保护肝脏及增进身体免疫调节功能的樟芝萃取物胶囊用途

技术领域

本发明涉及一种保护肝脏及增进身体免疫调节功能的樟芝萃取物胶囊用途。

背景技术

现有的樟芝人工萃取物，因所含多醣体及三萜类的成份不一样，对于护肝功能及对身体免疫功能的作用，可以发挥多大的效用，没有确实的实验以为证明，此乃樟芝萃取物有待改进的缺点。

发明内容

本发明所要解决的主要技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，而提供一种保护肝脏及增进身体免疫调节功能的樟芝萃取物胶囊用途，本发明在非特异性免疫功能试验中，具有促进腹腔吞噬细胞活性、调节抗肿瘤细胞激素分泌及促进血清抗体生成的免疫调节功能的作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

(一)护肝试验

本试验以四氯化依体重100g投0.2ml为标准喂药量，每周投予2次，共八周，试验组于开始试验前1天，每日经口投予本樟芝一次，直到实验终了，Wi star雄性大鼠由乐斯科生物科技股份有限公司提供，饲育温度22±2℃，照明时间12小时(07:00开灯，19:00熄灯)，饲料为福寿牌老鼠饲料，自由摄食，饮水为经逆渗透纯水机处理的饮用水，亦自由供饮，试验动物经过2周的驯化检疫，最后筛选健康且体重正常增重的动物，做试验使用。

肝如果受伤害，肝细胞内的GOT及GPT会漏出来，使血清中的GOT和GPT活性上升，其中GPT为肝的专一性指标，这是肝的静态指针，肝受伤发炎，也会启动肝的再生，使肝重量增加，肝含水增加，肝纤维化会影响脾脏的血流量使脾脏肿大，这些均可用来测定肝是否受伤害或纤维化。

而肝合成蛋白质的功能则可借测定肝合成的血浆中白蛋白或者肝中可流性蛋白质的含量而得知肝的能力如何。

本试验以四氯化碳诱发慢性肝炎，以服用樟芝实验，并以Silymarin药物对照服用效果，经过八周的实验，由表一看出，GPT有显著的降低，由1396U/L降至784U/L，由表三看出，肝蛋白质由149mg/g tissue升至183mg/g tissue，显示本发明的保肝效果显著。

(二)特异性免疫试验

由于免疫功能在正常或是某些疾病都扮演一个重要的关是，因此需正确地评估试剂的免疫功能调节，就需要建立动物模式或是人体的臨床试验来加以评估。特异性免疫功能评估试验，是喂食BALB/c小鼠测试物质及注射卵蛋白(ovalbumin，OVA)后，分别测定免疫细胞增生能力及血清抗体浓度等。因此在评估免疫细胞的功能时，应该分别由质与量兩方面来加以分析。量方面主要是测定各种免疫细胞的數目，目前利用荧光流体计數仪可以很容易地将免疫细胞正确地计算出。由特异性免疫反应相关指标，来评估试剂可得完整而 具体的免疫调节功能。

本发明在经过连续十周口服喂食试验物质予BALB/c小鼠后，分别测定免疫细胞增生能力及血清抗体生成。经由试验结果显示如下：

免疫细胞增生能力方面(表四)：正对照组脾脏细胞以LPS刺激，其免疫细胞增生能力显著高于对照组。试验物质低、中、高剂量和正对照组脾脏细胞以OVA刺激，其免疫细胞增生能力显著高于对照组。

血清抗体生成方面(表五)：试验前、第一次致敏前及第二次致敏前，各剂量组及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白G，和对照组无差异性存在；各剂量组及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白M，和对照组无差异性存在；各剂量组及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白E，和对照组无差异性存在。牺牲时，高剂量与正对照组的OVA专一性免疫球蛋白G，显著高于对照组；正对照组的OVA专一性免疫球蛋白M，显著高于对照组；各剂量组及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白E，和对照组无差异性存在。

依据前述结果显示，本发明在特异性免疫功能试验中，具有促进免疫细胞增生能力及血清特异性抗体生成的免疫调节功能的作用。

(三)非特异性免疫试验

此试验目的为借由非特异性免疫反应指标，以评估试验物质的非特异性免疫调节功能。由于免疫功能在正常或是某些疾病都扮演一个重要的关是，因此若要正确地评估试验物质的免疫功能调节，就需要建立动物模式或是人体的临床试验来加以评估。非特异性免疫功能评估试验，是在喂食试验物质后分别测定免疫细胞增生能力、自然杀手细胞活性、腹腔吞噬细胞活性、细胞表面标记、细胞激素分泌能力及血清抗体浓度等。因此在评估免疫细胞的功能时，应该分别由质与量两方面来加以分析。量方面主要是测定各种免疫细胞的数目，目前利用荧光流体计数仪可以很容易地将免疫细胞正确地计算出。质的方面，由非特异性免疫反应相关指标，来评估试验物质的完整而具体的免疫调节功能。

此试验为测试本发明在非特异性免疫调节功能上是否有其功效。在经过连续六周口服喂食试验物质予BALB/c小鼠后，分别测定腹腔吞噬细胞活性、细胞激素分泌能力及血清抗体生成等。经由试验结果显示如下：

腹腔吞噬细胞活性方面(表六)：在MOI等于5的比例下，试验物质中、高剂量和正对照组的腹腔吞噬细胞活性显著高于对照组。

细胞激素分泌功能方面(表七)：试验物质低、中、高剂量和正对照组脾脏细胞以LPS刺激，其TNF-d的分泌显著高于对照组。试验物质中剂量和正对照组脾脏细胞以Con A刺激，其IFN-γ的分泌显著高于对照组。

血清抗体生成方面(表八)：牺牲时，低、中、高剂量及正对照组的免疫球蛋白G，显著高于对照组。

依据前述结果显示，本发明在非特异性免疫功能试验中，具有促进腹腔吞噬细胞活性、调节抗肿瘤细胞激素分泌及促进血清抗体生成的免疫调节功能的作用。

(四)安全性测试：

1.沙门氏菌回复突变试验

2.体外哺乳类细胞染体结构异常试验

3.啮齿类外围血液微核试验

4.90天亚慢性大鼠口服投予试验

5.大鼠致畸胎毒性试验

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明护肝试验的方块流程图

图2是本发明特异性及非特异性免疫试验的方块流程图

具体实施方式

本发明的较佳实施例如下所述：

(一)护肝试验

试验组别与投予剂量：

1.剂量计算：本发明建议剂量为每天4颗，每颗500mg。成人每天用量为500mg×4＝2000mg/day。大鼠口服剂量依据实验动物与人体表面积比等效剂量换算比率计算。大鼠200公克与70公斤人的表面积比值为0.018，因此大鼠每天的剂量为2000mg×0.018＝0.036g/200gbody weight，即180mg/kg。本试验使用的剂量为每天投予180、540、1080mg/kg，分别为人体剂量的1、3、6倍。控制组大鼠给予同体积的0.5％carboxymethyl cellulose(CMC)。对照药物silymarin(sigma)使用剂量为200mg/kg。

2.试验物质配制：临用时，将胶囊解开，倒出粉末，以0.5％CMC分别配成浓度为18、54及108mg/ml的悬浮液，经口投予、投予体积为每100公克大鼠体重投与1毫升。对照药物silymarin悬浮于0.5％CMC，配制浓度为20mg/ml。

3.试验设计：试验物质于第一次四氯化碳溶液投予前一天开始投予，而后每日投予直至大鼠牺牲前一天止，投予时间为每日下午1:00-1:40。每周两次经口投予四氯化碳溶液，于第一次及第三次投予时，大鼠先绝食一晚，其它投予时不绝食。四氯化碳投予时间为早上8:00-8:40。于四氯化碳投予后满一、三、六周时，大鼠在乙醚麻醉下由尾动脉抽血，供血浆生化值检定。第八周采血时，大鼠也同时牺牲，迅速取下肝脏及脾脏，以冰冷生理食盐水洗净后，吸干水分，称重。最大叶肝脏分成两部分，相同的部位分别(1)浸于10％中性福马林溶液，供病理切片使用，(2)称重后在100OC完全烘干供胶原蛋白含量测定。其余肝脏分装4袋，储存于-800C备用。每周称体重一次，做为当周投予试验物质的体重依据。四氯化碳溶于橄榄油配制成20％的溶液，每次投予量为0.2ml/100g body weight。

4.实验结果：

(1)对血清GOT、GPT及albumin值的影响(表一)

大鼠投予四氯化碳的后，第一、三、六及八周的血浆GOT、GPT值均显著高于控制组。于第一至第八周，樟芝(540、1080mg/kg)处理的大鼠，其血浆GPT及GOT值低于四氯化碳组。Silymarin处理的大鼠对第一至第八周的血浆GOT、GPT值皆没有影响。大鼠投予四氯化碳的后，第六、八周的血浆albumin、值较正常控制组低。樟芝处理的大鼠对第六周血浆albumin值没有影响，樟芝(1080mg/kg)处理的大鼠可以增加第八周血浆albumin值。Silymarin处理的大鼠对第六、八周的血浆albumin值没有改善作用。

表一：第八周樟芝对CC14诱发大鼠慢性肝炎GOT、GPT及Albumin值的影响

All values are means±S.D.(n＝10).###P＜0.001 compared withcontrol group.

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 compared with CC14+CMC group.

(2)对肝脏、脾脏重量及肝脏含水量的影响(表二)

大鼠投予四氯化碳的后，最后的肝脏及脾脏重量较控制组高。樟芝和silymarin处理组的肝脏的重量与四氯化碳组比较没有差异。樟芝(1080mg/kg)处理组其脾脏重量明显低于四氯化碳组。四氯化碳组的肝脏含水量百分比明显高于正常控制组，樟芝(1080mg/kg)处理组的肝脏含水百分率较四氯化碳组低。Silymarin的处理对大鼠肝脏、脾脏重量及肝脏的含水量皆没有影响。

表二：樟芝对CC14诱发大鼠慢性肝炎肝脏、脾脏重量及肝脏含水量的影响

A1l values are means±S.D.(n＝10)###P＜0.001 compared withcontrol group.

*P＜0.05 compared with CC14+CMC group.

(3)蛋白质和hydroxyproline含量的影响(表三)

四氯化碳诱发大鼠慢性肝炎，使肝脏的可溶性蛋白质含量降低，樟芝(1080mg/kg)处理组与四氯化碳组比较，其肝脏可溶性蛋白质含量明显增加，silymarin对四氯化碳引起肝脏的可溶性蛋白质含量的减少没有影响。四氯化碳诱发大鼠慢性肝炎明显增加肝脏hydroxyproline含量。樟芝(1080mg/kg)处理组其肝脏hydroxyproline含量明显较四氯化碳组低。silymarin对四氯化碳引起的hydroxyproline含量增加没有影响。

表三：樟芝对CC14诱发大鼠慢性肝炎肝脏蛋白质及hydroxyproline含量的影响

All values are means±S.D.(n＝10)..###P＜0.001 comparedwith control group.

*P＜0.05 compared with CC14+CMC group.

5.结论

由以上综合结果，本发明经动物实验结果明确显示有下列功效：

1.可降低血浆GPT和GOT值。

2.可增加血浆白蛋白。

3.可减轻脾脏肿大。

4.可降低肝脏含水量。

5.可增加肝脏蛋白质含量。

(二)特异性免疫试验

自财团法人国家实验研究院国家实验动物中心购入4-5周龄BALB/c雌性小鼠。小鼠是适合用来做免疫功能评估的实验动物。本品是小鼠已有丰富的基础参考资料与数据，可应用于本试验结果的分析与评估。试验设计如下：

1.饲育管理：

a.饲育室第C室

b.饲育环境

c.环境监测

d.饲育庞与头数

e.饲料

f.饮水

g.动物室入室与器材搬入

2.投予量设定：

a.对照组：10m1/kg(注射用蒸馏水)

b.低剂量：0.26g/kg(相对人体口服建议1倍剂量)

c.中剂量：0.78g/kg(相对人体口服建议3倍剂量)

d.高剂量：1.30g/kg(相对人体口服建议6倍剂量)

e.正对照组：0.30g/kg(市售双鹤极品灵芝)

3.试验组别：

试验动物80只雌鼠入室后，先暂做临时编号并量测体重。经过约1周的驯化、检疫，在此期间每日进行临床症状的观察，最后经由兽医师判断，筛选出健康且体重正常增加的动物，方提供做试验，最后各组实际动物总数为50只。

4.试验物质、对照物质的投予：

a.试验物质配制方法、投药途径、投药次数将试验物质配制成不同浓度的喂食剂量，物质投予以试验开始当日口服投予试验物质一次，共投予10周，并于第6周时同时腹腔注射OVA及Complete Freunds Adjuvant(CFA)，第8周时同时腹腔注射OVA及Incomplete Freunds Adjuvant(IFA)。

b.投药剂量的计算：投药量的算出乃根据当周体重为准，依小鼠各别体重给予相等口服体积10ml/kg。

5.动物分组及个体与组别的识别：

a.动物分组

购入后于动物房先给予适应期逢机称重后，以S型方式将体重相近编为一组，以统计分析确认各组间体重无显著性差异。

b.个体识别

耳号(打耳洞法)。

c.试验组的识别

各试验组饲育笼都附上标示卡标示笼号、品是、性别、周龄及动物编号。

6.动物观察及检查项目：

a.临床症状观察

试验期间每日进行临床观察，并记录动物是否有临床症状，其它异常中毒症状或死亡。例假日亦照常进行临床症状观察。发现日及所有异常症状与程度记录在个别动物资料表。濒死动物，施以安乐死，并做剖检。死亡动物亦得进行剖检，并出可能致死原因。

b.体重测定

供试验动物于投药日投药开始前、投药期间每周一次、动物牺牲日，量测动物体重。

c.饲料摄取量

投药期间动物饲料摄取量每周量测一次。量测方法为体重秤重当日加入定量饲料，一周后结算饲料消耗量与剩余量g/mice/cage)。

7.卵蛋白(ovalbumin，OVA)的给予以OVA对小鼠进行腹腔注射。小鼠在喂食前，先采血以作实验基准值。喂食6周时，第一次注射OVA以致敏小鼠，每只小鼠注射6.25μg OVA和CFA入腹腔内，以得到OVA特异性抗体的产生，2周后第二次腹腔注射12.5μg OVA和IFA为追加致敏。分别于试验前、OVA致敏前、第二次致敏前与试验动物牺牲时采血以追踪血清中OVA特异性IgG、IgM及IgE浓度，其浓度计算以TMB呈后的吸光值(Absorbencies，A)计算的，单位为ELISA Unit(EU)，计算公式如下所示：ELISA units，EU＝(Asample-Ablank)/(Apositive-Ablank)

8.测试方式：

免疫细胞增生能力测试在喂食试验物质连续10周并在喂食期间给予两次OVA后，取出试验动物的脾脏细胞，以刺激物(Concanavalin A，ConA；Lipopolysaccharide，LPS或Ovalbumin，OVA)刺激后，再以CellTiterAQueous One Solution Reagent测定，比较各剂量组与对照组有无差异性存在。

OVA诱发特异性抗体生成于试验前、OVA致敏前、第二次致敏前与试验动物牺牲时采血，利用ELISA以追踪血清中OVA特异性IgG、IgM及IgE浓度，比较各剂量组与对照组有无差异性存在。

9.实施结果：

(1)免疫细胞增生能力(表四)：小鼠经牺牲后取出脾脏细胞，加入细胞裂殖原(Concanavalin A，Con A；Lipopolysaccharide，LPS或Ovalbumin，OVA)培养后以CellTiterAQueous One Solution Reagent测定免疫细胞增生能力。正对照组脾脏细胞以LPS刺激，其免疫细胞增生能力显著高于对照组(P＜0.05)；试验物质各剂量和正对照组脾脏细胞以OVA刺激，其免疫细胞增生能力显著高于对照组(P＜0.05，如下表)显示试验物质具有促进免疫细胞增生能力的功能。

表四：免疫细胞增生能力

本项测试乃利用CellTiterAQueous One Solution Reagent来测定免疫细胞增生能力＊表示与对照组相较，在统计上有显著差异(P＜0.05)

Con A：Concanavalin A LPS：Lipopolysaccharide OVA：Ovalbumin

A：对照组B：低剂量组C：中剂量组D：高剂量组E：正对照组

(2)OVA诱发特异性抗体生成(表五)：在喂食试验物质期间，采集试验前、OVA致敏前、第二次致敏前与试验动物牺牲时血液，以ELISA检测血清内对OVA专一性的免疫球蛋白浓度。试验前、第一次OVA致敏前及第二次致敏前的血清内免疫球蛋白浓度，各剂量组及正对照组在统计上与对照组无显著差异。牺牲时，血清内免疫球蛋白浓度结果显示，试验物质高剂量及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白G(Anti-OVA IgG)在统计上与对照组有显著差异(P＜0.05，如下表)，此外，正对照组的OVA专一性免疫球蛋白M(Anti-OVA IgM)在统计上与对照组也有显著差异(P＜0.05，如下表)，而试验物质各剂量及正对照组的OVA专一性免疫球蛋白E(Anti-OVA IgE)在统计上与对照组则无显著差异(P＜0.05，如下表)。显示本试验物质具有促进OVA专一性抗体IgG生成的功能。

表五：血清抗体生成

本项测试乃利用ELISA来测定血清中抗体生成的情形

＊表示与对照组相较，在统计上有显著差异(P＜0.05)

A：对照组  B：低剂量组  C：中剂量组  D：高剂量组  E：正对照组

10.结论

依据前述结果显示，本发明在特异性免疫功能试验中，具有促进免疫细胞增生能力及血清特异性抗体生成的免疫调节功能的作用。

(三)非特异性免疫试验

自财团法人国家实验研究院国家实验动物中心购入4-5周龄BALB/c雌性小鼠。小鼠是适合用来做免疫功能评估的实验动物。本品是小鼠已有丰富的基础参考资料与数据，可应用于本试验结果的分析与评估。

1.试验设计同本发明「特异性免疫实验」第1至6项。

2.测试方式：

(1)腹腔吞噬细胞活性

在喂食试验物质连续六周后，取出试验动物的腹腔吞噬细胞，以荧光标定的E.coli(FITC-E.coli)令其吞噬，再以流式细胞仪分析其活性，比较各剂量组与对照组有无差异性存在。

(2)细胞激素分泌功能

在喂食试验物质连续六周后，取出试验动物的脾脏细胞，加入刺激物(ConA或LPS)培养48-72小时，以酵素连结免疫分析法(EnzymeLinkedImmunosorbent Assays，ELISA)测得细胞激素分泌量，比较各剂量组与对照组有无差异性存在。

(3)血清抗体生成

喂食试验物质期间，采集试验物质投予前、投予后第三周及牺牲时动物血液，以ELISA测定血清内各免疫球蛋白的浓度，比较各剂量组与对照组有无差民间性存在

3.实验结果

(1)腹腔吞噬细胞活性(表六)

小鼠经牺牲后采集腹腔吞噬细胞，加入FITC-E.coli令其吞噬，再以流式细胞仪进行吞噬细胞活性分析。在Multiplicity of infection(MOI)等于5时，试验物质中、高剂量和正对照组的腹腔吞噬细胞活性显著高于对照组(P＜0.05)。显示本试验物质具有促进腹腔吞噬细胞的活性的功能

表六：腹腔吞噬细胞活性

本项测试乃利用流式细胞仪来测定吞噬细胞吞噬能力

＊表示与对照组相较，在统计上有显著差异(P＜0.05)

MOI：multiplicity of infection

A：对照组B：低剂量组C：中剂量组D：高剂量组E：正对照组

(2)细胞激素分泌功能(表七)

小鼠经牺牲后取出脾脏细胞，在未加入裂殖原及加入细胞裂殖原(Con A或LPS)的刺激下，分别作用培养48-72小时后，利用ELISA测试免疫细胞分泌细胞激素的 情形。在Con A或LPS的刺激下，脾脏细胞其介白质素IL-2(Interleukin-2)分泌，试验物质各剂量及正对照组在统计上与对照组无显著差异。在LPS的刺激下，肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor-alpha，TNF-d)的分泌，试验物质各剂量及正对照组在统计上与对照组有显著差异(P＜0.05)。在Con A的刺激下，干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)的分泌，试验物质中剂量及正对照组在统计上与对照组有显著差异(P＜0.05)。显示本试验物质具有调节抗肿瘤细胞激素分泌的功能。

表七：脾脏细胞激素分泌功能

本项测试乃利用ELISA来测定脾脏细胞激素分泌的情形

＊表示与对照组相较，在统计上有显著差异(P＜0.05)

A：对照组B：低剂量组C：中剂量组D：高剂量组E：正对照组

(3)血清抗体生成(表八)

在喂食试验物质期间，采集试验物质投予前、投予后第三周与牺牲时动物血液，以ELISA检测血清内免疫球蛋白浓度。投予前，血清内免疫球蛋白浓度结果显示，各剂量组在统计上与对照组无显著差异。投予中，血清内免疫球蛋白浓度结果显示，各剂量组在统计上与对照组无显著差异。牺牲时，血清内免疫球蛋白浓度结果显示，试验物质低、中、高剂量及正对照组的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)在统计上与对照组有显著差异(P＜0.05)，而IgM各剂量组在统计上与对照组无显著差异。显示本试验物质具有促进血清抗体IgG生成的功能。

表八：血清抗体生成

本项测试乃利用ELISA来测定血清中抗体生成的情形

*表示与对照组相较，在统计上有显著差异(P＜0.05)

A：对照组B：低剂量组C：中剂量组D：高剂量组E：正对照组

4.结论

依据前述结果显示，本发明在非特异性免疫功能试验中，具有促进腹腔吞噬细胞活性、细胞激素分泌及血清抗体生成的免疫调节功能的作用。

(四)安全性测试：

1.沙门氏菌回复突变试验

沙门氏菌回复突变试验(Ames test)的目的，是为了解试验物质在未经或经过大鼠肝脏代谢是统活化后微生物是统是否会发生基因突变，借此试验可以进行试验物质的基因毒性评估。本试验乃遵循OECDguideline#471的规范所进行。此结果表示本发明在本试验设计条件下无论是否经过代谢活化过程，皆不会显著引发沙门氏菌回复突变。

2.体外哺乳类细胞染体结构异常试验

本试验的目的，在于试验物质经由大鼠肝脏活化酵素是统代谢前及代谢后，对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells)引发直接或间接染体结构变异的种类、数量及细胞毒性，借以评估试验物质在体外哺乳类细胞的基因毒性。本试验乃遵循OECD#473的规范所进行。依此结果显示本发明在本试验浓度下，于体外哺乳类细胞染体结构异常试验结果为阴性反应。

3.啮齿类外围血液微核试验

本试验的目的，以本发明为试验物质，测试其对啮齿类动物体内(invivo)外围血液微核发生的比例，直接或间接引发红血球染体或有丝分裂器基因变异及造成伤害程 度，借以评估本发明在动物体内的基因毒性。本试验乃遵循OECD guideline#474的规范进行。根据1000mg/kgB.W.、2000mg/kg B.W.及4000mg/kg B.W.各剂量结果显示，本发明对于动物体内外围血液微核发生为阴性反应。

4.90天亚慢性大鼠口服投予试验

本试验为遵循OECD guideline#408规范进行试验，其目的是在测试本发明经90天重复给药后，对大鼠可能产生的毒性影响，了解毒性变化的产生，同时测定无毒性显示的剂量。结果显示，本发明经90天重复给予后对SD雌雄大鼠在临床病理及病理组织学上皆未发现与试验物质有关联的病变。因此3000mg/kg可当成「不造成任何不良副作用」(NoObserved Adverse Effect Level，NOAEL)的剂量。

5.大鼠致畸胎毒性试验

本试验的目的，是在检测试验物质对怀孕母鼠引发的毒性反应以及在动物胎儿的器官形成期导致胎儿死亡、发育迟滞或畸形的可能性。本试验以本发明的最高剂量3000mg/kg对怀孕母鼠重复投予，未发现到一般毒性反应，并且也未影响到胎儿器官的形成或发育。因此3000mg/kg可为「不造成任何不良副作用」No-Observed-Adverse-Effect-Level，NOAEL)的剂量。