借助于千兆赫或兆兆赫频谱分析进行实时PCR

借助于千兆赫或兆兆赫频谱分析进行实时PCR

本发明涉及在PCR扩增中对核酸分子，特别是多核苷酸序列进行频谱分析实时检测用的方法，以及相应的PCR装置(PCR＝聚合酶链式反应)。

通常，这样的方法以及PCR装置用于特定基因序列的表达的定量分析。一般地说，PCR扩增在DNS或RNS序列的复制和研究中，正如它们在许多生物学系统中那样被频繁地应用，然而在原则上还可以用于人工制造的多核苷酸序列。

在此描述的方法涉及PCR-扩增中的频谱分析实时检测。借此不仅涉及PCR扩增所有反应步骤进行期间的检测，而且涉及此前和此后的有目的的检测。因此例如，这可以在实施多核苷酸序列复制的实际PCR反应步骤之前的开始步骤中借助于频谱分析检测，对所采用的物质进行定性的以及定量的研究。此外，还可以在PCR扩增期间以及甚至在PCR扩增已经结束时进行频谱研究步骤。

一般地，PCR扩增用于与人类基因组比较相对较短的并在其构建上清晰定义的多核苷酸序列的复制。与活的生物体相反，PCR扩增只保证每个序列几千碱基对的多核苷酸序列的复制。为了进行PCR扩增首先要求制备PCR溶液，它除了缓冲溶液作为适当的化学环境以外，还要具有进行PCR扩增所需要的若干其它起始物质。这些起始物质一般包括原来的待复制的多核苷酸序列、确定待复制的多核苷酸序列的起始段及末段用的引物、相应的聚合酶，以便通过该引物来复制确定的段，以及作为所复制的多核苷酸序列的构件的脱氧核苷三磷酸。除了这些起始物质以外，PCR溶液还可以含有若干其它功能组分，它们也许在效率方面允许提高或优化PCR扩增的进程。

PCR扩增由重复地进行的PCR反应步骤组成，正如它们可以大致在实验室常见的热循环仪中进行的。在此，每次重复都包括变性、引物杂交和延伸三个PCR反应步骤。变性时，首先为了解除将两个单链多核苷酸序列结合在一起的氢键，在加热PCR溶液至约95℃的温度的情况下使双链多核苷酸序列解链。该温度水平一致保持到保证在PCR溶液中只存在单链多核苷酸序列为止。在引物杂交的PCR反应步骤中，温度一般在一个水平上维持几秒，以允许引物特异性附着在多核苷酸序列上。在此，所述温度水平一般处于在通过特异性附着而产 生的引物序列的解链点以下几度(℃)，并通常相应于55℃至65℃之间的温度。若引物在多核苷酸序列预先确定的位点上的附着结束，则在延伸的PCR反应步骤中在聚合酶的作用下通过所缺的链或基件在自由的核苷酸上填充进行。在此，引物形成逐段复制的新单链的起点。在PCR反应步骤期间，所调整的温度取决于各自使用的聚合酶的工作最优值，然而一般处于引物杂交温度水平以上约10℃至15℃。延伸的PCR反应步骤结束之后，重复该反应顺序，所要求的多核苷酸序列在最优反应情况下呈指数繁殖，因为在每下一个反应步骤中之前合成的多核苷酸序列都可以用作下一次链合成的模板。

在实时定量PCR中，先有技术已知的PCR扩增的进一步发展，复制多核苷酸序列进行PCR扩增，并同时提供对这样取得的多核苷酸序列进行量化的可能性。在此，该量化以实施在PCR扩增期间进行的荧光测量为依据。在此，所检测的荧光信号与所复制的多核苷酸序列数量成正比。与此相应地，与大多数只能在PCR扩增之后应用的传统的定量检测方法相反，实时定量的PCR允许在PCR扩增中复制的多核苷酸序列尚在其复制期间就进行定量数据处理。

在此应该指出，在此和在下文中，定量检测应理解为在量化的意义上与实时定量PCR相结合。这可以基于不同的已知的量化模型。在一种简单的情况下，大致可以利用这样的事实，即在所采用的复制的多核苷酸序列数量的对数和CT(阈值周期＝“Threshold Cycle”，即检测到的荧光第一次显著地高于背景荧光的时刻)之间存在线性的反比关系。若首先大致已知所采用的数量，则可以产生一条标准曲线，多核苷酸序列的每个未知数量与其斜率进行比较，便能进行定量。另一方面，若原始量未知，则可以通过测定CT反推原始量。其他计算方法是专业人员已知的。

在此，实时定量PCR要求荧光颜料或者所谓荧光标记，它在化学或在物理上与所复制的多核苷酸序列出现相互作用，并因此改变本身的荧光行为。与此相应地，在重复PCR反应步骤之后用所复制的多核苷酸序列的相应增长校准所检测的荧光信号的强度增长。通过实测的荧光信号对PCR扩增变化过程的检测，例如可以依靠对所复制的多核苷酸序列相对非特异的简单荧光颜料的应用。这样的荧光颜料大致为SybrGreen，它是一种不对称的花菁染料颜料分子，而且与待复制的DNA分子形成一种DNA-荧光颜料复合物，在波长λ_max＝494nm时吸收蓝光，在波长为λ_max＝521nm时发射绿光。另一种经常使用的荧光颜料是溴化乙 锭。作为这些荧光颜料的补充还加入荧光标记，诸如FRET-Sonden、Lightcycler-Sonden TaqMan-Sonden Molecular-beacons、Scorpionprimer或Luxprimer 它们虽然允许在多核苷酸序列各个位点上特异性结合，并因而具有狭义的荧光性能，但价格比较昂贵。所以这样的荧光标记不像荧光颜料那样典型地被广泛的应用。此外，分子信号灯(Molecular-beacons)呈现相对复杂的结构，需要额外地优化的并由此比较昂贵的引物来实行PCR扩增。此外，这类复杂的结构妨碍PCR反应条件的优化调整，并导致效率相对较低的多核苷酸序列复制，而且出现许多不希望有的副产物。

为了避免以荧光信号检测为基础的实时定量PCR出现这种缺点，由现有技术已知的WO 03/102238 A2建议一种检测PCR溶液中连续核酸分子的方法以及进行该方法的装置。该方法包括在一个小室(Kammer)中提供PCR起始物质，并重复执行变性、引物杂交和延伸的PCR反应步骤。在实施这种PCR反应步骤期间，通过用紫外光照射PCR溶液和随后进行的所吸收的光强度检测，使连续核酸分子显现(Darstellung)。在此，PCR溶液由一个适宜于执行PCR扩增的小室收纳，其中用来自UV光源的光能照射。

尽管在WO 03/102238 A2中描述的方法可以不必采用荧光标记，但是该方法在PCR溶液各组分方面或者在从在前的分离反应的反应步骤产生留下的残留物例如苯酚方面非常易受干扰。借助于紫外吸收的定量测定的另一个缺点是，单链与双链核酸分子的差别有限，并因此仅提供用于多核苷酸序列的高度非特异检测可能性。

WO 2008/109706 A1描述了各种类型的兆兆赫光谱学的应用。其中描述了双链和单链DNA的检测。在该出版物中完全没有描述PCR产物的实时检测方法。

WO 2006/064192 A1描述了一种兆兆赫范围的带状滤光片。该出版物没有描述在检测核酸分子方面的方法。

US 2006/0216742描述了应用千兆赫或兆兆赫辐射检测生物分子结合事件的方法和系统。

WO 03/100396 A1公开了一种检测配体对生物探针的特异性的方法。

DE 100 54 476 A1描述了一种检测多核苷酸序列用的方法，其中通过与入射电磁辐射的相互作用，测定与测试介质接触的探针的折射率或一个等效的量。

WO 2004/024949 A2描述了一种应用频谱数据迅速检测突变和核苷酸多态 现象。

US 2006/0216742 A1提出一种检测两个分子之间生物分子结合的存在的专用方法，它涉及检测方法以及相应的装置。按照该公开文献，通过兆兆赫辐射检测两个分子生物分子结合的存在，其中从辐射源发射兆兆赫辐射，并在透射包括该分子的探针之后用检测器检测。在此，所公开的方法不能对所采用的分子数量进行量化，所以不适宜用来对PCR扩增进行实时检测。

据此，任务是，提出一种在PCR扩增中实时检测多核苷酸序列的无标记方法，它使多核苷酸序列特定的和定量的检测，特别是使区分单链和双链多核苷酸序列成为可能，而且在很大程度上不受溶液纯度或质量的影响。

该任务用按照专利权利要求1和15的方法以及按照专利权利要求14的PCR装置解决。

具体地说，该任务通过一种在PCR扩增中对核酸分子，特别是对多核苷酸序列进行定量频谱分析实时检测用的方法，其中PCR扩增包括提供在缓冲溶液中的对于制备PCR溶液所必需的起始物质以及重复进行变性、引物杂交和延伸的PCR反应步骤，并且其中在PCR扩增期间在确定的时刻用来自辐射源的在千兆赫或兆兆赫范围内的电磁辐射照射PCR溶液，以便借助于检测器在定量实时检测中至少检测多核苷酸序列是否存在。

此外，该任务通过一种在PCR扩增中对核酸分子，特别是对多核苷酸序列进行定量频谱分析实时检测用的方法解决，其中该PCR扩增包括提供在缓冲溶液中的对于制备PCR溶液所必需的起始物质以及重复进行变性、引物杂交和延伸的PCR反应步骤，并且其中在PCR扩增期间在确定的时刻用来自辐射源的在千兆赫或兆兆赫范围内的电磁辐射照射PCR溶液，以便借助于检测器在实时检测中至少检测多核苷酸序列是否存在，而且其中变性反应步骤通过来自辐射源的兆兆赫辐射进行。

此外，该任务还通过在PCR扩增中对多核苷酸序列进行定量频谱分析实时检测用的PCR装置解决，其中它包括具有由所必需的起始物质和缓冲溶液组成的PCR溶液的接收区域的基片；温度改变装置，借此可以把PCR溶液加热和/或冷却至预先给定的温度，以便使变性、引物杂交或延伸的PCR反应步骤的重复成为可能；辐射源，用以千兆赫或兆兆赫范围的电磁辐射照射PCR溶液；和检测器，用以对透射PCR溶液的辐射进行定量频谱分析检测。

本方法以及按照本发明的PCR装置的核心思想在于，PCR扩增以及频谱分析实时检测以电磁频谱的千兆赫或兆兆赫范围实施。一般地，在这个频率范围内所使用的辐射处于100GHz(千兆赫)和20THz(兆兆赫)之间，特别是在300GHz和10THz之间。这个照射频率适宜于激励单链和双链多核苷酸序列的特定激活状态(一般地，采用振荡的(vibratorische)振动模式)。这种多核苷酸序列的各功能基团的激活状态就此用预先确定的电磁辐射频率校准并可以在消光测量中检测。下文中消光测量一般地指所有频谱分析检测，包括定量检测，它把照射PCR溶液的光强度的部分与从其中射出并用检测器检测的光强度部分联系起来，以便允许推断PCR溶液中所检测的物质和结构。此外，该激励模式(激活频率)对这些功能基团的化学结合状态是特征性的，而且可以因结合状态的改变伴随电磁激活频率的改变。激励模式检测尤其允许表明，它的出现表明在一个双链多核苷酸序列中两个单链多核苷酸序列之间氢键的存在。此外，与此相应地，可以通过在上述这个频率范围内的消光测量获得结论，在PCR溶液中是否存在单链或者双链多核苷酸序列混合物。

PCR溶液中借助于频谱分析消光测量检测多核苷酸序列的预先确定的激活状态，与至今借助于荧光测量的传统检测方法相比，完全不要求给PCR溶液添加荧光标记。以此一方面使制备PCR溶液的复杂性降低，而且成本较低。另一方面，可以省去有时对于PCR溶液有害的紫外线的采用。正是通过紫外光，电子激励作用在生物学大分子上，通过紫外光照射有时引发的化学副反应而产生的可能的误差来源是非常成问题的。然而，千兆赫以及兆兆赫范围的电磁辐射一般只会引起振荡激励，并且因此实际上几乎不干扰PCR溶液中的化学反应环境。此外，千兆赫和兆兆赫辐射的照射频率适宜于检测连接在一起的核酸分子或多核苷酸序列的杂交状态。所以，与借助于紫外范围的荧光测量的实时定量PCR方法不同，与按照本发明的方法相应的检测可以检测各种杂交状态的存在，特别是单链和双链多核苷酸序列的存在。这对于PCR扩增的进行有时是决定性的，定量检测还允许对在PCR溶液出现的反应步骤的进展以及质量作出结论，并以此一般地提高PCR扩增的效率。

此外，按照本发明的方法的另一个核心思想还在于，频谱分析实时检测所采用的辐射源还可以用来在PCR扩增中通过电磁辐射导致变性反应步骤。所照射的频率范围完全适于把双链多核苷酸序列中两个单链之间的氢键解开，而不 须给PCR溶液的整个系统直接添加热能。所以，在变性反应步骤中不需要为了多核苷酸序列的各链之间化学键的解开而使PCR溶液升温。该辐射源以千兆赫以及兆兆赫范围通过预先确定的频率的电磁辐射照射PCR溶液，更多的是使双链多核苷酸序列解链而无需PCR溶液本身经历剧烈的温度变化。因此，这种方法缩短了重复PCR反应步骤所必要的PCR溶液的加热和冷却阶段，并使时间上较快地出现待复制的多核苷酸序列的所希望量成为可能。

在按照本发明的方法的第一实施例中规定，在缓冲溶液中制备PCR溶液所必需的起始物质不包括化学的或物理的检测标记，特别是不包括荧光标记。在此，标记是指制备上述PCR溶液作为非必需的起始物质加入的物质，以便在一个先有技术已知的测量方法中可以检测多核苷酸序列的出现。所以，为按照该实施例的方法制备的PCR溶液，可以只限于所必需的起始物质，正如它们对于通常无实时检测的PCR扩增所必需的。一方面，以此减小对PCR扩增方法中化学以及物理性质可能的干状影响，而同时提高反应条件的可控性。

在另一个实施例中可以规定，所照射千兆赫或者兆兆赫范围的电磁辐射的强度这样选定，使得它们穿透PCR溶液预先确定的层厚。在此，所述层厚可以涉及所照射的电磁辐射透射的整个样品横截面，或者只涉及样品横截面的部分区域。所述层厚适于在以预先给定的辐射强度照射时和在多核苷酸序列以一个超过确定的监测阈值的数量存在时，检测出消光信号。从电磁辐射强度减弱引起的该消光信号，大致可能是吸收、散射、衍射以及反射造成的。若透射的层厚恒定，而且所照射的电磁辐射的强度不变，则在多核苷酸序列的消光截面积已知的情况下，可以反推所出现的多核苷酸序列数量。

在该方法的另一个实施方式中，在千兆赫或者兆兆赫范围内照射的电磁辐射的频率在100GHz和20THz之间，特别是在300GHz和10THz之间。这个频率范围覆盖大多数多核苷酸序列的频谱分析易于检测的激活频率，并因此，允许对激活振动进行频谱检测，特别是定量频谱检测。

在本发明另一个有利的实施例中规定，PCR溶液的缓冲溶液在千兆赫或兆兆赫范围内照射的电磁辐射的频率方面这样选定，使得在透射PCR溶液的预先确定的层厚之后用检测器可以在很大程度上不衰减地检测出照射强度。因此，该缓冲溶液本身在所采用的电磁照射频率方面这样选定，使得预先确定的频率范围的所照射的电磁辐射经历尽可能大的透射。若保证这个频率范围与多核苷 酸序列所检测的激活状态重叠，则与PCR溶液相互作用之后电磁辐射强度的降低并非因为缓冲溶液本身的消光特性，而只是因为起始物质以及所出现的分子的消光特性。此外，若能进一步排除PCR扩增副产物的消光，则多核苷酸序列激活状态区域中电磁辐射强度的减弱，在很大程度上只是因为电磁辐射与多核苷酸序列的相互作用。因此，提高了有用信号和不希望有的电磁辐射减弱的比率，还改善了定量频谱分析实时检测的质量。

在本方法另一个实施例中，其特征在于，PCR溶液涂抹在基片上，特别是涂抹在对于所照射千兆赫或兆兆赫范围的电磁辐射在很大程度上透明的基片预先确定的接收区域上。这样一个接收区域可以通过有限的容积形成，但或者还可以只把PCR溶液涂抹成平面。该基片本身可以是矿物基片，例如玻璃，但或者还可以是塑料基片。若该基片本身对于所照射的电磁辐射在很大程度上是透明的，则它只在用频谱分析实时检测方法所检测到的消光信号上引起一个很小的比例。若PCR溶液的缓冲溶液本身在所照射的电磁辐射的频率范围内同样不引起或只有引起小的辐射强度减弱，则所检测到的消光度在很大程度上以电磁辐射和PCR溶液，或其中所包含的材料的相互作用为依据。此外，该基片若为塑料，则可以通过选择适当的塑料，适应所照射的电磁辐射的有用频率范围，以便导致尽可能小的辐射强度减弱。

在本方法的另一个实施例中，该基片至少包括一个千兆赫或者兆兆赫范围内电磁辐射用的波导管。这种波导管一方面可以用作射线引导介质，同时还用作带有PCR溶液可能的接收区域的基片。与此相应地，可以以良好的可控性用电磁辐射局部照射PCR溶液。此外，像一般在准直和聚焦方法的情况那样，可以缩小散射或损失辐射，并改善频谱分析实时检测。如果预先确定的PCR溶液接收区域处于这样的范围内，其穿过射波导管衰逝的(evaneszenten)辐射场，则应用波导管特别有利。所以，多核苷酸序列的检测用这样的电磁辐射进行，使之一方面受波导管引导，而另一方面与波导管外表面的区域通信(kommuniziert)。

此外，在频谱分析实时检测方法的另一个实施例中还设置温度改变装置，可以借此把PCR溶液加热和/或冷却到预先给定的温度。这样的温度改变装置可以直接或间接地加热或冷却PCR溶液。例如，直接升温可以基于直接辐射加热或电阻加热。冷却可以通过适当安置的珀耳帖元件或冷却介质，例如空气进行， 后者与热交换器连接。在此，温度改变装置保证使尽可能快速和准确地更换各PCR反应步骤所需要的温度成为可能。

在该方法的另一个实施例中规定，所述温度改变装置加热和/或冷却热介质，该热介质通过基片间接加热和/或冷却PCR溶液。另外要考虑的是，基片本身的热容量要小，而导热性尽可能大。按照实施例，该热介质可以平面地相互作用，但或者也可以穿过为其规定的传输介质，例如，沟道。借助于基片的加热或冷却，在PCR溶液与基片适当的接触下，相应地改变PCR溶液的温度。故可以保证进行PCR反应步骤所需要的温度条件。

在本方法一个有利的实施例中规定，来自辐射源的在千兆赫或兆兆赫范围内的电磁辐射，在变性和/或引物杂交和/或延伸步骤之前和/或之后照射PCR溶液。与此相应地，在每次PCR扩增中出现的反应步骤之后借助于频谱分析检测初始条件以及反应结果。若检测证实，后续的PCR反应步骤的初始前提条件不利，则可以相应地改变反应条件，例如为改善结果而进行的温度选择。在一个替代的配置中，还可以在PCR扩增期间出现的变性、引物杂交或延伸的反应步骤中照射千兆赫或兆兆赫范围的电磁辐射，例如，以便得到在时间上各个分子构件的结合特性的推断。

在该方法一个特别有利的实施例中，选定电磁辐射频率，以便激励单链和/或双链多核苷酸序列所定义的振荡激励模式，以便检测该模式，特别是检测表征双链多核苷酸序列杂交状态的存在的模式。故可以在PCR扩增期间检测多核苷酸序列特定的分子结构的存在，借此可以测试和检测PCR扩增的进行质量。此外，还可以在检测多核苷酸序列之后中断PCR扩增。特别是还可以通过对确定激励模式激活频率偏移的检测，获取多核苷酸序列结构，特别是其杂交状态的结论。

在本发明的另一个实施例中，考虑在检测分析中在PCR扩增期间将借助于在千兆赫或兆兆赫范围内的电磁辐射进行的在前时间进行的检测面作为在后时间进行的检测的背景。在前时间进行的检测可以用于在消光测量中或者以直接地、经过平均地或者以经过滤的方式从在后的检测中去除的绝对必要的背景减除。因此，这对于获得定量结果所必要的背景减除步骤由此不再要求预知PCR装置具体的消光特性，而是允许以时间接近的方式获得一种良好的背景测定。

在多核苷酸序列频谱分析实时检测方法的另一个实施例中，来自辐射源的 千兆赫或者兆兆赫范围内的电磁辐射，在进行PCR扩增之前照射PCR扩增用的起始物质的溶液，以便借助于频谱分析检测确定各起始物质的化学或物理特性，特别是其质量、特异性及其结合特性。在此说明，一般在进行实时定量PCR之前，由于成本的原因，大部分PCR扩增用户都在采用荧光测量没有进行频谱分析实时检测可能性的PCR装置中，检测质量或特异性及其结合特性(多核苷酸序列的质量、引物结合、引物特异性、扩增数量)。所以按照实施例方法的执行，可以取消这个单独的检测，而借助于按照本发明的PCR装置直接测定各起始物质的物理和化学特性。此外，在PCR扩增中一般使用的引物是针对在不带频谱分析实时检测的常规PCR装置中的应用设计的，因而在带有频谱分析实时检测的PCR装置中的应用中，由于荧光标记的使用，需要再次优化对于含有引物带有荧光标记的PCR溶液的反应条件。这个再次优化主要由于如下原因是必要的，因为掺入荧光标记影响多核苷酸序列的解链点，并因此影响引物结合。因为能事先在PCR装置中测定引物结合或引物的特异性，其中在较晚的时刻还用千兆赫或者兆兆赫辐射进行多核苷酸序列的频谱分析实时检测，故取消成本过高的优化工作。

此外，还要指出，在UV范围的荧光测量中所采用的反应容器由于污染，正如例如，指纹，很容易引起错误的测量，并因此有时可能得出错误的吸收值。千兆赫或者兆兆赫范围的电磁辐射由于波长较大，针对反应容器以及还有缓冲液组分的这种污染物很不敏感。此外，本方法相应地省去对于频谱分析检测可能成为误差来源的劣质的(verdorbenen)或不准确应用的荧光颜料的使用。

本发明的其他实施例在从属权项中给出。

下面参照根据附图较详细地说明的实施例进一步阐明本发明。

在此展示：

图1是一个流程图，阐明在按照本发明的第一实施例的PCR扩增中多核苷酸序列频谱分析实时检测方法中，各个步骤在时间上的次序；

图2是一个示意图，表示在与PCR溶液中预先确定的多核苷酸序列的激活状态一致的照射频率下，在PCR扩增过程中PCR溶液的消光特性；

图3按照本发明的PCR装置第二实施例示意图的一个部分视图；

图4是按照本发明的PCR装置第三实施例的部分视图；

图5是按照本发明的PCR装置第四实施例的部分视图；

图6是按照本发明的PCR装置第五实施例的部分视图；

图7是按照本发明PCR装置的第六实施例，其基于图5所示第四实施例的部分视图；

图8是在千兆赫频率范围和/或兆兆赫范围内制备PCR溶液所使用的缓冲溶液以及多核苷酸序列的消光特性。

图1表示按照本发明的方法在PCR扩增中多核苷酸序列10的频谱分析实时检测的实施例的典型流程的示意流程图。在这样一个方法中首先要制备缓冲溶液13，其中收纳或溶解制备PCR溶液所必需的起始物质。所必需的起始物质12是待复制的多核苷酸序列10、适当的引物、聚合酶以及合成多核苷酸序列用的三磷酸脱氧核苷。在制备PCR溶液11之前可以已经在频谱分析实时检测中测定各起始物质12的质量、特异性 和形成特性。这种检测在图1中用1表示的时刻发生。制备PCR溶液11之后可以重新对PCR溶液11(时刻2)进行进一步的频谱分析实时检测。只有当通过变性、引物杂交和延伸的PCR反应步骤的重复发生待复制的多核苷酸序列的复制时，在每次成功的PCR反应步骤之后都可以进行频谱分析实时检测(时刻3，4和5)。在此，在变性的PCR反应步骤之后测量单链多核苷酸序列优选的激活状态(时刻3)，其中在延伸的PCR反应步骤之后(时刻5)测量双链多核苷酸序列的激活状态。因此，借助于按照该实施例的方法，频谱分析实时检测可以在PCR扩增的整个过程期间进行，而且还可以定量表征在PCR扩增中出现的多核苷酸序列在时间上的变化过程。另外，自然可以在PCR扩增结束之后进行频谱分析检测。

若按照本发明方法的一个方面，变性的PCR反应步骤通过照射兆兆赫范围的电磁辐射的进行，则本方法相应电磁辐射的照射在变性进行的时刻进行。

图2表示PCR溶液中消光变化过程的示意图，按照本发明的一个实施例，该PCR溶液可以用千兆赫或兆兆赫范围的电磁辐射进行频谱分析测定。这时，所照射的电磁辐射的频率这样选择，使之与各多核苷酸序列预先确定的激活状态的频率一致，并在相应的照射之后在其PCR溶液中被它减弱。因为，在PCR扩增中复制的多核苷酸序列的数目典型地在时间上按指数曲线增大，频谱分析实时检测的消光测量点处于按指数曲线变化过程的曲线上。现将用交叉标出PCR溶液各消光检测值。这时，按照可能影响PCR扩增的效率或速度的物理量以及化学量测定该时间变化过程。随后可以借助于计算方法从消光测量计算特定多 核苷酸序列的数量。

在PCR扩增期间，在多核苷酸序列频谱分析实时检测的实际执行中人们发现，只有在预先确定的监测阈值D₁以上，这样的检测才能提供可以在进一步数据处理中使用的明确的检测结果。低于该监测阈值D₁的监测值只具有理论性质，因为信躁比不允许进行明确的消光测量。所以，明确的频谱分析实时检测最早的时刻T₁在实测的消光处于监测阈值D₁以上时才出现。通过电磁辐射照射频率的相应选择，可以达到尽可能小的监测阈值D₂，而且在此阈值下电磁辐射的监测阈值D₁处于其他频率下。所以，必需进行的PCR反应步骤比传统的实时定量PCR方法少。另外，最早时刻T₂也尽可能小，特别是比其他频率的电磁辐射的T₁更短。

图3表示PCR扩增中多核苷酸序列频谱分析实时检测用的按照本发明的PCR装置一个实施例示意图的部分视图。按照该实施例，辐射源20向PCR溶液11发射千兆赫和/或兆兆赫范围的电磁辐射。PCR溶液11处于基片24的接收区域23，后者用所形成的PCR溶液层厚S定义，电磁辐射21通过它进行透过照射。这样一个接收区域23目前由至少部分地受限的容积，诸如容器形成。这时，辐射频率这样调节，使之与处于该PCR溶液11中的多核苷酸序列10的预先确定的激活状态的频率一致。所照射的电磁辐射21通过接收区域23截面透射之后，用检测器22检测电磁辐射21强度相应的减弱。

此处没有使用在光学结构中一般使用的其它光学元件，诸如聚焦元件、准直元件、射线引导元件和滤光片。附加设置这样传统的光学部件来调制射线，对于专业人员来说是显而易见的。

图4表示PCR扩增中多核苷酸序列频谱分析实时检测用的PCR装置一个实施例的另一个部分视图。与图3第一实施例的接收区域23相反，按照图4的第二实施例不存在双壁接收区域23，而只有单壁，其上接纳PCR溶液11。例如，在此可以指把PCR溶液在基片的接收区域23上涂成薄膜。此外，该PCR溶液11在基片24的接收区域23上的布置在地心引力场上这样取向，使得在频谱分析实时检测期间可以保证层厚S保持恒定。此外，基片24的接收区域23还可以包含这样的结构安排，使PCR溶液11和基片24的接收区域23之间的附着力提高。例如，这样的安排是薄的表面结构，支持PCR溶液11附着在基片24上。

图5表示按照本发明的PCR扩增中多核苷酸序列频谱分析实时检测用的PCR 装置第四实施例的部分视图。其中，从辐射源20发射的电磁辐射21的方向和被检测器22检测的辐射的方向不安排在彼此的延长线上。不如说，来自PCR溶液11的电磁辐射21和/或接收区域23基片这样地偏转，使得不进行直线射线行程。这种射线行程大致在散射测量时是有利的。辐射源20和检测器22这样的相对安排还可以有助于改善不同的组件的空间安排，这有助于减小按照实施例的PCR装置的整体尺寸。

与按照图3至图5所示的电磁辐射21射线自由行程的实施例相比，在按照图6的实施例的部分视图中在一个适宜于辐射频率范围的波导管W中引导该电磁辐射21。在此，该电磁辐射21可以在波导管W中直接耦合到辐射源20，但或者只有经过适当调制之后才耦合。相应地，该波导管W可以直接与检测器22结合，或者该辐射仅为借助检测器22的检测而进行调制。该波导管W为此这样地构造，其中在接收区域23中作为渐弱的辐射场给出电磁辐射21，所以它通过与涂在波导管W外面的PCR溶液的相互作用可以导致对电磁辐射21消光。波导管W的实施方式可以包括绝缘波导结构，或者还包括集成了其他接收装置的波导段。在一个优选的实施例中，波导管W集成在芯片构造中。

图7表示以一个基于图5第四实施例的在PCR扩增中对多核苷酸序列进行频谱分析实时检测用的PCR装置实施例的部分视图，其作为另一元件示出与接收区域23的基片24相互作用的温度改变装置25。温度改变装置25这样地构造，即在与接纳PCR溶液11的接收区域23的一侧相反的一侧加热和/或冷却基片24。通过相应的热传导改变基片24的温度，使PCR溶液11的温度发生变化。若基片24的热阻小，以及温度改变装置25的加热和/或冷却功率比所涂抹的PCR溶液11的热容量大，则PCR溶液11温度变化相对迅速，并可以保征快速跟随重复的PCR反应步骤。为了改善热传导，在温度改变装置25和基片24之间可以设置支持导热的介质。在按照本发明的PCR装置的一个实施例中，该温度改变装置25可以加热和/或冷却直接引导到基片24上的气流，并在通过基片24相应的导热之后相应地改变PCR溶液11的温度。

图8表示制备PCR溶液11所必需的缓冲溶液13的消光特性13’以及待检测的多核苷酸序列10在千兆赫或兆兆赫频率范围内预先确定的激活状态下的消光特性10′。由于其折射特性，缓冲溶液13的消光在预先确定的频率范围内是可检测的变化。实验室一般用的多种缓冲溶液13都具有这种消光特性。为了 尽可能降低多核苷酸序列10的激活状态的检测噪音，可能需要选择这样一种缓冲溶液13，它在多核苷酸序列10的上述激活状态的频率范围内，具有其最小的消光特性。与此相应地，照射PCR溶液11的电磁辐射21通过该缓冲溶液13的消光，比通过PCR溶液11中多核苷酸序列10的消光小，而且多核苷酸序列10激活状态的消光检测，受到该缓冲溶液13的干扰小。通过根据待检测的多核苷酸序列10及其激活频率，相应地选择或调整缓冲溶液13，可以达到有利的信躁比。

在此要指出，所有上述部分本身都是单独进行并且在每个特别是以附图所显示的细节的组合是作为本发明本质的要求提出的。专业人员很容易由此可以作出改变。

引用符号：

10 多核苷酸序列

10′ 多核苷酸序列激活状态的消光

11 PCR溶液

12 起始物质

13 缓冲溶液

13′ 缓冲溶液的消光

14 标记

20 辐射源

21 电磁辐射

22 检测器

23 接收区域

24 基片

25 温度改变装置

26 热介质

S 层厚

W 波导管

D₁ 检测阈值

D₂ 检测阈值

T 检测的最早时刻