标记前哨淋巴结的有机蓝染料与荧光成像的组合技术

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种有机蓝染料与荧光成像的组 合技术，尤其是一种以美蓝等为染料的标记前哨淋巴结的有机蓝染料 与荧光成像的组合技术。

背景技术

前哨淋巴结是指来自肿瘤淋巴引流区域的第一站淋巴结，如果前 哨淋巴结有肿瘤转移，则癌细胞很可能已扩散，此时需要扩大手术， 相反，则可以缩小手术范围。前哨淋巴结状态是诊断肿瘤是否扩散和 决定方案的重要依据，与传统淋巴结清扫术相比，前哨淋巴结活 检可避免手术不必要的扩大，减少病人痛苦，是肿瘤外科上的一个重 大突破。

前哨淋巴结活检的关键性技术是要准确到前哨淋巴结，即对前 哨淋巴结进行定位。目前临床上的定位方法主要是有机染料分子的染 法、放射性核素示踪法和蓝染料与核素联合使用法这三种方法。临 床上采用的蓝染料主要是美蓝(也称亚甲基蓝)，也可以是伊文思蓝、 异硫蓝、专利蓝，该染料无毒，无放射性，在临床上使用已超过100 年，早已被实践证明是很安全的试剂。自从1992年Morton等人 (Morton DL，Wen DR，Wong JH et al.Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma. Arch.Surg.1992，127：392-399)使用蓝染料进行核素瘤的前哨淋 巴结活检之后，应用该技术进行肿瘤前哨淋巴结活检在临床上被广泛 使用。

利用蓝染料进行肿瘤前哨淋巴结定位，是通过肉眼观察蓝染料的 颜(即蓝)进行的。该技术的操作一般是：将蓝染料的水溶液经 肿瘤附近的皮下注射到病人或动物体内，然后切开皮肤，通过肉眼观 察，沿蓝染的淋巴管寻蓝染的淋巴结。实践表明，只有经验非常丰 富的医生才能通过该技术准确到前哨淋巴结，而且，由于手术切口 较大，病人或动物比较痛苦。

采用放射性核素进行肿瘤前哨淋巴结定位，虽然可以在非手术的 情况下就可以通过放射性的信号到前哨淋巴结，但因存在放射性而 对病人和医护人员的健康产生危害，此外，价格较昂贵。

2004年，Kim等人利用近红外荧光量子点(CdTe/CdSe)通过活 体动物体内荧光成像技术对小鼠和猪的腋窝前哨淋巴结进行成像定 位，他们将皮摩尔量级的量子点水溶液注射到小鼠的脚掌和猪的腿 上，通过体内发射出的荧光，结果在体外可直接观察到腋窝处的前哨 淋巴结，该技术由于荧光信号强而且稳定，无须手术，被认为在临床 上有应用前景。然而，量子点中含有毒重金属，如镉(Cd)。重金属 Cd对生物体的毒性仅次于剧毒的汞(Hg)，Cd可导致动物和人类多种 癌症。国际癌症研究组织(IARC)已将Cd列为第一类致癌物。即使量 子点表面包覆有机高分子或无机材料，如SiO2，在体内环境中仍然有 Cd离子从量子点中渗出并逐渐积累而产生毒性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种标记前哨淋巴结的有 机蓝染料与荧光成像的组合技术。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述有机蓝染料 与荧光成像的组合技术的应用。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种标记前哨淋 巴结的有机蓝染料与荧光成像的组合技术，通过荧光成像设备波长不 小于570nm的激发光照射，有机蓝染料发出的荧光通过荧光成像设 备显示，其中，所述的有机蓝染料为临床上用作染或用作指示剂的 美蓝(methylene blue)、伊文思蓝(Evans blue)、异硫蓝(isosulfan blue)、专利蓝(patent blue)中的一种或其组合物。

本发明的申请人在对具有优异生物相容性及对前哨淋巴结染 性的有机蓝染料的研究中发现，这种临床应用广泛的有机蓝染料，虽 也有荧光特性，但荧光较弱，因此未引起人们的足够重视。在临床应 用中，只能通过外科手段形成创口，再用肉眼对美蓝的物理颜(蓝 )进行观察，从而确定前哨淋巴结的位置。

申请人在实验中发现，虽然这种有机蓝染料的荧光量子效率低， 但该荧光信号可被高灵敏的CCD相机捕捉，并可以通过成像软件显示 出来，也就是，有机蓝染料发出的荧光可以通过先进的活体动物体内 荧光成像仪器进行成像。因此，可以利用有机蓝染料的特性结合先进 的荧光成像技术应用于肿瘤前哨淋巴结的成像定位中。

在上述方案的基础上，所述的有机蓝染料在溶剂中制成的溶液， 溶剂为去离子水或磷酸盐缓冲液或生理盐水，溶剂的pH值在6.8～7.5 之间，溶液质量浓度为0.5～2％。

在上述方案的基础上，所述的激发光波长不小于600nm。

进一步优选激发光波长为670～720nm。

针对上述标记前哨淋巴结的有机染料与荧光成像的组合技术的 应用，先用有机蓝染料标记有机体内部的前哨淋巴结，再通过荧光成 像设备波长不小于570nm的激发光在有机体外部进行照射，有机蓝 染料发出的荧光通过荧光成像设备显示，其中，所述的有机蓝染料为 美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、专利蓝中的一种或其组合物，其中，优选 美蓝。

具体的，经过对动物肿瘤周围的皮下注射，有机蓝染料与前哨淋 巴结结合并对其进行标记，然后通过荧光成像设备波长不小于570nm 的激发光进行体外照射，使动物肿瘤附近的前哨淋巴结内的有机蓝染 料发射近红外荧光，而使动物组织、器官成像，成像过程和结果输出 均由荧光成像仪器完成，将有机体内的前哨淋巴结显示出来。

这里所指的有机体为带淋巴系统的人、哺乳动物、爬行动物、鸟 类等。

本发明的技术，同样可用于正常动物前哨淋巴结的定位，即有机 蓝染料经过对正常动物的皮下注射，然后通过有机体外部的荧光成像 设备波长不小于570nm的激发光进行体外照射，使注射部位附近的 前哨淋巴结内的有机蓝染料发射近红外荧光，并通过活体动物体内荧 光成像仪器将前哨淋巴结中的荧光显示出来。

本发明的优异效果是：

本发明克服了临床上进行肿瘤前哨淋巴结定位的常规方法中，用 有机染料进行染定位时需要通过在皮肤上较大切口寻蓝染淋巴 结的缺陷，无需手术即可定位前哨淋巴结，降低了病患的痛苦，同时 避免了采用放射性核素进行定位时存在的放射性危害，以及采用量子 点进行定位方法时存在重金属毒害，采用生物相容性优异的美蓝等有 机蓝染料，结合荧光成像构成组合技术，在570nm及以上激发光的 激发下，通过荧光成像设备对有机蓝染料的荧光进行成像，以便用肉 眼观察，方便、快速、准确，是一种极具临床使用价值的方法。

附图说明

图1为未经有机染料标记前哨淋巴结的大白兔在可见光及荧光下的 照片。

图2为经有机染料标记前哨淋巴结的大白兔在可见光及荧光下的照 片。

具体实施方式

实施例

一种用于标记前哨淋巴结的有机蓝染料与荧光成像的组合技术， 通过荧光成像设备波长为671～705nm的激发光照射，有机蓝染料发 出的荧光通过荧光成像设备显示，其中，所述的有机蓝染料为美蓝。 应用例

分别配制质量浓度0.2％，0.5％，1％和2％的美蓝的磷酸盐缓冲 液(pH＝7.2)，分别将不同浓度的美蓝溶液(0.8ml)注射到四只雌 性新西兰大白兔第二对乳腺的乳晕周围的皮下(大白兔已脱去胸部至 腋窝的体毛)，然后通过荧光成像设备波长为671～705nm激发光对 大白兔进行体外照射，荧光接收波长为750nm，通过成像系统观察第 二对乳腺至腋窝处的荧光信号。

请参阅图1为未经有机染料标记前哨淋巴结的大白兔在可见光 及荧光下的照片和图2为经有机染料标记前哨淋巴结的大白兔在可 见光及荧光下的照片所示，在无须切开大白兔皮肤的情况下，即可发 现，在1min左右美蓝的荧光就从第二对乳腺流向该侧的腋窝，并在 腋窝处有1～2个非常明显的直径在0.2～0.5cm的荧光光斑。当注射的 美蓝浓度为0.2％时，腋窝处的荧光光斑可保持1-2h，随美蓝浓度增 大，光斑的荧光信号持续时间越长，当注射的美蓝浓度为2％时，光 斑的荧光信号最长可持续24h。

通过传统的前哨淋巴结定位方法(即切开乳腺至腋窝处的皮肤)， 发现腋窝处荧光光斑的位置即为前哨淋巴结。

本实施例采用的荧光成像设备为美国CRI公司的CRI MaestroTM 活体成像系统。

也可以通过法国BioSpace公司的Photon Imagor荧光成像系统， 美国Kodak的活体成像系统；美国精诺真(Xenogen)产品等来实现。