测定血清中氨含量的液体单体试剂及其制备方法和应用

本发明涉及一种检测氨含量的试剂,尤其涉及测定血清中氨含量的单体 试剂, 本发明进一步涉及该单体试剂的制备方法及其在检测血清中氨 含量的应用,属于血清中氨含量的检测领域.

正常人体内游离血氨含量极低，正常值是（10‑47）μmol/L。血氨按 其来源可分为内源性氨和外源性氨。内源性氨主要来源于体内蛋白质 在代谢过程中产生的氨基酸以及经脱氨作用分解而来的氨，外源性氨 主要来源于蛋白质类食物在肠道内的细菌分解。肝脏是主要参与除氨 的器官，因此，发生氨代谢障碍性疾病，如肝性昏迷、肝性脑病、重 型肝炎、尿毒症等，由于氨不能正常代谢排出体外而引起血氨升高； 高血氨含量有神经毒性，血氨的测定对于肝硬化门脉高压、肝昏迷、 Reye's 综合症及儿科的一些先天性代谢紊乱等病的诊断、观察和预 后诊断有重要意义。

测定血清中氨含量的实验方法通常有微量扩散法、比法、离子交换 法、氨电极法和酶法等。谷氨酸脱氢酶法较其他方法操作简便，适用 于自动生化分析仪，其反应原理是：氨在谷氨酸脱氢酶的作用下与α ‑KG和NADH反应，生成L‑谷氨酸和NAD+，通过监测NADH的下降速率，与 同样处理的校准液比较，可计算出血清中氨的含量。

应用于临床诊断的AMM试剂盒多为谷氨酸脱氢酶法，存在单、双、三试 剂等多种液体剂型及干片制剂。试剂盒的主要难点是试剂的稳定性， 尤其是NADH的稳定性问题。NADH作为常用的还原性辅酶，在340nm有最 强吸收峰，在体外诊断试剂中常被作为原。但它在水溶液中不稳定 ，容易发生氧化还原反应，从而使试剂效期变短，难于在医院推广使 用。血氨干片制剂很好地解决了液体剂型稳定性差的缺点，但试剂制 备时需要冻干过程，应用时需要复溶过程，较为繁琐，也增加了试剂 成本。

申请号为200610030784.8的中国发明专利公开了一种还原性辅酶复合 稳定剂，涉 及到缓冲液、稳定剂、有机溶剂、螯合剂、防腐剂和无机盐等复合稳 定剂，对还原性辅酶NADH和NADPH具有高度稳定性；申请号为0011178 8.2的中国发明专利公开了可稳定还原性辅酶Ⅰ和还原性辅酶Ⅱ的试剂 ，加入金属离子螯合剂，可在更宽pH值条件下，阻止NADH和NADPH的氧 化。

但在血氨检测的液体试剂尤其是单试剂中，单靠这些稳定剂的加入并 不能保证水溶液中NADH或NADPH长时间（至少18个月）的稳定，难于在 各大医院推广使用。申请号为200410043900.0的中国发明专利申请公 开了一种酶法测定血氨的干粉试剂，稳定期达两年；申请号为200410 041963.2的中国发明专利申请公开了一种液体试剂，采用不同的酶反 应原理，但并未涉及到试剂的有效期。因此目前缺乏一种保存效期长 的血氨检测液体单试剂。

本发明的主要目的是提供稳定性好、保存效期长的血氨检测液体单试 剂；

本发明的另一目的是提供一种制备所述血氨检测液体单试剂的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种血氨检测液体单试剂，包括：缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二 酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶 、稳定剂。

血氨测定是NADH的降反应，谷氨酸脱氢酶控制此主反应的反应速度； 应用谷氨酸脱氢酶反应系统，将还原性辅酶（NADH）氧化成氧化性辅 酶（NAD+），通过测定还原性辅酶在主波340nm下的下降率直接反应血 氨含量。因还原性辅酶在溶液中稳定性不好，易被氧化成NAD+，导致 试剂空白吸光度下降较快，效期变短，难于在临床上推广使用；有鉴 如此，本发明在血氨检测单试剂中引入NADH再生系统，使单体试剂中 被氧化的NAD+再次转化为NADH，通过调节谷氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢 酶的酶活比例及反应时间，可使此再生反应不影响主反应进行，试剂 测值准确，并能保持长时间的稳定。再生系统中葡萄糖脱氢酶的酶促 反应会导致NADH浓度的升高，且葡萄糖脱氢酶对谷氨酸脱氢酶具有一 定的抑制作用，因此不合适的酶比例会影响检测结果，控制两种酶的 浓度比例是制备出测值准确且稳定性好的试剂的关键。本发明通过大 量的试验最终确 定，当单体试剂中谷氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶的酶活比例在3‑3000 ：1的范围内，能够有效确保还原性辅酶在溶液中稳定性，进而保证最 终测定结果的准确性。

为了达到更好的技术效果，每1升单体试剂中各组分的用量或浓度优选 为：缓冲液50‑200mM、谷氨酸脱氢酶500‑40000 U、α‑酮戊二酸2‑3 0 mM、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）0.1‑0.4 mM、葡萄糖 1‑500 mM、葡萄糖脱氢酶5‑1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的0. 05‑5%；余量为蒸馏水。

所述缓冲液包括但不仅限于三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、3‑(环己 胺)‑2‑羟基‑1‑丙磺酸(CAPSO)缓冲液、3‑(环己胺基)丙磺酸（CAPS） 缓冲液、吗啉代丙烷磺酸（MOPS）缓冲液或N‑三(羟甲基)甲基‑3‑氨基 丙烷磺酸（TAPS）缓冲液中的至少一种；所述缓冲液的浓度优选为50 ‑200mM；所述缓冲液的pH优选为7.0‑11.0，更优选为8.0‑9.6。

本发明单体试剂中所述稳定剂包括但不限于牛血清白蛋白、乙二醇、 甘油、EDTA钠/钾盐或TritonX‑100中的任意一种或多种。

本发明的另一目的是提供一种制备所述血氨检测液体单试剂的方法， 包括以下步骤：

将缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂溶解于蒸馏水中，其中 ，每1升单体试剂中各组分的用量或浓度控制为：缓冲液50‑200mM、谷 氨酸脱氢酶500‑40000 U、α‑酮戊二酸2‑30 mM、还原型烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸（NADH）0.1‑0.4 mM、葡萄糖1‑500 mM、葡萄糖脱氢酶 5‑1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的0.05‑5%；余量为蒸馏水。

本发明的另一目的是提供了一种应用所述血氨检测液体单试剂检测血 清中血氨含量的方法，包括：将待检测样品加入到血氨检测液体单试 剂进行反应；将反应物置于紫外/可见分光光度计或半、全自动生化分 析仪上，检测340nm波长下吸光度的下降，计算血氨含量。

其中待检测样品与血氨检测液体单试剂比例在1/100‑1/10之间；所述 的反应时间优选为1‑20分钟，可在20‑45℃范围内检测，最优温度为3 7℃。

例如在奥林巴斯AU400全自动生化仪上，设定参数为： 样本与试剂比 例为 20:200，主波340nm，副波410nm，反应方向为降反应，读点设为1‑10 点，方法学为终点法。

37℃和42℃加速破坏试验和临床相关性试验表明，本发明所制备的血 氨液体单试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻干和复溶的繁琐问题 ，可现配现用，（2‑8）℃可稳定18个月，测值准确，适用于手动、半 自动、自动检测系统，易于在各大医院推广使用。

从临床相关性曲线可以看出，本发明所制备的血氨液体单试剂与Dial ab试剂测值相关性良好，因此本发明所制备的血氨测定液体单试剂稳 定，测值准确度高。

图1 本发明实施例1所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相 关性曲线。

图2 本发明实施例2所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相 关性曲线。

图3 本发明实施例3所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相 关性曲线。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明 的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换 ，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1  血氨检测液体单试剂的制备

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解于 蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表1所示。

表1

组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.5） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 8000U

葡萄糖脱氢酶 200U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 40

实施例2  血氨检测液体单试剂的制备

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解于 蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表2所示。

表2

组分 浓度

Tris缓冲液（pH9.0） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 600U

葡萄糖脱氢酶 200U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 3

实施例3  血氨检测液体单试剂的制备

将CAPSO缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解 于蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表3所示。

表3

组分 浓度

CAPSO（pH9.2） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 15000U

葡萄糖脱氢酶 5U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 3000

实施例 4 血氨检测液体单试剂的制备

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解于 蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表4所示。

表4

试剂R组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.2） 100mM

α‑酮戊二酸 6mM

NADH 0.29mM

葡萄糖 10mM

谷氨酸脱氢酶 10000U

葡萄糖脱氢酶 100U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.4%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶 100

实施例5  血氨检测液体单试剂的制备

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、牛血清白蛋白和甘油溶解 于蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表5所示。

表5

试剂R组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.6） 150mM

α‑酮戊二酸 10mM

NADH 0.32mM

葡萄糖 20mM

谷氨酸脱氢酶 15000U

葡萄糖脱氢酶 10U

牛血清白蛋白 0.1%

甘油 2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶 1500

对比实施例1

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）和稳定剂TritonX‑100溶解于蒸馏水中；每1升单体试 剂中各组分的用量或浓度为表6所示。

表6

组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.5） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

谷氨酸脱氢酶 8000U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

对比实施例2

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）和稳定剂TritonX‑100溶解于蒸馏水中；每1升单体试 剂中各组分的用量或浓度为表7所示。

表7

试剂R组分 浓度

Tris缓冲液（pH9.0） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 025mM

谷氨酸脱氢酶 600U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

对比实施例3  血氨检测液体单试剂的制备

将CAPS缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）和稳定剂TritonX‑100溶解于蒸馏水中；每1升单体试 剂中各组分的用量或浓度为表8所示。

表8

组分 浓度

CAPS（pH9.6） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

谷氨酸脱氢酶 15000U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

对比实施例4  血氨检测液体单试剂的制备

将CAPSO缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH）和稳定剂TritonX‑100溶解于蒸馏水中；每1升单体 试剂中各组分的用量或浓度为表9所示。

表9

组分 浓度

CAPSO缓冲液（pH9.2） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

谷氨酸脱氢酶 9000U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

对比实施例5

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解于 蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表10所示。

表10

组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.5） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 80U

葡萄糖脱氢酶 40U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 2

对比实施例6

将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解于 蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表11所示。

表11

组分 浓度

Tris缓冲液（pH8.8） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 40U

葡萄糖脱氢酶 40U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 1

对比实施例7  血氨检测液体单试剂的制备

将CAPSO缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解 于蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表12所示。

表12

组分 浓度

CAPSO缓冲液（pH9.6） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 9300U

葡萄糖脱氢酶 3U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 3100

对比实施例8  血氨检测液体单试剂的制备

将CAPSO缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH）、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX‑100溶解 于蒸馏水中；每1升单体试剂中各组分的用量或浓度为表13所示。

表13

组分 浓度

CAPSO缓冲液（pH9.2） 50mM

α‑酮戊二酸 20mM

NADH 0.25mM

葡萄糖 5mM

谷氨酸脱氢酶 10500U

葡萄糖脱氢酶 3U

牛血清白蛋白 0.1%

TritonX‑100 0.2%

谷氨酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶氢酶 3500

试验例1  本发明血氨检测液体单体试剂的稳定性试验

1、试验材料

（1）供试材料：实施例1‑5所制备的血氨检测液体单体试剂；

（2）对照材料：对比实施例1‑8所制备的试剂；

2、试验方法

将供试材料及对照材料各自置于37℃和42℃进行加速破坏实验，定期 取出测定质控，比较试剂稳定性，两个水平的质控均按照北京利德曼 生化股份有限公司已注册的血氨质控品的配制规程自配，经验证质控 稳定性良好，有效期在24个月。在进行加速破坏试验的两周内质控于 （2‑8）℃闭盖保存，稳定性良好。

3、试验结果

试验结果见表14‑16。

表14

表15

表16

从表14‑16的数据可见：37℃、42℃分别加速破坏14天、3天，实施例 1‑3试剂测定质控值较稳定，而对比实施例所制备的试剂在37℃、42℃ 破坏试验进行中测值出现不同程度的下降，从Blank的下降速度也可判 定实施例1‑3试剂中NADH降解速度较 慢，远远低于其对照试剂的降解速度。按照通常法则，生物试剂在37 ℃每稳定1天，相当于在（2‑8）℃稳定1.5月，42℃每稳定1天，相当 于在（2‑8）℃稳定5‑6个月，因此本发明的液体单试剂在（2‑8）℃可 稳定至少18个月。

由37℃和42℃加速破坏试验和临床相关性试验表明，根据本发明提供 的制备方法制备的血氨液体单试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻 干和复溶的繁琐问题，可现配现用，（2‑8）℃可稳定18个月，测值准 确，适用于手动、半自动、自动检测系统，易于在各大医院推广使用 。

试验例2  血氨检测液体单体试剂的临床相关性试验

1、试验材料

（3）供试材料：实施例1‑5所制备的血氨检测液体单体试剂；

（4）对照材料：外购Dialab血氨测定试剂；

2、试验方法

将供试材料和对照材料同时测定50例临床病人样本，进行临床相关性 试验。

3、试验结果

试验结果见表17及图1‑3。

表17

从表4的测值及图1‑3的临床相关性曲线可以看出，实施例1‑3所制备的 血氨测定液体单试剂与Dialab试剂测值相关性良好，因此本发明所制 备的血氨测定液体单试剂稳定，测值准确度高。