用于肿瘤的7-氮杂吲哚-2,7-二氮杂萘衍生物

用于肿瘤的7-氮杂吲哚-2,7-二氮杂萘衍生物

本发明涉及化合物4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺

及其可药用盐和/或互变异构体。

本发明基于发现新的具有有价值特性的化合物，特别是可以用于制备药物的那些化合物的目标。

已经发现，本发明的化合物及其盐和/或互变异构体具有非常有价值的药理学特性，同时具有很好的耐受性。

具体而言，它展示出作为拮抗剂或激动剂的细胞增殖/细胞活力抑制作用。本发明的化合物因此可以用于防治和/或肿瘤、肿瘤生长和/或肿瘤转移。

可以在增殖测定/活力测定中测试抗增殖作用。

因此，施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐用于癌症，包括实体瘤，诸如例如癌(例如肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌或结肠癌)、骨髓疾病(例如髓性白血病)或腺瘤(例如绒毛状结肠腺瘤)。

此外，肿瘤包括单核细胞性白血病、脑癌、泌尿生殖系统癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌和肺癌，包括肺腺癌和小细胞肺癌、胰腺癌和/或乳腺癌。

此外，这些化合物可用于由HIV-1(1型人免疫缺陷病毒)诱导的免疫缺陷。

将癌样高增殖性疾病视为脑癌、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食管癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。具体而言，癌样细胞生长是代表本发明的靶标的疾病。因此，本发明涉及本发明的化合物作为在和/或预防所述疾病中的药物和/或药物活性化合物，并涉及本发明的化合物用于制备用于和/或预防所述疾病的药物中的用途，并且涉及所述疾病的方法，其包括向需要此类施用的患者施用本发明的化合物。

可以显示本发明的化合物具有抗增殖作用。向患有高增殖性疾病的患者施用本发明的化合物，例如以抑制肿瘤生长，以降低与淋巴增殖性疾病相关的炎症，以抑制由于组织修复的移植排斥或神经损伤等。本发明的化合物可用于预防性或性目的。如本文所用，术语“”用于指防止疾病和预先存在的病症两者。在明显的疾病发生前，通过施用本发明的化合物来实现防止增殖/活力，例如来防止肿瘤生长。或者，使用所述化合物通过稳定或改善患者的临床症状来进行性疾病。

宿主或患者可以是任何哺乳动物物种，例如灵长类物种，尤其是人；啮齿类动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔；马、牛、犬、猫等。动物模型是实验研究所关注的，其提供了用于人类疾病的模型。

可以通过体外测试来确定具体细胞对用本发明的化合物的敏感性。通常，细胞培养物与多种浓度的本发明的化合物孵育足以允许活性试剂诱导细胞死亡或抑制细胞增殖、细胞活力或迁移的时期，一般在约一小时至一周之间。可以使用来自活组织检查样品的培养细胞来进行体外测试。随后测定处理后剩余的细胞量。

剂量根据所用的具体化合物、具体疾病、患者状态等而不同。剂量通常足以显著降低目标组织中不期望的细胞，同时保留患者的活力。通常持续直至已发生显著降低，例如细胞负担中至少约50％的降低，并且可以持续直至在体内基本上检测不到不期望的细胞。

存在许多与细胞增殖和细胞死亡(凋亡)失调相关的疾病。目标病症包括但不限于以下病症。本发明的化合物可用于一系列不同的病症，其中存在平滑肌细胞和/或炎症细胞增殖和/或迁移入血管的内膜层，导致经过该血管的受限的血流，例如在新生内膜闭塞病变的情况中。目标闭塞性移植物血管疾病包括动脉粥样硬化、移植后冠状动脉血管疾病、静脉移植狭窄、吻合后假体的再狭窄(peri-anastomotische Prothesenrestenose)、血管成形术或支架置入后再狭窄等。

本发明的化合物也充当蛋白激酶、特别是丝氨酸/苏氨酸激酶型的调节剂、调制剂或抑制剂，所述蛋白质激酶尤其包括磷酸肌醇依赖性激酶 1(PDK1)。本发明的化合物展示出抑制丝氨酸/苏氨酸激酶 PDK1、IKKε和TBK1(和在ALK-1的情况下)的特定作用。

PDK1磷酸化并活化包含PKB、SGK、S6K和PKC异构形的AGC 蛋白激酶族的亚组。这些激酶参与PI3K信号转导路径并控制基础细胞功能，诸如存活、生长和分化。PDK1因此是多种代谢、增殖和生命维持作用的重要调节剂。

本发明的化合物还展示出TGFβ受体I激酶抑制特性。

许多疾病已经与TGF-β1过度产生相关。细胞内TGF-β信号传导路径的抑制剂是对于纤维化增生疾病的合适。具体地，纤维化增生疾病包括与失调的TGF-β活性相关的肾病和包括肾小球性肾炎(GN)的过度纤维化，诸如肾小球膜增殖GN、免疫GN和新月形GN。其它肾脏病变包括糖尿病性肾病、肾脏间质性纤维化、在接受环孢菌素的移植患者中的肾脏纤维化和HIV相关肾病。胶原血管性病症包括进行性系统性硬化症、多肌炎、硬化性皮炎、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、硬斑病或与雷诺氏综合征的发生相关的那些胶原血管性病症。由过度TGF-β活性导致的肺部纤维化包括成人呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维化和经常与自身免疫病症相关的间质肺纤维化，诸如系统性红斑狼疮和硬化性皮炎、化学品接触或过敏症。与纤维化增生特征相关的另一种自身免疫病症是类风湿性关节炎。

与纤维化增生病况相关的眼部疾病包括在视网膜复置术、使用眼内晶状体植入的白内障摘出术和后青光眼引流手术期间出现的增殖性玻璃体视网膜病变，且与TGF-β1过度产生相关。

TGF-β1，作为TGF-β家族的成员，是TGF-β受体家族的配体，其由定位于细胞膜上的异源二聚体蛋白组成，其具有细胞外受体部分和细胞内激酶结构域。成员是I型和II型受体；还参见Hinck FEBS Lett. 2012 http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2012.05.028。

对于配体TGF-β1、β2和β3经由它们相应受体的信号转导，已知它们在上皮和造血细胞的细胞周期停滞、间充质细胞增殖和分化的控制、伤口愈合、细胞外基质的产生和免疫抑制中发挥作用，还参见Massague的综述Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:753–91。

如果TGF-β1结合II型受体，则相应的I型受体结合且被磷酸化。该复合物磷酸化受体调节的Smad蛋白(R-Smad)，其然后与Smad4结合，迁移到细胞核心，并通过激活转录导致其中细胞行为的变化。

TGF-β I型受体，也称为ALK5(激活蛋白受体样激酶5)或TβR-I，详细记载于SwissProt中的P36897下，II型受体在P37173下，且ALK-1在P37023下。Smad2和Smad3是ALK-5的信号传导蛋白，ALK-1的信号传导蛋白是Smad-1、-5和-8。还参见Cunha BLOOD, 30 JUNE 2011 VOLUME 117, NUMBER 26, 6999。

本发明的化合物代表来自WO 2012/104007的选择。

本发明的化合物具有比来自WO 2012/104007的结构上最接近的化合物显著更高的活性。

WO 2005/095400 A1描述了作为蛋白激酶抑制剂的其它氮杂吲哚衍生物。

WO 2008/079988 A2描述了作为用于防治癌症的PDK-1抑制剂的喹唑啉衍生物。

WO 2008/112217 A1描述了作为用于防治癌症的PDK1抑制剂的苯并二氮杂萘衍生物。

吡啶酮基(Pyridinonyl)衍生物从WO 2008/005457已知作为用于防治癌症的PDK1抑制剂。

用于防治癌症的吡咯并吡啶激酶调节剂描述于WO 2008/124849。

WO 2006/106326 A1和WO 2008/156726 A1描述了作为用于防治癌症的PDK1抑制剂的其它杂环化合物。

WO 2009/054941 A1描述了作为用于防治癌症的PDK1抑制剂的吡咯并吡啶衍生物。

IKKε和TBK1是丝氨酸/苏氨酸激酶，其彼此之间以及与其它IkB激酶之间高度同源。这两种激酶在先天固有的免疫系统中起整体作用。双链RNA病毒被Toll样受体3和4以及RNA解旋酶RIG-I和MDA-5所识别，并且导致TRIF-TBK1/IKKε-IRF3信号传导级联的活化，这导致I型干扰素应答。

在2007年，Boehm等描述了IKKε为新的乳腺癌癌基因[J.S.Boehm等, Cell 129, 1065-1079, 2007]。研究了354种激酶它们与MAPK激酶Mek的活化形式一同重演Ras转化表型的能力。其中将IKKε鉴定为协作性癌基因。此外，作者能够显示IKKε在多种乳腺癌细胞系和肿瘤样品中扩增并过表达。在乳腺癌细胞中通过RNA干扰降低基因表达诱导凋亡并削弱其增殖。Eddy等在2005年得到了类似发现，其强调了IKKε在乳腺癌疾病中的重要性[S.F.Eddy等, Cancer Res. 2005；65 (24), 11375-11383]。

TBK1的促肿瘤发生作用在2006年首次报道。在包含251,000 cDNA的基因文库的筛选中，Korherr等准确地鉴定了三个基因TRIF、TBK1和IRF3，其通常作为促血管生成因子参与先天免疫防御[C.Korherr等, PNAS, 103, 4240-4245, 2006]。

在2006年，Chien等[Y. Chien等, Cell 127, 157-170, 2006]发表了使用致癌的Ras仅能将TBK1-/-细胞转化为有限的程度，其暗示TBK1参与Ras介导的转化。此外，他们能够显示RNAi介导的TBK1的敲低引发MCF-7和Panc-1细胞中的凋亡。Barbie等近来发表了TBK1在具有突变的K-Ras的多种癌细胞系中的必要的重要性，其暗示TBK1干预能够在相应的肿瘤中具有重要性[D.A.Barbie等, Nature Letters 1-5, 2009]。

S.I. Cunha和K. Pietras在Blood, 117 (26), 6999-7006 (2011)中描述了通过抑制受体ALK1延迟肿瘤生长，特别在乳腺癌和黑素瘤的情况下。

由蛋白激酶引起的疾病的特征在于此类蛋白激酶的异常活性或高活性。异常活性涉及：(1)在通常不表达这些蛋白激酶的细胞中表达；(2)增加的激酶表达，其导致不期望的细胞增殖，诸如癌症；(3)增加的激酶活性，其导致不期望的细胞增殖诸如癌症，和/或相应的蛋白激酶的高活性。高活性涉及编码某一蛋白激酶的基因的扩增或可能与细胞增殖性疾病相关的活性水平的产生(即细胞增殖疾病的一种或多种症状的严重程度随渐增的激酶水平而增加)，蛋白激酶的生物利用率还可以受该激酶的一组结合蛋白的存在或不存在的影响。

可以使用本发明的化合物的最重要类型的癌症包括结肠直肠癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤以及肾细胞癌瘤和子宫内膜癌瘤，尤其是还有其中PTEN突变的癌症类型，尤其是乳腺癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。

此外，本发明的化合物可以用于实现在某些现有癌症化学疗法和放射疗法中的附加或协同作用和/或恢复某些现有癌症化学疗法和放射疗法的效力。

本发明的化合物还是指该化合物的水合物和溶剂化物，此外是指可药用衍生物。

本发明还涉及该化合物的盐、和水合物和溶剂化物。化合物的溶剂化物是指惰性溶剂分子加合在化合物上，这是由于它们相互的吸引力而形成的。例如，溶剂化物是单或二水合物或醇化物。

本发明自然还涉及本发明的化合物的盐的溶剂化物。

可药用衍生物是指，例如，本发明的化合物的盐以及所谓的前药化合物。

前药衍生物是指借助于例如烷基或酰基、糖或寡肽所修饰的本发明的化合物，其可在生物体中快速地裂解，以形成根据本发明的活性化合物。

这些还包括本发明的化合物的可生物降解的聚合物衍生物，如，例如，Int. J. Pharm. 115, 61-67(1995)所描述的衍生物。

表述“有效量”表示在组织、系统、动物或人中引起生物学或医学响应(其是例如研究人员或医师所寻或希望的)的药物或药物活性化合物的量。

此外，表述“有效量”代表这样的量，与没有接受该量的相应受试者相比较，其具有下列后果∶

改善的、治愈、预防或消除疾病、综合症、状况、不适、病症或副作用，或还减轻疾病、状况或病症的进展。

表述“有效量”还包括有效提高正常生理功能的量。

本发明涉及化合物4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺及其盐和用于制备该化合物及其可药用盐和互变异构体的方法，其特征在于

在Masuda反应中，式II的化合物

    ，

其中R¹表示Br或I，且R²表示氮杂吲哚保护基，

与4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷反应，且在Suzuki反应中，作为中间体形成的硼酸频哪基酯

与式III的化合物反应

其中X表示Cl、Br或I，

以得到式IV的化合物

其中R²表示氮杂吲哚保护基，

且保护基R²随后从式IV的化合物被裂解掉，

和/或4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺被转化成其盐之一。

在上文和下文中，基团R¹和R²具有在式II、II和IV的情况下所指示的含义，除非另外明确指示。

R¹表示Br或I，优选I。

R²表示氮杂吲哚保护基，优选叔丁基氧基-羰基或苯磺酰基，特别优选苯磺酰基。

苯磺酰基保护基也可以被本领域技术人员已知的其它磺酰基或氧基羰基保护基替代。

烷基或芳基磺酰基的裂解使用碱金属氢氧化物和伯醇在标准条件下实施。

化合物4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和还有用于它们制备的起始材料另外通过本身已知的方法制备，例如在文献中描述的(例如在标准操作说明中，诸如Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart)，更确切的说在已知并且适合于所述反应的反应条件下。在此还可以使用本文中没有更详细提及的本身已知的变体。

化合物4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺可以优选通过使式II的化合物与式III的化合物在相继的Masuda/?Suzuki反应中反应来获得。

在式III的化合物中，X优选表示Cl、Br或I。

式II的化合物与式III的化合物反应后，氮杂吲哚保护基R²也被裂解掉。

所述反应在Suzuki偶合的条件下实施。

根据所用条件，反应时间在几分钟至14天之间，反应温度在约-30℃至140℃之间，通常在0℃至110℃之间，尤其优选在约70℃至约100℃之间。

合适的惰性溶剂例如是烃类，诸如己烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯；氯代烃类，诸如三氯乙烯、1,2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷；醇类，诸如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚类，诸如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃(THF)或二氧杂环己烷；乙二醇醚类，诸如乙二醇单甲醚或乙二醇单乙醚、乙二醇二甲醚(二甘醇二甲醚)；酮类，诸如丙酮或丁酮；酰胺类，诸如乙酰胺、二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺(DMF)；腈类，诸如乙腈；亚砜类，诸如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸类，诸如甲酸或乙酸；硝基化合物，诸如硝基甲烷或硝基苯；酯类，诸如乙酸乙酯，或所述溶剂的混合物。

特别优选的是二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、甲醇和/或二氧杂环己烷。

药用盐及其它形式

所述本发明的化合物可以使用其最终非盐形式。另一方面，本发明还包括使用该化合物的其药学上可接受的盐形式，它们可以利用本领域已知的方法、由许多有机和无机酸和碱来获得。本发明的化合物的药学上可接受的盐形式大部分是通过常规方法制备的。酸加成盐可以通过用药学上可接受的有机和无机酸处理本发明的化合物来形成，所述药学上可接受的有机和无机酸例如卤化氢，诸如氯化氢、溴化氢或碘化氢，其它矿物酸及其相应的盐，诸如硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐等，和烷基-和单芳基磺酸盐，诸如乙磺酸盐、甲苯磺酸盐和苯磺酸盐，及其它有机酸及其相应的盐，诸如乙酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等等。相应地，本发明的化合物的药学上可接受的酸加成盐包括下列∶乙酸盐、已二酸盐、海藻酸盐、精氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、重亚硫酸盐、溴化物、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、辛酸盐、氯化物、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、磷酸二氢盐、二硝基苯甲酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、粘酸盐(得自于粘酸)、半乳糖醛酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、半琥珀酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、异丁酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苦杏仁酸盐、偏磷酸盐、甲磺酸盐、甲基苯甲酸盐、磷酸一氢盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、膦酸盐、邻苯二甲酸盐、但不限于这些。

可以使用试剂诸如(C₁-C₄)烷基卤化物，例如甲基、乙基、异丙基和叔丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二(C₁-C₄)烷基硫酸酯，例如，硫酸二甲酯、硫酸二乙酯和硫酸二戊酯；(C₁₀-C₁₈)烷基卤化物，例如癸基、十二烷基、月桂基、十四烷基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；和芳基(C_1-C₄)烷基卤化物，例如苄基氯和苯乙基溴，将包含碱性含氮基团的本发明化合物季铵化。根据本发明的水溶性和油溶性化合物两者可以使用此类盐来制备。

优选的上述药用盐包括乙酸盐、三氟乙酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、半琥珀酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、羟乙基磺酸盐、苦杏仁酸盐、葡甲胺、硝酸盐、油酸盐、膦酸盐、新戊酸盐、磷酸钠、硬脂酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐，硫代苹果酸盐、甲苯磺酸盐和氨基丁三醇，但不限于这些。

如下制备本发明的化合物的酸加成盐：利用常规方式，使游离碱形式与足够量的所需的酸接触，以形成盐。利用常规方式，使盐形式接触碱，并分离游离碱，可以再生游离碱。在某些方面，游离碱形式在某些物理特性(诸如，在极性溶剂中的溶解度)方面与其相应的盐形式不同；然而，对于本发明的目的，盐在其它方面相当于其各自的游离碱形式。

如果本发明的化合物含有多于一个的能够形成这种类型的药学上可接受的盐的基团，则本发明还包括多盐。典型的多盐形式包括，例如，酒石酸氢盐、双乙酸盐、富马酸氢盐、二甲葡胺、二磷酸盐、二钠和三盐酸盐，但不限于这些。

就上述内容而论，可以看出，在本发明的上下文中，表述“药学上可接受的盐”是指活性化合物，其包含以其盐之一的形式的本发明的化合物，特别是，如果与该活性化合物的游离形式或先前使用的活性化合物的任何其它盐形式相比较，这种盐形式可以赋予活性化合物改善的药物动力学特性。活性化合物的药学上可接受的盐形式还可以第一次提供这种活性化合物先前不具有的目标药物动力学特性，甚至在体内效力方面可以对这种活性化合物的药效学具有积极影响。

此外，本发明涉及药物，其包含4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其可药用盐和互变异构体，和任选的赋形剂和/或助剂。

可以以剂量单位形式施用药物制剂，每个剂量单位含有预定量的活性化合物。根据所的状况、施用方法和患者的年龄、体重和状况，此类单位可以包含例如0.5 mg至1 g，优选1 mg至700 mg，尤其优选5 mg至100 mg本发明的化合物，或可以以剂量单位形式施用药物制剂，每个剂量单位包含预定量的活性化合物。优选的剂量单位制剂是包含上述日剂量或部分剂量，或者其相应部分的活性化合物的那些制剂。此外，可以使用药物领域通常已知的方法来制备这种类型的药物制剂。

药物制剂可以适合于经由任何所需的合适方法施用，例如通过口服(包括含服或舌下)、直肠、鼻部、局部(包括含服、舌下或透皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)方法施用。此类制剂可以使用药物领域已知的所有方法来制备，例如，通过将活性化合物与赋形剂(一种或多种)或助剂(一种或多种)混合。

适合于口服施用的药物制剂可以以离散单位形式施用，所述离散单位，诸如，例如，胶囊或片剂；散剂或颗粒剂；在水或非水液体中的溶液或悬浮液；食用泡沫或泡沫食物；或水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。

由此，例如，在口服施用片剂或胶囊剂形式的情况下，可以将活性化合物组分与口服无毒且药学上可接受的惰性赋形剂诸如例如乙醇、丙三醇、水等结合。粉末剂如下制备：将化合物磨碎至合适的细尺寸，并将其与类似方式粉碎的药物赋形剂(诸如，例如，食用碳水化合物，诸如，例如，淀粉或甘露糖醇)混合。同样也可以存在调味剂、防腐剂、分散剂和染料。

胶囊剂如下制备：制备如上所述的粉末混合物，并随即填充到成型的明胶壳中。可以将助流剂和润滑剂诸如例如高度分散的硅酸、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体形式的聚乙二醇加入到粉末混合物中，然后进行填充。为了提高服用胶囊剂后药物的有效性，同样也可以加入崩解剂或增溶剂，例如，琼脂、碳酸钙或碳酸钠。

此外，如果需要或必要的话，同样可以将合适的粘合剂、润滑剂和崩解剂以及染料掺入进混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、从玉米制造的甜味剂、天然和合成胶(例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于：淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。如下配制片剂：例如，制备粉末混合物，将该混合物造粒或干压，加入润滑剂和崩解剂，并挤压整个混合物，得到片剂。如下制备粉末混合物：将以合适方式粉碎的化合物与上述稀释剂或基料混合，并任选与粘合剂(例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶解阻滞剂(例如，石蜡)、吸收促进剂(例如，季盐)和/或吸收剂(例如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。可以将粉末混合物如下进行造粒：用粘合剂例如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚粘液或纤维素或聚合物材料的溶液湿润，并将其挤压通过筛网。作为造粒的替代性方法，可以使粉末混合物运行通过压片机，得到不均匀形状的块，将其破碎以形成颗粒。为了防止粘住片剂铸型模，可以通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油，将颗粒润滑。然后将润滑的混合物压缩，得到片剂。本发明的化合物还可以与自由流动的惰性赋形剂结合，而后直接挤压得到片剂，而无需进行造粒或干压步骤。可以存在由虫胶密封层、糖或聚合物材料层和蜡的光泽层组成的透明或不透明保护层。可以将染料加入到这些涂层中，以便能够区别不同的剂量单位。

可以制备剂量单位形式的口服液体，例如溶液剂、糖浆剂和酏剂，使得给定的量包含预定量的化合物。可以通过将化合物溶解在含有合适的调味剂的水溶液中来制备糖浆剂，而酏剂是通过使用无毒的醇媒介物来制备的。可以通过将化合物分散在无毒的赋形剂中来配制混悬剂。同样可以加入增溶剂和乳化剂(例如，乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(例如，薄荷油或天然甜味剂或糖精，或其它人工甜味剂)等等。

如果需要的话，可以将口服施用的剂量单位制剂包封在微囊中。还可以制备延长或延迟释放的制剂，例如，通过涂敷颗粒材料或将颗粒材料包埋在聚合物、蜡等中。

还可以脂质体递送系统形式施用本发明的化合物及其盐和互变异构体，所述脂质体递送系统例如，小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。

也可以利用与化合物分子偶联的作为单独载体的单克隆抗体来递送本发明的化合物及其盐和互变异构体。该化合物也可以与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这种聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基团取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，该化合物可以与适合于实现药物的控制释放的能够生物降解的聚合物类别偶联，所述聚合物例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚、聚原酸酯、聚乙缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲性的水凝胶的嵌段共聚物。

适合于透皮施用的药物制剂可以以用于与接受者的表皮长时间紧密接触的独立硬膏剂形式施用。由此，例如，利用在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中总括性描述的离子电渗疗法，可以从硬膏剂中递送活性化合物。

可以将适合于局部施用的药物化合物配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

对于眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤的，优选，以局部软膏剂或乳膏剂的形式施用制剂。在提供软膏剂的制剂的情况下，活性化合物可以与石蜡或与水可互溶的乳膏剂基料一起使用。或者，可以将活性化合物与水包油型乳膏剂基料或油包水型基料一起配制，得到乳膏剂。

适合于局部施用于眼睛的药物制剂包括滴眼剂，其中，将活性化合物溶解或悬浮在合适的载体(尤其是水性溶剂)中。

适合于局部施用于口腔的药物制剂包括锭剂、软锭剂和嗽口水。

适合于直肠施用的药物制剂可以以栓剂或灌肠剂形式施用。

适合于鼻部施用的药物制剂(其中载体物质是固体)包括具有例如20至500微米范围粒径的粗糙粉末，其是采用如鼻吸的方式施用的，即，从接近鼻子的包含粉末的容器中通过鼻道快速吸入。以鼻喷雾剂或滴鼻剂形式施用的合适的制剂(液体作为载体物质)包括活性组分的水或油溶液。

适合于吸入施用的药物制剂包括细粒粉剂或雾剂，其可以利用各种类型的加压分配器(带有气雾剂、雾化器或吸入器)来产生。

适合于阴道施用的药物制剂可以以阴道栓、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂的形式施用。

适于肠胃外施用的药物制剂包括水性和非水无菌注射溶液剂，其含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，借此制剂与待的接受者的血液等渗；和可以包含悬浮介质和增稠剂的水性和非水无菌混悬剂。可以以单剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)施用制剂，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)状态下，以至于在使用之前，只需要即刻加入无菌的载体液体，例如注射用水。根据处方制备的注射溶液剂和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

很明显，除了上面特别提到的组分之外，制剂还可以包含本领域有关各种类型制剂所常用的其它试剂；由此，例如，适合于口服施用的制剂可以包含调味剂。

根据本发明化合物的有效量取决于许多因素，包括，例如，动物的年龄和体重，需要的确切病症和它的严重程度，制剂的特性和施用方法，并且其最终由医生或兽医来决定。然而，用于肿瘤生长(例如，结肠癌或乳癌)的根据本发明化合物的有效量通常在每天0.1至100 mg/kg接受者(哺乳动物)体重的范围，尤其典型地在每天1至10 mg/kg体重的范围。由此，对于重量为70 kg的成年哺乳动物来说，每天的实际量通常在70至700 mg，其中可以以每天单剂量的形式或通常以每天一系列分剂量(例如，两个、三个、四个、五个或六个分剂量)的形式施用该量，以使得总的日剂量相同。其盐或互变异构体的有效量，可以确定为本发明的化合物本身的有效量的分数。可以假定的是，类似的剂量适合于上面所提及的其它病症。

此外，本发明涉及药物，其包含4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其可药用盐和互变异构体，和至少一种其它药物活性化合物。

本发明还涉及由下列独立包装组成的套件(试剂盒)：

(a) 有效量的 4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其药学可使用的盐，和

(b) 有效量的其它药物活性化合物。

该套件包括合适的容器，诸如盒子，独立的瓶、袋或安瓿。例如，该套件可以包括独立的安瓿，每个包含溶解或冷冻干燥形式的有效量的4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其可药用盐和互变异构体，和有效量的其它药物活性化合物。

用途

本发明的化合物适合作为用于哺乳动物尤其是人和控制癌症疾病的药用活性化合物。

此外，本发明涉及4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺及其可药用盐和互变异构体，其用于肿瘤、肿瘤生长、肿瘤转移和/或AIDS。

此外，本发明涉及4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺及其可药用盐和互变异构体，其用于纤维化、再狭窄、HIV感染、阿尔兹海默病、动脉粥样硬化和/或用于促进伤口愈合。

本发明包括4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其生理上可接受的盐和互变异构体用于制备药物的用途，所述药物用于或预防癌症。用于的优选的癌源自：脑癌、生殖泌尿道癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌和肺癌、肠癌。另一组癌症的优选形式是：单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤和乳癌。

还包括4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其生理上可接受的盐和互变异构体用于制备药物的用途，所述药物用于和/或控制哺乳动物中的肿瘤诱发的疾病，其中对于该方法，向需要这种的患病哺乳动物施用有效量的本发明的化合物。量根据具体疾病而变化，并且不用过分努力就可以由本领域技术人员来确定。

特别优选的是疾病的用途，其中所述疾病是实体瘤。

优选地，实体瘤选自下列的肿瘤：鳞状上皮、膀胱、胃、肾、头和颈、食道、宫颈、甲状腺、肠、肝、脑、前列腺、生殖泌尿道、淋巴系统、胃、喉和/或肺。

此外，实体瘤优选地选自肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、结肠癌和乳癌。

此外，优选血液和免疫系统的肿瘤的用途，优选选自下列的肿瘤的用途：急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病和/或慢性淋巴细胞性白血病。

此外，本发明涉及本发明的化合物用于骨病状的用途，其中骨病状源于骨肉瘤、骨关节炎和佝偻病。

4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]-吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺还可以与其它众所周知的剂同时施用，所述剂之所以被选择是由于它们对所的病症特别有效。

本发明化合物还适合与已知的抗癌药剂组合。这些已知的抗癌药剂包括下列药剂∶雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和其它血管生成抑制剂。本发明化合物特别适合与放射疗法同时施用。

“雌激素受体调节剂”是指妨碍或抑制雌激素与受体结合的化合物，与机理无关。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于：他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY 117081、托瑞米芬、氟维司、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]苯基2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羟基二苯酮-2,4-二硝基苯腙和SH646。

“雄激素受体调节剂”是指妨碍或抑制雄激素与受体结合的化合物，与机理无关。雄激素受体调节剂的实例包括：非那雄胺及其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和乙酸阿比特龙。

“类视黄醇受体调节剂”是指妨碍或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，与机理无关。这种类视黄醇受体调节剂的实例包括：贝沙罗汀(Bexaroten)、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4'-羟基苯基)维甲酰胺和N-4-羧基苯基维甲酰胺。

“细胞毒性剂”是指主要通过直接作用于细胞功能而引起细胞死亡或者抑制或妨碍细胞有丝分裂(Myose)的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、插入剂、微管蛋白抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。

细胞毒性剂的实例包括但不限于：替拉扎明(Tirapazimin)、Sertenef、恶液质素(Cachectin)、异环磷酰胺、他索纳明(Tasonermin)、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、松龙苯芥、二溴卫矛醇、雷莫司汀(Ranimustin)、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、庚铂(Heptaplatin)、雌莫司汀、甲苯磺酸英丙舒凡(Improsulfan-tosylat)、氯乙环磷酰胺、嘧啶亚硝脲、二溴螺氯铵、嘌嘧替派(Pumitepa)、乐铂、沙铂、甲基丝裂霉素(Profiromycin)、顺铂、伊罗夫文(Irofulven)、右异环磷酰胺、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)合铂(cis-Aminedichlor(2-methylpyridin)platin)、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式、反式、反式)双-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯代)铂(II)]四氯化物、Diarisidinylspermin、、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特(Pinafid)、戊柔比星(Valrubicin)、氨柔比星、抗瘤酮(Antineoplaston)、3'-脱氨基-3'-吗啉代-13-脱氧代-10-羟基洋红霉素、蒽环霉素(Annamycin)、加柔比星(Galarubicin)、依利奈法德、MEN10755和4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲磺酰基柔红霉素(参见WO 00/50032)。

微管蛋白抑制剂的实例包括：紫杉醇、硫酸长春地辛、3',4'-双脱氢-4'-脱氧-8'-去甲长春碱、多烯紫杉醇(Docetaxol)、根霉素、多拉司他汀(Dolastatin)、羟乙基磺酸米伏布林、Auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、自念珠藻环肽(Cryptophycin)、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱(Anhydrovinblastin)、N,N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、TDX258和BMS188797。

拓扑异构酶抑制剂是例如，托泊替康、Hycaptamin、依立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3',4'-O-外型亚苄基教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':b,7]中氮茚并[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、索布佐生、2'-二甲基氨基-2'-脱氧依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)-乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、苯胺吖啶(Asulacrin)、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基-氨基]乙基]-5-[4-羟基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并(3',4':6,7)萘并(2,3-d)-1,3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-(亚甲基二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]菲啶鎓、6,9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5,10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7,10-二羟基-2-(2-羟基乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙基氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-硫杂蒽-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。

“抗增殖剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸，例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001，以及抗代谢剂，例如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、Fosteabin-Natriumhydrat、雷替曲塞(Raltitrexed)、Paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋啉、地西他滨、诺拉曲塞(Nolatrexed)、培美曲塞(Pemetrexed)、奈拉滨(Nelzarabin)、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷、2'-氟代亚甲基-2'-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢苯并呋喃基)磺酰基]-N'-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四烷二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油-B-L-甘露庚吡喃糖基]腺嘌呤(N6-[4-Deoxy-4-[N2-[2(E),4(E)-tetradecadienoyl]glycylamino]-L-glycero-B-L-mannoheptopyranosyl]adenin)、Aplidin、海鞘素、曲沙他滨(Troxacitabin)、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b]-1,4-噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰基氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)十四碳-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶(Methioninase)、2'-氰基-2'-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲。“抗增殖剂”还包括不同于“血管生成抑制剂”下所列出的那些的生长因子的单克隆抗体如曲妥单抗；和肿瘤抑制基因如p53，其可以通过重组病毒介导的基因转移来递送(例如，参见美国专利US 6,069,134)。

来自下表的药物优选，但非排他地，与4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-[2,7]二氮杂萘-1-基胺组合。

4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺及其可药用盐和/或互变异构体，特别优选与免疫调节剂，优选与抗PDL-1或IL-12组合。

此外，本发明涉及用于肿瘤的4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其生理上可接受的盐和互变异构体，其中有效量的式I的化合物与来自免疫调节剂组的化合物组合施用。

此外，本发明涉及用于肿瘤的4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和/或其生理上可接受的盐和互变异构体，其中有效量的式I的化合物与放疗和来自免疫调节剂组的化合物组合施用。

药理学抑制剂对体外肿瘤细胞的增殖/活力的作用的证明

1.0背景

在本发明实验描述中，描述了活性化合物对肿瘤细胞增殖/肿瘤细胞活力的抑制作用。

将所述细胞在微量滴定板(96-孔形式)中以合适的细胞密度接种且将测试物质以浓度系列的形式加入。在含血清的培养基中再培养四天之后，肿瘤细胞增殖/肿瘤细胞活力可以借助于阿拉马蓝(Alamarblue)测试系统确定。

2.0实验程序

2.1细胞培养

例如，市售结肠癌细胞系、卵巢细胞系、前列腺细胞系或乳腺细胞系等。

将细胞在培养基中培养。以几天的时间间隔，将细胞借助于胰蛋白酶溶液从培养皿中脱离且以合适的稀释度接种在新鲜的培养基中。将细胞在 37℃和10% CO₂下培养。

2.2. 细胞的接种

将在180μl体积培养基中每培养物/孔的限定数量的细胞(例如 2000个细胞)使用多通道移液器接种在微量滴定板(96孔细胞-培养板)中。随后将细胞在CO2培养箱(37℃和10% CO2)中培养。

2.3. 测试物质的添加

将测试物质溶解于例如DMSO中且随后以相应的浓度(如果需要的话，以稀释系列)用于细胞培养基中。根据活性化合物的效力和所需的浓度散布可以调节稀释步骤。将细胞培养基以相应的浓度添加至测试物质中。测试物质向细胞的添加可以在细胞接种的当天进行。为此，在每种情况下，将来自稀释前板的20μl物质溶液加到培养物/孔中。将细胞在37℃和10% CO₂下再培养四天。

2.4. 颜反应的测量

在每种情况下，每孔加入20μl阿拉马蓝试剂，且例如在CO2培养箱(在37℃和10% CO2下)中将微量滴定板再孵育七小时。在具有荧光滤光片的阅读器中在540nm的波长处测量板。在直接测量之前可以轻轻地摇动板。

3. 评估

将培养基对照(没有细胞和所使用的测试物质)的吸光度值从所有其它吸光度值中减去。将对照(在没有测试物质的情况下的细胞) 设定为等于100%，且所有其它吸光度值以相对于其的关系而设定(例如，对照的%)：

计算：

100 * (存在细胞和测试物质的值-培养基对照的值)

              (存在细胞的值-培养基对照的值)

IC₅₀值(50%抑制)借助于统计程序诸如例如RS1确定。

4.0 PDK1抑制的测试

实验批次在闪光板系统中用384个孔/微量滴定板进行。

在每种情况下，将在每孔50μl常规实验溶液中的PDK1样品His₆1-50)(-PDK1( 3.4 nM)、PDK1底物生物素-bA-bA-KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDY-IADWC (400 nM)、4 μM ATP (具有0.2μCi ³³P-ATP/孔)和测试物质在30℃下孵育60 分钟。测试物质以相应的浓度使用(如果需要的话，则以稀释系列使用)。在没有测试物质的情况下进行对照。反应使用标准方法终止并洗涤。激酶的活性经由掺入的放射性在TopCount仪器中测量。为了确定非特异性激酶反应(空白值)，在存在100nM十字孢碱(staurosporin)的情况下进行实验批次。

5.0评估

将空白值(在存在十字孢碱的情况下不使用测试物质)的放射性(每分钟分解)从所有其它放射性值中减去。将对照(在没有测试物质的情况下的激酶活性)设定为等于100%且将所有其它放射性值(在减去空白值之后)表达为相对于其的关系(例如，以对照的%)。

计算：

100* (存在测试物质的激酶活性的值–空白值)

              (对照值 – 空白值)

= 对照的%

IC₅₀ 值(50%抑制)借助于统计程序诸如例如RS1确定。本发明的化合物的IC₅₀数据显示在表1中。

APCI-MS(大气压化学电离-质谱) (M+H)⁺ 。

本发明的化合物的IC₅₀数据显示在表1中。

IKKε–激酶测试(IKKε)

激酶测定作为384孔闪光板测定进行。

在存在或不存在测试物质的情况下，将1 nM IKKε、800 nM生物素化的IκBα(19-42)肽(生物素-C6-C6-GLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE)和10 μM ATP (以0.3 μCi的³³P-ATP/?孔掺入)在30℃下在50 μl的总体积中(10 mM MOPS、10 mM醋酸镁、0.1 mM EGTA、1 mM二硫苏糖醇、0.02%的Brij35、0.1%的BSA、0.1%的BioStab，pH 7.5)孵育120分钟。反应使用25μl的200mM的EDTA溶液终止，在30分钟之后在室温下用抽吸过滤，且将孔用100μl 0.9% NaCl溶液洗涤3 次。激酶反应的非特异性比例(空白试验)使用3 μM EMD 1126352 (BX-795)确定。放射性在TopCount仪器中测量。IC₅₀值使用RS1计算。

TBK1 –激酶测定

激酶测定作为384孔闪光板测定进行。

在存在或不存在测试物质的情况下，将0.6 nM TANK结合激酶(TBK1)、800 nM生物素化的MELK衍生肽(生物素-Ah-Ah-AKPKGNKDYHLQTCCGSLAYRRR)和10 μM ATP (以0.25 μCi的³³P-ATP/孔掺入)在30℃下在50 μl的总体积中(10 mM MOPS、10 mM醋酸镁、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、0.02%的Brij35、0.1%的BSA，pH 7.5)孵育120 min。反应使用25μl 200 mM EDTA溶液终止，在30分钟之后在室温下抽吸过滤，且将孔用100μl 0.9% NaCl溶液洗涤3次。激酶反应的非特异性比例(空白)使用100nM十字孢碱确定。放射性在TopCount仪器中测量。IC₅₀值使用RS1计算。

用于确定抑制剂对TGF-β介导作用的抑制的效力的体外(酶)测定

作为实例，测试了抑制剂消除TGF-β介导的生长抑制的能力。

将肺上皮细胞系M v 1L u 的细胞以限定的细胞密度接种在96-孔微量滴定板中并在标准条件下培养过夜。第二天，将培养基用包含0.5% FCS和1ng/mL TGF-β的培养基替代，且将测试物质以限定的浓度，通常以具有5-倍梯级的稀释系列形式加入。溶剂DMSO的浓度恒定在0.5%。再两天之后，进行细胞的结晶紫染。从固定细胞中提取结晶紫之后，在550nm处用光谱仪测量吸光度。其可以用作存在的贴壁细胞的定量量度且因此用作在培养期间细胞增殖的定量量度。

ALK-5抑制的测试

实验批次在闪光板系统中用384个孔/微量滴定板进行。

在每种情况下，在30℃下在存在或不存在5至10种不同浓度的测试物质的情况下，将31.2 nM GST-ALK5、439 nM GST-SMAD2和3 mM ATP (存在0.3 μCi 33P-ATP/孔)在总体积35 μl缓冲液(20 mM HEPES、10 mM MgCl2、5 mM MnCl2、1 mM DTT、0.1% of BSA，pH 7.4)/孔中孵育45 min。反应使用25μl 200 mM EDTA溶液终止，在30分钟之后在室温下抽吸过滤。

将孔用100μl 0.9% NaCl水溶液洗涤3次，并且残余放射性在TopCount仪器(Perkin-Elmer)中测量。IC50值使用RS1软件计算。

评估

将空白值(在存在100 nM十字孢碱的情况下不使用测试物质)的放射性(每分钟分解)从所有其它放射性值中减去。将对照(在没有测试物质的情况下的激酶活性)设定为等于100%且将所有其它放射性值(在减去空白值之后)表达为相对于其的关系(例如，以对照的%)。

计算：

100* (存在测试物质的激酶活性的值–空白值)

              (对照值 – 空白值)

= 对照的%

IC₅₀ 值(50%抑制的测试物质的浓度)借助于统计程序(诸如，例如，RS1)确定。本发明的化合物的IC₅₀数据显示在表2中。

ALK-1抑制的测试

本领域技术人员已知的测定如URL http://?www.reactionbiology/webapps/main/Kinases/Invitro-gen?100114/?ALK1.pdf下所示进行。

ALK1/ACVRL1

(丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶受体R3，激活蛋白受体样激酶1，ALK-1，TGF-β超家族受体I型，TSR-I，SKR3，ACVRLK1)

CAT#：ALK1

酶：人ALK1

底物：酪蛋白，20 mg/ml

ATP 10 μM。

反应：

。

HPLC/MS 方法：

柱：Chromolith SpeedROD RP-18e，50 x 4.6 mm²

梯度：A:B =  96:4-0:100

流速：2.4 ml/min

洗脱液A：水 + 0.05% 的甲酸

洗脱液B：乙腈 + 0.04% 的甲酸

波长：220 nm

质谱分析：正模式

m.p.=熔点

MS(ESI)：质谱(电喷雾电离)

MS (EI)：质谱(电子撞击电离)。

在上面和下面，所有温度都是以℃表示。在下面的实施例中，“常规后处理”是指：根据最终产物的组成，如果需要，添加水，如果需要，将pH值调节至2和10之间，用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取混合物，分离各相，用硫酸钠干燥有机相，蒸发并通过硅胶层析和/或通过结晶纯化。

合成

本发明的化合物通过以下制备：起始材料1 (4-溴-2,7-二氮杂萘-1-基胺)与起始材料2 (1-苯磺酰基-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶)的Pd催化的交联偶合和随后使用醇类在碱性条件下裂解掉苯-磺酰基。

起始材料1：

4-溴-2,7-二氮杂萘-1-基胺，CAS 959558-28-2，可商购，并且通过使用乙酸中的溴溴化2,7-二氮杂萘-1-基胺制备。

或者，所述化合物从2H-2,7-二氮杂萘-1-酮 CAS 67988-50-5、氢溴化物CAS 950746-19-7或盐酸化物CAS 369648-60-2制备。

溴化得到4-溴-2,7-二氮杂萘-1(2H)-酮 CAS 959558-27-1，其通过氯化化合物诸如POCl₃和/或PCl₅转换为4-溴-1-氯-2,7-二氮杂萘。与氨或氨等同物反应得到2,7-二氮杂萘-1-基胺。

或者，4-甲基烟腈 CAS 5444-01-9与DMF缩醛(例如CAS 4637-24-5 [二甲基])反应，得到4-((E)-2-二甲基氨基-乙烯基)-烟腈 CAS 36106-34-0，其被环化为2,7-二氮杂萘-1-基-胺。

起始材料2：

1-(苯磺酰基)-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶 CAS 943324-08-1是可商购的，并且通过与双(频那醇合)二硼(bis(pinacolato)diboron) CAS 73183-34-3的Pd催化的反应从3-碘-2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚 CAS 943324-07-0制备(Seefeld等, WO 2007/076423 A2, 第170页)。

或者，采用化合物3-溴-2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚 CAS 744209-37-8代替3-碘-2-甲基-1-(苯-磺酰基)-7-氮杂吲哚。

实施例：

4-溴-2,7-二氮杂萘-1-基胺

将940 ml DMF 二甲基缩醛添加至940 g DMF中的200 g 4-甲基-烟腈的溶液中，并且将混合物在120-110℃的回流下加热3天。将混合物冷却至35℃，倾入10升冰水中，并且在4℃冷却16 h。将沉淀滤出，用水洗涤并干燥，得到263 g 4-((E)-2-二甲基氨基乙烯基)-烟腈; M~173.22 g/?mol; M+H实测值174, NMR对应。

将810 g甲酸铵添加至4升容器中的253 g 4-((E)-2-二甲基氨基-乙烯基)-烟腈。然后添加300 ml AcOH，并且将混合物在115℃加热20 h。将混合物冷却，添加5升水，并且将混合物用0.5升CH₂Cl₂萃取10次。将水相使用160 g NaOH调节至~ pH 10。将水相用MTB醚萃取，将有机相分离开并且经硫酸钠干燥。去除溶剂并干燥得到 59 g 2,7-二氮杂萘-1-基胺, M~145.16 g/mol, M+H实测值146, NMR对应。

将32 g 2,7-二氮杂萘-1-基胺在室温溶解在200 ml乙酸中。然后缓慢添加200 ml乙酸中的35 g溴，使得温度不超过25℃。将混合物再搅拌60分钟。

将获得的悬浮物溶解在500 ml水中，并使用500 ml 25%氨水溶液将pH调节至pH 7-8。

将混合物搅拌14 h。将棕沉淀滤出，用水洗涤并干燥，得到28.3 g粗产物。通过在乙酸乙酯/甲醇中的快速层析纯化得到18.5 g 4-溴-2,7-二氮杂萘-1-基胺, M~224.06 g/mol, M+H实测值224。

1-(苯磺酰基)-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶

在-70℃在N₂气氛下，将4.8 ml THF/庚烷中的二异丙氨基锂的2M溶液经60 min的时程添加至20 ml THF中的1 g 1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚的溶液中。允许混合物经50分钟的时程温热至20℃。将悬浮液冷却至-70℃，并且经20分钟的时程逐滴添加20 ml THF中的1.1 g溶液。将混合物在-70℃搅拌一小时，随后在室温搅拌14 h。将混合物用水稀释，并用二氯甲烷萃取。将萃取液经硫酸钠干燥，过滤，去除溶剂，并从环-己烷结晶，得到0.68 g 2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚, M~ 272.32 g/mol, M+H实测值273, NMR对应。

DMF中的溴化：

将75 ml DMF中的25 g NBS添加至75 ml DMF中的34.8 g 2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚的溶液中。将混合物在室温搅拌1 h，倾入水中，将已沉淀出的沉淀分离出，用水洗涤并干燥，得到42 g 3-溴-2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚, M~351.22 g/mol, M+H实测值351。

乙腈中的溴化：

将2 ml CH₃CN中的72 mg NBS添加至3 ml CH₃CN中的100 mg 2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚的溶液中。将混合物在室温搅拌20 h，倾入水中，将已沉淀出的沉淀分离出并干燥，得到93 mg 3-溴-2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚, M~351.22 g/mol, M+H实测值351。

将2.6 g乙酸钾和300 mg PdCl₂(PPh₃)₂添加至30 ml二甘醇二甲醚中的3 g 3-溴-2-甲基-1-(苯磺酰基)-7-氮杂吲哚和2.9 g双频那醇合二硼(Bispinacolatodiboron)的溶液中。将混合物在120℃加热3 h，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥，过滤出，并去除溶剂。得到3 g 1-(苯磺酰基)-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶, M~ 398.29 g/mol, M+H实测值399。

4-(1-苯磺酰基-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺

在氮气气氛下，将23.7 g 磷酸三钾和3.2 g 反式-二氯二(三环-己基-膦)-钯(II)添加至400 ml二甘醇二甲醚和15 ml水中的12.5 g 4-溴-2,7-二氮杂萘-1-基胺的溶液中。将混合物加热至125℃，并且经30分钟的时程逐滴添加100 ml二甘醇二甲醚中的25 g 1-(苯磺酰基)-2-甲基-3-(4,4,5,5-四-甲基-1,3,2-二氧杂硼戊烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶。将混合物在125℃搅拌3 h，在室温搅拌20 h，随后去除溶剂并使混合物进行常规后处理。将产物借助快速层析(经330 g二氧化硅，乙酸乙酯中的甲醇梯度，200ml/min，在254 nm的UV检测)纯化，得到4-(1-苯-磺酰基-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺(M~415.47 g/mol, M+H实测值416)的纯级分(5.1 g)和污染级分(6.5 g)。

4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺

将400 ml THF/三氟乙醇 (1:1体积)中的23 g 4-(1-苯磺酰基-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺和26 g碳酸铯的混合物在回流下加热20 h。将混合物冷却，将溶剂去除，并将产物借助快速层析(经220 g二氧化硅，乙酸乙酯中的甲醇梯度，150ml/min，在254 nm的UV检测)纯化，得到12.2 g 4-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2,7-二氮杂萘-1-基胺, M~275.31, M+H实测值276.2；

。

表 2

TGF-β激酶ALK5和ALK1的抑制

本发明的化合物与现有技术的化合物的比较

下列实施例涉及药物∶

实施例A∶注射小瓶

使用2N盐酸，将100 g本发明的化合物和5 g磷酸氢二钠的3升二次蒸馏水溶液调节至pH 6.5，无菌过滤，转移到注射小瓶中，在无菌条件下冷冻干燥，并在无菌条件下密封。每个注射小瓶包含5 mg活性化合物。

实施例B∶栓剂

将20 g本发明的化合物与100 g大豆卵磷脂和1400 g可可脂的混合物熔融，倒入模具中，冷却。每个栓剂包含20 mg活性化合物。

实施例C∶溶液剂

在940 ml二次蒸馏水中，用1 g本发明的化合物、9.38 g NaH₂PO₄?2H₂O、28.48 g Na₂HPO₄?12H₂O和0.1 g苯扎氯铵制备溶液剂。将pH值调节至6.8，并将溶液剂补充至1升，经辐射消毒。该溶液剂可以以滴眼剂形式使用。

实施例D∶软膏剂

在无菌状态下，将500 mg本发明的化合物与99.5 g凡士林混合。

实施例E∶片剂

将1 kg本发明的化合物、4 kg乳糖、1.2 kg马铃薯淀粉、0.2 kg滑石和0.1 kg硬脂酸镁的混合物用常规方式挤压，得到片剂，以至于每个片剂包含10 mg活性化合物。

实施例F∶糖衣药丸

类似于实施例E，压制片剂，随后以常规方式，用蔗糖、马铃薯淀粉、滑石、西黄蓍胶和染料的包衣进行包衣。

实施例G∶胶囊剂

用常规方式将2 kg本发明的化合物引入到硬明胶胶囊中，以至于每个胶囊剂包含20 mg活性化合物。

实施例H∶安瓿

将1 kg本发明的化合物的60升二次蒸馏水溶液无菌过滤，转移到安瓿中，在无菌条件下冷冻干燥，并在无菌状态下密封。每个安瓿包含10 mg活性化合物。