离子交换谱法中改进的蛋白质分离

离子交换谱法中改进的蛋白质分离

本发明涉及改进的制备（>5克/升）蛋白质分离。这些改进通过结合用于制备蛋白 质分离的盐和pH梯度并基于通过结合的盐-pH梯度运行产生的数据开发制备分步洗脱蛋白 质分离来实现。

发明背景

蛋白质异质性因体内翻译后修饰而产生，或经由化学和酶促反应人工产生，或因机械 应力、高温或极端pH作为发酵和纯化过程中的副产物产生[1-4]。与mAb相关的蛋白质异质 性包括但不限于电荷变体（如酸性和碱性变体）、糖基化变体和尺寸变体（如聚集体、单体、 片段、Fab和Fc残基）[5-7]。在性mAb中，此类产物变体导致不同的药代动力学和药效动 力学，这将影响药物的稳定性、功效和效力[1]。因此，它们必须被彻底剖析并从最终产品池 中除去。

液相谱法（LC）用作mAb生产的标准纯化工具[8]。用于mAb的通用下游工艺（DSP） 包括但不限于A蛋白亲和谱法（AC）、离子交换谱法和疏水作用谱法（HIC）[9]。IEC（离 子交换谱法）如强阳离子交换谱法（SCX）、弱阳离子交换谱法（WCX）和弱阴离子交换 谱法（WAX）以分析规模广泛使用以分离具有非常相似的等电点（pI）的mAb电荷变体与其 它蛋白变体，其包括但不限于尺寸变体、糖基化变体、甲硅烷基化变体（silylation variant）和C-端/N-端加工变体[7、10-14]。虽然使用具有固定pH值的氯化钠的浅盐梯度斜 率可用于表征mAb变体，其在电荷变体分离中的应用是蛋白特异性的，并必须针对个别mAb 进行优化[15]。谱聚焦（CF）是盐梯度的替代，其中使用聚两性电解质缓冲剂在该柱内部 [16-21]或通过在该柱入口处混合两种具有不同pH值的适当的缓冲剂（其随后流通穿过该 柱）在外部[22-26]生成pH梯度。取决于相应的pI值，mAb电荷变体在pH梯度中的不同点处聚 焦，并因此导致高分辨的峰[27]。

高性能CF在IEC中用于mAb电荷变体分离的初始应用限于具有7.3至9.0的pI范围 的中性与碱性mAb[28-29]。近来发现，这种应用谱系可以通过调节pH梯度中的离子强度扩 展至酸性mAb（pI = 6.2）[29]。据报道[29]，在提高和受控的离子强度下的pH梯度已经对酸 性、中性和碱性获得更好解析的峰。虽然上述实例描述了分析规模下盐介导的pH梯度对mAb 电荷变体分离的成功，Kaltenbrunner等人[30]在更早时已经声称他们的使用甘露醇、硼酸 盐和氯化钠的pH-盐混合梯度能够在制备规模上分离mAb同种型。他们已经使用由pH 7.0至 9.1的递增pH梯度结合递减的盐梯度来分离具有8.15至8.70的pI的同工蛋白质。

但是，在他们的方法中发现了一些限制、缺点和矛盾。例如，他们建议的方法仅适 于分离糖蛋白同种型，其在多个碳水化合物侧链方面不同[29-30]。这限制了此类梯度体系 的使用仅限于糖基化蛋白质，由此令其对其它类型的mAb变体如电荷或尺寸同种型而言不 切实际。尽管其声称提高的峰间分辨率归因于pH-盐混合梯度，在含有顺式二醇的寡糖与缓 冲剂组分硼酸盐之间的非特异性反应是否对所述改进的分离具有显著影响还不清楚[29]。 此外，它们的所谓同工蛋白质的“制备”分离仅为0.5毫克mAb/毫升填充树脂[30]，这对生产 规模分离仍然太低。

迄今为止，对WCX–Fractogel® COO^-（M）报道了使用pH-盐混合梯度体系的生产规 模（≥ 30毫克/毫升）mAb电荷变体分离[31]。但是，使用乙酸盐产生了递增的pH梯度伴随着 递增的盐梯度体系，并且其仅涵盖了5至6的非常狭窄的pH范围，由此将这种方法限于具有 大约5.6的洗脱pH的mAb。应当指出，在他们的pH-盐混合梯度中使用的pH范围非常接近于羧 基官能团的pKa（pKa = 4.5）。对于WCX，已知的是除了流动相中使用的缓冲物类外，树脂主 链上的官能团也将导致瞬时pH变化，尤其在接近羧基基团的pKa的pH处[32-33]。由于他们 的研究中使用的pH范围非常接近于羧基基团的pKa，有理由预测，除了流动相中使用的乙酸 盐之外，树脂主链上部分质子化的羧基基团也将向该梯度体系提供一定的缓冲容量。此外， 还不清楚该混合pH-盐体系中的pH梯度是否由单独的乙酸盐缓冲剂产生，或是否其为羧基 基团与乙酸盐的组合效应。同样，还不能确定这种效应是否在电荷变体分离中起主要作用。 同样，对这种类型的树脂推荐的正常工作pH范围为6至8，在该范围中，羧基基团将充分脱质 子化（即离子化）。如果其在低于6的pH值下工作，该WCX可能遭受容量损失。尽管在他们的研 究中报道了38至54克/升填充树脂的高结合容量[31]，这一结果可能是蛋白质特异性的，这 与论文中的最终信息一致——即他们的研究中显示的分离效率仅针对特定的抗体。对高于 6的pH未给出其它分离实例和在他们的研究中没有使用其它抗体的事实令该方法用于分离 其它mAb的适用性存在疑问。

几个专利[34-36]要求保护CEX和混合模式谱（MMC）用于mAb变体分离的用途，其 包括但不限于从mAb中清除酸性、碱性、脱酰胺基或二醇-变体。尽管如此，在这些权利要求 [34-36]中应用盐浓度或pH值一次一变的单梯度洗脱和分步洗脱。此外，除了产物——mAb 之外，该进料仅包含一种类型的电荷变体——酸性变体[34-36]，其是相对“纯”的。

要解决的问题

因此，本发明的目的是提供通过使用离子交换谱法分离和纯化所述蛋白质的改进方 法，该方法消除了所述问题和缺点，特别地，该方法考虑了蛋白质包括肽，尤其是蛋白质包 括mAb、任何mAb或其它蛋白质同种型、电荷变体、mAb片段、mAb加合物、双特异性mAb、任何部 分衍生自抗体构建体的蛋白质如Fab，mAb与其它蛋白质或更小的分子的组合如ADC。这意味 着，本发明的目的还在于分离这些蛋白质产品以便以最高可能纯度分离所需产物。

特别地，本发明的目的是提供一种制备方法，通过该方法可以在单一道次中将较 大量的蛋白质结合到谱载体材料上，另一方面，通过该方法，这些蛋白质可以分离成单个 组分并可以清除不想要的成分。

发明概述

本发明由此涉及由蛋白质混合物纯化蛋白质的方法，通过：

a）提供包含至少两种不同蛋白质的样品，

b）以≥5毫克/毫升、尤其≥30毫克/毫升、特别≥60毫克/毫升的总蛋白质负载将该混 合物施加至离子交换材料，

c）通过递增的pH和递减的盐浓度来运行相反的pH-盐梯度以分离蛋白质，或相反运行 递减的pH和递增的盐浓度，或运行渐增的pH梯度，或运行渐减的pH梯度，

d）利用来自c）的分离数据限定和运行用于蛋白质分离的分步洗脱曲线，和

e）在逐步洗脱中分离该蛋白质。

根据本发明，蛋白质分离还可以在步骤d）中在梯度洗脱中进行。

由此，根据本发明，因此将蛋白质混合物吸附或结合到离子交换材料上并再次洗 脱。根据待分离的蛋白质混合物的性质，用于纯化的方法可以使用阳离子交换材料、阴离子 交换材料或混合模式谱材料来进行。

本发明的分离方法可以通过经由施加至少两种缓冲溶液的缓冲体系以产生pH梯 度来处理，由此在一种缓冲溶液的存在下发生蛋白质的所需吸附或结合，并且在渐增浓度 的另一缓冲溶液的存在下发生洗脱，而pH递增且盐浓度同时递减或相反——其中pH递减且 盐浓度同时递增。适于产生pH梯度的缓冲体系采用MES、MOPS、CHAPS等等，以及使用氯化钠 的电导率改变体系。在本发明的修改形式中，施加这些产生pH梯度的缓冲溶液可以与否则 不变的体系或具有恒定或逐渐改变的盐浓度的体系结合。

如果在c）中pH在4-10.5范围内变化且盐浓度在0-1 M盐范围内改变的话，获得良 好的分离结果。

如果通过施加在pH 5至9.5之间调节的缓冲体系产生pH梯度和如果在0-0.25 M的 浓度范围内产生盐梯度的话，该分离结果尤其良好。

如前所述的本发明的方法的特征在于通过施加至少两种缓冲溶液的缓冲体系来 产生的pH梯度，并且在于在第一缓冲溶液的存在下吸附或结合蛋白质，并且在于在渐增浓 度的另一缓冲溶液的存在下洗脱，而pH值递减且盐浓度同时递增。

特别地，在本发明的方法中，从蛋白质混合物中分离单克隆抗体（mAB）。将它们从 其相关的电荷变体、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体、二聚体和聚集体、单体、2/3片段、¾ 片段、一般片段、抗原结合片段（Fab）和Fc片段中分离并纯化。

总之，本发明涉及其中通过在离子交换谱法中使用相反的pH-盐梯度并利用纯 化方案，如离子交换谱法中的分步洗脱纯化来分离蛋白质，如单克隆抗体的方法。使用相 反的pH-盐梯度来确定最佳操作条件，由此开发该纯化方案。结果，能够获得改进的蛋白质 分离效率，并可以在优化条件下进行所需蛋白质的逐步洗脱。

发明详述

本文中公开的本发明涉及在离子交换谱法（IEC）中相反的pH-盐混合梯度洗脱。更特 别地，本发明涉及应用递增的pH梯度结合递减的盐梯度用于从其相关的电荷变体（例如酸 性与碱性单体）、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体（例如聚集体、单体、2/3片段、抗原结合 片段(Fab)和可结晶片段(Fc)）中制备分离单克隆抗体（mAb）。

不同于前述专利中要求保护的单梯度洗脱和使用盐或pH变化的分步洗脱[34- 36]，由递增的pH梯度结合递减的盐梯度组成的本发明的相反的pH-盐混合梯度用于IEC，优 选CEX，最优选SCX以便分离mAb变体如电荷变体、糖基化变体、2/3片段、Fab、Fc以及来自该 产物的聚集体。

与这些专利[34-36]中公开的使用相对“纯”的进料（仅一种电荷变体类型）不同， 本发明的进料可以包含超过一种电荷变体类型。

由此，包含应当分离的蛋白质物质的生物溶液首先与适当的缓冲溶液混合。随后 将接收到的混合物供应至离子交换谱柱，带电荷的基团和蛋白质、肽或片段、其聚集体、 同种型和变体与强阳离子交换（SCX）固定相紧密结合。为了回收该分析物，随后用中和该离 子相互作用的溶剂洗涤该树脂。中和洗涤与洗脱用合适的缓冲溶液的混合物来进行。最优 选的合适的生物缓冲剂选自提供4.5至10.5的pH的那些。上文已经提及了合适的缓冲剂。可 以在互联网上到许多合适的缓冲剂：http://www.hsbt.tw/pdf/Biological% 20Buffers.pdf。合适的缓冲剂优选包括称为MES、MOPS、CHAPS、HEPES的缓冲剂。但是还存在 可以使用的其它缓冲剂或缓冲溶液，只要它们不显示干扰与所需分离产物或与分离材料的 反应或相互作用。

高负载下的pH梯度分离是可能的，因为低起始pH值允许高蛋白质结合容量，尤其 是在强阳离子交换树脂上。由于修饰如唾液酸化（sialylation）、脱酰胺基化和C-端赖氨酸 截短等等，mAb可以是高度异质的。

盐梯度阳离子交换谱法已经成功用于表征mAb电荷变体。但是，常常需要额外的 努力来调整用于个别mAb的盐梯度方法。在快节奏的药物开发环境中，需要更通用的平台方 法以适应大多数mAb分析。

在2009年，Farnan和Moreno报道了一种使用pH梯度离子交换谱法分离mAb电荷 变体的方法。用于生成该pH梯度的缓冲剂由哌嗪、咪唑和Tris组成，覆盖了5至9.5的pH范 围。虽然观察到良好的分离，但是pH提高的斜率在开始时很浅，并在接近尾声时变得陡峭 [15]。

现在，通过自己的试验已经发现，在用于阳离子交换谱法的新颖的pH梯度法结 合盐梯度法中，改进的蛋白质A、mAb和相应的同种型的纯化是可能的。对缓冲剂配制品选择 几种缓冲剂物类，并用氢氧化钠调节该缓冲剂的pH。该方法的特征在于多组分缓冲体系，其 中线性梯度由100%低pH缓冲剂（大约5的pH）的洗脱剂运行至100%高pH缓冲剂（大约9.5至 10.5的pH）的洗脱剂。调节各缓冲剂物类的浓度以实现线性递增或递减的pH洗脱曲线。合适 的缓冲剂组合物公开在以下实施例中。除此之外，提供的实施例还显示了如何结合线性递 增的pH梯度方法与递减的线性盐梯度方法以便更好地使用强阳离子交换树脂进行分离。为 了证实实现了线性pH梯度，可以使用简单的在线pH计。可以在不同的容器中提供不同的缓 冲溶液并将其进料到该柱中，从而在该柱中设置所需pH。但是还有可能将适当量的来自该 容器的不同缓冲溶液混合在一起并在分离过程中以递增的pH将该混合的缓冲溶液引入该 柱中。预混合缓冲溶液的优点在于无需在分离柱中调节pH值，并且与离子交换剂结合的蛋 白质混合物发生pH的均匀改变。

一旦在初始运行中建立了目标mAb的适当pH洗脱范围，可以通过在更狭窄的pH范 围内运行更浅的pH梯度简单地实现分离的进一步优化。

由于采用了强阳离子交换谱法（SCX），不存在来自固定相的缓冲效应的干扰。该 强阳离子交换（SCX）固定相通常由颗粒状或整块材料组成，其含有在水溶液中带负电荷的 基团。这些带电荷基团与蛋白质、肽或其片段、聚集体或同种型和变体之间的相互作用导致 这些碱性分析物的紧密结合。通常，所述SCX材料具有磺丙基、磺基异丁基、磺乙基或磺甲基 基团。此类固定相的实例是交换剂材料如Eshmuno^® CPS、Eshmuno^® CPX或SP Fast Flow Sepharose^®、Eshmuno^® S Resin、Fractogel^® SO₃ (M)、Fractogel SE Hicap (M)、SP Cellthru BigBead Plus^®、Streamline^® SP、Streamline^® SP XL、SP Sepharose^® Big Beads、Toyopearl^® M-Cap II SP-550EC、SP Sephadex^® A-25、Express-Ion^® S、Toyopearl^® SP-550C、Toyopearl^® SP-650C、Source^® 30S、Poros^® 50 HS、Poros^® 50 XS、SP Sepharose^® Fast Flow、SP Sepharose^® XL、Capto^® S、Capto^® SP ImRes、Capto^® S ImpAct、Nuvia^® HR-S、Cellufine^® MAX S-r、Cellufine^® MAX S-h、Nuvia^® S、UNOsphere^® S、UNOsphere^® Rapid S、Toyopearl^® Giga-Cap S-650 (M)、S HyperCel Sorbent^®、 Toyopearl^® SP-650M、Macro-Prep^® High S、Macro-Prep^® CM、S Ceramic HyperD^® F、 MacroCap^® SP、Capto^® SP ImpRes、Toyopearl^® SP-650S、SP Sepharose^® High Perform、 Capto^® MMC、Capto^® MMC Imp Res、Eshmuno^® HCX、Nuvia^® High c-Prime等等。

适于本发明的分离方法的SCX材料是平均粒径>30 µm、优选≥40 µm、尤其优选为 50-100 µm的颗粒材料。

应当根据蛋白质的pI选择合适的阳离子交换（SCX）固定相和该缓冲体系。这意味 着为了洗脱经由非共价离子相互作用结合到该离子交换树脂上的蛋白质，必须通过与竞争 盐的相互作用或通过中和来削弱离子相互作用。

或者并取决于操作条件和蛋白质的pI，也可以使用弱阳离子交换树脂，如 Fractogel^® EMD COO (M)、CM Sepharose^® HP、CM Sepharose^® FF、Toyopearl^® AF Carboxy 650-M、Macro-Prep^® CM、Toyopearl^® GigaCap CM、CM Ceramic Hyper^® D、或Bio- Rex^® 70。

取决于蛋白质的pI，可以使用阴离子交换树脂（SAX）。强阴离子交换树脂的实例是 Fractogel^® EMD TMAE (M)、Fractogel^® EMD TMAE Medcap (M)、Fractogel^® EMD TMAE Hicap (M)、Eshmuno^® Q、Eshmuno^® QPX、Eshmuno^® QPX Hicap、Capto Q、Capto Q ImpRes、Q Sepharose^® FF、Q Sepharose^® HP、Q Sepharose^® XL、Source^® 30Q、Capto^® Adhere、Capto^® Adhere ImpRes、POROS^® 50 HQ、POROS^® 50 XQ、POROS^® 50 PI、Q HyperCel、Toyopearl^® GigaCap Q 650-M、Toyopearl^® GigaCap Q 650-S、Toyopearl^® Super Q、YMC^® BioPro Q、 Macro-Prep^® High Q、Nuvia^® Q或UNOsphere^® Q。

或者并取决于操作条件和蛋白质的pI，也可以使用携带二乙基氨基乙基（DEAE）或 二甲基氨基乙基（DMAE）官能的弱阴离子交换树脂。实例是Fractogel^® EMD DEAE、 Fractogel^® EMD DMAE、Capto^® DEAE或DEAE Ceramic HyperD^® F。

现在，如上文已经提及的那样，出乎意料地发现，从生物流体中分离包含蛋白质、 肽或片段、聚集体、同种型和变体的混合物可以通过运行相反的pH-盐混合梯度而以优异的 结果来进行，这意味着递增的pH和同时递减的盐浓度，或反之亦然，以分离蛋白质。梯度洗 脱是指具有变化的pH的洗脱缓冲剂中盐浓度的平滑转换，这里主要是从高盐浓度向低盐浓 度的转换。为了生成适于该分离方法的条件，将两种缓冲溶液以合适的盐浓度混合。

相反的pH-盐混合梯度的这些条件允许以改进的分辨率分离多个连续的级分并收 集它们，同时以线性方式调节洗脱条件、pH和盐浓度。相反的pH-盐线性梯度为离子交换 谱法和疏水作用谱法提供了最高分辨率，并可以收集大量的连续级分。

为了进行本发明的分离，优选将高盐浓度添加到具有低pH的缓冲溶液中。优选在 不添加盐的情况下使用具有高pH的缓冲溶液。如果所得两种缓冲溶液逐渐混合在一起并直 接在混合后逐渐引入该分离柱，该洗脱溶液的pH经时提高，而盐浓度同时降低。

通常，NaCl是可用于进行不同蛋白质级分的结合域洗脱过程的盐，因为改变NaCl 浓度与改变电导率结合，这影响了结合到离子交换剂的蛋白质的带电荷基团的结合强度。

一旦建立用于分离蛋白质混合物的相反pH-盐混合梯度的适当条件，不同蛋白质 级分的单个峰可以分配至从混合物中发生分离的最佳条件。这些条件可用于逐步洗脱各种 所需的蛋白质级分。在以下实施例中，显示了该原理的应用。

在下面，例示了其中进行至少三种产物电荷变体和至少三种产物尺寸变体的分离 的试验。发现根据本发明在单次谱运行中成功地解析了如上列举的这些变体。

如果使用简单的缓冲体系取代聚两性电解质缓冲剂以覆盖4.5至10.5的宽pH范 围，并且如果使用氯化钠来产生该盐梯度，可以实现这种令人惊讶的分离结果。通过在柱入 口处外部混合两种具有不同pH值和氯化钠浓度（即A具有低pH和高盐浓度；B具有高pH和低 盐浓度）的缓冲剂（即A和B）生成所述相反的pH-盐混合梯度，其随后运行流通该柱。

该试验表明，在低负载和在非常高的负载下，当相应地控制该过程时用各种蛋白 质可以实现良好的分离。在极高负载下获得的结果是特别令人信服的，因为通常存在早期 穿透，无法实现蛋白质的适当分离。

在低负载（≈1毫克/毫升填充树脂）下、在较高负载（≥ 30毫克/毫升）下和在极高 负载（≥ 60毫克/毫升）下，对含有各种mAb同工蛋白质的三种不同进料提供了示例性多产 物分离实例。对该分离，测试了不同的梯度类型，如盐梯度、pH梯度、平行的pH-盐混合梯度 和相反的pH-盐混合梯度。在低负载下的结果显示，盐梯度适于分离尺寸变体（即用于聚集 体和单体），而pH梯度适于电荷变体分离（即用于酸性、中性和碱性单体）。令人惊讶地，在相 反的pH-盐混合梯度体系中实现了对二者——尺寸变体与电荷变体——的最佳分离。

这些试验的另一令人惊讶的结果在于，蛋白质负载≥ 30毫克/毫升的较大负载能 够以制备规模实现良好的分离，而不会受困于分离效率的损失。

大量试验的结果表明，使用递增的pH梯度与递减的盐梯度使得蛋白质变体将不仅 经受线性pH梯度中的聚焦效应，还同时经受降低的盐浓度造成的蛋白质迁移速度的减缓， 由此导致改进的分辨率。Zhou等人[31]也已经使用乙酸钠作为唯一的缓冲组分，同时他们 使用在提高浓度下的相同盐以产生递增的电导率梯度。由此，他们仅使用一种盐类型来伴 随地产生平行的渐增pH与电导率梯度。由于乙酸盐的pKa，使用这种类型的缓冲体系生成的 pH梯度仅限于4.8至6.2的pH范围[29、31]。与此相反，本试验显示，如果流动相由使用MES、 MOPS、CHAPS等等的缓冲体系和使用氯化钠的电导率改变体系组成，可以实现有利的结果。 因此，本发明的核心与Zhou等人所提出的不可相比[31]。本发明的混合梯度体系利用覆盖 了4.5至10.5的宽pH范围的常见缓冲体系。这提供了分离具有酸性、中性或碱性pI值的宽范 围的mAb的优点。由于使用SCX，在4.5至10.5的pH范围内与具有羧基配体的WCX相比不存在 来自固定相的缓冲效应的干扰。与Kaltenbrunner等人[30]描述的pH-盐混合体系相比，其 缓冲体系利用在甘露醇的顺式二醇基团与硼酸盐的反应中释放的羟基离子以便在流动相 中实现酸性pH值，应用简单缓冲剂体系的本发明的体系在根本上不同。本发明的特定优点 在于在流动相中的缓冲剂组分和蛋白质之间不存在非特异性结合，如在使用硼酸盐缓冲剂 的情况下。在DSP中，高动态结合容量总是优选的。同时，还期望具有低电导率的产品池，以 使洗脱液可以在需要时直接装载到下一IEC上，这可以节省对中间稀释或脱盐步骤的需要。 本文中公开的相反的混合pH-盐梯度体系非常好地用于这些目的，因为已经发现，如果向起 始缓冲溶液中添加某些盐，动态结合容量（DBC）提高，并且采用递减的盐梯度可以获得在较 低电导率下的洗脱。还经由递增的pH梯度的谱聚焦效应，促进了蛋白变体之间良好的分 离。最后但同样重要的是，已经提及，本文中公开的方法适于蛋白质负载≥ 30毫克/毫升的 制备规模的mAb变体分离，而不会受困于分离效率的损失。除此之外，使用梯度洗脱的分离 过程可以直接转化为使用类似缓冲体系的分步洗脱。此外，高蛋白质负载进一步强化了本 发明的有用性。

已经进行了各种试验，由此在下文中公开了实施例的选择。这些实施例显示了可 以如何不同地实施所要求保护的方法。通过对工艺参数的简单调节，可以分离和纯化不同 的蛋白质级分，其分离通常是困难的。由此，可以更少地改变该pH梯度或仅改变盐浓度几毫 摩尔。另一变体包括选择谱材料。通常，阳离子交换材料是合适的，如Eshmuno® CPX，但 是根据所需分离也可能使用阴离子交换材料或混合模式谱材料（MMC）。混合模式谱材 料含有多模式官能的配体，其能够通过离子相互作用、氢键和/或疏水作用的组合进行蛋白 质吸附。合适的混合模式分离材料是Eshmuno® HCX。因此，使用不同的离子交换材料也会 导致不同蛋白质级分的特征分离。

适于蛋白质分离和纯化的阴离子交换材料是市售的，例如Sepharose Q ™ FF （Amersham-Biosciences/Pharmacia）、Capto® Q ImpRes、DEAE Sepharose® Fast Flow、 Q Sepharose Fast Flow（GE-Healthcare）、Fractogel® EMD DEAE(M)、Fractogel® EMD TMAE(M)、Eshmuno® Q（Merck KGaA）、Econo-Pac^®（Bio-Rad）、Ceramic HyperD等等。根据蛋 白质混合物和包含的杂质，另一离子交换剂可以导致最佳分离结果。

本说明书使得本领域技术人员能够全面应用本发明。即使没有进一步的评论，假 定本领域技术人员将能够在最宽范围内利用上述说明。

从事常规实验室工作的从业人员将能够利用本文中的教导在新方法中有效分离 上文限定的蛋白质，所述新方法利用了纯化方案，如在离子交换谱法中的分步洗脱纯化， 开发利用相反的pH-盐梯度用于确定最佳操作条件。

如果还有什么不清楚的地方，要理解的是，应参考引用的出版物和专利文献。因 此，这些文件被认为是本说明书的公开内容的一部分。

为了更好地理解且为了阐述本发明，在下文中给出了实施例，这些实施例在本发 明的保护范围内。这些实施例也用于阐述可能的变体。但是，由于所述发明原理的一般有效 性，实施例不适于将本申请的保护范围仅缩小至这些实施例。

此外，对本领域技术人员不言而喻的是，在给出的实施例中和在说明书的剩余部 分中，存在于组合物中的组分量加起来总是仅为100重量%或摩尔%，基于作为整体的组合 物，并且不能超过这一数值，即使从所示百分比范围可以出现更高的值。除非另行说明，%数 据是重量%或摩尔%，除了以体积数据显示的比率之外，如洗脱剂——为了制备洗脱剂，特定 体积比的溶剂用在混合物中。

实施例和说明书以及权利要求书中给出的温度总是以℃为单位。

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实施例

实施例1

使用IEC制备分离mAb A电荷变体

如下进行制备谱运行：

设备：ÄKTApurifier 100

柱：Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 平均粒度50 µm, 离子容量60 µmol/mL, 柱 尺寸8 i.d.×50 mm (2.5 mL)

进料：MAb A后蛋白质A池

流动相：

(A) 用于线性盐梯度的缓冲剂由10 mM MES组成。缓冲剂A不含有NaCl。缓冲剂B含有1 M NaCl。两种缓冲剂的pH用NaOH调节至pH 6.5，

(B) 用于线性pH梯度的缓冲剂由12 mM乙酸、10 mM MES、6 mM MOPS、4 mM HEPES、8 mM TAPS、8 mM CHES、11 mM CAPS、53 mM NaOH组成。除非在附图描述中说明，否则不向缓冲剂A 和B中添加NaCl。缓冲剂A用HCl调节至pH 5。缓冲剂B不需要pH调节（pH = 10.5），

(C) 用于具有递减的pH和递增的盐梯度的相反pH-盐混合梯度的缓冲剂由12 mM乙酸、 12 mM乙酸、10 mM MES、6 mM MOPS、4 mM HEPES组成。缓冲剂A不含有NaCl且pH用NaOH调节 至8。缓冲剂B含有200 mM NaCl且pH用NaOH调节至5，

(D) 用于具有递增的pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度的缓冲剂由12 mM乙酸、 12 mM乙酸、10 mM MES、6 mM MOPS、4 mM HEPES、8 mM TAPS、8 mM CHES、11 mM CAPS组成。 缓冲剂A含有150 mM NaCl且pH用NaOH调节至5。缓冲剂B不含有NaCl且pH用NaOH调节至 10.5，

(E) 用于具有递增的pH和递增的盐梯度的平行pH-盐混合梯度的缓冲剂由12 mM乙酸、 10 mM MES、6 mM MOPS、4 mM HEPES组成。缓冲剂A不含有NaCl且pH用NaOH调节至5。 缓冲剂 B含有200 mM NaCl且pH用NaOH调节至8。

线性梯度洗脱：

梯度斜率：60 CV（2.5毫升/CV），否则将在附图描述中说明

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）

蛋白质负载：1毫克/毫升，否则将在附图描述中说明

就地清洗（CIP）：0.5 M NaOH（3-5 CV）

分步洗脱：

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）用于结合蛋白质；3毫升/分钟（= 358 cm/h）用于洗脱 蛋白质

蛋白质负载：30毫克/毫升

就地清洗（CIP）：0.5 M NaOH（3-5 CV）。

使用如（D）中所述的缓冲剂A和B（参见流动相）。0%缓冲剂B用于蛋白质结合。对于 蛋白质洗脱，通过混合如下不同浓度的缓冲剂A和B来生成不同的步骤：

步骤 缓冲剂B [%]

1 46

2 55

3 70

4 81

5 89

6 93

如下进行分析：

设备：ÄKTAmicro

使用BioSep™-SEC-s3000, Phenomenex, 柱尺寸7.8 i.d.×300 mm, 粒度5 µm进行 尺寸排阻高效液相谱法（SE-HPLC）。所用缓冲剂由50 mM NaH₂PO₄和300 mM NaCl组成，pH 7。使用流量为1毫升/分钟的等度洗脱。注入体积为40微升至100微升不等。

使用YMC BioPro Sp-F, YMC Co. Ltd., 柱尺寸4.6 i.d.×50 mm, 粒度5 µm进 行阳离子交换高效液相谱法（CEX-HPLC）。使用如前文在（B）中所述的缓冲剂。使用以0.7 毫升/分钟流量在8.75 CV梯度长度中由50%至85%缓冲剂B的梯度洗脱。注入体积为40微升 至100微升不等。

结果：

收集下列数据以比较不同梯度类型在使用CEX分离mAb A电荷变体中的效率。

在图1（图1）中，显示了为分离mAb A电荷变体筛选不同的梯度洗脱类型。（A）线性 盐梯度洗脱：0-1 M NaCl，pH 6.5，（B）线性pH梯度洗脱：pH 5-10.5，0.053 M Na⁺，（C）具有 递减的pH和递增的盐梯度的相反pH-盐混合梯度洗脱：pH 8-5，0-1 M NaCl，（D）具有递增的 pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度洗脱：pH 5-10.5，0.15-0 M NaCl，（E）具有递增的 pH和递增的盐梯度的平行pH-盐混合梯度洗脱：pH 5-8，0-0.2 M NaCl在Eshmuno® CPX上。 源于氢氧化钠（用于缓冲剂的pH调节）的抗衡离子描述为Na⁺，而来自氯化钠的那些描述为 NaCl。

在图1中所示的所有梯度洗脱运行中，（D）中的相反pH-盐混合梯度显示最高的可 分辨峰数量——6，而其它两种混合梯度（C）和（E）显示适度分辨的峰（峰数量——3）。经典 洗脱方法如线性pH梯度（B）显示三个高分辨的峰，在末端具有肩峰，而线性盐梯度仅显示两 个峰。

以下数据显示了在图1的梯度类型（A）、（B）和（D）中汇集的级分的详细HPLC分析。

在图2（图2）中，左栏由顶部至底部描绘了图1（A）、（B）和（D） 中显示和描述的相应 制备谱运行（短划线：电导率(cond.)，虚线：pH）。中间栏和右栏是由左栏的相应制备谱 运行汇集的单个峰的HPLC分析。Mono.-单体，Ag 1、2和3-聚集体变体1、2和3，AV-酸性电荷 变体，MP-主峰，BV-碱性电荷变体。源于氢氧化钠（用于缓冲剂的pH调节）的抗衡离子描述为 Na⁺，而来自氯化钠的那些描述为NaCl。

对于所选的所有三种梯度洗脱类型，观察到可以从单体中分辨聚集体（参见图2中 的SE-HPLC）。根据图2中的制备谱图，线性盐梯度洗脱提供了由单体峰（峰数量1）略微更 好地分辨聚集体峰（峰数量2）。但是，除了碱性电荷变体之外，绝对不存在电荷变体的分离 （参见图2中的CEX-HPLC）。线性pH梯度和具有递增的pH与递减的盐梯度的相反（Opp.）pH-盐 混合梯度显示由主峰（MV）高度分辨的酸性电荷变体（AV）和碱性电荷变体（BV）。除了电荷变 体分离之外，相反pH-盐混合梯度还描述了三个单独的聚集体峰，这证实了这种类型的混合 梯度的优点。

以下数据比较了相反pH-盐混合梯度洗脱与线性pH梯度的容量以及相应的同工蛋 白质分离效率。

图3a-3d（图3a-3d）：左栏描绘了采用不同目标负载的相反pH-盐混合梯度pH 5- 10.5, 0.15-0 M NaCl（A、C、F、G），线性pH梯度pH 5-10.5, 0.053 mM Na⁺（B、D），和含有盐 的线性pH梯度pH 5-10.5, 0.15 M NaCl（E）在Eshmuno® CPX上的相应的制备谱运行。对 于（A）-（F），梯度斜率为60 CV，而对（G）为276 CV。短划线-电导率（cond.），虚线-pH。中间栏 和右栏是由左栏的相应制备谱运行汇集的单个峰的HPLC分析。Mono.-单体，Ag 1、2和3- 聚集体变体1、2和3，AV-酸性电荷变体，MP-主峰，BV-碱性电荷变体。源于氢氧化钠（用于缓 冲剂的pH调节）的抗衡离子描述为Na⁺，而来自氯化钠的那些描述为NaCl。每一运行的蛋白 质回收率> 90%。

当使用30毫克/毫升填充树脂的目标负载时，对线性pH梯度体系观察到蛋白质穿 透（参见图3中的(B)），而对相反pH-盐混合梯度体系并未观察到这种情况（参见图3中的 (A)）。当目标负载提高至60毫克/毫升填充树脂时，对于线性pH梯度体系，蛋白质穿透提高 至大约80%（进料的100% UV信号 ≈ 1560 mAU）（参见图3中的(D)）。应当指出，在60毫克/毫 升填充树脂的相同目标负载下，在相反pH-盐混合梯度体系中未观察到蛋白质穿透。在样品 注入结束时（即当用结合缓冲剂洗涤该柱时）发生在V_R ~ 40至50 mL之间的峰（参见图3中 的(C)）。为了证实动态结合容量（DBC）可以随提高的盐浓度而提高，通过向缓冲剂A和B中添 加0.15 M氯化钠来重复该pH梯度洗脱试验，在（E）中的结果表明，实现了60毫克/毫升填充 树脂的目标负载，而没有任何蛋白质流过该柱。尽管如此，在分离效率方面，在60毫克/毫升 负载下，在相反pH-盐混合梯度（参见图3中(C)的CEX-HPLC）中汇集的级分显示出与含有 0.15 M NaCl的pH梯度（参见图3中(E)的CEX-HPLC）相比单个变体物类的更高纯度。同样，主 峰2和碱性电荷变体峰3在相反pH-盐混合梯度中比在提高盐浓度下的pH梯度中更好地分辨 （比较图3中的制备谱图(C)和(E)）。

对于相反pH-盐混合梯度体系，发现在5%穿透下的动态结合容量（DBC_5%）为大约98 毫克/毫升填充树脂（参见图3中的(F)）。为了研究不同梯度斜率之间的分离效率，使用非常 浅的梯度-276 CV重复相同的DBC_5%试验（参见图3中的(G)）。除了在浅梯度中单个峰之间更 高的分辨率之外，与更陡峭的斜率相比没有观察到相应池的纯度的显著改善（比较图3中 (F)和(G)的CEX-HPLC）。除了结合容量方面的显著提高之外，该相反pH-盐混合梯度体系还 支持由主峰高分辨率分离酸性与碱性电荷变体。与经典pH梯度洗脱相比，该相反pH-盐混合 梯度体系提供以下益处：更高的结合容量（至少两到三倍），相当（如果不是更好）的产物相 关电荷变体之间的分离，和产物相关聚集体物类之间显著改善的分离。

应当指出，150 mM的相反pH-盐中的初始盐浓度对制备CEX树脂而言相对较高。合 理地预测，如果使用较低盐浓度（例如50 mM或100 mM）可以获得更高的结合容量以及改善 的峰之间的分辨率。

以下显示了分离方法由混合pH-盐梯度洗脱转化为使用相同缓冲体系的一系列逐 步洗脱。

图4：（图4）左栏描绘了使用分步洗脱在Eshmuno® CPX上的多产物分离。峰1和2在 第一步骤中洗脱（46%缓冲剂B），峰3在第二步骤中洗脱（55%缓冲剂B），峰4在第三步骤中洗 脱（70%缓冲剂B），峰5在第四步骤中洗脱（81%缓冲剂B），峰6在第五步骤中洗脱（89%缓冲剂 B），峰7在第六步骤中洗脱（93%缓冲剂B）。短划线-电导率（cond.），虚线-pH。中间栏和右栏 是由左栏的相应制备谱运行汇集的单个峰的HPLC分析。Mono.-单体，Ag 1、2和3-聚集体 变体1、2和3，AV-酸性电荷变体，MP-主峰，BV-碱性电荷变体。

基于图3的（A）中的洗脱曲线，将各变体物类洗脱时缓冲剂B的相应浓度转化为使 用相同缓冲体系的一系列逐步洗脱。如图4中可见，经由分步洗脱，单个产物变体彼此非常 好地分离。除了良好的分离之外，在峰1、2和3中实现了相应单体物类（即AV、MP和BV）的超过 80%的产率（根据图4的CEX-HPLC中峰下方的面积）。

容易将分离方法由梯度洗脱转化为分步洗脱加强了相反pH-盐混合梯度对于在最 短时间内采用最少实证工作进行多产物分离工艺开发的优势。

实施例2

使用IEC制备分离mAb B电荷变体

该制备谱运行如下进行：

设备：ÄKTApurifier 100

柱：Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 平均粒度50 µm, 离子容量60 µmol/mL, 柱 尺寸8 i.d.×20 mm (1 mL)

进料：MAb B单体后蛋白质A池

流动相：

(A) 对于线性盐梯度，缓冲剂A和B由20 mM乙酸组成。在缓冲剂B中添加250 mM氯化钠， 而未添加至缓冲剂A中。用NaOH 将两种缓冲剂调节至pH 5，

(B) 对于线性pH梯度，缓冲剂A由12 mM乙酸、10 mM MES和10 mM MOPS组成，而缓冲剂B 由6 mM MOPS、6 mM HEPES、10 mM TAPS和9 mM CHES组成。分别用NaOH将缓冲剂A和B调节至 pH 5和9.5，

(C) 对于具有递增的pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度，使用与（A）相同的缓冲 剂组分，但是向缓冲剂A中加入一定量的氯化钠（50 mM或100 mM），而未添加至缓冲剂B中。 分别用NaOH将两种缓冲剂调节至pH 5和9.5。

梯度斜率：60 CV (1 mL/CV)，否则将在附图描述中说明

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）

蛋白质负载：1毫克/毫升，否则将在附图描述中说明

CIP：0.5 M NaOH（3-5 CV）。

如下进行分析：

设备：ÄKTAmicro

使用YMC BioPro Sp-F, YMC Co. Ltd., 柱尺寸4.6 i.d.×50 mm, 粒度5 µm进行 CEX-HPLC。缓冲剂由10 mM MES、6 mM MOPS、4 mM HEPES、8 mM TAPS、8 mM CHES和31.8 mM NaOH组成。缓冲剂A用HCl调节至pH 6。缓冲剂B（pH = 9.5）不需要pH调节。使用以0.7毫升/ 分钟流量在15.76 CV梯度长度中由25%至60%缓冲剂B的梯度洗脱。注入体积为40微升至100 微升不等。

结果：

以下数据比较了在CEX上三种不同的梯度洗脱体系的同工蛋白质分离效率：线性盐梯 度洗脱、线性pH梯度洗脱和相反pH-盐混合梯度洗脱。

图5：（图5）左栏描绘了在Eshmuno® CPX上三种线性梯度洗脱类型的相应制备 谱运行。短划线-电导率（cond.），虚线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱运行汇集的 单个峰的CEX-HPLC分析。CEX-HPLC分析中的A-H描绘了不同的单体电荷变体。

通过在图5中比较三种不同的梯度类型，线性盐梯度洗脱仅显示一个洗脱峰，而其 余两种显示主峰和肩峰。这表明，盐梯度是本文中测试的三种方法中效率最低的体系。对于 pH梯度和混合梯度洗脱，在两种设定中均可以实现特定电荷变体的去除，但是后者显示了 更好分辨的含有碱性电荷变体的肩峰。另外从CEX-HPLC分析中可以看出，与pH梯度（F、G和 H）相比，混合梯度中的肩峰3含有两种碱性电荷变体（G和H），这表明与常规pH梯度洗脱体系 相比，使用该混合梯度更好地分离同工蛋白质。

以下数据比较了线性pH梯度与相反pH-盐混合梯度洗脱的容量以及相应的电荷变 体分离效率。

图6：（图6）左栏描绘了采用5%穿透（DBC_5%）的线性盐梯度洗脱0-0.25 M NaCl, pH 5、线性pH梯度洗脱pH 5-9.5, 0 M NaCl和相反pH-盐混合梯度pH 5-9.5, 0.05-0 M NaCl 在Eshmuno® CPX上的相应的制备谱运行。梯度斜率-690 CV。短划线-电导率（cond.），虚 线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱运行汇集的单个峰的CEX-HPLC分析。CEX-HPLC分 析中的A-H描绘了不同的单体电荷变体。每一运行的蛋白质回收率> 90%。

图7a-7c：（图7a-7c）相应梯度类型的洗脱峰中单个电荷变体的总计百分比在图6 中显示。A-H显示了沿该梯度图6的CEX-HPLC中显示的单个电荷变体的最大值。用数字（1-7） 标记的直线显示了采取图6中的级分池的位置。

与经典线性盐和线性pH梯度洗脱的DBC相比（DBC_5% ≈ 53-55毫克/毫升填充树 脂），当使用具有渐增的pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度时（参见图6），mAb B的DBC 明显更高（DBC_5% ≈ 71毫克/毫升填充树脂）。根据电荷变体沿洗脱梯度的变化（参见图7）， 观察到在线性盐梯度中，酸性电荷变体（A、B、C、D）和碱性电荷变体（G、H）分别在梯度开始时 和在梯度结束时集中，由此导致电荷变体的低效分离。相反的是，这些电荷变体分别沿pH梯 度与混合梯度均匀分布。应当指出，与混合梯度相比，电荷变体沿pH梯度稍好的分布是因为 使用pH梯度缓冲剂，在达到DBC_5%之前较少蛋白质可以装载到该柱上。如实施例1中所示（参 见图3a-3d (C)和(E)），如果在提高的盐浓度下使用pH梯度缓冲剂将类似于混合梯度中所 用量的蛋白质（即~71毫克/毫升填充树脂）装载到该柱上，电荷变体的分离将比混合梯度更 差。因此，合意地得出以下结论：与经典pH梯度方法相比，混合梯度改善了蛋白质的DBC，而 不损失同工蛋白质分离效率。

试验表明，如果使用含有较少此类物类的混合物，可以改善电荷变体的分离。由 此，图6中相反pH-盐混合梯度的肩峰5-7汇集并合并以形成含有较少电荷变体（E、F、G和H） 的进料并使用类似的试验设置再次进行谱分离。

以下数据显示了含有E、F、G和H电荷变体的再次谱分离的进料的结果。

图8：（图8）由图6中的相反pH-盐混合梯度的肩峰5-7汇集的含有电荷变体E、F、G和 H的进料的再次谱分离。左栏描绘了线性pH梯度洗脱pH 5-9.5, 0 M NaCl和相反pH-盐混 合梯度pH 5-9.5, 0.05-0 M NaCl/0.10-0 M NaCl（由顶部至底部）在Eshmuno® CPX上的 相应制备谱运行。短划线-电导率（cond.），虚线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱 运行汇集的单个峰的CEX-HPLC分析。CEX-HPLC分析中的E-H描绘了不同的单体电荷变体。

当使用含有0.05 M NaCl的相反pH-盐混合梯度时，实现了肩峰1与主峰2之间的最 佳分辨（图8中的中间栏）。尽管如此，CEX-HPLC结果表明，含有0.10 M NaCl的混合梯度中的 主峰2仅含有一种主要电荷变体H，表明这种体系具有最有效的电荷变体分离。在三种体系 中，混合梯度体系在分辨率和电荷变体去除效率方面优于线性pH梯度体系。

实施例3

使用IEC制备分离mAb B Fc、Fab、2/3片段和单体物类

该制备谱运行如下进行：

设备：ÄKTApurifier 100

柱：Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 平均粒度50 µm, 离子容量60 µmol/mL, 柱 尺寸8 i.d.×20 mm (1 mL)

进料：MAb B天然单体加Fc/Fab和2/3片段

流动相：

(A) 对于线性pH梯度，缓冲剂A由12 mM乙酸、10 mM MES和10 mM MOPS组成，而缓冲剂B 由6 mM MOPS、6 mM HEPES、10 mM TAPS和9 mM CHES组成。缓冲剂A和B分别用NaOH调节至pH 5和9.5，

(B) 对于具有递增的pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度，使用与（A）相同的缓冲 剂组分，但是向缓冲剂A中加入一定量的氯化钠（50 mM或100 mM），而未添加至缓冲剂B中。 分别用NaOH将两种缓冲剂调节至pH 5和9.5。

梯度斜率：60 CV (1 mL/CV)

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）

蛋白质负载：1毫克/毫升，否则将在附图描述中说明

CIP：0.5 M NaOH（3-5 CV）

分步洗脱：

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）用于结合蛋白质；3毫升/分钟（= 358 cm/h）用于洗脱 蛋白质

蛋白质负载：30毫克/毫升

就地清洗（CIP）：0.5 M NaOH（3-5 CV）。

使用如（B）中所述的缓冲剂A和B（参见流动相）。0%缓冲剂B用于蛋白质结合。对于 蛋白质洗脱，通过混合如下不同浓度的缓冲剂A和B来生成不同的步骤：

步骤 缓冲剂B [%]

1 28.5

2 34

3 46

4 63

5 76

如下进行分析：

设备：ÄKTAmicro

使用Superdex™ 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare, 柱尺寸10 i.d.×300 mm, 平均粒度8.6 µm进行SE-HPLC。所用缓冲剂由50 mM NaH₂PO₄和300 mM NaCl组成，pH 7。 使用流量为0.5毫升/分钟的等度洗脱。注入体积为40微升至100微升不等。

结果：

以下数据表明，本发明的方法对采用CEX将天然mAb与其它可溶性尺寸变体如2/3片段、 Fc和Fab分离具有超出使用pH梯度的方法的特定优势。

图9：（图9）左栏描绘了线性pH梯度洗脱pH 5-9.5, 0 M NaCl和相反pH-盐混合梯 度pH 5-9.5, 0.05-0 M NaCl在Eshmuno® CPX上的相应制备谱运行。短划线-电导率 （cond.），虚线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱运行汇集的单个峰的SE-HPLC分析。 MAb-天然单体mAb B，2/3 Fg.-2/3片段，Fc-可结晶片段，Fab-抗原结合片段。

尽管分离结果令人信服，当解释图9中SE-HPLC结果中的Fc和Fab峰时需要训练有 素的专家。Fc（V_R ≈ 15 mL）表现为在Fab（V_R ≈ 15.5 mL）之前的肩峰。对于使用线性pH梯 度洗脱的谱运行的SE-HPLC分析，级分池1和2仅含有Fc，而Fab在级分池4和5中到。同 样，对于使用相反pH-盐混合梯度洗脱的谱运行，相应的SE-HPLC结果表明级分池1主要含 有Fab，而级分池2是Fc和Fab的混合物。

通过比较图9中左栏的谱运行，尽管使用线性pH梯度洗脱获得了更高数量的解 析峰，该产物峰（即左上角的谱图中的峰6）与Fab峰（即同一谱图中的峰5）重叠。相反， 尽管在相反pH-盐混合梯度洗脱中解析较少的峰，产物峰（即左下角的谱图中的峰4）可以 非常好地与其它杂质峰切割，这提供了更宽的使用分步洗脱来洗脱产物的窗口。这里同样 清楚的是，通过在递增的pH梯度中使用递减的盐梯度，Fab与固定相之间的相互作用被强烈 抑制，由此导致该峰被完全排除出产物峰。在pH梯度洗脱中（图9中的左上角），Fab物类在Fc 和2/3片段之后被洗脱。但是，在混合梯度洗脱中（图9中的左下角），Fab物类在Fc和2/3片段 之前被洗脱。

由于本研究中使用的天然单体mAb与实施例2中所用相同，相反pH-盐混合梯度洗 脱（图9中的左下角）的峰4和5类似于图5中的洗脱峰（左下），并且此前已经显示电荷变体在 图5中分离。因此，通过结合实施例2和3的结果，证实了相反pH-盐混合梯度可用于同时分离 电荷和尺寸变体，这再次证实了实施例1中显示的结果。

以下数据比较了在较高负载下线性pH梯度与相反pH-盐混合梯度洗脱的相应的电 荷变体分离效率。

图10：（图10）左栏描绘了采用30毫克/毫升填充树脂负载的线性pH梯度洗脱pH 5- 9.5, 0 M NaCl与相反pH-盐混合梯度pH 5-9.5, 0.05-0 M NaCl在Eshmuno® CPX上的相 应制备谱运行。短划线-电导率（cond.），虚线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱运 行汇集的单个峰的SE-HPLC分析。MAb-天然单体mAb B，2/3 Fg.-2/3片段，Fc-可结晶片段， Fab-抗原结合片段。

在图10中，在高负载（= 30毫克/毫升填充树脂）下测试了多产物分离效率。重现了 与图9中所示相同的分离结果。应当注意的是，与图9中所用进料相比，该试验中所用进料含 有略微更高百分比的Fc和Fab。尽管如此，在两种情况下的洗脱曲线和洗脱序列是相同的； pH梯度洗脱显示更高数量的解析峰，但是分离产物池效率较低（图10中左上谱图的峰6）， 而混合梯度洗脱与之相反（图10中左下谱图的峰4）。再一次，显示混合梯度洗脱体系可以 在高蛋白质负载下用于纯化。

以下显示了分离方法由混合pH-盐梯度洗脱转化为使用相同缓冲体系的一系列逐 步洗脱。

图11：（图11）左栏描绘了使用分步洗脱在Eshmuno® CPX上的多产物分离。峰1在 第一步骤中洗脱（28.5%缓冲剂B），峰2在第二步骤中洗脱（34%缓冲剂B），峰3在第三步骤中 洗脱（46%缓冲剂B），峰4在第四步骤中洗脱（63%缓冲剂B），和峰5在第五步骤中洗脱（76%）。 短划线-电导率（cond.），虚线-pH。中间栏和右栏是由左栏的相应制备谱运行汇集的单个 峰的HPLC分析。MAb-天然单体mAb B，2/3 Fg.-2/3片段，Fc-可结晶片段，Fab-抗原结合片 段。CEX-HPLC分析中的A-H描绘了不同的单体电荷变体。

类似于实施例1，分离过程从混合梯度洗脱体系转化为一系列逐步洗脱。根据图11 中的SE-HPLC结果，峰1含有Fab，纯度> 99%且产率为~91%，而峰4含有mAb，纯度> 99%且产率 为~70%。峰2由~75%纯度的2/3片段以及~25%纯度的Fc组成。大约50%产率的2/3片段在峰2中 洗脱，而另一半在峰3中到，以及一些mAb。还在峰4和5中观察到电荷变体分离，描绘在图 10中的CEX-HPLC结果中，其中酸性变体A、B、C、D、E和F在级分池4中到，碱性变体G和H在最 终级分池5中到。使用分步洗脱的电荷变体分离再次证实了在实施例2中显示的混合梯度 洗脱中的观察结果——相应的缓冲体系适于将酸性电荷变体与碱性电荷变体分离。

总之，实施例3显示了本发明的相反的混合pH-盐梯度体系用于尺寸变体和电荷变 体分离的通用适用性，其在高负载下运行，并且也可以容易地转化为一系列逐步洗脱。

实施例4

使用MMC制备分离mAb B Fc、Fab、2/3片段和单体物类

如下进行制备谱运行：

设备：ÄKTApurifier 100

柱：Capto® MMC, GE Healthcare, 平均粒度75 µm, 离子容量70-90 µmol/mL, 柱尺 寸8 i.d.×20 mm (1 mL)

进料：MAb B天然单体加Fc/Fab和2/3片段

流动相：

(A) 对于线性pH梯度，缓冲剂A由12 mM乙酸、10 mM MES和10 mM MOPS组成，而缓冲剂B 由6 mM MOPS、6 mM HEPES、10 mM TAPS和9 mM CHES组成。分别用NaOH将缓冲剂A和B调节至 pH 5和9.5，

(B) 对于具有递增的pH和递减的盐梯度的相反pH-盐混合梯度，使用与（A）相同的缓冲 剂组分，但是向缓冲剂A中加入一定量的氯化钠（50 mM或100 mM），而未添加至缓冲剂B中。 分别用NaOH将两种缓冲剂在pH 5至9.5的pH范围内调节。

梯度斜率：60 CV（1 mL/CV）

流量：1毫升/分钟（= 119 cm/h）

蛋白质负载：1毫克/毫升

CIP：0.5 M NaOH（3-5 CV）。

如下进行分析：

设备：ÄKTAmicro

使用Superdex™ 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare, 柱尺寸10 i.d.×300 mm, 平均粒度8.6 µm进行SE-HPLC。所用缓冲剂由50 mM NaH₂PO₄和300 mM NaCl组成，pH 7。 使用流量为0.5毫升/分钟的等度洗脱。注入体积为40微升至100微升不等。

结果：

收集以下数据，显示了本发明对使用MMC将天然mAb与其它可溶性尺寸变体如2/3片段、 Fc和Fab分离而言超出pH梯度的优势。

图12：（图12）左栏描绘了线性pH梯度洗脱pH 5-9.5, 0 M NaCl和相反pH-盐混合 梯度pH 5-9.5, 0.05-0 M NaCl在Capto® MMC上的相应制备谱运行。短划线-电导率 （cond.），虚线-pH。右栏描绘了由左栏的相应制备谱运行汇集的单个峰的SE-HPLC分析。 MAb-天然单体mAb B，2/3 Fg.-2/3片段，Fc-可结晶片段，Fab-抗原结合片段。

根据图12，线性pH梯度导致4个峰（峰1-4），其中在SE-HPLC中检测到蛋白质，而相 反pH-盐混合梯度导致3个含有蛋白质的峰（峰2-4）。尽管如此，与线性pH梯度相比，使用相 反pH-盐混合梯度更好地分辨产物峰（峰4）与其它峰（即杂质）。这与在CEX上的同工蛋白质 分离的结果一致（参见图9），这也意味着，与经典线性pH梯度方法相比，使用相反pH-盐混合 梯度体系，开发用于分离产物与杂质的分步洗脱的优化窗口更宽。

因此，表明了本发明不仅适于在IEC中分离同工蛋白质，也适于在MMC中分离同工 蛋白质。