一种铁皮石斛组培接种方法

一种铁皮石斛组培接种方法

技术领域

本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及一种铁皮石斛组培接种方法。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）为兰科石斛属多年生草本植物，野生铁皮石斛主要分布在浙江、安徽、江西、广西等地。铁皮石斛的种子构造独特，无胚乳，自然繁育率极低，加之人们对野生资源的疯狂采挖，野生铁皮石斛资源已经濒临灭绝。随着现代生物组培技术的发展，现在铁皮石斛种苗的人工繁育技术已经逐渐成熟。目前工厂化的铁皮石斛种苗繁育，一般采用铁皮石斛果荚为种源，经过人工播种培养基，令种胚萌发后，经过瓢种、单苗转接、壮苗、生根四个阶段约8-10个月的培养即可得到铁皮石斛成品组培苗。在单苗转接、壮苗、生根三个阶段转接过程中，需要人工用接种镊子将种苗一一频繁转接到新的培养基中，在转接过程中需要耗费大量的劳动力和原料，工序繁琐、效率低下，导致生产成本居高不下。另外在转接过程中，如果力度控制不当，在夹取幼苗时会造成苗体物理损伤，导致苗体生长缓慢、叶片黄化、整体失绿死亡等情况，严重影响种苗的成活率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种简单、高效的的铁皮石斛组培接种方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种铁皮石斛组培接种方法，包括以下步骤：

1）铁皮石斛果荚的选择：选择露天仿野生栽培3-6年生的铁皮石斛所结并生长110-130天所形成的成熟未开裂果荚；

2）种胚播种：将铁皮石斛果荚在超净工作台上经质量百分比浓度为65-75%的酒精消毒12-15min后，再将果荚内的种胚播种到无菌烧杯中；

3）无菌种胚混合液的制备：在步骤2）的无菌烧杯中加入无菌水并搅拌，将种胚分散在无菌水中，分散度为60-100个/mL，得到无菌种胚混合液；

4）萌发生根培养基的配制：以1/2MS培养基作为基础培养基，以该基础培养基的体积计，向该基础培养基中添加下列添加物：萘乙酸0.7-0.9mg/L、活性炭0.2-0.5g/L、6-苄氨基腺嘌呤0.05-0.2mg/L、椰汁50-80g/L、去皮香蕉30-50g/L、大米20-30g/L、蔗糖25-35g/L和琼脂5.8-6.3g/L，得到萌发生根培养基，并将该萌发生根培养基的pH值调至6.0~6.2，之后将配制的萌发生根培养基分装到带透气孔的650mL组培瓶中，每个组培瓶的灌液深度为3-4cm，然后将各个组培瓶在高压灭菌锅内于121℃灭菌20-23min，冷却后备用；

5）种胚的接种与培养：将无菌种胚混合液用无菌移液器接种到萌发生根培养基中，每个组培瓶的接种量为800-1000μL，再用无菌涂布棒涂平，将组培瓶的瓶盖旋紧，接种完成；之后将各个组培瓶于22-24℃下暗处理5-7天，然后在每日光照强度为1200-1500Lux、光照时间为10-11h的培养环境下培养30-40天，最后在每日光照强度为2500-3000Lux、光照时间为12-13h的培养环境下培养若干天，直至种胚萌发并得到铁皮石斛组培苗。

MS基础培养基是目前使用最普遍的培养基，其组成包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、肌醇等等，1/2MS基础培养基即大量元素变为原来的1/2的培养基，可以自制或者选择市售产品。

优选地，步骤3）中，种胚的分散度的确定方法为：用移液移取1mL无菌种胚混合液，用无菌水稀释10倍后，对种胚进行计数，确定其分散度，若分散度不满足60-100个/mL的要求，则向无菌烧杯中补充种胚或无菌水，直至分散度满足要求。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明铁皮石斛组培接种方法，是一种简单、高效的组培接种方法，该方法经过一次诱导萌发生根培养基接种于培养种胚，不需要进行反复的转接，并且本发明方法配制的萌发生根培养基以天然抑菌添加物为主，无有害化学成分添加，从而能够有效解决传统人工逐颗接种调试时间长、工作量大、污染率高、生产出的种苗稳定性差的问题，本发明方法可大幅降低铁皮石斛组培过程中的污染率，降低铁皮石斛的组培成本；本发明铁皮石斛组培接种方法使铁皮石斛组培接种效率和移栽成活率大幅提高，生产效率是传统方法的3-4倍，移栽成活率可达92-93%以上。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1的铁皮石斛组培接种方法，包括以下步骤：

1）铁皮石斛果荚的选择：选择露天仿野生栽培3年生的铁皮石斛所结并生长110天所形成的成熟未开裂果荚；

2）种胚播种：将铁皮石斛果荚在超净工作台上经质量百分比浓度为65%的酒精消毒12min后，再将果荚内的种胚播种到无菌烧杯中；

3）无菌种胚混合液的制备：在步骤2）的无菌烧杯中加入无菌水并搅拌，将种胚分散在无菌水中，分散度为60-70个/mL，得到无菌种胚混合液；

4）萌发生根培养基的配制：以1/2MS培养基作为基础培养基，以该基础培养基的体积计，向该基础培养基中添加下列添加物：萘乙酸(NAA)0.75mg/L、活性炭0.3g/L、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.08mg/L、椰汁50g/L、去皮香蕉35g/L、大米22g/L、蔗糖25g/L和琼脂5.8g/L，得到萌发生根培养基，并将该萌发生根培养基的pH值调至6.0，之后将配制的萌发生根培养基分装到带透气孔的650mL组培瓶中，每个组培瓶的灌液深度为3cm，然后将各个组培瓶在高压灭菌锅内于121℃灭菌20min，冷却后备用；

5）种胚的接种与培养：将无菌种胚混合液用无菌移液器接种到萌发生根培养基中，每个组培瓶的接种量为800μL，再用无菌涂布棒涂平，将组培瓶的瓶盖旋紧，接种完成；之后将各个组培瓶于22℃下暗处理5天，然后在每日光照强度为1200-1500Lux、光照时间为10-11h的培养环境下培养30天，最后在每日光照强度为2500-3000Lux、光照时间为12-13h的培养环境下培养130天后，得到铁皮石斛组培苗，组培苗分布均匀、苗体健壮，移栽成活率为92.3%，变异率为零。

实施例2的铁皮石斛组培接种方法，包括以下步骤：

1）铁皮石斛果荚的选择：选择露天仿野生栽培5年生的铁皮石斛所结并生长120天所形成的成熟未开裂果荚；

2）种胚播种：将铁皮石斛果荚在超净工作台上经质量百分比浓度为70%的酒精消毒14min后，再将果荚内的种胚播种到无菌烧杯中；

3）无菌种胚混合液的制备：在步骤2）的无菌烧杯中加入无菌水并搅拌，将种胚分散在无菌水中，分散度为75-85个/mL，得到无菌种胚混合液；

4）萌发生根培养基的配制：以1/2MS培养基作为基础培养基，以该基础培养基的体积计，向该基础培养基中添加下列添加物：萘乙酸(NAA)0.8mg/L、活性炭0.35g/L、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.075mg/L、椰汁65g/L、去皮香蕉40g/L、大米25g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.0g/L，得到萌发生根培养基，并将该萌发生根培养基的pH值调至6.1，之后将配制的萌发生根培养基分装到带透气孔的650mL组培瓶中，每个组培瓶的灌液深度为3.5cm，然后将各个组培瓶在高压灭菌锅内于121℃灭菌22min，冷却后备用；

5）种胚的接种与培养：将无菌种胚混合液用无菌移液器接种到萌发生根培养基中，每个组培瓶的接种量为900μL，再用无菌涂布棒涂平，将组培瓶的瓶盖旋紧，接种完成；之后将各个组培瓶于23℃下暗处理6天，然后在每日光照强度为1200-1500Lux、光照时间为10-11h的培养环境下培养32天，最后在每日光照强度为2500-3000Lux、光照时间为12-13h的培养环境下培养118天后，得到铁皮石斛组培苗，组培苗分布均匀、苗体健壮，移栽成活率为93.2%，变异率为零。

实施例3的铁皮石斛组培接种方法，包括以下步骤：

1）铁皮石斛果荚的选择：选择露天仿野生栽培6年生的铁皮石斛所结并生长130天所形成的成熟未开裂果荚；

2）种胚播种：将铁皮石斛果荚在超净工作台上经质量百分比浓度为75%的酒精消毒14min后，再将果荚内的种胚播种到无菌烧杯中；

3）无菌种胚混合液的制备：在步骤2）的无菌烧杯中加入无菌水并搅拌，将种胚分散在无菌水中，分散度为90-100个/mL，得到无菌种胚混合液；

4）萌发生根培养基的配制：以1/2MS培养基作为基础培养基，以该基础培养基的体积计，向该基础培养基中添加下列添加物：萘乙酸(NAA)0.9mg/L、活性炭0.4g/L、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.1mg/L、椰汁75g/L、去皮香蕉45g/L、大米30g/L、蔗糖33g/L和琼脂6.2g/L，得到萌发生根培养基，并将该萌发生根培养基的pH值调至6.2，之后将配制的萌发生根培养基分装到带透气孔的650mL组培瓶中，每个组培瓶的灌液深度为4cm，然后将各个组培瓶在高压灭菌锅内于121℃灭菌23min，冷却后备用；

5）种胚的接种与培养：将无菌种胚混合液用无菌移液器接种到萌发生根培养基中，每个组培瓶的接种量为1000μL，再用无菌涂布棒涂平，将组培瓶的瓶盖旋紧，接种完成；之后将各个组培瓶于24℃下暗处理5天，然后在每日光照强度为1200-1500Lux、光照时间为10-11h的培养环境下培养35天，最后在每日光照强度为2500-3000Lux、光照时间为12-13h的培养环境下培养115天后，得到铁皮石斛组培苗，组培苗分布均匀、苗体健壮，移栽成活率为93.5%，变异率为零。

以上实施例1-3的步骤3）中，可以采用以下方法确定种胚的分散度：用移液移取1mL无菌种胚混合液，用无菌水稀释10倍后，对种胚进行计数，确定其分散度，若分散度不满足60-100个/mL的要求，则向无菌烧杯中补充种胚或无菌水，直至分散度满足要求。