普拉克索用于肌萎缩性侧索硬化的用途

技术领域

本发明涉及使用普拉克索(2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并 噻唑)神经变性疾病。更具体地说，本发明涉及基本上纯的立体 异构体R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑 (benzathiazole)和其药理学上可接受的盐作为神经保护剂用以 神经变性疾病的用途。

背景技术

神经变性疾病(NDD)例如阿尔茨海默氏病(AD)和帕金森氏症(PD) 是由大脑中的某些种的神经元的加速损失所引起的。帕金森氏病 (PD)和阿尔茨海默(AD)疾病通常都是零星地出现，没有任何明显 的孟德尔遗传方式，但是可以表现出母性偏向。虽然成年人的NDD存 在稀见的或罕有的遗传形式，但是在这些常染体遗传变异中，发病 机理的相关性以更加普遍地零星形式出现是一个激烈讨论的话题。

累积的迹象令人信服的表明：偶发性成年人的NDD的主要发病机 理与线粒体功能障碍有关，并因此引起细胞氧化应激增加。PD和AD 脑和非-CNS组织显示线粒体电子传递链(ETC)活性降低。当在胞质 杂交(″cybrid″)细胞模型中进行选择性放大时，从PD(Swerdlow 等人，Exp Neurol 153：135-42，1998)和AD(Swerdlow等人，Exp Neurol 153：135-42 1997)患者中得到的线粒体基因概括出ETC缺乏， 引起氧化应激的增加和各种其它重要的线粒体和细胞的功能障碍。综 合组织研究和偶发性PD和AD的胞质模型地证据表明：通过能捕 获氧自由基和保护细胞免受线粒体造成的细胞死亡的试剂，以缓减氧 化应激，被认为是作为神经保护剂用于这些疾病的化合物的一个 主要特征(Beal，Exp Neurol 153：135-42，2000)。

氧化应激还与致命的神经变性疾病肌萎缩性侧索硬化(ALS)有 关。ALS，又名Lou Gehrig氏病，是一种渐进的致命性的神经变性疾 病，其涉及到皮层、脑干和脊髓的运动神经元。它是一种上下运动神 经元的变性疾病，其导致随意肌的逐渐衰弱，最终导致死亡。这种疾 病通常发生在四十或五十岁的人中间，并且在发病后的2-5年内导致 个体死亡。ALS以偶发性的和家族性的形式发生。

在所有ALS患者当中，约10％是家族性的病例，其中20％在过氧化 物歧化酶1(SOD1)基因(以前被称为Cu、Zn-SOD)中产生突变，这 表明：异常功能的Cu、Zn-SOD酶在发病机理和家族性肌萎缩性侧索硬 化(FALS)的进展上可以起到一个关键性的作用。人们相信，由于突 变SOD1引起的氧自由基尤其是羟基自由基的增加，是导致FALS中的 运动神经元死亡的一系列事件的最初因素。此假设被最新的报道所证 实，即，转染了的突变SOD1的神经元前体细胞导致羟基自由基产生的 增加并且通过细胞凋亡加快细胞死亡的速率。此外，申请人认为在偶 发性形式的ALS中，氧化应激同样造成运动神经元死亡。

最新的研究表明：在与ALS有关的过早神经元死亡中，一种可能 的刺激情况是存在突变的线粒体基因(线粒体DNA，mtDNA)。这些mtDNA 突变导致线粒体中能量产生途径功能上的异常，导致产生过量的损害 性氧衍生物，其被称为″活性氧物种″(ROS)，包括称为″氧自由基″ 的实体。当产生的ROS超过细胞自身能够消除/灭活ROS的能力时，这 种情况被称为存在″氧化应激″。

氧化应激可以损伤许多细胞成分。通过发明人的工作，表明在AD 和PD的细胞模型中，由氧化应激损伤的一种关键性细胞成分是一种特 殊的线粒体蛋白质络合物，其被称为″线粒体过渡孔隙络合物″ (MTPC)。正常活性的MTPC对保持线粒体膜之间的生物电势(ΔΨ) 是必不可少的，其反过来被用于储存能量的化学物质例如ATP的线粒 体合成。ΔΨ的损失将引起线粒体的去极化并引发一系列生物化学反 应，最终通过一种被称为″细胞程序死亡″或″细胞凋亡″的机理，导致 细胞死亡。细胞凋亡机理不仅在AD和PD中观察到，而且还在其它NDD 例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨廷顿氏病中观察到。

因此，这些各种神经变性疾病的一种方法是给予一种神经保 护剂。用于这些虚弱的和致命的疾病的有效的神经保护剂不仅应该在 这些疾病的细胞培养和动物模型中是有效的，而且其实现对神经组织 效果所需的足够高的剂量必须是能被长期耐受的。理想地，这样 的药剂还应是以细胞成分为靶点涉及控制细胞死亡途径以及阻断疾病 的病理生理过程。

发明内容

根据本发明的一种实施方案，本发明提供一种神经变性疾病 例如ALS的方法。该方法包括将普拉克索给予个体的步骤，其中普拉 克索的给药量应可以有效地减少个体中的氧化应激。

普拉克索(PPX，2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑)以 两种立体异构体形式存在：

S(-)对映体在D2族多巴胺受体上是一种有效的激动剂，广泛地 在PD的症状控制中使用。在US 4,843,086、4,886,812和5,112,842 中描述了普拉克索的合成、制剂和给药，这些文献的公开内容在此引 入作为参考。数个组表明：S(-)PPX在氧化应激增强的细胞和动物 模型中是起神经保护作用的，包括多巴胺神经元的MPTP毒性(参见US 560,420和6,156,777，这些文献的公开内容在此引入作为参考)。S (-)PPX减少由帕金森氏病的神经毒素和ETC络合物I抑制剂甲基吡 啶鎓(MPP+)引起的氧化应激，两者在体外和在体内都可以阻碍由MPP+ 和其它刺激诱发的线粒体过渡孔隙(MTP)的打开(Cassarino等人， 1998)。PPX的亲脂性阳离子结构提示这样的一种可能性，即PPX通 过ΔΨM的富集于线粒体中，结合它的低还原电势(320mV)，可以解 释这些理想的神经保护性质。

S(-)PPX是强效的多巴胺激动剂，应控制其对人的用药量从而限 制限制能达到大脑的药物水平。由于PPX的R(+)对映体具有微乎其 微的多巴胺激动剂活性(Schneider and Mierau，J Med Chem 30：494-498，1987)，但是可以保持S(-)PPX的理想的分子/抗氧化 剂性质，因此该化合物在此被建议作为在神经变性疾病中出现的细胞 死亡串联的激活和生活力损失的一种有效抑制剂。

发明概述

本发明提供预防和/或延迟，或者缓和与各种神经变性疾病有关的 症状的方法。更具体地说，本发明涉及包含普拉克索的组合物和使用 这种组合物肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。

发明的详细说明

定义

在本发明的说明书和权利要求书中，将根据下面所述的定义，使 用以下术语。

在此使用的术语″纯净″及类似术语是指与分子或化合物的分离其 形式是基本上除去了在原始或自然环境中分子或化合物的通常的伴生 杂质。

在此使用的术语″″包括特定疾病或病症的预防，或与特定疾 病或病症有关的症状的减轻和/或预防或消除所述的症状。

在此使用的″有效量″是指足以产生选定效果的数量。例如，普拉 克索或其衍生物的有效量包括这样的数量，其抑制存在于个体中的活 性氧物种的生成或降低活性氧物种的含量。

在此使用的术语″卤素″是指Cl、Br、F和I。尤其优选的卤素包 括Cl、Br和F。在此使用的术语″卤代烷基″是指带有至少一个卤素取 代基的C1-C4烷基，例如氯甲基、氟代乙基或三氟甲基等等。

在此使用的术语″C1-Cn烷基″其中n是一个整数，表示具有一个至 指定数目个碳原子的分枝的或线性的烷基。典型地C1-C6烷基包括，但 是不局限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、戊基、己基等等。

在此使用的术语″C2-Cn链烯基″其中n是一个整数，表示具有2至 指定数目个碳原子的和至少具有一个双键的烯属不饱和的分枝的或线 性基团。这样的基团的例子包括，但是不局限于，1-丙烯基、2-丙烯 基、1，3-丁二烯基、1-丁烯基、己烯基、戊烯基等等。

在此使用的术语″C2-Cn炔基″其中n是一个整数，表示具有2至指 定数目个碳原子的和至少具有一个三键的不饱和的分枝或线性的基 团。这样的基团的例子包括，但是不局限于，1-丙炔基、2-丙炔基、 1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等等。

术语″C3-Cn环烷基″其中n＝8，表示环丙基、环丁基、环戊基、 环己基、环庚基和环辛基。

在此使用的术语″芳基″是指具有一个或两个芳香环的单-或双环 的碳环体系，包括但不限于，苯基、苄基、萘基、四氢萘基、茚满基、 茚基等等。术语(C5-C8烷基)芳基是指通过烷基与母体部分相连的任 何芳基。

术语″杂环基″是指含一个至三个选自氧、硫和氮的杂原子的单-或 双环的碳环体系。

在此使用的术语″杂芳基″是指具有一个或两个含有一个至三个杂 原子的芳香环的单-或双环的碳环体系，包括但是不局限于，呋喃基、 噻吩基、吡啶基等等。

术语″双环的″表示不饱和的或饱和的稳定的7-至12-元桥连的或 稠合的双环碳环。双环可以在任何提供一种稳定结构的碳原子处连 接。术语包括，但是不局限于，萘基、双环己基、双环己烯基等等。

本发明的化合物包括在分子中含有一个或多个不对称中心的那些 化合物。根据本发明，没有标明立体化学的结构将被理解为包括所有 各种光学异构体和其外消旋混合物。

在此使用的术语神经保护剂是指一种药剂，其预防或减缓神经元 退化的进程和/或预防神经元细胞死亡。

发明

本发明涉及使用四氢苯并噻唑类化合物神经变性疾病，包括 ALS。更具体地说，本发明的四氢苯并噻唑类化合物具有通式：

其中R1、R2、R3和R4独立地选自H、C1-C3烷基和C1-C3链烯烃。在 一种优选实施方案中，NR3R4基在6-位上。在另一种实施方案中，R1、 R2和R4是H，R3是C1-C3烷基，NR3R4基在6-位上。在一种实施方案中， 化合物具有式I的通式结构，其中R1和R2每个是H，R3和R4是H或C1-C3 烷基。

根据一种实施方案，本发明涉及一种ALS的方法。该方法包 括给患者服用一种下面通式结构的化合物：

其中R1和R2是H，R3和R4是H或C1-C3烷基。在一种优选实施方案 中，R1、R2和R4是H，R3是丙基。在另一种实施方案中，组合物包括普 拉克索，其中普拉克索组分基本上由普拉克索的两种立体异构体(R (+)-2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑或S(-)-2-氨基- 4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑)之一组成。在一种实施方案中，组 合物的活性剂由普拉克索立体异构体R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氢- 6-丙氨基苯并噻唑二盐酸化物或其它药理学上可接受的盐组成，基本 上不含它的S(-)对映体。在一种实施方案中，提供一种组合物，其 中在组合物中存在的大于80％普拉克索化合物是R(+)构型，更优选 大于90％或大于95％的以R(+)构型的普拉克索化合物。在一种实施 方案中，提供一种包括普拉克索的组合物，其中大于99％的普拉克索化 合物以R(+)构型存在。

在一种实施方案中，提供一种组合物，其包括一种基本上由R(+) -2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑二盐酸化物或它的其它药 理学上可接受的盐组成的活性剂，以及一种药学上可接受的载体。此 组合物可以长期口服给予，用于预防NDD中的神经细胞损失(更特别 地在ALS患者中减少氧化应激)，或者它可以制剂后通过静脉给药用 于预防急性脑损伤中的神经细胞损伤。

本发明组合物的神经保护作用通过至少三个机理中的一个，至少 部分地从活性化合物的能力得到以预防神经细胞死亡。第一，本发明 的四氢苯并噻唑类化合物能够减少由可以效仿PD的神经毒素引起的 ROS的生成(在小鼠大脑体内和线粒体能量生成受损的体外细胞)。以 这种方式，四氢苯并噻唑类化合物起″自由基清除剂″的作用。第二， 四氢苯并噻唑类化合物可以部分恢复与AD和PD线粒体有关的减少了 的ΔΨ。第三，四氢苯并噻唑类化合物可以阻碍细胞凋亡途径，其通 过AD和PD线粒体损伤的药理学模型产生。

根据一种实施方案，提供一种在ALS患者中减少氧化应激的方法。 本发明的目的是减少氧化应激，包括任何减少存在于患者体内的活性 氧物质的含量，例如包括减少血浆中ROS的含量，其通过将水杨酸盐 转化为2，3DHBA进行测定。该方法包括给予有效量的具有下列通式的 四氢苯并噻唑：

其中R1、R2和R4是H，R3是C1-C3烷基。在一种实施方案中，四氢 苯并噻唑类化合物是R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻 唑或S(-)-2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑或R(+)和S (-)立体异构体的外消旋混合物。用于ALS的四氢苯并噻唑类化 合物的给药量将随给药途径以及其它因素而变化，其它因素包括年 龄、体重、健康的一般状况、症状的严重程度、的频率和在 期间是否伴随其它的药物。通过本领域普通技术人员已知的常规方法 可以容易地确定活性化合物的给药剂量。

或者，本发明提供一种增加了线粒体能量生成受损的细胞线粒体 膜之间的生物电势(Ψ)的方法。该方法包括损伤的线粒体能量生成 的细胞与包含普拉克索活性剂和一种药学上可接受的载体的组合物接 触的步骤。在一种实施方案中，普拉克索活性剂基本上由R(+)2-氨 基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑立体异构体和其药理学上可接受 的盐组成。

许多中枢神经系统疾病和病症导致神经元损伤，这些病症中的每 一个可以用本发明的四氢苯并噻唑类化合物的组合物进行。可以 导致神经损伤的病症包括：原发性神经变性疾病；亨廷顿氏舞蹈病； 中风和其它缺氧或局部缺血性疾病；神经外伤；代谢引起的神经性损 伤；脑病发作引起的后遗症；出血性中风；继发性神经变性病(代谢 性或毒性疾病)；帕金森氏症；阿尔茨海默氏病；阿尔茨海默型的老 年性痴呆(SDAT)；与认知功能障碍有关的老化；血管性痴呆，多梗 塞性痴呆，雷维小体痴呆或神经变性痴呆。

对人给药本发明的药物也是安全的。S(-)普拉克索，其是一种 有效的批准用于PD症状的多巴胺激动剂，是R(+)普拉克索的对 映体。但是，R(+)普拉克索缺乏药理学多巴胺活性。因此，R(+) 2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑和其药理学上可接受的盐可 以比S(-)普拉克索以更大剂量给予，并可以提供神经保护的大脑水 平。根据一种实施方案，通过ALS通过给予R(+)或R(-)普拉克索 进行，然而，给予R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻 唑是优选的，因为可以给予更高的剂量。如实施例1所示，S(-)和R (+)异构体在减少氧化应激方面大约是等效的。但是，R(+)异构体 允许使用更高的剂量，因此可以减少更多的毒性氧自由基。因此，在 一种实施方案中，提供一种减少患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的患者 的神经细胞死亡的方法，其中患者给予一种包含一种下面通式结构的 药物组合物：

在EP 186 087和它的同族专利US 4,886,812中描述了普拉克索 的合成，这些文献的公开内容在此引入作为参考。

在一种实施方案中，普拉克索，更优选R(+)-2-氨基-4，5，6，7- 四氢-6-丙氨基苯并噻唑，与粘合剂混合，得到口服片剂，或与本领域 已知的物质混合，得到一种持续给药的经皮贴剂(″皮肤贴剂″)。或 者，普拉克索可以与所需的稳定剂一起配制成一种溶液，其可以胃肠 外给药(即静脉内、肌内注射、皮下)。本发明的口服和/或经皮制剂 被用于减少患有NDD(即阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿氏病、 肌萎缩性侧索硬化)的患者的神经细胞死亡。本发明的肠胃外制剂被 用来减少患有急性脑损伤(即中风、蛛网膜下腔出血、缺氧-局部缺血 性脑损伤、癫痫持续状态、外伤性脑损伤、低血糖性脑损伤)的患者 的神经细胞死亡。

使用R(+)普拉克索NDD，由于它是多巴胺激动剂S(-)普 拉克索(Mirapex，Pharmacia and Upjohn)的一种相对不活泼的立 体异构体，解决了使用S(-)普拉克索作为多巴胺激动剂的一个重要 难题。由于对血压和精神的多巴胺能副作用，Mirapex的剂量是受到 限制的。R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑具有1％或 更少的效力，以引起由使用S(-)普拉克索产生的副作用。因此，本 发明可以更安全地给予AD患者，这些患者通常甚至不能容忍小剂量的 多巴胺激动剂药物。本发明还可以以比S(-)普拉克索大的多的 剂量静脉内给予。因此，它可以安全地用于降低血压时可能产生危害 的病症例如中风。

在一种实施方案中，提供一种患有神经变性疾病的患者的方 法，同时减少多巴胺能副作用的风险。该方法包括步骤：给药一种包 含一种普拉克索活性剂和一种药学上可接受的载体的组合物，其中普 拉克索活性剂基本上由R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻 唑立体异构体和其药理学上可接受的盐组成。在一种实施方案中，被 的神经变性疾病选自ALS、阿尔茨海默氏病和帕金森氏症，所给予 的组合物的剂量为每天约10mg-约500mg的R(+)2-氨基-4，5，6，7- 四氢-6-丙氨基苯并噻唑或其药理学上可接受的盐。

所使用的剂量当然随被的具体疾病以及其它因素而定，其它 因素包括年龄、体重、健康的一般状况、症状的严重程度、的频 率和在期间是否伴随其它的药物。通过本领域普通技术人员已知 的常规方法可以容易地确定每个活性化合物的使用剂量。例如，可以 口服给予患有NDD的人日总剂量为10mg至500mg之间的本发明的四 氢苯并噻唑类化合物。或者，可以胃肠外给予患有急性脑损伤的人单 个剂量在10mg至100mg之间的四氢苯并噻唑类化合物，和/或通过 持续静脉内输液给予日剂量在10mg至500mg之间的四氢苯并噻唑类 化合物。

在一种优选实施方案中，R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基 苯并噻唑(或其药理学上可接受的盐)给予患有神经变性疾病例如ALS 的患者以该疾病。在此使用的术语″″包括特定疾病或病症的 症状的减轻，和/或预防或消除所述的症状。更具体地说，给予患者一 种组合物，其包括一种普拉克索活性剂和一种药学上可接受的载体， 以预防或显著减少神经细胞死亡，其中普拉克索活性剂基本上由普拉 克索的R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑(和其药理学 上可接受的盐)立体异构体组成。在US 4,843,086、4,886,812和 5,112,842中描述了普拉克索的合成、制剂和给药，这些文献在此引 入作为参考。

在个体组织中产生的羟基自由基引起水杨酸盐转化为2，3二羟基 苯甲酸(DHBA)的增加(Floyd et al.(1984) J.Biochem.Biophys.Methods 10：221-235；Hall et al.(1993) J.Neurochem.60：588-594)。因此，在人体血浆中累积的2，3DHBA可 以作为个体所遭受的氧化应激水平的指示物。研究了R(+)2-氨基- 4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻唑或S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6- 丙氨基苯并噻唑对2，3二羟基苯甲酸(DHBA)血清浓度水平的影响。 如图5和6所示，ALS患者用S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基 苯并噻唑后，人体2，3DHBA的血清浓度水平减少了。这些数据表 明：用普拉克索减少了ALS患者体内的氧化应激。

此外，如图7所示，在小鼠身上进行了其它的研究，表明普拉克 索在减少体内氧化应激方面的效力。在此研究中，以3个不同的日剂 量，在小鼠的饮用水中给予R(+)PPX 8周，然后给予一种神经毒素 (N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶，MPTP)其增加了大脑中的氧化 应激。然后分析脑组织氧自由基的产生。数据表明：30mg/kg/day和 100mg/kg/day的剂量显著地减少大脑中的自由基水平。

还进行了毒理学研究，没有发现副作用的证据。具体地，在小鼠的 饮用水中加入R(+)PPX，进行8周的毒理学研究。对它们所有的主要 器官进行病理检查，没有发现损害。虽然这并不能表明R(+)PPX作 为神经保护剂有效性的问题，但是它表明人类长期给予非常高剂量的 药物的潜在的安全性(和由此的可行性)。

本发明还涉及包含本发明的四氢苯并噻唑类化合物的药物组合 物。更具体地说，可以使用标准的本领域熟练技术人员所熟知的药学 上可接受的载体、填料、增溶剂和稳定剂将四氢苯并噻唑类化合物配 制成药物组合物。

包含四氢苯并噻唑类化合物的药物组合物通过许多途径中的任一 种给予需要这种药物的个体，包括但不限于，局部、口服、静脉内、 肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、 肠、局部、舌下或直肠方式。

本发明还提供一种包含一个或多个容器的药包或试剂盒，其中容 器中充满一种或多种本发明药物组合物的成分。根据一种实施方案， 本发明提供一种用于ALS患者的试剂盒。在该实施方案中，试剂 盒包含一种或多种本发明的四氢苯并噻唑类化合物，更具体地说，四 氢苯并噻唑类化合物是R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻 唑立体异构体。这些药物可以包装在各种各样的容器中，例如药水瓶、 试管、微量孔板、瓶子等等。优选地，试剂盒还包括使用说明书。

附图的简要说明

图1A表示的细胞素C的MPP+-诱发释放的时间过程，图1B表 示将MPP+-诱发激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的时间过程。 SH-SY5Y细胞在5mM的MPP+中培育不同时间，然后采集。在图1A中， 细胞在等渗蔗糖中均质化，离心，将100ug上清液蛋白经SDS-PAGE 电泳，转入尼龙膜，用增强化学发光检测对细胞素C进行免疫染。 最左边的带(在X轴上叫做″0hr″)与线粒体细胞素C在时间″0″处 对应，其它的带表示电泳过的细胞素C免疫染的胞浆蛋白。MW标 记的位置表示在y轴上。其它批次细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶3的试验使用一种商业体系，根据制造商的教导(Biomol)。在 图1B中所示的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的试验是3-4个独立实 验的结果。与在0.25小时的活性相比，*p＜0.05。

图2表示通过PPX、米酵菌酸和马兜铃酸抑制MPP+-诱发的天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活的数据。在有或没有1mM的S(-) PPX、1mM的R(+)PPX、250μM的米酵菌酸(BKA)或25μM的马 兜铃酸(ARA)或它们的组合存在下，SH-SY5Y细胞和5mM MPP+一起 培育24小时。然后，细胞进行天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性 的分析。表示在图2中的是4-5个独立实验的平均的+/-SEM。条带A-F 表示与下列化合物一起培育的细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3活性：A，对照组(没有加入化合物)；B，MPP+；C，MPP+/BKA；D， MPP+/S(-)PPX；E，MPP+/R(+)PPX；F，MPP+/ARA。对于条带B， 与对照组相比，p＜0.05；对于条带C-F，与MPP+处理的细胞(条带B) 相比，p＜0.05。

图3表示通过PPX、米酵菌酸和马兜铃酸抑制MPP+-诱发的天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的活性的数据。有或没有1mM的S(-)PPX、 1mM的R(+)PPX、250μM的米酵菌酸(BKA)或25μM的马兜铃 酸(ARA)存在下，SH-SY5Y细胞与5mM MPP+一起培育4或8小时。 然后，细胞进行天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9活性的分析。表示 在图3中的是3-4个独立实验的平均的+/-SEM。条带A-I表示与下列 化合物一起培育的细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9活性：A， 对照组(没有加入化合物)；B，15分钟MPP+；C，4小时MPP+；D，4 小时MPP+/PPX；E，8小时MPP+；F，8小时MPP+/BKA；G，8小时MPP+/S (-)PPX；H，8小时MPP+/R(+)PPX；I，8小时MPP+/ARA。对于条 带C和E，与对照组相比，p＜0.01；对于条带F、G、H和I，对照组相 比，p＜0.05。

图4A与4B。通过PPX对映体，MPP+-诱发的细胞死亡的抑制。在 有或没有增加浓度的S(-)PPX(图4A)或R(+)PPX(图4B)存在 下，SH-SY5Y细胞与5mM MPP+一起培育24小时。条带A-F表示分别 用0nM、3nM、30nM、300nM、3uM和30um的PPX处理的细胞。 然后，细胞与钙黄绿素-AM一起培育，洗涤，然后在荧光板读数器上读 数。独立实验的数目标在每根棒中，为了与没有PPX(仅仅MPP+)的 进行比较，通过t检验获得的P值表示在每根棒上。在MPP+存在下，3 nM的R(+)PPX比S(-)PPX(p＝0.035)造成更大的钙黄绿素滞 留，3uM的S(-)PPX比R(+)PPX(p＝0.027)造成更大的钙黄 绿素滞留。

图5是患者给予1.3克阿斯匹林后，在ALS和对照组(CTL)中血 浆中的2，3-DHBA水平随时间改变的图示。图5A表示血浆中的2，3- DHBA浓度改变的平均+/-SEM；图5B表示血浆中2，3-DHBA浓度与水杨 酸盐浓度的比值；图5C表示整个时间过程的血浆水杨酸盐浓度。

图6是普拉克索对血浆2，3-DHBA浓度的作用的图示。图6A表示 用普拉克索前后，单个患者中的DHBA浓度。患者2，3，7和12 是不走动的。患者3和7是上呼吸机的。图6B提供在普拉克索前 后，2，3-DHBA的平均+/-SEM血桨水平。图6C提供在普拉克索前 后，2，3-DHBA浓度/水杨酸盐的平均+/-SEM血桨水平。

图7.小鼠在它们的饮用水中给予R(+)PPX，然后用一种增加大 脑中氧化应激的神经毒素(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶， MPTP)进行处理，然后测定大脑和前脑中2，3-DHBA的含量。

具体实施方式

实施例1

R(+)和S(-)PPX是细胞死亡串联激活的有效抑制剂。

材料和方法。

细胞培养

从American Tissue Culture Collection(www.atcc.org)处 获得SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞，并将其以一种复制状况供养在培 养物中。为了分析天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶试验和研究细胞 素C释放，在5％的CO2气氛中，在37℃，将它们置于含10％胎牛血清 的DMEM/高糖、抗生素/antimicotic(100IU/ml的青霉素，100μ g/ml的硫酸链霉素，0.25μg/ml的两性霉素B)和50μg/ml的尿 苷和100μg ml的丙酮酸盐在T75培养瓶中培养，以进行近乎完全的 融合(2×107细胞/培养瓶)。然后，它们用5mM甲基吡啶鎓碘化物 (MPP+；Sigma；www.sigma-aldrich)或100μM25-35或35-25 βamyioid肽(Bachem；www.bachem)培养不同的时间，然后 采集。为了进行细胞死亡研究，将细胞放入96孔黑底平板中，接触毒 素之前，将细胞在DMEM介质中生长24小时。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶试验。

暴露于MPP+或β淀粉状肽后，在PBS中收集细胞，在4℃下在450 xg中离心6分钟。将细胞小球以2×107细胞/100μl lysis缓冲液 的浓度再悬浮在低张细胞lysis缓冲液中[25mM HEPES，5mM MgCl2， 5mM EDTA，1M DTT和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma Chemical)]。 溶解产物进行四个循环的冻融。然后，细胞溶解产物在4℃下以16,000 xg离心30分钟。收集上层清液部分，通过Lowry试验(BioRad)测 定蛋白质含量。在96孔平板中，100μg蛋白质用来测定天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶活性，试验一式四份。使用试验缓冲液测定活性， 原始记录由厂家提供。(Biomol，caspase 3；Promega，caspases 3 and 9)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性基于合成肽底物的裂解， 引起有颜的(对硝基苯胺(p-NA)，Biomol)或有荧光性的 (aminomethylcoumarin(AMC)，Promega)生团的释放。只有激 活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶能够裂解这些底物，当每个试验 试剂盒配备的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂用于试验中时， 生团的产生被完全禁止。在所示的试验条件下，在2小时内观察到 生团以线性速度产生。生团吸收度(p-NA)在OptiMax平皿读数 器上测定或生团荧光(AMC)在SpectraMax Gemini平皿读数器37 ℃下培育0时间和30分钟后，估算相对的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶活性。在30分钟时的读数减去在零时间时的原信号。

细胞死亡

细胞死亡通过测定钙黄绿素保留的损失进行评价，在细胞生长过 程中用″Live-Dead″分析(Molecular Probes；www. molecularprobes)，按照制造商的教导在96孔板中与钙黄绿素 -AM一起培养。钙黄绿素信号在SpectraMax Gemini可调节荧光板读 数器(分子装置)中进行分析。所有读数都减去作为背景值的与甲醇 一起预培养的细胞的钙黄绿素荧光。每个分析用8孔/例进行，取平均 值。为了在本范例中评价S(-)和R(+)PPX的宽范围的浓度，进行 3-8个独立的实验。

细胞素C Western印迹

细胞素C由Western印迹测定，100μg细胞上清液蛋白经聚丙 烯酰胺电泳后转入尼龙膜。初生抗体是一种老鼠单克隆抗细胞素C， 自Pharmingen中获得并且以1∶10,000稀释度使用。用增强化学发光 (Pierce)进行检测，并且在BioRad FluorS图像位置成像。

药物

R(+)和S(-)PPX(Pharmacia Corporation赠送)以其二盐 酸盐的方式获得并将其直接溶解到培养基中。米酵霉酸、腺苷酸转运 体上的ATP结合位点拮抗剂以溶液形式配制到1M的NH4OH中。马兜铃 酸(钠盐)，一种磷酸脂酶A2抑制剂，从Sigma Chemical Co获得。 在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶实验中，在MPP+或β淀粉状肽前1 小时加入药物。在钙黄绿素/细胞死亡实验中，在MPP+前4小时加入药 物。

结果

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)由MPP+和BA 25- 35激活。

图1B表示用5mM的MPP+培养SH SY5Y细胞期间，天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶3活性的时间过程。在4小时的时候可检测到活性 增加，在24小时的时候活性增加约2倍。图1A表示细胞素C蛋白 释放到细胞质中的Western印迹结果。与生化活性曲线相似，在4小 时时可检测到少量的细胞质细胞素C，在12小时时细胞质细胞素 C有明显增加。

图2表示在MPP+暴露期间R(+)和S(-)PPX对映体两者都抑制 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活。由MPP+诱导的天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶3活性的增加还被米酵菌酸阻碍，米酵菌酸腺苷 酸转运体的内膜位置上的ATP结合位点的一种特殊拮抗剂。马兜铃酸、 一种磷酸脂酶A2抑制剂，以前显示其阻碍MPP+诱导的SH-SY5Y细胞 凋亡(Fall and Bennett，1998)，同样阻止天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶3活性的增加。由MPP+和BA 25-35肽诱发的天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶的活性被PPX对映体和在线粒体过渡孔处活泼的试 剂阻碍。S(-)PPX使得用BA 25-35肽培养后天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶3活性的增加减少约70％，其本身没有抑制作用。与MPP+接 触还增加了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的活性，其时间过程与 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性相似(参见图3)。天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶9活性的增加也被S(-)和R(+)PPX、米酵 菌酸和马兜铃酸阻碍。

图4表示不同浓度的R(+)或S(-)PPX，在接触5mM的MPP+ 之前24小时，对所培养的SH-SY5Y细胞的细胞钙黄绿素滞留的作用。 钙黄绿素是一种荧光染料，其保留在细胞内，具有维持质膜电势的能 力。MPP+仅仅降低约60％的钙黄绿素吸收。在30nM水平时，两个PPX 对映体都显著地恢复钙黄绿素吸收，这种保护作用通过30μM的PPX 被保持。

讨论

本研究为使用神经毒素MPP+和25-35β淀粉状肽加入到作为细胞 培养模型的复制SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞中，用于研究潜在的可分 别用于帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的神经保护化合物。SH-SY5Y细 胞是神经外胚层起源的赘生性、分裂细胞，没有初生神经元。由于Ras 突变，引起MAPK/ERK信号的慢性激活，它们进行有丝分裂。在短期 MPP+培养中，与初生神经元相比，SH-SY5Y细胞是相对迟钝的。申请 人发现2.5和5mM、但不是1mM的MPP+在18-24小时内生产细胞凋 亡的形态和DNA固缩片段。然而，用较低浓度的MPP+培养更长的时间 可以更接近动物中PD的体内MPTP模型，已经报道，更长时间接触较 低MPP+水平仍可活化线粒体细胞死亡串联。

SH-SY5Y细胞还对β淀粉状肽敏感。Li等人(1996)发现，接触 100μM的β淀粉状2S-3S 3天后，缺少血清的SH-SY5Y显示出广泛 的DNA微缺末尾标记以及表现出一种浓度依赖的DNA梯的增加。β淀 粉状肽诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活在SH-SY5Y中没 有清楚地描述，但是若干报道表明，在各种初生神经元系中，因接触 β淀粉状肽天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活。这些包括由25-35 类似物激活的小脑粒细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、-3 和-6，以及大鼠初生皮层神经元中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 -3的激活。因此，一点也不惊讶，SH(-)SY5Y接触100μM的β淀 粉状25-35后观察到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性 (DEVDase)，接触反转35-25序列后，没有观察到天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶的激活。

本实验的焦点是确定是否PPX对映体可以阻止天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶的激活以及在接触急性毒素、AD和PD的细胞培养模型中 是否可以促进作为细胞存活率标记的钙黄绿素滞留。在PD的MPP+模型 中，″引发子″天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9和″执行子″天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活都被两个PPX对映体阻滞，以及在AD 的BA 25-3S模型中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性被S(-) PPX阻滞。在PD的MPP+模型中，纳摩尔级的两个PPX对映体都可以促 进细胞存活。因此，本发现进一步增加了对PPX的神经保护作用的研 究的增长体，并且暗示这一类化合物在神经变性疾病中潜在的临床应 用。

虽然本研究没有确定PPX作用的最接近位点，但是在这些细胞模 型中的若干发现暗示了线粒体过渡孔复合物(MTPC)。首先，米酵菌 酸，一种MTP开放的选择性腺苷酸转运体拮抗剂和抑制剂，阻滞MPP+ 诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9和3的激活。这与MPP+或直 接或通过包括氧化应激的机理引起MTP开放相一致，。在离体肝脏线 粒体中，MPP+可以引起标准的MTP开放，其被自由基捕获酶不完全阻 滞以及被S(-)PPX彻底阻滞。在离体线粒体中，毒害神经的25-35BA 肽还可以刺激MTP开放。在体内的大脑微量渗析研究中和在体外的神 经细胞培养物中，MPP+和2S-35BA肽增加氧化应激，S(-)PPX已经 表明可以减少体外和体内的MPP+诱导的氧化应激。

实施例2

使用普拉克索ALS

在家族性肌萎缩性侧索硬化(FALS)和常见的偶发性ALS(SALS) 中，已经发现氧化性异常。2，3-DHBA是一种羟基化的水杨酸盐副产物， 其被证明是一种可靠的自由基活性增加的体内标记物并且由HPLC可靠 地进行测定。口服给予水杨酸盐后，在SALS患者中观察到2，3-二羟 基苯甲酸(2，3-DHBA)和DHBA/水杨酸盐的血清水平增加了。在此使 用12个SALS患者研究确定使用普拉克索前后的2，3-DHBA水平。

方法

参与的制剂

本研究分两个阶段进行。在第一阶段，十一个确定的SALS患者， 其符合Airlie House标准，并研究了7个对照组。这些参与者服用阿 斯匹林后进行2，3-DHBA分析。口服1.3克阿司匹林后，2、3和4小 时后抽取血液。分离血清，冷冻并储存在-80度。随后对等分试样的血 清进行编号和混盲，用于2，3-DHBA和水杨酸盐测定。

在第二阶段，随机地选择17个患有确定SALS的患者。患者口服 1.3克阿司匹林后，3小时后抽取血液。获得这些基线样品后，SALS 参与者开始用普拉克索进行。与PD病人相似，逐渐增大剂量使其 最终剂量达到1.5mg一天三次-一天四次，接着进行7周滴定法。每 个参与者达到他的/她的最高普拉克索剂量三星期后，再次进行服用阿 斯匹林研究。最初十七个SALS患者中的十二个可以完成普拉克索逐渐 增大阶段。在这些当中，只有两个不能达到6mg每天的普拉克索剂量， 所有的患者都可以获得至少3mg每天的剂量。然后，每个参与者提供 继续进行普拉克索的机会。

试样制备

血清的制备：在4℃下0.9ml血清与0.2ml 1M的高氯酸混合， 在冷冻微量离心机中以15,000rpm离心10分钟。

2，3-DHBA测定：将20μL上清液分两份注射到C18″儿茶酚胺 ″Adsorbosphere柱(Alltech)上，以0.6ml/min的速度用缓冲剂 灌注，该缓冲剂由125ml/L的乙腈、1.5gm/L的庚烷磺酸钠、3ml/L 的三乙胺、100mg/L的Na2EDTA组成并且最后用磷酸将pH值调节到 2.8。使用CouloChem II flow-through电化学检测器(ESA，具有下 列设定：保卫细胞＝+600mV；E1＝-100mV；E2＝+400mV)进 行检测。在这些条件下2，3-DHBA在10-10.5分钟被洗脱出。

水杨酸盐测定：50μL上清液分两次注射到C8 Kromosil HPLC 柱(Alltech)上，以0.8-1.0ml/min的速度用70％甲醇/30％水/0.5％ 三氟乙酸进行洗脱。在这些条件下水杨酸盐在6-7分钟的时候被洗脱 出来，并且通过315nM出的紫外吸收测定。

结果

图5A表示在第一阶段研究中的11个SALS患者(59.2±12.3岁) 和7个年龄相当的对照患者(56.7±10.7岁)的2，3-DHBA血清水平 增加的时间过程。SALS患者表现出10-156个月的的病史，代表这种 疾病的急性和慢性阶段。SALS患者服用阿斯匹林3小时后，检测到最 大的2，3DHBA水平，这个时间点在第二阶段阶段被选用。此外，当 SALS组和对照组随时间推移进行对比时，二因素方差分析显示在 2，3-DHBA的产生中存在差别。两组受试者在p＝0.033水平有显著差 异；post-hoc检验(图基检验)在各时间点之间没有显示任何显著差 异。

作为另一个比较，随时间推移比较两组受试者之间的2，3-DHBA/ 水杨酸盐的比值。给予阿斯匹林3小时后，ALS组显示常规标记物 2，3-DHBA产生的正常化标记增加约1.5倍。二因素方差分析显示在p＝ 0.06水平时(图5B)有显著差别。在ALS和CTL受试组(图5C)之 间，随着时间的推移，血清中水杨酸盐含量没有显著的区别。在进入 第二阶段研究的最初的17个患者当中，5个患者由于疾病的并发症或 不能忍受药物而中途退出。其余的参加者为8男和4女。平均年 龄是63.2岁。这些ALS患者很好地忍受了普拉克索。这些参加者 没有表现出任何临床痴呆证据，它们也没有显著的心血管不稳定性。

参加该研究的患者代表疾病进展的各个临床阶段。四个参加者是 是不能走动的，其中两个是依赖于呼吸机的。其它八个在开始研究的 时候是能走动的。从进入研究到最后抽取血液的平均时间为76.6天， 时间的范围是49-105天。

在用普拉克索前后，比较2，3-DHBA的血清浓度水平。毫无例 外，个体2，3-DHBA的血清浓度水平降低了(图6A)。图6B表示获得 稳定的普拉克索剂量前后，ALS患者的血浆中的2，3-DHBA浓度的均值 +/-SEM。平均降低约45％，在p＝0.015水平时是显著的。在使用普 拉克索之前(18.8+/-7.2，S.D.)和期间(20.2+/-5.5，S.D.)， 血清水杨酸盐含量(μM)没有变化。图6C表示：对于每个患者，通 过普拉克索，以水杨酸盐水平为基准的2，3-DHBA的血清浓度水平 平均降低了59％；t检验显示在p＝0.010水平时存在显著差异。

讨论

本研究显示：ALS患者口服阿斯匹林后，基于增加产生的2，3- DHBA，观察到体内氧化应激增加了约两倍。临床疾病进展的各个阶段 观察到2，3-DHBA的增加，表明这种代谢物在整个疾病过程中可以作为 增加的氧化应激的可靠指标，尤其可用于通常难以确诊的疾病早期阶 段。因为受试者人数较少，没有研究2，3-DHBA产生的水平与疾病阶段 的相关性。

本研究还显示：普拉克索，以帕金森氏症通常可以耐受的剂 量给予，可以降低ALS患者体内氧化应激。12个患者的血清在达到普 拉克索的最大忍受剂量之前和几个星期后显示降低约45％的基线2，3- DHBA，以水杨酸盐水平为基准的基线2，3-DHBA降低约59％。可能是由 于它的自由基捕获/抗氧化剂性质，普拉克索导致这种在ROS产生方面 的降低。在体外的SY5Y成神经细胞瘤细胞和大鼠体内受到被甲基吡啶

抑制的络合物I急剧影响的纹状体中，普拉克索已经显示能够降低 ROS产生的能力(Cassarino et al.，J.Neurochem 1998；71：295- 301)。体内试验中，普拉克索还降低注入神经毒素6-羟基多巴胺后大 脑内的ROS产生，(Ferger et al.Brain Res 2000；883：216-23)， 抑制用前神经毒素MPTP[16]处理后导致的细胞素C的释放和降低体 内大脑脂质氧化。

由于在R(+)和S(-)对映体中观察到约等当量的普拉克索的神 经保护作用，以及由于多巴胺激动剂作用主要存在于S(-)对映体， ROS捕获作用可能与多巴胺激动剂性质没有关系。如果这是真的话，那 么普拉克索的R(+)对映体应具有比在本研究中使用的S(-)对映体 高很多的耐受剂量，在体内具有增加的抗氧化作用的潜力。

在偶发性ALS中很好地建立了氧化应激物，但是氧化应激增加的 病因学仍是不清楚的。在ALS中，CNS氧化应激损伤的标记物包括腰椎 脊髓中的增加的脂质过氧化产物的免疫组化染、脊髓液中水平增加 的硝基酪氨酸和亚硝基化的二氧化锰歧化酶。这些结果与由包括氧化 氮衍生物的ROS造成的ALS组织增加的损伤一致。

ALS的动物模型和细胞模型还提供对氧化应激和运动神经元易获 病性的了解。ALS脊髓运动神经元降低了细胞素C氧化酶的活性(研 究的组织化学)，这种降低的电子传输链作用可以用于增加氧自由基 产生。携带突变体人类SOD1 FALS基因的小鼠的脊髓微量透析表明： ROS产生和丙二醛含量的增加，与那个概念一致。另外，还报道： CuZn-SOD FALS突变增加了因兴奋性中毒导致脊髓运动神经元死亡的 脆弱性，其机理包括氧化应激增加。最后，ALS患者氧化应激增加使得 在ALS患者脊髓中可以观察到细胞凋亡过程标记物的增加，使得在 FALS老鼠模型中在运动神经元死亡中包含天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶。

线粒体病状发生在实验性运动神经元疾病的早期。这些结构不仅 仅对氧化性损伤敏感，而且它们的功能障碍加速自由基的产生并且可 能对线粒体DNA产生损伤。观察ALS肌肉活组织切片检查中线粒体功 能显示了络合物I的活性降低，以及对ALS前角细胞树突的超微结构 分析显示了聚集的、黑暗的线粒体。在ALS中，变性前角细胞周围的 神经胶质兴奋性氨基酸载体-2(EAAT2)的选择性损失可能反映出其他 的蛋白质损伤，这些蛋白质损伤可以促进兴奋性中毒增加。

因此，ALS中的氧化性损伤可以代表一种初生神经变性过程，一种 运动神经元线粒体病理学的继发性偶发症状，或者两者的结合。用SALS 线粒体基因扩增进行研究的胞质杂交表明：SALS的氧化应激增加可以 用初生线粒体遗传病因学来理解。在SALS中，目前还不知道线粒体DNA 如何变为有缺陷的；母系遗传和偶发性获得机理都是可能的。

服用水杨酸盐和2，3-DHBA测定法作为评价体内相对氧化应激水 平的尺度已经应用到成年人初始的糖尿病、酒精方面的肝脏功能障碍 和关节炎上。许多氧化性物质可以促进2，3-DHBA产生，包括羟基自由 基和过亚硝酸阴离子。因此，无法指定所观测到的2，3-DHBA的特定 ROS源，也不能确定水杨酸盐羟基化作用增加的组织来源。

总之，在一SALS患者中发现2，3-DHBA(一种氧化应激标记物) 的基础血清浓度水平增加了，这些水平用普拉克索后降低了。如 图6所示，ALS患者用S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并噻 唑后，个体2，3DHBA的血清浓度水平降低了。特别地，患者口服 给予日剂量为3-6mg的S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氢-6-丙氨基苯并 噻唑七周。七周后，采集血清样品，测定2，3DHBA的浓度，与在 前采集的血清样品中的2，3DHBA水平相比。这些数据表明：用普拉克 索减少了ALS患者体内的氧化应激。

实施例3

普拉克索在降低体内Mptp诱导的氧化应激中的有效性

方法

雄性C57BL/6小鼠每天在饮用水中接受R(+)普拉克索二盐酸化 物8周，剂量分别为0、10、30或100mg/kg/天。在进行研究的当天， 给小鼠皮下注射30 mg/kg的神经毒素N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢 吡啶(MPTP)以增加大脑中的氧化应激。1小时后，给小鼠腹膜内注射 100mg/kg的水杨酸钠。水杨酸盐注射1小时后，处死小鼠，分析前 脑中2，3-二羟基苯甲酸(2，3-DHBA)含量。

如图7所示，结果表明：用剂量分别为30和100mg/kg/天的R (+)普拉克索进行，可以显著地降低由MPTP产生的前脑氧化应 激。还进行了毒理学研究，没有检测到副作用的证据。特别地，在小 鼠的饮用水中加入R(+)PPX，进行8周的毒理学研究。对它们所有的 主要器官进行病理检查，没有发现损害。