞(死亡的MDA-MB-231细胞)的百分率。

6.SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞动物体内抗肿瘤活性检测

取对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，胰酶消化后制成单细胞 悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1ml于裸鼠肩胛部皮下注射。实验分组及情况见表 11，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量裸鼠体重，观察体重变化情况； 隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体 积＝1/12π×a×b2。第(3)组结束后第13天计算各组裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1- 组肿瘤平均体积/阴性对照组肿瘤平均体积)×100％。

表13实验分组及情况

*FAC化疗方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；环磷酰胺500mg/M2，第一天给 药，21天一个疗程。

7.实验结果

7.1入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ的酶切鉴定

入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒经过Not I/Asc I双酶 切，经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在2.5kb和1.7kb处有清晰条带，如图2所示，与预期结果一 致。证明Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因正确插入到pENTRTM/D-TOPO载体中。

7.2重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ转化菌落PCR结果

随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的正向引物和V5反向引物进行PCR扩增，产 物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1.7kb处出现清晰的条带，如图3所示，说明Meso/scFv-CD8- CD28-CD3ζ基因成功插入到pLenti6.3/V5-DEST表达载体中。

7.3入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA的酶切鉴定

入门克隆pENTRTM/D-TOPO-siRNA质粒经过Not I/Asc I双酶切后得到的产物经琼 脂糖凝胶电泳检测，分别在大约2.5kb和0.1kb处有清晰条带，如图4所示，与预期片结果一 致。证明siRNA正确插入到载体中。

7.4重组慢病毒表达质粒pLenti6.3-siRNA转化菌落PCR产物的电泳结果

随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的正向引物和V5反向引物进行PCR扩增， PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，在0.1kb处出现清晰的条带，如图5所示，说明siRNA成功 插入到pLenti6.3/V5-DEST表达载体中。

7.5实时荧光定量PCR检测SHP基因表达结果

利用SHP和GAPDH引物所扩增出的基因片段，经比照扩增曲线，各样品均已进入扩 增平台期，说明反应条件设定准确，熔解曲线分析未见杂峰，说明扩增产物单一，没有非特 异性扩增。与NC组相比，NC-siRNA组和SHP-siRNA组中SHP基因的表达水平分别相当于在NC 组表达水平的99.5％和35.6％，如图6所示。

7.6NK细胞体外杀伤三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的流式检测结果

以各组细胞作为效应细胞，用CFSE标记三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，作为靶细 胞，应用流式细胞术检测NK细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤效率，实验结果如图7所示。Meso- CAR组细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为36.27％，SHP-siRNA组细胞对MDA-MB-231细胞 的杀伤率约为29.19％，NC-siRNA组细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为19.28％，Meso- CAR-SHP-siRNA组细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为70.15％，Meso-CAR-NC-siRNA组细 胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为37.01％，NC组细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为 20.38％，显示SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤效率远远高 于其余各组细胞的杀伤效率。说明本专利制备的SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞对 三阴性乳腺癌细胞具有高效的杀伤作用。

7.7SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞体内抑制三阴性乳腺癌的实验结果

SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞进行体内抗肿瘤实验发现，各组裸鼠均存 活，以阴性对照组裸鼠为参照，化疗组裸鼠体重下降，肿瘤体积减小，但进食及活动减少

SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞组裸鼠存活状况较为良好体重无明显 下降，且肿瘤体积明显较小，抑瘤率达到71.2％。体重情况和肿瘤抑制率统计结果见表14。 实验结果说明本专利制备的SHP基因沉默的Meso特异性CAR-NK细胞能够有效抑制体内肿瘤 的生长。

表14各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率的比较

分组 裸鼠体重(g) 肿瘤体积(cm 3) 抑瘤率(％)

(1)阴性对照组30只 21.56±1.25 6.31±1.57 /

(2)单纯化疗组30只 19.32±1.42 2.78±0.64 56.0

(3)Meso-CAR-SHP-siRNA-NK组30只 21.23±1.67 1.84±0.72 71.2

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。