使用具有两性离子固定相的HILIC与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测

本发明涉及用于在大量样品中分析有机小分子的方法。具体而 言，本发明提供从诸如全血、血浆、血清和尿的生物基质中大规模 测定临床目标有机小分子甲基丙二酸、丁二酸并任选测定高半胱氨 酸的方法。

背景技术

所有在本文中公开的参考文献均通过引用结合到本文中。

要求临床实验室所使用的分析技术具有快速、简单且稳定的性 能，除此之外还需具备灵敏性和选择性。大量的不同基质(即尿、血 浆、血清、全血等)中的样品需要各种各样的技术，基于这些技术可 开发出简单的并且以几乎不间断或不间断的自动方式使用的方法。 常用的技术为酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法因易于自动化而得于 普及。然而，偶尔会由于交叉反应或缺少抗体而导致需要使用多种 ELISA试剂盒来监测样品中多种可能在临床上重要的化合物。这增 加了成本并降低了样品处理量。

因此，液相谱(LC)并且尤其是高效液相谱(HPLC)作为将混 合物分离为其各组分并定量测定各化合物的优异方法而倍受瞩目。 通过简单地选择流动相和固定相，HPLC能将脂溶性或水溶性物质分 离为其各组分而无需对所述物质进行任何预处理。然而，仅仅使用 例如紫外区吸收的常规参数，用于HPLC的传统检测器系统对特定 化学结构不灵敏。例如，在测定UV吸收相对较低的化合物时，需要 柱前衍生步骤以获得保留时间、增强谱分离选择性并获得对临床 相关浓缩物的足够高的灵敏度(Pastore A等，Clin.Chem.44，825-32， 1998)。因此，质谱检测成为日益频繁使用的工具。US 4,298,795公 开了通过质谱法进行检测的HPLC系统。对质谱的一般性介绍以及 与液相谱的联用可参见“Introduction to mass spectrometry(质谱介 绍)”(Watson，J.Throck，Lippincott-Raven Publisher出版社， Philadelphia，第3版，1997)，质谱电喷雾离子化原理描述于Mass Spectrometry Reviews，20，362-87，2001，Nadja B.Chech和Christie G. Enke著。

含有HPLC和质谱(MS)检测联用的系统还被开发用于大量临床 样品的常规分析，可预期其将更多地用于临床实验室(Kinter M.，Clin. Chem.，50，1500-2，2004)。已将样品制备和校正规程以及自动化程序 优化并用于HPLC-MS方法。MS技术的进步在MS仪器中产生了具 有高分辨率的高效仪器。事实上，在某些情况下，预先的谱分离 已被省略并被认为不必要。

US 6,541,263描述了使用HPLC和质谱在人血浆中测定皮质类 固醇。HPLC和MS的联用使得可定量和定性地分析低浓度的结构类 似的化合物。然而，采用US 6,541,263的技术分析的所有化合物均 为非常大且疏水的物质。还需要分析在临床上重要的小的、极性的 和/或亲水的分子。

这种小的、极性的和/或亲水的分子在临床上重要的分析之典型 实例是对甲基丙二酸和丁二酸的定量分析，任选还对高半胱氨酸的 定量分析。甲基丙二酸(MMA)(以及高半胱氨酸)是B12缺乏的诊断 标记物，而常常干扰上述化合物定量分析的丁二酸是MMA在生理 学上的丰富的异构体。多年来，人们尝试了使用各种分析技术的不 同方法以达成快速、准确地定量测试MMA的目标，然而这是徒劳 的。在这些技术中，MMA是在谱上与丁二酸良好地分离，而不是 在同一次分析中通过光谱数据的解卷积法(deconvolution)或使用高分 辨能力，即MS/MS检测系统来分离。

WO 03/079008公开了使用液相谱和串联MS检测诸如MMA 和丁二酸的小分子的方法。所述方法复杂、耗时，包括在测定前对 样品的衍生化以及在获得结果前的预先计算的步骤。

WO 2006/090428提供了用于分析小分子的反相方法。从其公开 的谱图可知难以获得对MMA和丁二酸的良好分离。

因此，仍需要用于定性和/或定量地分析临床样品中的医学目标 有机小分子的改进方法。理想地，这种测定方法应快速、需要最少 量的样品预处理、易于自动化且结果应易于解释。

发明内容

本发明通过提供用于检测甲基丙二酸并任选同时检测高半胱氨 酸和丁二酸的方法解决上述对MMA快速、准确定量的问题，所述 方法涉及液相谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包 括以下步骤：

a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的 样品；

b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；

c)将包含所述样品的所述流动相从液相谱柱洗脱，所述液相 谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；

d)通过质谱检测可能存在的甲基丙二酸和/或丁二酸以及任选的 高半胱氨酸；以及

e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机 分子的量。

由于样品预处理规程已知，因此初始样品浓度可通过稀释因子 计算并且与临床或医学评价研究中的对象(患者)的其它观察相关。

优选水混溶性有机溶剂为乙腈。所述溶剂还可选自以下水溶性 溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮和THF或其混合物。优选乙腈。

此外，优选流动相由乙腈和水缓冲溶液(诸如盐、弱酸和弱碱的 水溶液)构成。缓冲物质优选诸如乙酸铵和甲酸铵的盐，还可使用诸 如甲酸或乙酸的弱酸。在某些HILIC/MS应用中，可在水缓冲溶液中 包含氨和碳酸铵。所述水缓冲溶液具有微酸性至微碱性的pH，优选 为4.0-7.5，还优选为4.0-7.0，尤其为4.0-5.0，并且流动相的总离子 强度优选为5-60mM。

此外，优选流动相的乙腈/水缓冲溶液的组成为95/5-60/40，优 选85/15-65/35，并最优选80/20-65/35。

此外，还优选固定相的两性离子基团为CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2- CH2-SO3-或-O-PO-3-CH2-CH2-N+(CH2)3，优选CH2-N+(CH3)2-CH2-CH2- CH2-SO3-。实施本发明时可使用的固定相公开于US 2005/0064192 A1 和WO 00/27496。

已证明这些两性离子固定相对极性和亲水性化合物的分离的选
择性和适应性与固定相载体的化学或物理形式(format)无关。例如，
已显示在硅胶载体上使用两性离子固定相时，对流动相pH的改变可
用于优化对肽的分离选择性(P.J.Boersema，N.Divecha，A.J.R.Heck，
S.Mohammed J.Proteome Res.，(2007)，印刷中)，对于一系列聚甲基
丙烯酸酯基两性离子整体柱(zwitterionic monolith)上的苯甲酸也有类
似的方式(Z.Jiang，N.W.Smith，P.D.Ferguson和M.R.Taylor，Anal.
Chem.79，1243-1250，2007)。在这些研究中，影响均非来自于载体材
料，而是来自于同时影响容量因子和选择性的分析物的解离和相应
的亲水性变化。在最近的关于HILIC的综述中讨论了固定相功能基
团和载体的影响(P.K.Irgum J.Sep.Sci.，29，1784-1821，
2006)。

适合于本发明的载体的实例有多孔硅胶、锆、石墨和聚合物或
共聚物材料，其形状为大小-30μm、优选为3.5-10μm并且孔隙
为50-300的球形颗粒，或者为所述材料的整体柱结构，或者任选
为窄内径毛细管的内壁。

合成或天然来源的聚合物或共聚物载体可含有单乙烯基或低聚 乙烯基单体单元，诸如苯乙烯及其取代衍生物、丙烯酸或甲基丙烯 酸、丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸羟烷基酯和甲基丙 烯酸羟烷基酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、乙烯吡啶及其取代衍生 物、二乙烯基苯、二乙烯吡啶、亚烷基二丙烯酸酯、亚烷基二甲基 丙烯酸酯、最多具有5个乙二醇重复单元的寡聚乙二醇二丙烯酸酯 和寡聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、亚烷基双(丙烯酰胺)、双(丙烯 酰胺)、三甲氧基丙烷三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯、 三丙烯酸酯和四丙烯酸酯，和它们的混合物。

在优选的实施方式中，两性离子功能配体通过接枝聚合结合至 所述载体、通过多步反应将两性离子单体或两性离子配体附着至所 述载体表面或通过将所述单体或配体和交联单体和稀释剂共聚形成 包含两性离子功能基团的整体柱载体(monolith carrier)。

尤其有利的是应用所述方法定量或定性测定临床样品中的甲基 丙二酸、任选还测定高半胱氨酸和丁二酸。这种临床样品优选体 液，诸如尿、血、血浆、血清和脑脊液。将所述临床样品与乙腈混 合以使可包含于所述样品中的蛋白质沉淀。在去除沉淀的蛋白质 后，可将残留的上清液直接注入流动相并洗脱。

发明详述

本发明提供对反相HPLC方法和公知的标准-HPLC和质谱的联
用的可行替代方案，即亲水性相互作用液相谱(HILIC)与质谱检测
联用。HILIC是适用于极性和亲水化合物的分离技术，并且采用包含
高含量的(40-99％ v/v)水混溶性有机溶剂(乙腈、丙醇、乙醇、甲醇、
THF、丙酮)的洗脱液以提高分析物和亲水固定相间的亲水性相互作
用。通常发现HILIC所使用的流动相良好地适用于ESI-MS检测
(Guo Y.，Gaiki S.，J.Chromatogr.A，1074，71-80，2005)，而且与反相方
法相比，常常改进检测极限，尤其是当分析亲水化合物时和当最终
流动相缓冲盐浓度可保持在合理的浓度水平，通常低于50mM时更
是如此(Bengtsson J.，Jansson B.，Hammarlund-Udenaes M.，Rapid
Commun.Mass Spectrom.，第19卷(2005)，2116-2122)。尽管有其它
市售HILIC固定相，但都不能真正媲美WO00/27496 A1和US
2005/0064192 A1所公开的固定相。这种固定相以注册商标ZIC
HILIC和ZIC-pHILIC相出售(SeQuant AB，瑞典)。包含这些高极性
两性离子固定相的谱柱提供可显著溶剂化极性和荷电化合物的独
特环境，所述谱柱使得高效HILIC分离成为可能。所述两性离子
固定相(图2)可通过弱静电相互作用与荷电分析物相互作用，在实践
中，这在方法开发中选择缓冲盐和离子强度时为谱法提供更高的
自由度，因此使所述谱柱成为用于LC-MS分析的理想选择。本专
利申请显示了当将有效的分离和灵敏的检测方法联用时的优势，并
通过可从临床样品中的丁二酸和高半胱氨酸中分辨出甲基丙二酸的
等度HILIC分离作为例示。

ZIC-HILIC柱(SeQuant AB，瑞典)为粒度为3.5、5或10μm的
硅胶基固定相，而ZIC-pHILIC柱(SeQuant AB，瑞典)是粒度为5
μm的聚合物基固定相，但是均具有磺基甜菜碱型两性离子功能团。

附图说明

参照附图进一步描述本发明，其中：

图1显示MMA、丁二酸和高半胱氨酸的结构；

图2显示ZIC-HILIC柱的两性离子甜菜碱功能基团；

图3a-c提供说明在氘代MMA内标的存在下，从分别掺入了a) 50、b)476和c)1000nM MMA的人血浆样品中分离MMA的谱 图，使用与单离子监测负离子电喷雾MS联用的HILIC；

图4提供人血浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中 掺入了50-1000nM中六个彼此独立浓度的MMA；

图5提供人血浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中 掺入了50-200,000nM中13个彼此独立浓度的MMA；和

图6显示高半胱氨酸、甲基丙二酸和丁二酸的完全基线HILIC 分离的谱图，分别采用UV(a)检测和MS(b)检测。这些实验所使 用的实验条件与用于优化的MMA定量分析的那些不同，并且例示 了获得在临床样品中定量或定性测定甲基丙二酸与高半胱氨酸和丁 二酸的可能性。

实施例1

实验部分

试剂和药品

乙腈(HPLC纯)和分析纯的乙酸铵均购自默克(Darmstadt，德 国)，而甲酸(％，p.a.)购自JT BAKER(Deventer，荷兰)。所有的水均经 Milli-Q水纯化系统(Millipore，Bedford，MA)纯化。血浆蛋白质沉淀 (PPT)溶液通过如下方法制备：加入25mL乙腈，随后加入250mL 浓乙酸和43mL 196.5mmol氘代甲基丙二酸(d3-MMA)储备液至50 mL容量瓶，再加入乙腈至刻度线。该PPT溶液包含99.5％体积乙 腈、0.5％体积乙酸和169nM浓度的d3-MMA。

蛋白质沉淀和血浆样品净化

使用HILIC技术可实施非常有效且直接的临床样品的样品预处 理。由于乙腈在HILIC中是弱溶剂，可在乙腈中沉淀干扰血浆蛋白 质。首先将PPT溶液(0.80mL)移液至2mL玻璃自动进样瓶，然后加 入人血浆(0.20mL)并用惰性瓶帽封盖样品瓶。然后，将所有样品置 于定轨摇床上(Janke&Kunkel，Typ Vx8)(或具有类似功能的其它装置)5 分钟以达到充分的混合。在血浆蛋白质沉淀步骤之后、将样品瓶转 移至Hettich Zentrifugen Rotana 460R离心机(或具有类似功能的其它 装置)，15℃下以6200rpm离心10分钟，随后进行分析。为测定分 析回收率，在蛋白质沉淀之前和之后加入已知量的MMA和MMA- d3。

谱系统

谱系统包含安捷仑1100(Agilent 1100)分离模块，所述模块以
0.4mL/min的流速输送包含乙腈和pH 4.7的100mM乙酸铵水缓冲
液(80∶20 v/v)的流动相。使用安捷仑1100自动进样器将标准品、经
掺杂的样品、对照品和人类患者样品(4μL)进样至长100mm、内径
2.1mm的具有3.5μM颗粒的ZIC-HILIC分离柱，该柱置于设置在
30℃的安捷仑1100柱箱中。如下进行定量分析：在安捷仑1100质
谱上，使用负离子模式ESI的单离子监测(m/z 117.2和120.2)，并施
加设置为10L/min的干燥气流，气体温度：300℃，并将毛细管电压
设置为3.0KV。所有谱图均记录于安捷仑Chemstation工作站。
在以两性离子固定相上的HILIC模式分离后，使用负离子ESI MS
检测定量分析人血浆样品中的甲基丙二酸(MMA)

使用标准溶液、经掺杂的血浆样品以及人类患者样品，获得针 对MMA的重复性、重现性、精确、线性、LOD等分析数据，这些 工作全部在它处写明。针对采用同位素标记内标的生物样品，开发 了用于样品后处理，随后进行负离子ESI-MS单离子监测的的简单、 耐用(rugged)且有效的定量分析方法。以当前的系统设置获得了优异 的灵敏度和充分的线性(r2＞0.998)，并且其中，MMA的LOQ约为10 nM且标准溶液的LOD小于5nM。由于MMA的内源性水平在140- 500nM之间，我们所提出的经过稀释/蛋白质沉淀的取样步骤将稀释 样品4次，以达到目标水平。

结果：

图3a-c显示了表明将MMA从分别掺入了a)50、b)476和c) 1000nM MMA的人血浆样品中分离的谱图。所有的样品中均添加 了氘标记的内标(MMA-d3)，参见图3a-c中下方的谱图。在具有 3.5μM颗粒的100×2.1mm ZIC-HILIC柱上进行所有的分离，在安捷 仑1100质谱仪中，使用负离子模式ESI的单离子监测(m/z 117.2和 120.2)，进行检测。

图4显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所述人血浆样 品中掺入了50-1000nM中6个彼此独立浓度的MMA。向所有样品 添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间的面 积响应比。

图5显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所述人血浆样 品中掺入了50-200,000nM中13个彼此独立浓度的MMA。向所有 样品添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间 的面积响应比。

实施例2

实验条件

谱柱：    ZIC-HILIC 50x 4.6mm，5μm

UV

柱温：      RT

流动相：    乙腈/乙酸铵(pH 6.8，最终溶液中为30

            mM)；70/30(v/v)

流速：      1.5mL/min

检测器：    波长为206nm(UFS 1.0V)的UV

进样量：    5μL流动相中的测试溶液

MS

柱温：      30℃

流动相：    乙腈/乙酸铵(pH 6.8，最终溶液中为25

            mM)；75/25(v/v)

流速：      1.0mL/min

分流：      100μL/min至MS

检测器：    Agilent 1100台式MS，正离子模式ESI

毛细管电压：3000V

碎裂电压    150V

(Fragmentor)：

质量范围：  50-200m/z

进样量：    5μL 0.1mg/mL流动相溶液中的各化合

            物

样品：      以洗脱顺序将高半胱氨酸、甲基丙二酸

            和丁二酸溶解于流动相。

方法开发通常使用UV检测器进行，因为它易于使用且耐用， 但是该方法常常缺乏允许在相关生理水平进行定量分析所需的灵敏 度。此处，显示出暂时的最佳分离条件可通过UV检测建立，图 6(a)，然后简单地转化并轻微地修改以更好的适用于MS检测而获得 灵敏度。对所有化合物的基线分离可在90秒内完成，并且化合物以 介于1.4和3之间的k’流出。值得注意的是高半胱氨酸和甲基丙二酸 之间的基线下降。产生该现象的主要原因是低检测波长与样品和流 动相之间细微的缓冲液浓度不匹配的组合所致。通过降低流速和流 动相中水的比例(从30％体积降低至25％体积)并且稍微地减小离子强 度，使所述方法适应LC-MS仪器并获得充分的分离效率，如图6(b) 所示。使用暂时的MS兼容条件，可测定生物样品中的甲基丙二酸以 及高半胱氨酸和丁二酸，但它们不为临床相关浓度水平。因此，图6 显示了对高半胱氨酸、甲基丙二酸和丁二酸分离，随后分别通过UV (a)和MS(b)检测。然而，在这些实验中所使用的实验条件与用于最 佳的MMA定量的那些不同。

ZIC-HILIC柱的确是分离甲基丙二酸和丁二酸的合适工具。与
相对便宜且简单的MS检测设备组合，可容易地以多达每小时20个
样品的处理能力对生物相关浓度进行定量分析。