C07K16/22 C12N15/13
1.一种抗VEGF的单克隆抗体,其特征在于:它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区:CDRH1(SEQ ID NO.1:TYGMS),CDRH2(SEQ ID NO.2:ISNGGSYTFYPDSVKG),CDRH3(SEQ ID NO.3:HGSVTTRGFDY)。
2.根据权利要求1所述的抗VEGF的单克隆抗体,其特征在于:它还/或具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的轻链可变区:CDRL1(SEQ ID NO.4:KASQSVSNDVV),CDRL2(SEQ ID NO.5:YASNRYT),CDRL3(SEQ ID NO.6:LQDYSSPFT)。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体,其特征在于:所述单克隆单体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物,也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体,其特征在于:其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体,其特征在于:其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体的DNA序列,其特征在于:其重链核苷酸序列如SEQ ID NO.9 所示;其轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示。
技术领域
本发明属于抗体工程领域,具体涉及一种识别人血管内皮生长因子(huVEGF)表位的鼠单克隆抗体,更具体的,设计该单克隆抗体的重链和轻链可变区的三个高变区氨基酸序列。
背景技术
1971年Folkman首先观察到当肿瘤体积超过1-2 mm3,需要新血管的形成来维持生长,从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的,并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。已有研究表明,几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。
1989年Ferrara N 发现了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一,在肿瘤的血管生长中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响,在肿瘤的血管发生过程中发挥极其重要的作用。VEGF 既可以用于肿瘤的理想靶点,也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后的标志物。
VEGF是相对分子质量34000-42000的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白,其编码基因位于染体的6q21.3,全长14 kb,含有8个外显子和7个内含子,可形成9种异构体,主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF189 和VEGF206。其中多数组织以表达VEGF165为主。
Genetech公司针对VEGF的人源化单克隆抗体阿瓦斯丁自2004 年上市以来被证明对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。2006年,其优化后的抗体片段雷珠被美国FDA 批准用于老年黄斑变形,成为老年性黄斑病变、糖尿病引起的眼底病的首选药。
由于VEGF及其受体的多样性,不同抗原表位或者不同亲和力的VEGF抗体可能有不同的肿瘤生长抑制效果。因此研究不同的VEGF抗体将有助于VEGF抗体药物的升级。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人血管内皮生长因子(huVEGF)的单克隆抗体,能够特异性的识别huVEGF,对huVEGF有很高的亲和力。
本发明提供了一种针对huVEGF的鼠源单克隆抗体。
本发明还提供了优选的VEGF 抗体重链可变区,其中高变区具有下列氨基酸序列:
CDRH1(SEQ ID NO.1:TYGMS),CDRH2(SEQ ID NO.2:ISNGGSYTFYPDSVKG),CDRH3(SEQ ID NO.3:HGSVTTRGFDY)。
本发明还提供了优选的VEGF 抗体轻链可变区,其中高变区具有下列氨基酸序列:
CDRL1(SEQ ID NO.4:KASQSVSNDVV),CDRL2(SEQ ID NO.5:YASNRYT),CDRL3(SEQ ID NO.6:LQDYSSPFT)。
本发明所述单克隆抗体可以是,例如,单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物,也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1 小鼠单克隆抗体的制备和筛选
1) 小鼠的免疫
将VEGF165 蛋白溶解在l×PBS,取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma) 混匀乳化,取8 周龄的BALB/c 雌鼠,皮下多点注射抗原。2 周后,取适量的蛋自溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma) 混匀乳化,在小鼠的皮下,进行第二次免疫。以后每隔3 周,进行第三、四次免疫。第四次免疫后3 天,取脾脏进行细胞融合。
2) 细胞融合
从免疫小鼠内收获脾细胞,将具有较高活性Sp2/0 骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬液按1 :10-100 比例混合,加入聚乙二醇使细胞彼此融合,在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液,以HAT选择性培养基进行细胞培养。
3) 阳性克隆的筛选
待融合的细胞培养至第5-10天时,吸取96 孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量,经有限稀释进行三次亚克隆筛选,依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔,将孔中细胞扩大培养,然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定,选高效价,高特异性的细胞株,命名为16-5。
4) 单克隆抗体可变区序列的获得
利用Trizol(Invitrogen) 法提取杂交瘤细胞株16-5 的总RNA,然后用oligo-dT引物和SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase(lnvitrogen) 反转录成cDNA。经PCR扩增获得抗体重链和轻链的DNA 片段,连于克隆载体,挑取克隆进行测序。
序列表
<110> 中美华世通生物医药科技(武汉)有限公司
<120> 一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体
<130> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 重裢可变区CDR1
<400> 1
Thr Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 重裢可变区CDR2
<400> 2
Thr Ile Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 重裢可变区CDR3
<400> 3
His Gly Ser Val Thr Thr Arg Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 轻裢可变区CDR1
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Val
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 轻裢可变区CDR2
<400> 5
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 轻裢可变区CDR3
<400> 6
Leu Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 228
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Leu Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
20 25 30
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Thr Ile Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Phe Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Gly Ser Val Thr Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gln Thr Ser
225
<210> 8
<211> 216
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 9
<211> 684
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
ctcgaggtga agctgatgga gtctggggga gacttagtga agcctggagg gtccctgaaa 60
ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtacctatg gcatgtcttg ggttcgccag 120
actccagaca agaggctgga gtgggtcgca accattagta atggcggtag ttacaccttc 180
tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaactccctt 240
tacctgcaaa tgagcagtct gaagtctgac gacacagcca tgttttactg tgcaagacac 300
ggcagtgtga ctacgagggg gtttgattac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgaccaaac tagt 684
<210> 10
<211> 658
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 10
gagctcgata ttgtgatgac ccagtctccc aaattcctgc ttgtatcagc aggagacagg 60
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ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480
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ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaactct acgcctgcga agtcacccat 600
cagggcctga gatcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gttctaga 658
本文发布于:2024-09-22 14:20:29,感谢您对本站的认可!
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