A61K38/16 A61K39/36 C07K14/415 C12N15/63 A61K48/00 C12N15/11
1.DNA分子，它相应于选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5的核苷酸序列。
17.用作药物的权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA分子。
2.DNA分子，它含有从70位开始的权利要求1的核苷酸序列，它 编码具有梯牧草的主要过敏原Phl p4的性质的多肽。
3.DNA分子，它相应于编码梯牧草的主要过敏原Phl p4的核苷酸 序列。
4.DNA分子，它在严格条件下与权利要求1～3中的一项或多项所 述的DNA分子杂交，并且源自禾本科物种的DNA序列。
5.DNA分子，它编码能与梯牧草的主要过敏原Phl p4发生免疫学 上的交叉反应的多肽，并且源自禾本科物种的DNA序列。
6.DNA分子，它相应于权利要求1～5中的一项或多项所述的部分 序列或部分序列的组合，它编码免疫调控性的T-细胞反应性的第4组 禾本科过敏原的片段。
7.根据权利要求6的DNA分子，它编码选自下组的Phl p4片段：
片段1-200，具有Phl p4的氨基酸1-200；
片段185-500，具有Phl p4的氨基酸185-500。
8.DNA分子，它相应于权利要求1～7中的一项或多项所述的核苷 酸序列，它编码免疫调控性的T-细胞反应性的片段，其特征在于，所 述的核苷酸序列已经通过各个密码子的特异性突变、去除或增加进行 了特异性的修饰。
9.根据权利要求8的DNA分子，其特征在于，所述的突变导致相 应多肽中一个、多个或所有半胱氨酸替换为其它的氨基酸。
10.重组DNA表达载体或克隆系统，它含有与表达控制序列功能 性连接的权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA分子。
18.用作药物的权利要求10所述的重组表达载体。
11.宿主生物体，它被权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA 分子或权利要求10的表达载体所转化。
12.通过培养权利要求11的宿主生物体、从培养物中分离相应的 多肽来制备权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA序列编码的多 肽的方法。
13.权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA序列编码的多肽。
14.用作药物的权利要求13的多肽。
15.药物组合物，它含有至少一种权利要求14的多肽，任选地含 有其它用于过敏症的诊断和/或的活性成分和/或佐剂，其中禾本科 的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
16.至少一种权利要求14的多肽在制备用于诊断和/或过敏 症和/或预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参 与该过敏症的诱发。
19.药物组合物，它含有至少一种权利要求17的DNA分子或至 少一种权利要求18的表达载体，任选地含有其它用于过敏症患者的免 疫性DNA接种和/或预防该过敏症的活性成分和/或佐剂，其中禾 本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
20.至少一种权利要求17的DNA分子或至少一种权利要求18 的表达载体在制备用于过敏症患者的免疫性DNA接种和/或预防 该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症 的诱发。
草花粉过敏原Phl p4的DNA序列和用重组方法进行的制备
背景技术
本发明涉及提供主要的草花粉过敏原Phl p4的基因序列。本发明 还包括具有低过敏反应的片段、部分序列的新组合和点突变体。重组 DNA分子和衍生出的多肽、片段、部分序列的新组合以及变体能用于 花粉过敏性疾病。由重组方法制备的蛋白能用于花粉过敏症的体 外和体内诊断。
1型过敏症在世界范围内都是重要的。在工业化国家中有高达20％ 的人患有例如过敏性鼻炎、结膜炎或支气管哮喘等疾病。这些过敏 症由空气中的过敏原(空气过敏原)导致，它们从不同的起始源释放， 例如植物花粉、微粒、猫或狗。这些1型过敏症患者中有高达40％依 次表现出对草花粉过敏原的特异性IgE反应(Freidhoff等，1986，J. Allergy Clin.Immunol.78，1190-2001)。
引发1型过敏症的物质是蛋白、糖蛋白或多肽。从粘膜摄入后， 这些过敏原与结合在致敏个体的肥大细胞表面上的IgE分子反应。如 果两个IgE分子通过过敏原彼此交联，就会导致效应细胞释放介质(例 如组胺、前列腺素)和细胞因子，从而产生相应的临床症状。
根据各过敏原分子与过敏症患者的IgE抗体反应的相对频率，将 它们分为主要的和次要的过敏原。
到目前为止，梯牧草(Phleum pratense)、Phl p1(Petersen et al.， 1993，J.Allergy Clin.Immunol.92：789-796)、Phl p5(Matthiesen and Lowenstein，1991，Clin.Exp.Allergy 21：297-307；Petersen et al.，1992， Int.Arch.Allergy Immunol.98：105-109)、Phl p6(Petersen et al.，1995， Int.Arch.Allergy Immunol.108：49-54)、Phl p2/3(Dolecek et al.，1993， FEBS，335(3)299-304)、Phl p4(Haavik et al.，1985，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78：260-268；Valenta et al.，1992，Int.Arch.Allergy Immunol.97：287-294，Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol. 98：189-198)和Phl p13(Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：324- 332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)已经被认为 是主要过敏原。
Phl p4已经作为分子量为50-60kDa地基础糖蛋白来提及(Haaviket al.，1985，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78：260-268).Phl p4分子 是胰蛋白酶抗性的(Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol. 98：189-198)，70-88％的草花粉过敏症患者具有针对该分子的IgE抗体 (Valenta et al.，1993，Int.Arch.Allergy Immunol.97：287-294；Rossi et al，2001，Allergy 56：1180-1185；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy 33：43-51)。还描述了来自相关草种的同源分子(Su et al.，1991，Clin. Exp.Allergy 21：449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl. Immunol.89：342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin.Immunol. 83：845-852；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol. 98：1065-1072；14-17)。这些禾本科(Poaceae)的同源分子形成第4 组过敏原，这些分子对单克隆小鼠抗体和人IgE抗体具有较高的免疫 学上的彼此交叉反应(Fahlbusch et al.，1993 Clin.Exp.Allergy 23：51-60；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol. 98：1065-1072；Su et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.97：210； Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807；Gavrovic- Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin.Immunol.10(6)：361- 367；Stumvoll et al.2002，Biol.Chem.383：1383-1396；Grote et al， 2002，Biol.Chem.383：1441-1445；Andersson and Lidholm，2003，Int. Arch.Allergy Immunol.130：87-107；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy， 33(1)：43-51)。
与上面提及的梯牧草主要过敏原(Phl p1，Phl p2/3，Phl 5a和5b， Phl p6和Phl p13)相反，Phl p4的基本结构尚未阐明。类似地，也没 有其它草种的第4组中的分子的完整序列。
迄今还未能成功地测定N-端氨基酸序列。但是，其原因尚不清楚。 Fischer等人(J.Allergy Clin.Immunol.，1996；98：189-198)猜想是N- 端封闭，但是用赖氨酰基内肽酶降解后能够纯化出内部肽并测定其序 列：IVALPXGMLK(SEQ ID NO.7)。
该肽与豚草过敏原Amb a1和Amb a2的肽序列具有同源性，而且 类似于来自玉米(Zm58.2)、西红柿(lat 59，lat 56)和烟草(G10) (Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：189-198)的蛋白 的序列。关于黑麦草(Lolium perenne)，在基本的第4组过敏原中已 经描述了具有下述序列的肽片段：FLEPVLGLIFPAGV(SEQ ID NO. 8)和GLIEFPAGV(SEQ ID NO.9)(Jaggi et al.，1989，Int.Arch. Allergy Appl.Immunol.89：342-348)。
通过酶降解类似地得到了来自鸭茅(Dactylus glomerata)的第4 组过敏原的肽，并予以测序：
DIYNYMEPYVSK(P15，SEQ ID NO 10)，
VDPTDYFGNEQ(P17，SEQ ID NO 11)，
ARTAWVDSGAQLGELSY(P20，SEQ ID NO 12)，和
GVLFNIQYVNYWFAP(P22，SEQ ID NO13)(Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol。98：1065-1072)。
还通过蛋白水解得到了亚热带狗牙根(Bermuda grass)(Cynodon dactylon)的第4组过敏原的肽，并予以测序：
KTVKPLYIITP(S，SEQ ID NO 14)，
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS(V49L，SEQ ID NO 15)，
TVKPLYIITPITAAMI(T33S，SEQ ID NO 16)，
LRKYGTAADNVIDAKWDAQGRLL(T35L，SEQ ID NO 17)，
KWQTVAPALPDPNM(P2，SEQ ID NO 18)，
VTWIESVPYIPMGDK(V26L，SEQ ID NO 19)，
GTVRDLLXRTSNIKAFGKY(L25L，SEQ ID NO 20)，
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS(T22L，SEQ ID NO 21)，
YRDLDLGVNQWG(P3，SEQ ID NO 22)，
SATPPTHRSGVLFNI(V20L，SEQ ID NO 23)，和
AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD(V14L， SEQ ID NO 24)(Liaw et al.，2001，Biochem.Biophys.Research Communication 280：738-743)。
但是，这些描述的Phl p4肽序列和第4组过敏原至今还没有导致 第4组过敏原完整基本结构的阐述。
因此，本发明的目的包括提供Phl p4的完整DNA序列和相应的重 组DNA，Phl p4过敏原可以由它们表达为蛋白，并使这样的或其修饰 过的形式在药理学上的重要应用成为可能。
附图说明
图1：由基因组DNA获得的Phl p4基因扩增子的内部DNA序列 (SEQ ID NO 25)用显示为斜体的降解引物NO.30(有义)和NO.37 (反义)进行克隆，并测序。显示出的序列代表来自6个克隆的共有 序列。从该序列产生的特异性有义引物No.82标有下划线。
图2：Phl p4基因的3’端核酸序列(SEQ ID NO 26)
用特异性有义引物No.82(显示为斜体)得到扩增子，用梯牧草 cDNA得到3’-RACE PCR中的锚定引物，并测序。显示出的序列代表 来自3个测序过程的共有序列，包括了Phl p4基因的3’端至终止密码 子(双下划线)。用于构建反义引物No.85和No.86的序列区域标有下 划线。
图3：Phl p4过敏原的推导氨基酸序列中的Phl p4肽的定位(SEQ ID NO2)
从纯化的成片段的Phl p4过敏原的氨基酸测序得到的肽P1-P6 (SEQ ID NO’s 27-32)能明确地与从核酸序列衍生出的Phl p4基因的 氨基酸序列比对。
图4：通过Western印迹、使用对nPhl p4特异性的单克隆抗体5H1 (印迹A)和3C4(印迹B)测定重组Phl p4(rPhl p4)的身份。
第1道：含有rPhl p4片段1-200的E.coli总细胞提取物
第2道：含有rPhl p4片段185-500的E.coli总细胞提取物
第3道：含有rPhl p4的E.coli总细胞提取物
第4道：从梯牧草纯化出的nPhl p4
(←)：C-端rPhl p4片段或rPhl p4完整分子的终止或降解片段
图5：通过Western印迹、使用来自草花粉过敏症患者血清的IgE 测定重组Phl p4(rPhl p4)的反应性。
用SDS-PAGE分离表达完整Phl p4基因或N-端片段1-200或C- 端片段185-500的转化的大肠杆菌细胞的提取物，转移到硝酸纤维素膜 上。印迹与来自草花粉过敏症供体A、B或C的血清一起孵育，随后 通过与碱性磷酸酶偶联的抗-人IgE抗体比检测结合的IgE。
第1道：含有rPhl p4片段1-200的大肠杆菌总细胞提取物
第2道：含有rPhl p4片段185-500的大肠杆菌总细胞提取物
第3道：含有rPhl p4的大肠杆菌总细胞提取物
第4道：从梯牧草纯化出的nPhl p4
上文和下文中使用的核苷酸或氨基酸序列“SEQ ID NO”的编号 是指说明书所附的序列表。
发明内容
现在，本发明首次提供了主要的草花粉过敏原Phl p4的基因序 列，并发现了从单核苷酸多态性(SNPs)产生的3个显性序列(SEQ ID NO1、3和5)。
因此，本发明涉及一种DNA分子，它相应于选自SEQ ID NO1、 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5的核苷酸序列，或者一种DNA分子，它 相应于编码梯牧草的主要过敏原Phl p4的核苷酸序列。
本发明还包括具有低过敏反应的片段、部分序列的新组合和点突 变体。
因此本发明还涉及编码免疫调节的、T-细胞反应性的禾本科第4 组过敏原片段的相应的部分序列、部分序列的组合或交换、缺失或添 加突变体。
除其它草种的第4组过敏原外，第13组过敏原也是本发明的目 的，因为它们在SDS-PAGE中表现出与第4组过敏原非常相似的分子 量，并且难以通过生化技术进行分离(Suck et al.，2000，Clin.Exp. Allergy 30：324-332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395- 1402)。在本发明的蛋白和DNA序列的帮助下，它现在首次可以获得， 但是，可以明确地证明第4和13组具有明显不同的氨基酸序列。
利用关于天然过敏原的DNA序列的知识，现在可能把这些过敏原 制成用于诊断和过敏性疾病的重组蛋白(Scheiner and Kraft， 1995，Allergy 50：384-391)。
有效过敏症的传统方案是特异性免疫或脱敏(Fiebig， 1995，Allergo J.4(6)：336-339，Bousquet et al.，1998，J.Allergy Clin. Immunol.102(4)：558-562)。在该方法中，以递增的剂量对患者皮下 注射天然过敏原提取物。但是，该方法有过敏反应或甚至过敏性休克 的风险。为了使这些风险最小化，采用了类过敏原形式的创新制品。 它们是化学修饰的过敏原提取物，它们具有显著降低的IgE反应性， 但是与未处理的提取物相比有等同的T-细胞反应性(Fiebig，1995， Allergo J.4(7)：377-382)。
关于重组方法制备的过敏原甚至还可能有更多的实质性的优 化。通过重组方法制备的高纯度过敏原的确定的鸡尾酒，任选地与患 者的各个敏化模式相匹配，可以替换来自于天然过敏原来源的提取 物，因为它们除了含有不同的过敏原以外，还含有相对大量的免疫原 性的、但非过敏性的次要蛋白。
通过特异性的突变重组过敏原提供了现实的前景，这可以导致用 表达产物可靠的脱敏，该突变重组过敏原中的IgE表位被特异性地去 除，而未消弱所必须的T-细胞表位(Schramm et al.，1999，J. Immunol.162：2406-2414)。
其它的在过敏症患者体内性的影响紊乱的TH-细胞平衡的可 能是免疫性DNA疫苗。这包括用编码相关过敏原的可表达的DNA 。通过给啮齿动物注射编码过敏原的DNA，已经提供了过敏原特 异性的影响免疫反应的初步实验证据(Hsu et al.，1996，Nature Medicine 2(5)：540-544)。
本发明因此还涉及作为药物的上文或下文所述的DNA分子、或相 应的重组表达载体。
通过重组方法制备的相应蛋白可以用于花粉过敏症的和体 外、体内诊断。
为了制备重组过敏原，将克隆的核酸连接到表达载体上，该构建 体在合适的宿主生物体中表达。生化纯化后，该重组过敏原可以通过 已经建立的方法用于检测IgE抗体。
本发明因此还涉及含有上文或下文所述的DNA分子的重组表达载 体，该DNA分子功能性地连接到表达控制序列上，以及用所述的DNA 分子或所述的表达载体转化的宿主生物体。
本发明类似地涉及至少一种上述的DNA分子或至少一种上述的表 达载体在制备用于过敏症患者的免疫性DNA接种和/或预防该过 敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱 发。
如已经陈述的，本发明能用作含有重组过敏原或核酸的用于特异 性免疫的制品的主要组分。这里有许多种可能。首先，未改变基 本结构的蛋白可以作为制品的组分。其次，通过特异性地去除整个分 子或编码T-细胞表位的各片段制品的IgE表位，低过敏原性(类过敏 原)形式可以根据本发明用于，以防止不希望的副作用。最后， 核酸本身，如果与真核表达载体连接，提供了一种制品，它的直接应 用会在意义上改善过敏免疫状态。
因此本发明涉及与SEQ ID NO 1、3或5相应的重组DNA分子， 其中1-69位的核苷酸序列源自Phl p4 N-端的氨基酸序列。这里使用了 大肠杆菌中常见的密码子。从70位，该DNA序列与已经在梯牧草的 基因组和cDNA中识别鉴定的序列相同。
因此本发明还涉及含有从SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的70位开始的核苷酸序列的DNA分子，该DNA分子编码具有 梯牧草的主要过敏原Phl p4的性质的多肽。
而且，本发明涉及由一个或多个上述的DNA分子编码的多肽，优 选地它们的性质是作为药物。
更具体地说，它们是SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6 的多肽，其中已经通过分离的天然Phl p4过敏原的N-端氨基酸序列分 析确定了氨基酸1-33位。24-500位源自SEQ ID NO 1、3和5的DNA 序列。6、7、8和9位的可变氨基酸源自对天然Phl p4的不同制品N- 端蛋白序列分析(表1)。
因此，本发明还涉及一种通过培养权利要求11的宿主生物体、从 培养物中分离相应的多肽来制备这种多肽的方法。
本发明类似地涉及至少一种上述的多肽在制备用于诊断和/或 过敏症和用于预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过 敏原参与该过敏症的诱发。
本发明的这些作为人过敏原的多肽或蛋白存在于梯牧草的花粉颗 粒中。其它禾本科(例如黑麦草(Lolium perenne)，鸭茅(Dactylis glomerata)，早熟禾(Poa pratensis)，狗牙根(Cynodon dactylon)， 绒毛草(Holcus lanatus)等)的花粉颗粒含有同源的过敏原分子(第4 组过敏原)。
这些分子的同源性已经通过它们与鼠单克隆抗体和人IgE抗体的 免疫学交叉反应性进行了证实。
因此，本发明还涉及与Phl p4 DNA序列同源的序列和其它禾本科 (例如黑麦草，鸭茅，早熟禾，狗牙根，绒毛草，小麦(Triticum aestivum)和大麦(Hordeum vulgare))第4组过敏原的相应的DNA 分子，由于它们存在序列同源性，它们在严格条件下会与Phl p4 DNA 杂交，或者对Phl p4具有免疫学的交叉反应性。
进行下面的操作来测定Phl p4的蛋白和DNA序列。
根据已知的方法(Fahlbusch et al.1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807，Suck et al.2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)纯化并 分离天然过敏原Phl p4。根据Suck等人(2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)所述的方法进行微纯化，并去除第13组过敏原的痕迹。 通过Edman降解测定从梯牧草分离的该Phl p4的N-端氨基酸序列。 用不同批次的Phl p4测定的N-端序列(P1a-f)如表1所示。前15位 的共有序列被认为是下述序列：YFPP′P′AAKEDFLGXL(SEQ ID NO 33)。14位不能测定；它可能是被半胱氨酸占据。不同批次在6、7、8 和9位的不同氨基酸暗示异构意义上的变化。4和5位被羟基脯氨酸 (P′)占据，它在分析制品p1-a和-b时通过特异性分析清楚地予以确 定。
用内肽酶Glu-C(Promega，Heidelberg，Germany)处理SDS-变 性的Phl p4产生不同的肽。对两种肽(P2和P3)测定的氨基酸序列如 表1所示。用内肽酶Lys-C(Roche，Mannheim，Germany)切割来纯 化两种肽(P4和P5)并测序(表1)。通过CNBr切割分离另一种肽(P6)， 测定其氨基酸序列(表1)。
N-端序列的氨基酸序列和内部肽2和6用作构建退火引物的基 础。使用梯牧草基因组DNA，用有义引物No.30和反义引物No.37(表 2)制备扩增子。对从这些扩增子得到的克隆进行测序(图1)，并用于 构建特异性有义引物No.82(表2)。使用从梯牧草花粉的代表性mRNA 体制备出的cDNA、本发明的特异性有义引物No.82和锚定引物 AUAP(Life Technologies，Karlsruhe，Germany)，在严格条件下进行 PCR。对约450kb的扩增子进行测序，这样识别出直到Phl p4基因的 3’端的缺失序列(图2)。以按照本发明确定的C-端Phl p4序列为基础， 构建了特异性反义引物No.85和No.86(表2)。以Phl p4肽P1-a的N- 端氨基酸序列(表1)为基础，构建了源自编码氨基酸24-33位 (LYAKSSPAYP(SEQ ID NO 34))的DNA的退火有义引物No.29。
使用梯牧草基因组DNA，用引物No.29和No.86进行PCR。该PCR 产物用作用引物No.29和No.85进行的第二次PCR(嵌套的PCR)的 基础。将扩增子插入载体pGEM T-easy(Promega，Heidelberg， Germany)，克隆，测序。该序列开始于从N-端计算的24位或SEQ ID NO 1、3或5的DNA序列的70位，并延伸到引物No.85(SEQ ID NO 1、3或5中的1402位)，它位于已经确定的Phl p4基因的C-端部分。 使用这些数据，Phl p4分子的完整氨基酸序列可以从第一个33氨基酸 位置开始构建，通过蛋白序列分析和推定的氨基酸序列(477个位置) 进行测定，该氨基酸序列可以源自用引物No.29/No.85和No.82/锚定 引物制备的克隆。这两个克隆的核苷酸序列在197个位置重叠。通过 直接氨基酸序列分析进行测定，克隆No.29/No.85编码的肽与Phl p4 的N-端序列(1-33位)在10个氨基酸位置重叠，这两种方法测定的氨 基酸相应。
基于直接测定的N-端氨基酸和推导的氨基酸序列的Phl p4的氨基 酸序列相应于序列表中SEQ ID NO 2、4和6列出的序列相同。
用特异性有义引物No.88(表2)和特异性反义引物No.86制备 PCR产物，二者都使用梯牧草的基因组和cDNA，并直接测序。
这样可以排除PCR错误，发现遗传变异(单核苷酸多态性)。
在DNA序列SEQ ID NO 1中发现的单核苷酸多态性如表3所示。 一些这样的单核苷酸多态性导致修饰的氨基酸。这些如表4所示。而 且，对产生相对于显性序列SEQ ID NO 2、4和6发生偏离的氨基酸的 DNA克隆进行测序(表5)。这些氨基酸变体认为是Phl p4分子的异构 体。猜测这些异构体的存在是归因于天然Phl p4的不同等电行为。迄 今已知的所有花粉过敏原都有这样的异构体。通过发现了对于天然Phl p4的已经识别出的内部肽P3、P4和P5(表1)的本发明重组Phl p4 分子的推导氨基酸序列中的同源肽序列(图3)这一事实，可以证明另 一事实，即引物No.29和86确定的DNA片段实际上编码与天然Phl p4 过敏原相同的蛋白。所述的Phl p4氨基酸序列表明，它是由500个氨 基酸组成的基础分子，具有计算出的等电点8.99(SEQ ID NO 2)、8.80 (SEQ ID NO 4)或9.17(SEQ ID NO 6)。定量的氨基酸组合物如表6 所示。计算出的重组Phl p4的分子量是55.762(SEQ ID NO 2)、55.734 (SEQ ID NO 4)或55.624(SEQ ID NO 6)道尔顿。该计算出的分子 量与通过SDS-PAGE测定的55kDa天然Phl p4的分子量非常吻合 (Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807和Suck et al.， 2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)。
已经描述了分子量为50-60kDa的相关草物种的第4组过敏原(Su et al.，1991，Clin.Exp.Allergy 21：449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch. Allergy Appl.Immunol.89：342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin. Immunol.83：845-852；LeducBrodard et al.，1 996，J.Allergy Clin. Immunol.98：1065-1072；14-17)。
为了制备重组Phl p4蛋白，将编码Phl p4的SEQ ID NO 1、3和/ 或5的DNA序列插入表达载体(例如pProEx，pλCro，pSE380)。关 于从蛋白测序获知的N-端氨基酸，使用了大肠杆菌优化密码子。
转入大肠杆菌后，表达，用不同的分离方法纯化重组Phl p4，得 到的蛋白再经历重新折叠过程。
这样方法得到的rPhl p4蛋白在SDS-PAGE中出现一条带，它包括 了与天然Phl p4相同分子量的区域。通过与鼠单克隆抗体5H1和3C4 的反应，该抗体5H1和3C4已经用天然Phl p4诱导并且与禾本科的同 源蛋白(第4组)交叉反应(Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807；Gavrovic-Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin. Immunol.10(6)：361-367)(图4)，已经证明了rPhl p4的免疫学反应 性。rPhl p4与已经证实了与天然rPhl p4的IgE反应性的过敏症患者 体内的IgE抗体反应。该IgE反应性和作为过敏原的作用已经在点实 验、Western印迹和聚苯乙烯微量滴定板上的过敏原吸附中予以证实。 Western印迹的检测如图5所示。rPhl p4与第4组过敏原反应性的草 花粉过敏症患者的嗜碱性细胞的反应时，刺激它们增加活化标记CD 203c的表达。这种rPhl p4的嗜碱性细胞活化清楚地表明，该分子也作 为过敏原起作用。该rPhl p4过敏原这样就可以用于草花粉过敏症患者 的高特异性诊断。该诊断可以在体外通过检测特异性抗体(IgE， IgG1-4，IgA)和与携带IgE的效应细胞(例如来自血液的嗜碱性细胞) 反应来进行，或者在体内通过皮试反应和对反应器官的刺激来进行。
利用新鲜制备的血液淋巴细胞中的T细胞和建立的nPhl p4反应性 T细胞系和克隆，通过过敏原特异性刺激T淋巴细胞的扩增和细胞因 子的合成，已经检测了rPhl p4与草花粉过敏症患者的T-淋巴细胞的反 应。
以所述的rPhl p4 DNA序列为基础，将编码具有50-350个氨基酸 的肽的部分序列克隆入表达载体。这些部分序列依次包括了rPhl p4的 完整序列，有至少12氨基酸的重叠。表达的肽相应于Phl p4片段。单 个的或混合的Phl p4片段与过敏症患者的IgE抗体不反应，或者仅仅 是小范围的反应，因此它们可以归入低过敏原类。相反，这些片段的 混合物能够以与完整的重组的或天然的Phl p4相同的方式刺激具有 Phl p4反应性的草花粉过敏症患者的T淋巴细胞。
图4显示了作为实例的通过与Phl p4特异性单克隆鼠抗体结合而 表征相应于氨基酸1-200和185-500的两个这样的Phl p4片段。C-端片 段185-500仅仅与单克隆抗体5H1反应，而N-端片段1-200清楚地与 单克隆抗体3C4反应。从图5可以看出，片段185-500与来自过敏症 患者B和C的血清的IgE的反应强度较低，即过敏原性不如片段1- 200，它具有降低的IgE反应性(低致敏性)，至少对患者血清C如此。
本发明因此还涉及上文或下文所述的DNA分子，它编码具有Phl p4的氨基酸1-200的片段1-200，
以及DNA分子，它编码具有Phl p4的氨基酸285-500的片段 285-500。
通过位点特异性的谤变修饰编码半胱氨酸的三联密码子，使其编 码其它的氨基酸，优选丝氨酸。已经制备了这样的两种突变体：其中 各半胱氨酸被替换，其中2个半胱氨酸基团的不同组合或所有的5个 半胱氨酸被修饰。这些半胱氨酸点突变体表达的蛋白对过敏症患者的 IgE抗体具有降低的或零反应性，但是与这些患者的T-淋巴细胞反应。 本发明因此还涉及上文或下文所述的DNA分子，其中相应多肽的一 个、多个或所有的半胱氨酸基团已经通过定点诱变替换为其它氨基 酸。
相应于具有T-细胞表位的多肽的低过敏原性片段的免疫调控活性 和低过敏原性点突变体(例如半胱氨酸多态性)的免疫调控活性已经 通过其与草花粉过敏症患者的T细胞的反应予以证实。
这种低过敏原性片段或半胱氨酸点突变体可以用作过敏症患者的 脱敏制品，因为它们与T-细胞等效反应，但是由于降低了或完全没有 IgE反应性，因而减少了IgE介导的副作用。
如果将编码低过敏原性Phl p4变体的核酸或未修饰的编码Phl p4 的DNA与人表达载体连接，这些构建体可以同样用作免疫的制品 (DNA接种)。
最后，本发明涉及药物组合物，它含有至少一种上述的DNA分子 或至少一种上述的表达载体，任选地含有其它用于过敏症患者的免疫 性DNA接种和/或预防该过敏证的活性成分和/或佐剂，其中禾本 科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
另外一组本发明的药物组合物含有至少一种上述的多肽，而不是 DNA，它适用于诊断和/或所述的过敏症。
本发明意义上的药物组合物含有作为活性成分的本发明的多肽或 表达载体和/或各自的药学上可有用的衍生物，包括它们所有比例的混 合物。根据本发明的活性成分在这里可以与至少一种固体、液体和/或 半液体赋形剂或佐剂，任选地与一种或多种其它的活性成分相组合， 制成合适的剂型。
特别合适的佐剂是免疫刺激性DNA或具有CpG效果的寡核苷 酸。
这些组合物可以用作人用药或兽用药中的剂或诊断剂。合适 的赋形剂是适合于肠胃外施用且对本发明的活性成分不产生负面影响 的有机物或无机物。特别适合肠胃外施用的是溶液，优选基于油的或 水性溶液，以及悬浮液、乳状液或灌注液。本发明的活性成分也可以 冻干，得到的冻干物用于，例如，制备注射制品。所指的组合物可以 是灭菌的，和/或含有佐剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、 乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲物和/或多种其它的活性成分。
而且，用本发明的活性成分的相应制剂可以得到持续释放的制 品。
因此本发明也用于提高体外诊断，该诊断作为过敏原组分诱发的 对患者特异性敏感图谱的识别的一部分。本发明同样用于制备用于草 花粉过敏症的特异性免疫的显著改善的制品。
表1 Phl p4肽的氨基酸序列
表2以Phl p4肽序列和DNA序列为基础构建的退火的和特异性 有义引物和反义引物
引物82、85、86和88的核苷酸序列以通常的3字母密码显示。至 于引物29、30和37，则使用IUPAC-IUB DNA码；这里的字母“N” 代表次黄嘌呤核苷。
表3测得的单核苷酸多态性
表4单核苷酸多态性引起的氨基酸交换
表5各重组Phl p4克隆与SEQ ID NO 2相比发生偏离的氨基酸位 置
*[SEQ ID NO 2的氨基酸/在序列中的位置/偏离的氨基酸]
表6 Phl p4的氨基酸组成
*包括羟基脯氨酸
按照SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4/SEQ ID NO 6的顺序给出三个显 性序列的值。
序列表
<110>Merck Patent GmbH
<120>草花粉过敏原Phl p4的DNA序列和用重组方法进行的制备
<130>P 02/101
<140>EP 02 013953.1
<141>2002-06-25
<160>52
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1503
<212>DNA
<213>梯牧草(Phleum pratense)
<220>
<221>人工DNA序列
<222>(1)..(69)
<223>来源于测序过的蛋白的DNA序列
<220>
<221>天然DNA序列
<222>(70)..(1503)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<223>
<400>1
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aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat 96
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ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg cgg tgg tcg tcg ccg 144
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
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Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
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65 70 75 80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tcc ctg 288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg 336
Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
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Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
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Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
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aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac 576
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Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
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Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr
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Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
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Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
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Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
210 215 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225 230 235 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
245 250 255
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr
260 265 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met
275 280 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
325 330 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val
340 345 350
Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
370 375 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385 390 395 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420 425 430
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln
450 455 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465 470 475 480
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
485 490 495
Ile Lys Lys Tyr
500
<210>5
<211>1503
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>人工DNA序列
<222>(1)..(69)
<223>来源于测序过的蛋白的DNA序列
<220>
<221>天然DNA序列
<222>(70)..(1503)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<223>
<400>5
tac ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt 48
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1 5 10 15
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat 96
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg agg tgg tcg tcg ccg 144
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
gac aac gtg aag ccg ctc tac atc atc acc ccc acc aac gtc tcc cac 192
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His
50 55 60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgc cac agc gtc cgc atc cgc 240
Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tct ttg 288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
cag ccc gag acg ttc gcc gtc gtc gac ctc aac aag atg cgg gcg gtg 336
Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
tgg gtg gac ggc aag gcc cgc acg gcg tgg gtg gac tcc ggc gcg cag 384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
115 120 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc tat aag gcg agc ccc acg ctg gcg 432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala
130 135 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acg atc gga gtg ggc ggc aac ttc gcg 480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcc gcg gag 528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc aag ctg cac gac 576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
180 185 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg 624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
195 200 205
ggc gag agc ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg cag gtg aag ctc ctg ccg 672
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro
210 215 220
gtg ccg ccc acc gtg aca ata ttc aag atc tcc aag aca gtg agc gag 720
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac aag tgg caa gtg gtc gcg ccg cag ctt 768
Gly Ala Val Aep Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
245 250 255
ccc gcc gac ctc atg atc cgc atc atc gcg cag ggg ccc aag gcc acg 816
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr
260 265 270
ttc gag gcc atg tac ctc ggc acc tgc aaa acc ctg acg ccg ttg atg 864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
275 280 285
agc agc aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac ccc tcc cac tgc aac gag 912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
atg tca tgg atc cag tcc ato ccc tto gtc cac ctc ggc cac agg gac 960
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
gcc ctc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac tcc ttc aag ccc ttc 1008
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
325 330 335
gcc gaa tac aag tcc gac tac gtc tac cag ccc ttc ccc aag acc gtc 1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val
340 345 350
tgg gag cag atc ctc aac acc tgg ctc gtc aag ccc ggc gcc ggg atc 1104
Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
arg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tcc 1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
370 375 380
gcc acg ccc ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385 390 395 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc gcc gcc gcg ccc ctc tcg tgg 1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
agc aag gac atc tac aac tac atg gag ccc tac gtg agc aag aac ccc 1296
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420 425 430
agg cag gcg tac gca aac tac agg gac atc gac ctc ggc agg aac gag 1344
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
gtg gtc aac gac gtc tcc acc tac gcc agc ggc aag gtc tgg ggc cag 1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln
450 455 460
aaa tac ttc aag ggc aac ttc gag agg ctc gcc att acc aag ggc aag 1440
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465 470 475 480
gtc gat cct acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc 1488
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
485 490 495
atc aaa aag tac tga 1503
Ile Lys Lys Tyr
500
<210>6
<211>500
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>6
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1 5 10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His
50 55 60
Ile Gln Ser Als Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
115 120 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala
130 135 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
180 185 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro
210 215 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
245 250 255
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr
260 265 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
275 280 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
325 330 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val
340 345 350
Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
370 375 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385 390 395 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420 425 430
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln
450 455 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465 470 475 480
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
485 490 495
Ile Lys Lys Tyr
500
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>7
Ile Val Ala Leu Pro Xaa Gly Met Leu Lys
1 5 10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>黑麦草(Lolium Perenne)
<400>8
Phe Leu Glu Pro Val Leu Gly Leu Ile Phe Pro Ala Gly Val
1 5 10
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>黑麦草
<400>9
Gly Leu Ile Glu Phe Pro Ala Gly Val
1 5
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>鸭茅(Dactylus glomerata)
<400>10
Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys
1 5 10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>11
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Glu Gln
1 5 10
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>12
Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln Leu Gly Glu Leu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>13
Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro
1 5 10 15
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>狗牙根(Cynodon dactylon)
<400>14
Lys Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro
1 5 10
<210>15
<211>22
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>15
Lys Gln Val Glu Arg Asp Phe Leu Thr Ser Leu Thr Lys Asp Ile Pro
1 5 10 15
Gln Leu Tyr Leu Lys Ser
20
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>16
Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Ile Thr Ala Ala Met Ile
1 5 10 15
<210>17
<211>24
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>17
Leu Arg Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Asn Val Ile Asp Ala Lys Val
1 5 10 15
Val Asp Ala Gln Gly Arg Leu Leu
20
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>18
Lys Trp Gln Thr Val Ala Pro A la Leu Pro Asp Pro Asn Met
1 5 10
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>19
Val Thr Trp Ile Glu Ser Val Pro Tyr Ile Pro Met Gly Asp Lys
1 5 10 15
<210>20
<211>19
<212>PRT
<213>狗牙根
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>20
Gly Thr Val Arg Gln Leu Leu Xaa Arg Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe
1 5 10 15
Gly Lys Tyr
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>21
Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Leu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Pro Lys Lys Ser
20
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>22
Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Val Asn Gln Val Val Gly
1 5 10
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>23
Ser Ala Thr Pro Pro Thr His Arg Ser Gly Val Leu Phe Asn Ile
1 5 10 15
<210>24
<211>36
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>24
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Gln Val Thr Arg Asp Ile Tyr Ala Phe
1 5 10 15
Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ala Tyr Val Asn Tyr
20 25 30
Arg Asp Leu Asp
35
<210>25
<211>149
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>25
caccggaagg gggtgctgtt caacatccag tacgtcaact actggttcgc cccgggagcc 60
ggcgcggcgc cattgtcgtg gagcaaggag atctacaact acatggagcc gtacgtgagc 120
aaggaccccg tccaggccta cgccaacta 149
<210>26
<211>299
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>26
actactggtt cgccccggga gccggcgcgg cgccattgtc gtggagcaag gagatctaca 60
actacatgga gccatacgtg agcaagaacc ccaggcaggc ctacgccaac tacagggaca 120
tcgacctcgg gaggaacgag gtggtgaacg acgtctccac cttcagcagc ggtttggtgt 180
ggggccagaa atacttcaag ggcaacttcc agaggctcgc catcaccaag ggcaaggtgg 240
atcccaccga ctacttcagg aacgagcaga gcatcccgcc gctcatcaaa aagtactga 299
<210>27
<211>33
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>27
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val
1 5 10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
Pro
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>28
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln
1 5 10 15
Tyr Val
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>29
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
1 5 10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(9)
<223>未确定的氨基酸
<400>30
Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg
1 5 10
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>31
Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile
1 5
<210>32
<211>16
<212>PRT
<213>未确定的氨基酸
<400>32
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr
1 5 10 15
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>33
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>34
Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr Pro
1 5 10
<210>35
<211>33
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>35
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val
1 5 10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
Pro
<210>36
<211>29
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>36
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phs Leu Gly Xaa Leu Val
1 5 10 15
Lys Glu Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro
20 25
<210>37
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>37
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>38
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Lys Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>39
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Asp Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(5)
<223>未确定的氨基酸
<400>40
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Leu Ala Asn Glu Asp Phe
1 5 10
<210>41
<211>18
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>41
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln
1 5 10 15
Tyr Val
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>42
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
1 5 10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(9).
<223>未确定的氨基酸
<400>43
Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg
1 5 10
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>44
Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile
1 5
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>45
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr
1 5 10 15
<210>46
<211>29
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>46
ytntaygcna arwsnwsncc ngcntaycc 29
<210>47
<211>28
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>47
caymgnaarg gngtnytntt yaayatmc 28
<210>48
<211>26
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>48
tarttngcrt angcytgnac nggrtt 26
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>49
actactggtt cgccccggga gcc 23
<210>50
<211>28
<212>DNA
<213>梯牧草
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