用于进行灌注细胞培养的方法和系统

用于进行灌注细胞培养的方法和系统

本发明涉及用于进行灌注细胞培养的方法和系统，籍此回收排放物流的上清液。

生物制造中最常用的培养模式为分批细胞培养、分批补料和灌注细胞培养。选择这些技术的其中一种的原因在于与蛋白和/或宿主相关的不同因素。细胞附着于载体上或在悬浮中进行培养。最易于操作的模式可能是分批式生物反应器。接种之后，细胞生长和生产，直至由于培养基消耗达到限制并且细胞密度开始降低。第二种非常常见的方法为分批补料，其中通过在培养期间的不同时间点添加高度浓缩的进料来防止营养限制。因此，该培养持续时间比分批模式长，并且最终生产率得到提高。

灌注细胞培养方法经不断地灌注新鲜培养基通过培养物，同时为细胞提供新鲜营养物并去除用过的培养基和任选的死细胞和目标产物，同时保留大量活细胞，允许生物反应器在长达数月的长时间段内连续运行。灌注技术的关键优势包括每生物反应器体积的更高产量、增加的灵活性和更一致的产物质量。但要实现这一点，需要非常仔细地设置系统和方法。与分批补料系统不同，灌注系统不积累废物。可将表达的蛋白快速取出并用于纯化，这对于容易不稳定的蛋白来说是显著的优势。

在保持细胞处于培养的同时去除用过的培养基可使用不同技术(如过滤，例如交替切向流(ATF)和标准切向流过滤(TFF))来完成。其他方法包括使用沉降装置、离心机或声学装置。另一个选项为通过使细胞与生物反应器中的基质(毛细管纤维、膜、固定床中的微载体等)结合而保留细胞。

关于灌注细胞培养的提供关于有利设置的详细信息的综述可见于“Perfusionmammalian cell culture for recombinant protein manufacturing-A criticalreview” Jean-Marc Bielser等人, Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340。其中死细胞只能通过排放从系统中去除的基于过滤的灌注系统描述于“Potential of CellRetention Techniques for Large-Scale High-Density Perfusion Culture ofSuspended Mammalian Cells”, D. Voisard, F. Meuwly, P.-A. Ruffieux, G. Baer,A. Kadouri,Cytotechnology28: 163-175, 1998中。

在一些灌注方法中，使用超滤膜以将产物保留于生物反应器中。这些方法也被称为“浓缩分批补料”或CFB。浓缩分批补料细胞培养可提高制造能力而无需另外的体积容量。有关这种特殊灌注方法的信息可见于William C. Yanga,∗, Daniel F. Minklera,Rashmi Kshirsagarb, Thomas Ryllb, Yao-Ming Huanga, Journal of Biotechnology217 (2016) 1-11。

图1显示现有技术的灌注细胞培养生物反应器的示意图。具有包括液体细胞培养基和细胞的细胞培养物(2)的生物反应器(1)任选地通过搅拌器3搅拌。可经Q-进入(也被称为P)添加新的新鲜培养基。包括细胞、液体培养基和目标产物的收获物流经Q-收获管线离开生物反应器(1)。Q收获通常被称为H。细胞保留装置(4)例如通过上述方法保留细胞，使得可收集无细胞或细胞减少的收获物。一般地，在灌注细胞培养中，培养基经Q-进入连续进料，而收获物经Q-收获连续取出。

一旦细胞密度达到期望的设定点，就需要去除过量的细胞以保持稳定的细胞浓度和实现稳态操作。这是经排放物流Q-排放(也被称为B)完成的。此流包括液体和固体部分，其为悬浮液。固体部分包括活细胞和非活细胞，液体部分包括液体细胞培养基以及液体中存在的废物组分和目标产物。为保持生物反应器中的恒定体积，一般Q-进入= Q-收获+ Q-排放，也称为P = H + B，意指经Q-进入新添加至生物反应器中的细胞培养基的体积需要等于经Q-收获和Q-排放取出的体积。

如例如在Jean-Marc Bielser等人, Biotechnology Advances 36 (2018) 1328-1340中讨论的，这种排放物流被浪费而没有回收目标产物。因此，为使方法产量最大化，一般使排放物流速率最小化。

然而，方法的性能和产量取决于不同的流速。增加的灌注速率通常可实现产生更多的生物量并因此产生更多的目标产物。细胞生长越快，导致产量损失的排放速率就越大。因此，稳定操作通常被限定在其中细胞密度大到足以实现经济上可行的生产率的范围内，但在其中细胞生长受营养限制或其他环境因素控制以最小化排放速率的状态下。

因此，寻不仅允许经济的细胞密度而且允许高的、更有生产力的细胞密度的方法将是有利的。已发现这可通过在生物反应器系统中插入排放物回收装置来实现。用这一装置，需要从生物反应器中取出以去除过量的活细胞和非活细胞但总是还含有目标产物的排放物首先被分离成主要包含细胞的固体部分和包含具有目标产物的液体的液体部分。然后可将液体部分引导回到生物反应器内，或者可将其引导到收获物流中。这样，排放物中存在的目标产物的主要部分不会被浪费，而是可被回收。这导致更高的方法产量并可在方法优化中实现另外的自由度，因为不再需要限制排放物流以减少目标产物的损失。如果这有利于更高的产物产量，则反而可增大排放物流。

因此，本发明涉及生物反应器系统，该系统包括具有培养基入口和收获物出口的生物反应器，一般包括细胞保留装置，籍此生物反应器另外包括具有用于排放物的入口、用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置和出口的排放物回收装置，该入口将排放物从生物反应器引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置，而该出口用于将排放物的液体部分引导至生物反应器和/或收获物中。细胞随着时间的推移和数个循环在排放物回收装置中积累。因此，优选的为柔性容器。也可在循环之间取出细胞浆液。

在优选的实施方案中，用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置为容器或袋。

在优选的实施方案中，系统另外包括用于控制排放物的液流进入排放物回收装置内，并且尤其是进入用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置内的泵，以及用于控制排放物液体部分的液流通过排放物回收装置的出口离开用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置回到生物反应器内和/或进入收获物出口内的泵。

在最简单的情况下，一根管线或管、一个泵和一个容器就足以实现排放物回收。然而，另外的管和泵可提高排放物回收装置的效率。在一个实施方案中，存在交替使用的两个单独的沉降容器，其允许准连续操作。

在优选的实施方案中，系统另外包括过程管理系统。

在优选的实施方案中，排放物回收装置的入口为管，优选为可密封的塑料管。管的密封可通过泵、通过阀门或其他锁闭机构来完成。

在优选的实施方案中，排放物回收装置的出口为管，优选为可密封的塑料管。管的密封可通过泵、通过阀门或其他锁闭机构来完成。

在优选的实施方案中，排放物回收装置的出口引导到生物反应器内。优选地，其在浸没位置(其意指在培养基和细胞悬浮液表面下方的位置)处进入生物反应器。

在另一个优选的实施方案中，用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置为用于沉降细胞的容器。

在优选的实施方案中，排放物回收装置的出口在与入口连接的相反侧和所述侧的上半部连接至用于沉降细胞的容器。

在非常优选的实施方案中，用于沉降细胞的容器为扁平容器，最小维度为其水平放置的高度。

在非常优选的实施方案中，扁平容器为塑料袋。

本发明还涉及用于灌注细胞培养的方法，其包括在生物反应器系统中培养细胞，所述系统包括具有培养基入口和收获物出口的生物反应器以及具有用于排放物的入口(将排放物从生物反应器引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置)和出口(用于将排放物液体部分从用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置引导回生物反应器中或引导至收获物出口中)的排放物回收装置，籍此

i. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次将新的细胞培养基经培养基入口插入生物反应器内

ii. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次经收获物出口从生物反应器中取出收获物

iii. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次经排放物回收装置的入口从生物反应器中取出一定量的排放物并将其引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置，分离细胞和液体部分，并通过排放物回收装置的出口将液体部分转移回生物反应器中和/或进入收获物出口内。

在优选的实施方案中，在iii中，被转移回生物反应器和/或进入收获物出口内的排放物的液体部分包含从生物反应器中取出的排放物中包含的液体的多于70%，优选多于80%，和从生物反应器中取出的排放物中包含的细胞的少于10%，优选少于5%，例如在1-5%之间，例如约1%、约2%、约3%或约4%。

在优选的实施方案中，将iii在细胞培养过程期间进行一次或数次，经排放物回收装置的入口从生物反应器中取出一定量的排放物并将其引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的包括容器的装置，允许排放物在所述容器中沉降一段时间，使得细胞向所述容器的底面沉降，之后通过排放物回收装置的出口取出沉降细胞上方细胞减少的液体上清液返回生物反应器和/或进入到收获物出口内。

在优选的实施方案中，允许排放物在容器中沉降的时间在30分钟-2小时之间。

在优选的实施方案中，对方法步骤i、ii和iii进行调整以使得生物反应器中细胞培养物的体积保持在恒定水平。此外，通过对流速B和H的高级控制，P可保持恒定，这被认为是稳态灌注操作的先决条件。

根据现有技术的灌注生物反应器系统的示意图可见于图1。根据本发明的包括排放物回收装置的灌注生物反应器系统的示意图显示于图2。

图3显示在细胞沉降之后从排放物回收装置重新进料到生物反应器内的排放物的液体部分的活细胞密度。

图4显示根据本发明具有2vvd的灌注方法的示例性流速方案。

有关图5-11的详细信息可见于实施例。

细胞培养为其中培养细胞的任何设置。

细胞培养一般在生物反应器中进行。

生物反应器为适合于细胞培养的任何容器，比如瓶、管、器皿、袋、烧瓶和/或罐。一般地，容器在使用之前进行灭菌。细胞培养一般通过将细胞在水性细胞培养基中在适合于细胞生长和/或维持的条件(比如合适的温度、pH、同渗重摩、通气、搅动等)下温育来进行，所述条件限制来自环境的外来微生物的污染。本领域技术人员知晓用于培养细胞的合适的温育条件。根据本发明使用的生物反应器优选为适合于灌注细胞培养的生物反应器。

适用于本发明的生物反应器系统包括生物反应器和在所述生物反应器中运行灌注细胞培养必需的另外设备，如以下一种或多种

- 用于搅拌的装置

- 用于向生物反应器供给组分和从生物反应器排放组分的装置，例如管、泵、阀门、储罐

- 细胞保留装置(见上文)

- 用于监测生物反应器体积的系统，例如生物反应器天平、液位传感器等

- 用于控制和保持温度、同渗重摩、通气、搅动等的装置

- 用于细胞培养生物反应器的自动化或部分自动化操作的计算机系统。

根据本发明的细胞培养基(同义使用：培养基)为保持和/或支持细胞体外生长和/或支持或保持特定生理状态的组分的任何混合物。

其可能包含未确定的组分，比如血浆、血清、胚胎提取物或者其他未确定的生物提取物或蛋白胨。优选地，其还可为化学上确定的培养基。细胞培养基可包含保持和/或支持细胞体外生长必需的所有组分或者用于添加与单独添加的其他组分组合或不组合的选择的组分(培养基补充剂)。细胞培养基的组分也被称为细胞培养基成分。

根据本发明的细胞培养装置和方法被设计成适合于生长原核细胞(如细菌细胞)以及真核细胞（如酵母、真菌、藻类、植物、昆虫和/或哺乳动物细胞）和任选的古细菌或保持/支持其生长。优选的细胞为哺乳动物细胞。

化学上确定的细胞培养基为包含化学上良好表征的‘确定的’原材料的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成均为已知的。化学上确定的培养基不包含化学上不明确的物质，如化学上不明确的酵母、动物或植物组织；它们不包含蛋白胨、饲养细胞、血清、不明确的提取物或消化物或者可贡献给培养基化学上不太确定的蛋白和/或肽和/或水解产物的其他组分。在一些情况下，化学上确定的培养基可包含化学上确定的蛋白或肽，一个实例为胰岛素(见下文其他)。

液体细胞培养基一般通过使粉状细胞培养基溶解于合适的液体中来产生。

粉状细胞培养基或干粉培养基或脱水培养基为一般由研磨方法或冻干方法产生的细胞培养基。这意味着粉状细胞培养基一般为细粒状的颗粒培养基，而不是液体培养基。术语“干粉”可与术语“粉末”互换使用；然而，除非另外指明，否则如本文使用的“干粉”仅指粒状材料的总体外观，而并非预期意指材料完全不含复合或附聚溶剂。粉状细胞培养基也可为粒状细胞培养基，例如通过辊压进行干法制粒或通过流化床喷雾制粒法进行湿法制粒。这种培养基也可通过喷雾干燥来制备。

用于制备液体细胞培养基的溶剂(也被称为液体)一般为水(最特别地为蒸馏和/或去离子水或纯化水或注射用水或通过反渗透(Milli-Q®)纯化的水)或水性缓冲液。溶剂还可包含盐水、提供合适的pH范围(一般在pH 1-pH 10之间的范围内)的可溶性酸或碱离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和醇或其他极性有机溶剂。

添加细胞之前，溶解的培养基的pH一般在pH 2-12之间，更优选在pH 4-10之间，甚至更优选在pH 6-8之间，和最优选在pH 6.5-7.5之间，和理想地在pH 6.8-7.3之间。

包含保持和/或支持细胞体外生长必需的所有组分的细胞培养基一般包含至少一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐，一种或多种缓冲剂组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分(含氮碱基)或其衍生物。其还可包含化学上确定的生物化学物质，比如重组蛋白，例如rInsulin、rBSA、rTransferrin、rCytokine等。

培养基还可包含丙酮酸钠，高度纯化并因此化学上良好确定的提取物，脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，和/或泊洛沙姆产品组分(基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)，特别是有时被称为Pluronic F 68或Kolliphor P 188或Lutrol F 68的泊洛沙姆188，和/或表面活性组分，比如化学制备的非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂的一个实例为末端为伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，也被称为泊洛沙姆，例如可从德国巴斯夫(BASF, Germany)以商品名pluronic®获得。此类泊洛沙姆产品组分在下文中仅称为泊洛沙姆或pluronic。还可添加螯合剂、激素和/或生长因子。

其可包含的其他组分为乳酸、巯基乙酸、硫代硫酸盐、连四硫酸盐、二氨基丁烷、肌醇、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、鞘磷脂、含铁化合物(包括具有铁硫簇的化合物)、尿酸、氨基甲酰磷酸盐、琥珀酸、硫氧还蛋白、乳清酸、磷脂酸、多胺(比如腐胺、亚精胺、精胺和/或尸胺)、甘油三酯、类固醇(包括但不限于胆固醇)、金属硫蛋白(metallothionine)、氧气、甘油、尿素、α-酮戊二酸盐、氨、甘油磷酸盐、淀粉、糖原、乙醛酸盐、类异戊二烯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、脂质(包括但不限于胶束中的那些)、三丁酸甘油酯、丁酸甘油酯、胆酸、脱氧胆酸、多磷酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐和/或草酸盐的纯化合物、盐、缀合物和/或衍生物。

糖组分均为单糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)或其衍生物如糖醇。糖组分也可为寡糖或多糖。

根据本发明氨基酸的实例特别地为蛋白质氨基酸，尤其是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、氨酸和缬氨酸，以及非蛋白质氨基酸，比如D-氨基酸。

酪氨酸意指L-或D-酪氨酸，优选为L-酪氨酸。

半胱氨酸意指L-或D-半胱氨酸，优选为L-半胱氨酸。

还包括氨基酸前体和类似物。

维生素的实例为维生素A (视黄醇、视黄醛、各种类视黄醇和4种类胡萝卜素)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸、烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸、亚叶酸)、维生素B12(氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺)、维生素C (抗坏血酸) (包括抗坏血酸的磷酸酯)、维生素D (麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E (生育酚、生育三烯酚)和维生素K (叶绿醌、甲基萘醌)。还包括维生素前体和类似物。

盐的实例为包含无机离子比如碳酸氢根、钙、氯离子、镁、磷酸根、钾和钠或微量元素比如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn的组分。实例为五水合硫酸铜(II)(CuSO4.5 H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2.2 H2O)、氯化钾(KCl)、硫酸铁(II)、无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、六水合氯化镁(MgCl2.6H2O)、七水合硫酸锌(ZnSO4.7 H2O)。

缓冲剂的实例为碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。

辅因子的实例为硫胺素、生物素、维生素C、钙化醇、胆碱、NAD/NADP (还原和/或氧化的)、钴胺素、维生素B12、黄素单核苷酸和衍生物、黄素腺嘌呤二核苷酸和衍生物、谷胱甘肽(还原和/或氧化和/或作为二聚体的)、血红素、氯化血红素、血红蛋白、铁蛋白、核苷酸磷酸酯和/或衍生物(例如磷酸腺苷)、辅酶F420、s-腺苷甲硫氨酸、辅酶B、辅酶M、辅酶Q、乙酰辅酶A、钼蝶呤、吡咯并喹啉醌、四氢生物蝶呤的化合物、盐、复合物和/或衍生物。

核酸组分为核碱基(如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和/或次黄嘌呤)、核苷(如胞苷、尿苷、腺苷、黄苷、肌苷、鸟苷和胸苷)和核苷酸(比如一磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷)，包括但不限于其脱氧和/或磷酸酯衍生物和/或二聚体、三聚体和/或聚合物，如RNA和/或DNA。

可添加组分，其改善培养基的物理化学特性，例如但不限于增加培养基和/或其一种或多种组分的澄清度和/或溶解度，而不会在使用的浓度下显著负面影响细胞生长特性。此类组分包括但不限于螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂、去污剂、表面活性剂、乳化剂(如聚山梨酯80)、中和剂(如聚山梨酯80)、胶束形成剂、胶束抑制剂和/或聚丙二醇、聚乙烯醇和/或羧甲基纤维素。

如本文使用的，术语“细胞密度”、“活细胞密度”和“细胞浓度”可互换地指每单位体积细胞培养物的代谢活性细胞的数量。

术语“灌注”或“灌注方法”是指用于产生目标产物(例如抗体或重组蛋白)的细胞培养方法，其中生物反应器内的高浓度细胞在细胞培养期间连续或者一次或多次接受新鲜生长培养基，籍此对可能含有目标产物的用过的培养基进行收获，这意味着在细胞培养期间连续或者一次或多次从生物反应器中被取出。优选地，将新鲜生长培养基连续进料到生物反应器内，并且连续收获可能含有目标产物的用过的培养基。

待以本发明的系统和方法进行培养的细胞特别是可为能够表达目标产物的细胞，所述目标产物例如性生物分子，比如免疫球蛋白(例如单克隆抗体或抗体片段)、融合蛋白、凝血因子、干扰素、胰岛素、生长激素或其他重组蛋白。此类细胞可为例如CHO细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、PER.C.6细胞、骨髓瘤细胞、HEK细胞等。

“稳态”一般为不随着时间推移变化或者其中一个方向的变化连续地被另一个方向的变化所平衡的稳定状态。在灌注中，稳态可通过“恒定的活细胞密度”来定义。恒定的活细胞密度与恒定的灌注速率相结合导致恒定的细胞特异性灌注速率(CSPR)，这通常被认为是实现稳态的关键标准。

一般地，为进行灌注细胞培养，将少量细胞和液体细胞培养基引入生物反应器中并选择培养条件，使得细胞分裂并因此产生增加的细胞密度，同时表达目标产物。培养可根据本领域已知的方法进行，涉及例如合适的搅动程度、添加氧气/空气、去除CO2和其他气体代谢物等。在培养期间，可控制各种参数，比如pH、电导率、代谢物浓度、细胞密度等，以提供合适于给定细胞类型的条件。细胞密度可适当地增加至其中生物反应器中的细胞浓度为至少100万个细胞/ml，优选至少1000万个细胞/ml，一般在1000万-2.5亿个细胞/ml之间的水平。上限将主要由细胞悬浮液在非常高细胞密度下的流变特性决定，其中当接近糊状稠度时，搅动和气体交换会受到阻碍。灌注方法的其他限制可能会阻止操作人员达到这一物理限制，例如最大细胞保留装置流速、最大生物反应器氧气转移速率、产物稳定性限制以及培养基允许的最低细胞特异性灌注速率(CSPR)。细胞活力可例如为至少50%，比如至少80%或至少90%。

由生物反应器中的细胞表达的目标产物的浓度可为至少0.1 g/l或至少2 g/l。一般其在0.1-5 g/l之间，但在一些方法如CFB(其中不收获产物而是将其保留于生物反应器中)中，可达到高达10-30 g/l的产物浓度。

适合于灌注细胞培养的示例性生物反应器包括细胞保留装置，以在收获期间将细胞保持于生物反应器中。这种细胞保留装置可为声学的、交替切向流(ATF)、沉降器、离心机等。在一些实例中，可使用一次性的、可重复使用的或半一次性的生物反应器。可使用硬件设计的任何组合。在一个实例中，可使用一次性细胞保留装置。在一些实施方案中，使用一次性导管、管道、泵、袋组件和细胞保留装置，而不是硬管道和可重复使用的装置。

本发明生物反应器系统的生物反应器可具有任何合适的体积，包括但不限于约1L-约2000 L，但所述体积不限于此示例性范围。某些示例性的生物反应器体积包括但不限于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、500、1000、1500 L、任何中间体积等。

示例性的生物反应器可具有任何合适的最小和最大工作体积，这取决于例如总器皿体积、器皿的高度和直径之间的比率、器皿构造(例如生物反应器是否为袋式生物反应器)、生长速率等。例如，在5 L生物反应器中，示例性的最小工作体积可在约100 mL-约1 L的范围内，和示例性的最大工作体积可在约3.5 L-约5 L的范围内。在20 L生物反应器中，示例性的最小工作体积可在约100 mL-约5 L的范围内，和示例性的最大工作体积可在约15L-约19 L的范围内。在200 L生物反应器中，示例性的最小工作体积可在约20 mL-约50 L的范围内，和示例性的最大工作体积可在约150 L-约190 L的范围内。本领域的普通技术人员将认识到，以上数值和范围为说明性的并且不预期限制本发明的范围。

生物反应器可包括一个或多个入口，也被称为入口端口，用于引入一种或多种进料(例如细胞培养基)、化学物质(例如pH缓冲剂)、消泡剂等。其还可包括一个或多个出口，也被称为出口端口，用于从生物反应器中取出细胞和/或液体。可向生物反应器中的每个入口和/或出口提供用于启动和引导流体流过入口和/或出口的任何合适的机构，包括但不限于一个或多个蠕动泵、一个或多个加压机构等。可向每个入口和/或出口提供用于监测和控制流体流过入口的任何合适的机构，包括但不限于一个或多个质量流量计、一个或多个流量控制阀等。例如，生物反应器可包括流量控制机构以控制物质进出生物反应器的流速。

生物反应器还可包括用于体积和/或水平控制的装置。

生物反应器包括培养基入口，其可在离散时间操作或连续地操作，以将新的细胞培养基引入细胞培养物内。生物反应器包括一个或多个用于释放用过的细胞培养物、细胞和/或目标产物的收获物出口。收获物出口可包括流量控制阀以控制收获物的速率。在一个实施方案中，可将收获物储存于收获瓶或容器中。

本发明的生物反应器系统另外包括排放物回收装置。可在其入口处提供流量控制阀以控制排放速率和排放提取的持续时间。

在一个实施方案中，生物反应器和/或排放物回收装置的装置(6) (图2)为柔性的无孔塑料袋，例如由柔性聚合物(例如聚乙烯材料或薄膜)制成的。一般地，袋上附有配件。如本文使用的，术语“配件”是指被焊接(例如热焊接)至无孔袋膜上以使其附接的单独物体。因此，配件通常包含可与构成无孔袋的壁的聚合材料相同或相似的聚合材料。配件通常为比无孔袋的壁更致密的材料，并且可被添加至袋中以实现功能性。配件的非限制性实例为形成入口或出口的配件。在本发明的优选实施方案中，无孔袋包括在无孔袋壁中的至少一个入口和出口，以便向袋中添加或从袋中取出液体或细胞，籍此其可为组合的入口和出口或者单独的入口和单独的出口。袋还可包括多于一个入口和/或多于一个出口。在排放物回收装置的装置(6)的情况下，袋优选包括一个入口和一个或两个出口。

一般地，管道附接至入口和/或出口。

在本发明的各种实施方案中，排放物回收装置的无孔袋为包括顶板和底板的二维一次性袋，或三维一次性台式生物反应器袋，或与支持结构一起使用的一次性生物反应器袋。无孔袋可为任何大小，例如具有1升、10升、100升、200升、500升或5000升的内部体积。

管道一般为由塑料或金属制成的柔性或非柔性管道。优选地，其为柔性塑料管道。管道的直径和长度取决于生物反应器系统的大小。一般地，管道的内径在2-50 mm之间，一般在2-30 mm之间。

一般地，生物反应器系统还包括经管道连接的泵和阀门。该泵用于将液体或悬浮液或细胞浆液从生物反应器输送至例如收获物或排放物回收装置或者用于将液体或悬浮液或细胞浆液从例如收获物或排放物回收装置输送至生物反应器或其他位置。合适的泵的实例为蠕动泵、磁耦合泵、隔膜泵等。

阀门的位置使得其可阻碍、允许或引导例如流体、细胞悬浮液或细胞浆液的流动。合适的阀门的实例为例如电磁阀或夹管阀。

生物反应器系统可包括一个或多个传感器或探头，用于实时检测一个或多个操作参数，包括但不限于入口端口的状态、出口端口的状态、多路歧管的状态、电容探头、细胞培养体积传感器、细胞培养生物反应器重量传感器、液位传感器、温度计、pH探头、氧探头、乳酸探头、氨探头、搅动速率传感器、代谢流传感器、代谢速率传感器、灌注速率传感器、一氧化碳传感器、质谱、气相谱、其组合等。这些传感器可检测一个或多个操作参数，包括但不限于活细胞密度(使用电容探头或提供细胞密度线上测量的任何备选方法)、细胞培养体积、细胞培养重量、细胞培养液位、温度、pH、溶解氧、搅动速率、代谢流、代谢速率、灌注装置的灌注速率、摄氧速率、二氧化碳产生(例如使用气相谱、质谱)、乳酸水平、氨水平、其组合等。生物反应器还可包括软传感器。

生物反应器及其入口端口、出口端口等可耦联至一个或多个过程管理系统，所述系统被配置或编程为进行传感器数据的多变量分析并基于分析实时自动控制生物反应器的操作。过程管理系统可通过例如打开/关闭入口或出口的端口，改变多路歧管的状态，改变生物反应器系统的灌注速率，改变细胞培养物的搅动速率、温度、pH、溶解氧水平、其组合等来控制操作。

排放物回收装置包括用于排放物的入口(将排放物从生物反应器引导到用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置内)和用于排放物的液体部分的出口(从用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置引导至生物反应器和/或收获物出口)。在这种情况下，收获物出口意指收获物出口的任何部分，例如管或收获物容器。排放物回收装置可由形成确定的、封闭的无菌容积的软或硬材料(如金属或优选为塑料)制成。

根据本发明的包括排放物回收装置的灌注生物反应器系统的示意图显示于图2。

具有包括液体细胞培养基和细胞的细胞培养物(2)的生物反应器(1)任选地通过搅拌器(3)搅动。可经Q-进入添加新的新鲜培养基。包括细胞、液体培养基和目标产物的收获物流经Q-收获管线离开生物反应器(1)。细胞保留装置(4)例如通过上述方法保留细胞，使得可收集无细胞收获物，并且将细胞保留于生物反应器中。应从生物反应器中取出的排放物经Q-排放从其中被提取并经入口(5)被引导到用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置(6)内，所述入口将排放物从生物反应器引导到所述装置(6)内。在该装置(6)中，排放物的细胞与排放物的液体部分分离，例如通过沉降、声学装置、过滤或离心，优选通过沉降。在这种情况下，沉降意指通过让细胞由于重力而沉降将细胞的悬浮液分离成浓缩的细胞浆液和无细胞或细胞减少的上清液。一般包含液体细胞培养基、废物和目标产物的上清液经出口(7)从装置(6)中取出。然后，其可从出口(7)被引导回到生物反应器内(根据路线a)或引导至收获物出口(根据路线b)。对于排放物回收，路线a)当然为优选的。任选地，用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置(6)还包括出口(8)，通过该出口可将细胞浆液取出并转移至废物中。在优选的实施方案中，用于液体的出口(7)的位置使得只有液体上清液经该出口取出。这例如通过定位出口的高度使得其高于沉降细胞的高度来完成。出口(7)还可包括过滤器或等效装置以防止细胞流过出口(7)。优选地，出口(7)位于装置(6)中尽可能远离入口(5)并且位于装置(6)上半部的位置，使得当通过出口(7)从装置(6)中取出液体上清液时，沉降的细胞不受液流的干扰或被液流带走。优选地，出口(7)引导回到生物反应器内。

另一方面，出口(8)为设计用于取出沉降的细胞的任选出口。在每次将排放部分分离成液体上清液部分和细胞之后，或者一旦装置(6)中沉降细胞的量使得来自生物反应器的进一步悬浮液不能插入到装置(6)内时，则经出口(8)从装置(6)中取出沉降的细胞。优选地，出口(8)位于装置(6)的底部以实现易于经重力取出细胞浆液。当然，也可经位置不同的出口通过其他方式取出细胞。排放物回收装置还可包括用于确定细胞密度的传感器或探头。入口处的细胞密度一般为生物反应器的细胞密度，但出口处的细胞密度要低得多，因为理想情况下应将尽可能少的细胞转移回生物反应器。细胞密度传感器可指示是否排放物回收装置可能太满或者细胞的沉降并不正常工作，使得太多的细胞转移回生物反应器。

入口(5)以及出口(7)和(8)一般包括带有阀门和/或泵的管道。入口和出口优选位于生物反应器中的浸没位置中。

在一个实施方案中，排放物回收装置包括均独立地连接至入口和出口的两个装置(6)。其一般还包括至少一个泵或阀门，所述泵或阀门可将来自生物反应器的悬浮液流通过入口引导到装置(6)之一内，并将液体上清液从装置(6)之一引导回到生物反应器内和/或引导到收获物内。如果存在两个或更多个装置(6)，则可通过准连续交替加载两个或者甚至更多个装置(6)进行排放物回收。当一个装置(6)装载有来自生物反应器的新的细胞悬浮液时，另一个装置(6)中的细胞可沉降，并且之后可将液体上清液引导回到生物反应器内和/或收获物内。

在一个实施方案中，排放物回收装置的入口和出口为相同的。在这种情况下，这是最简单的设置，排放物回收装置仅经一根管连接至生物反应器，该管同时为入口和出口。泵和/或阀门被用于引导流动。首先，泵将排放物从生物反应器泵送到排放物回收装置内。然后允许细胞在排放物回收装置的容器(装置6)中沉降。之后，将液体上清液泵送回到生物反应器内。这可进行数次，直至排放物回收装置容器的细胞太满而无法允许有效沉降细胞和取出上清液。

在如以上的情况下，当排放物回收装置意指在没有取出沉降细胞的情况下数次填充新的排放物时，柔性塑料袋为优选的容器类型。

本发明的排放物回收装置可通过引导回生物反应器中的出口区别于其他入口或出口系统如收获。出口也可能引导至收获，但非常优选地，一个出口引导回生物反应器内。在优选的实施方案中，排放物回收装置不连接至生物反应器系统的任何其他入口和出口或管道，但其仅具有引导进出生物反应器的入口和出口，优选其具有至少一个用于引导进出排放物回收装置的流动的泵。

本发明还涉及用于灌注细胞培养的方法，其包括在生物反应器系统中培养细胞，所述系统包括具有培养基入口和收获物出口的生物反应器以及具有用于排放物的入口(将排放物从生物反应器引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置)和出口(用于将排放物液体部分从用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置引导回生物反应器中和/或引导至收获物出口中)的排放物回收装置，籍此

i. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次将新的细胞培养基经培养基入口插入生物反应器内

ii. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次经收获物出口从生物反应器中取出收获物

iii. 在细胞培养过程期间连续或者一次或数次经排放物回收装置的入口从生物反应器中取出一定量的排放物并将其引导至用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置，分离细胞与液体部分，并通过排放物回收装置的出口将液体部分转移回生物反应器中和/或进入收获物内。

用包括排放物回收装置的生物反应器系统，可更灵活地进行灌注细胞培养。尤其是，通过在没有产物损失的情况下取出排放物，可自由地选择从生物反应器中取出的排放物的量，而无需将其限制于最低限度以减少产物损失。

在优选的实施方案中，步骤iii通过将确定量的细胞悬浮液通过入口从生物反应器泵送到用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置内来进行。在所述装置提供通过沉降分离细胞与液体的情况下，在停止泵送到用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置内之后，沉降开始，并且细胞沉降且移向装置的底部。一旦细胞已经沉降并且优选在装置的底部形成固体饼状物，就可取出液体上清液并将其进料回到生物反应器内或者可将其添加至液体收获物中。一般地，允许细胞沉降30分钟-5小时，优选30分钟-2小时。沉降也可进行更短/更快，即低于30分钟，取决于所需的细胞分离程度。对于一些方法，如果这增加了灵活性，则在排放物中去除部分细胞可能就足够了。

一般地，进料回到生物反应器内或到收获物中的液体的量多于已从生物反应器中取出并泵送到用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置内的排放细胞悬浮液体积的50%。更优选多于70 vol%，最优选在75-90 vol%之间被重新进料到生物反应器内或添加至收获物中。优选将其重新进料到生物反应器内。

优选地，重新进料到生物反应器内或添加至收获物中的排放物的液体部分不包含任何细胞。这可通过将与收获物出口处使用的装置类似的细胞保留装置(如过滤装置、声学装置等)插入排放物回收装置内来实现。尤其是如果排放物的液体部分重新进料到生物反应器内，那么并非强制其绝对无细胞。因此，当指涉排放物的液体部分时，其意指与已从生物反应器中取出并引导到排放物回收装置内的排放物相比较，其为至少细胞数量减少的排放物部分。理想地，其包含已取出的排放物中活细胞密度的少于10%，优选少于5%，最优选少于2%，例如约1%。

图3显示在细胞沉降之后从排放物回收装置重新进料到生物反应器内的排放物的液体部分的活细胞密度。可以看出VCD保持恒定，直至排放物液体部分的多于80%被重新进料。

优选地，用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置为扁平容器，其最小维度为其高度。优选地，该高度小于其他两个维度任何一个的一半，最优选小于四分之一。其他两个维度，宽度和深度，可根据应回收的排放物的量进行选择。一般这取决于生物反应器的大小。维度在10 cm-100 cm之间为合适的。

尽管用于分离排放物的细胞与排放物的液体部分的装置优选通过经沉降来分离液体上清液和细胞而起作用，但也可使用其他装置。可使用也可用于分离细胞和液体收获物的此类装置，如过滤、离心、声学装置等。

一般地，整个过程根据灌注细胞培养的常见过程要求来运行。优选地，灌注速率保持恒定，使得灌注速率(添加新鲜细胞培养基) (P) =排放速率(B) +收获速率(H)，从而实现稳态灌注。

一般地，这由过程管理系统进行调整，所述系统例如Lucullus PIMS，其例如使用程序化的步骤链，它本身读取预先调整的参数或生物反应器探头的在线信号，以经控制泵来组织灌注过程。新鲜培养基的添加例如被由离开生物反应器的收获物和排放物流动引起的生物反应器重量减少自动触发。

在优选的实施方案中，运行根据本发明的用于灌注细胞培养的方法使得生物反应器中细胞悬浮液的体积(在下文中也被称为生物反应器的液体体积)在方法的整个时间内(不包括细胞培养开始时的填充和生长阶段)保持几乎相同。根据本发明的几乎相同或恒定的体积意指生物反应器的液体体积增加至初始体积的不多于110%，优选不多于105%，并且减少至初始体积的不小于90%，优选不小于95%。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的用于灌注细胞培养的方法包括连续或半连续灌注和收获。这意味着在细胞培养的整个时间内(不包括开始时的填充和生长阶段)，将新鲜的细胞培养基连续或周期性地添加至生物反应器中，并且从生物反应器中连续或周期性地取出收获物。灌注和收获的量可能彼此独立地变化。在一个实施方案中，两个液流永远不会完全停止。

在非常优选的实施方案中，在生物反应器中具有恒定液体体积的系统中，并且优选在还具有连续或半连续灌注和收获的系统中，每次从生物反应器中取出排放物时，收获速率都会由于排放速率而降低，使得从生物反应器中取出的液体体积总量保持恒定，变化小于10%，优选小于5%。这样，新鲜培养基的进料可保持恒定。这是优选的，因为除不变的收获物取出之外，取出排放物将需要添加过量的新鲜培养基以保持生物反应器液体体积恒定，或者将会导致生物反应器内的液体体积减少。如果灌注速率P和VCD保持恒定，则CSPR也为恒定的，这是长期稳态操作的要求。

在另一个优选的实施方案中，如果将从排放物回收装置回收的液体泵送回到生物反应器内，则收获速率增加。优选地，将其增加至这样的速率，所述速率使得生物反应器的液体体积保持恒定(变化小于10%、优选小于5%)而不需要修改新鲜培养基的恒定进料。这意味着当从排放物回收装置回收的液体被泵送回生物反应器内时，收获速率会由于液体排放物重新进料的速率而增加。

图4显示根据本发明具有2vvd的灌注方法的示例性流速的方案。每个排放物回收操作包括4个依序的阶段，导致特征性的活细胞密度(VCD)曲线(带有黑点的黑线)。在第1阶段，排放泵(带有浅点的虚线)被关闭，收获泵以2 vvd运行(带有黑三角形的点线)，同时VCD正在增加。第1阶段为其中不触发排放操作的阶段。在第2阶段，排放泵被设置为2 vvd(流入排放物回收装置内)，同时停止收获速率。此时VCD由于细胞的取出和等于排放速率的新鲜培养基的进料而降低。在第3阶段，泵的开/关状态等同于第1阶段，不同之处在于排放物回收装置中的细胞沉降。在这段时间内，生物量饼状物正在积聚。第4阶段显示重新进料或排放物回收操作：排放泵或重新进料泵以-2 vvd运行(负号)，因为泵的方向反转(排放物回收装置的流出)。收获泵以4 vvd运行以补偿排放培养基的重新进料和保持2 vvd的新鲜培养基的恒定进料。在第4阶段操作期间，VCD仅由于几乎澄清的重新进料上清液中的剩余细胞而增加。当生物量超过其设定点时，这些依序阶段被重新触发。

液流的此类调节优选由过程管理系统进行调节。

本发明也适用于CFB方法。

CFB方法一般不以稳态操作，因为由于产物在生物反应器中的积累，产物通过排放的损失会极高。然而，在根据本发明的包括排放物回收装置的生物反应器中运行CFB方法并用根据本发明的方法，这也独特地允许CFB方法以稳态操作，因为排放物回收使产物损失最小化。

不由此而受到限制的情况下，通过以下实施例进一步说明本发明。上下文引用的所有文献以及2019年11月7日递交的相应欧洲专利申请EP 19207666.9特此通过参考结合。

实施例

实施例1：通过确定哺乳动物细胞的沉降速度评估排放物回收装置的设计

方法：

顶部开口且底部带有旋塞的圆柱形玻璃柱填充有细胞悬浮液(活细胞密度：30 x106 vc/mL)。圆柱形柱被垂直固定于三脚架中。然后在6小时时间段内将细胞留在柱中。然后通过读取细胞和流体的分离线来监测沉降，所述分离线可通过线下方的细胞积累和线上方几乎无细胞的流体来进行鉴定。该分离线随着时间的增加向下移动。在特定时间点读取沉降长度。用x轴上的时间[小时]和y轴上的沉降长度[cm]创建一个图表。计算趋势线，得出斜率或沉降速度。

结果

图6显示哺乳动物细胞系随着时间推移的沉降趋势线。趋势线的斜率等于沉降速度：0.6889 cm/h。

结论：

•排放物回收装置的设计如果为沉降长度短的扁平形，则其可最好地工作。短沉降长度使细胞和流体的分离时间减少成为可能。

•为处理灌注生物反应器的排放体积，排放物回收装置中的体积必须分布在更大的表面上。

•装置的安装方式必须为固定的，没有来自外部的冲击。

实施例2：生物过程操作中扁平形袋的设计的可行性测试

背景信息：

将确定设计的测试包括在灌注生物反应器操作内。在这样的生物反应器运行中，将细胞以五十万个细胞/mL的低活细胞密度接种，并扩大至32 x 106个活细胞/mL。然后开始稳态，取出否则会通过指数生长进一步积累的细胞。在该实施例中，取出的细胞被泵送到扁平的2D排放物回收袋内，而不是仅在废物中。本实验中的排放物回收操作包括沉降时间的测试、泵的适当处理和袋的设计本身的测试。待通过该实验进行回答的关键问题如下：

1. 尽可能短地沉降细胞以获得稳定的生物量饼状物/澄清的上清液需要多少时间

2. 在先前问题的前提下，可在没有增加生物量探头信号的情况下重新进料澄清的上清液吗

3. 在生物量饼状物变得不稳定之前可能的泵速是多少

4. 排放物能回收多少

方法：

为研究上述问题，实验的硬件设置设计如下：

排放泵(速度和方向可调)与天平和连接的生物反应器组合使用。在天平上放置带有2D袋组件的槽以测量流入量和流出量。

将2D塑料袋放置于白槽中并用胶带水平固定。指定的入口/出口管用通向泵的白夹子使槽可垂直关闭。槽的重量由天平控制，用于量化完全排放物回收过程液流。

2D塑料袋与灌注生物反应器的连接用特定的管组件实现，该组件由通过Pharmed泵管连接的两个可密封C-Flex管组成：

生物反应器经排放线管道通过泵与2D袋连接。安装两根可密封的C-Flex管用于无菌连接，并且一根管用于泵。集成样品端口以控制流入和流出液流，用于活细胞密度和细胞活力。

可密封的末端之一还含有样品端口，用于进入到排放物回收装置内的相应排放悬浮液或/和返回到生物反应器内的相应澄清的上清液的VCD控制。安装样品端口以回答问题1.)、3.)和4.)。

与直接安装于生物反应器控制单元上的常用排放泵不同，使用了其泵速和方向可变化的独立泵。问题2.)的答案将源自生物量信号的读取。

在该实验中进行具有以下过程步骤的描述的硬件设置的3次运行。目标是排放每天排放总量的一半。基于前一天的排放量计算排放的一半：

1. 以120 rpm (39.2 mL/min)的最大泵速从生物反应器中排放出计算的量

2. 排放物沉积120分钟

3. 以不同速度重新进料上清液/在线控制VCD生物量信号监测

结果：

图7描述排放物回收过程的依序步骤：(1) 将细胞悬浮液排放出生物反应器；(2)沉降/流体和细胞颗粒的分离；(3) 澄清的上清液的重新进料操作。

图8说明用两种不同泵速的运行1的澄清的上清液的重新进料过程(流出)。如果生物量饼状物被泵破坏，则应用2.29 mL/min的较低泵速进行测试。即使在32 mL/min下，生物量饼状物也保持稳定。与排放量相比较，湿生物量的剩余份额为约9.6%。

图9说明使用样品端口对活细胞密度的等效测量。在测量3.3 x 106 vc/mL的初始细胞密度之后，其稳步降低至低于0.5 x 106 vc/mL。初始较高的细胞密度来自粘附于样品端口管道中的细胞簇。曲线的垂直增加指示生物量饼状物破坏的点或重新进料至生物反应器的上清液的最大值。

所有运行的概述：

结论：

进行实施例2的实验以回答以下问题：

1. 尽可能短地沉降细胞以获得稳定的生物量饼状物/澄清的上清液需要多少时间

该实验的设置测试了120分钟的沉降时间。在该段时间内，积聚了稳定的生物量饼状物。稳定性通过泵速增加和细胞密度监测得到证明。在从2.29至约30 mL/min的增加的泵速下，只要排放物的最大流体被回收，它就一直得以保持。

2. 在先前问题的前提下，可在没有增加生物量探头信号的情况下重新进料澄清的上清液吗

问题的相关性得以给出，因为生物量信号为稳态灌注生物反应器中排放过程的触发影响因素。在重新进料过程期间，生物量在2-4 pF的范围内增加。为评价此增加的相关性，应考虑稳态操作中生物量信号的正常波动。由于细胞保留装置的交替切向流过滤或进料/收获过程，细胞浓度和因此的生物量信号随着时间的推移周期性变化。可观察到的范围也在如排放物回收操作的重新进料期间观察到的范围内。在本专利的概念中，可得出以下结论：

i. 生物量信号保持在允许灌注过程在稳态下进一步进展的范围内

ii. 冗余工作的排放物回收装置/过程将易于补偿触发排放操作的生物量信号的更高增加。

3. 在生物量饼状物变得不稳定之前可能的泵速是多少

在运行1中，测试了2.29至32 mL/min的泵速增加。那里的生物量饼状物没有以任何方式被破坏。

4. 排放物能回收多少

与生物量饼状物被破坏(由对照样品中细胞密度的增加指示)之前的排放量相比较，剩余湿生物量饼状物的份额在9.47%-14%的范围内。

这些问题有助于进一步设计下一个实验，其中测试了从排放物中回收产物的2天稳态操作。

实施例3：稳态灌注中的排放物回收操作

背景信息：

实施例2回答了有关技术可行性的基本问题。实施例3描述补充实验，显示在没有操作中断的情况下灌注稳态操作中排放物回收概念的整合。待通过该实施例进行回答的问题为，作为稳态控制的主要参数的生物量信号是否终止于与开始排放物回收操作之前类似的水平。

方法：

灌注生物反应器与哺乳动物细胞系和适当的培养基在灌注中一起运行(灌注速率= 3.66 vvd)，首先扩大然后过渡至稳态操作，生物量信号设定点为86.5 pF (50 x 106vc/mL)。根据前一天的排放量(0.66 vvd = 2772 g)，计算每天排放量的估计值并将其除以2用于每天两次排放物回收操作。当排放物回收操作开始时，关闭生物量的自动化稳态控制以手动控制与排放物回收组合的稳态(参见图5A)。

从概念上讲，灌注速率需要在整个排放物回收操作期间保持恒定。在每天两次排放操作(每天快速取出一半排放量)期间，将等量的新鲜培养基进料到生物反应器内，在这种短时间段内大幅增加灌注。另一方面，当没有排放操作时灌注速率会降低。这样，每天的总灌注速率保持恒定，尽管其在一天内发生变化。

实验分为两个阶段(图5B)：在第1阶段的排放操作之后，将细胞悬浮液直接重新进料回到生物反应器内，而在第2阶段，在排放和重新进料之间应用60分钟的沉降时间。两个阶段均含有两个排放物回收操作。

结果：

在图10中，可以看到实验的第1阶段：

在130分钟内以31 rpm (= 640 mL/h; P = 3.66 vvd)的排放#1/2 (排放量1386g)，无沉降：进行3步排放操作，与86.5 pF的初始设定点相比较，最终生物量信号为93.2pF。

在实施例3的第1阶段和第2阶段之间，将生物反应器中的生物量调节至86.5 pF以具有相等的起点。在图11中，可以看到实验的第2阶段。

在130分钟内以31 rpm (= 640 mL/h; P = 3.66 vvd)的排放#1/2 (排放量1386g)，1小时沉降：进行3步排放操作，最终生物量信号等于86.5 pF的设定点。

结论：

在该实施例中，排放操作被集成到真实灌注生物反应器的稳态内。测试了两种不同的沉降形式以评估生物量信号是否达到与排放物回收操作之前相同的值。在没有沉降时间的情况下，排放物的重新进料导致生物反应器中的生物量增加，而60分钟的沉降适合于以与排放物回收之前相同的生物量信号结束。与具有120分钟沉降时间的实施例2相比较，在实施例3中60分钟似乎为有效的。这可通过该设置中130分钟的较长排放时间(其中细胞可已经开始沉降)来解释。实施例3显示对稳态灌注过程的一般适用性。可用该实施例计算出在没有和具有排放物回收情况下的总收获量的计算(表2)：

表2：在没有和具有排放物回收操作情况下的稳态灌注生物反应器之间所得收获物的比较。除通常的收获产率——3.00 vvd的排放物流之外，0.66 vvd的排放(没有回收操作)进一步分离成最终成为废物的约0.14 vvd的湿生物量饼状物和被回收并累加到收获产率的0.52 vvd。该实施例中的排放物回收操作可将总收获产率从82%提高到96%。

在实施例3中，与没有排放物回收的标准稳态方法相比较，可多收集17%的收获物。