C07K16/24(2006.01)I C07K14/54(2006.01)I A61P17/00(2006.01)I A61P17/04(2006.01)I
1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括特异性结合含有氨基酸 序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交 瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具 有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、
c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、
d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、
e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、
f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、
g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、
h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，和
i)ATCC专利保藏名称PTA-6873。
7.根据权利要求1-6的抗体，其中所述抗体中和IL-31(SEQ ID NO：2)与IL-31RA(SEQ ID NO：5)的相互作用。
8.根据权利要求1-6的抗体，其中所述抗体是(a)鼠单克隆抗体、 (b)源自(a)的人源化抗体、或(c)抗体片段或(d)人单克隆抗体。
9.权利要求1-6的抗体，其中所述抗体还含有放射性核素、酶、 底物、辅助因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒或毒素。
10.权利要求1-6的抗体，其中所述抗体还包含聚乙二醇化。
11.权利要求1-6的抗体，其中所述抗体是中和性抗体。
12.权利要求1-6的抗体，其中施用所述抗体至哺乳动物抑制、防 止、减少或阻断所述多肽的促炎活性。
13.权利要求1-6的抗体，其中施用所述抗体至哺乳动物抑制、防 止、减轻或阻断了与所述多肽的促炎活性相关的搔抓行为和皮炎。
14.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6815的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
15.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6816的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
16.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6829的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
17.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6830的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
18.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6831的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
19.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6871的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
20.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6872的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
21.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6875的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
22.根据权利要求1的单克隆抗体，其中所述多肽能够结合由保藏 在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏名称PTA-6873的杂交 瘤产生的单克隆抗体。
2.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤 由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、
c)ATCC专利保藏名称PTA-6871、
d)ATCC专利保藏名称PTA-6829，和
e)ATCC专利保藏名称PTA-6830。
3.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤 由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816，和
c)ATCC专利保藏名称PTA-6871。
4.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤 由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6829，和
b)ATCC专利保藏名称PTA-6830。
5.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤 由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6872，和
b)ATCC专利保藏名称PTA-6875。
6.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：11的多肽的单克 隆抗体，其中所述多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交 瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有ATCC专利保藏名称PTA-6874。
23.一种减轻哺乳动物中的炎症的方法，所述方法包括施用给哺乳 动物一定量的根据权利要求1的IL-31抗体，以此减轻炎症。
27.权利要求23-26的方法，其中所述疾病是炎性疾病，包括搔痒 性疾病。
28.根据权利要求23-26的方法，其中所述疾病是特应性皮炎。
29.根据权利要求23-26的方法，其中所述疾病是结节性痒疹。
30.根据权利要求23-26的方法，其中所述抗体是根据权利要求 1-6的抗体。
24.一种受其中IL-31起作用的炎性疾病折磨的哺乳动物的 方法，所述方法包括：
施用IL-31拮抗剂给该哺乳动物，这样炎症得以减轻，其中所述拮 抗剂包括(i)特异性结合IL-31RA的多肽或多肽片段的抗体、抗体片 段或结合多肽，或者(ii)IL-31RA的多肽或多肽片段；并且其中IL-31 的炎性活性得以减少。
25.一种在哺乳动物中减轻、抑制或防止其中IL-31起作用的搔痒 症的影响的方法，所述方法包括：
施用IL-31拮抗剂给哺乳动物，这样搔痒症得以减轻，其中所述拮 抗剂包括(i)特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2或其片段的多 肽的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，并且其中IL-31的 骚痒活性得以减少。
26.一种在哺乳动物中减轻、抑制或防止其中IL-31起作用的搔痒 症的影响的方法，所述方法包括：
施用IL-31拮抗剂给哺乳动物，这样使得哺乳动物中的骚痒得以减 轻，其中所述的拮抗剂包括(i)特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2， 或其片段的多肽的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，并由 此IL-31的搔抓活性得以减少。
31.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由选自下列的杂交瘤克隆名称号产生的单 克隆抗体：
a)克隆292.12.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6815)、
b)克隆292.63.5.3(ATCC专利保藏名称PTA-6829)、
c)克隆292.72.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6816)、
d)克隆292.84.1.6(ATCC专利保藏名称PTA-6871)和
e)克隆292.118.6.4(ATCC专利保藏名称PTA-6830)。
32.一种特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆 抗体，其中所述多肽能够结合由选自下列的杂交瘤克隆名称号产生的单 克隆抗体：
a)克隆294.35.2.6.3(ATCC专利保藏名称PTA-6872)、
b)克隆294.144.3.5(ATCC专利保藏名称PTA-6873)、
c)克隆294.154.5.6(ATCC专利保藏名称PTA-6875)，和
d)克隆294.163.2.1(ATCC专利保藏名称PTA-6831)。
33.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括能够竞争结合含有氨基 酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂 交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏， 具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、
c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、
d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、
e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、
f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、
g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、
h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，和
i)ATCC专利保藏名称PTA-6873。
34.一种杂交瘤，其中所述杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保 藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、
c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、
d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、
e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、
f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、
g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、
h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，和
i)ATCC专利保藏名称PTA-6873。
IL-31单克隆抗体及使用方法
发明背景
免疫系统具有广泛的包括淋巴细胞在内的特定细胞类型。淋巴细 胞决定宿主中免疫反应的特异性并包括两种类型：作为抗体生成细胞 的前体的B淋巴细胞，和某些调节功能例如特异性免疫应答的产生所 需的T淋巴细胞。
成熟的T细胞可以被激活，即通过抗原或其它刺激激活，来产生 例如细胞因子、生物化学信号分子或受体，它们进一步影响T细胞 的命运。
B细胞可通过它们细胞表面上的受体(包括B细胞受体)和其它 辅助分子(accessory molecule)激活，来实施辅佐细胞(accessory cell)功能，例如细胞因子的产生。
单核细胞/巨噬细胞和T-细胞可通过它们细胞表面上的受体激 活，并通过将抗原递呈至淋巴细胞而在免疫应答中起重要作用，而且 还通过分泌众多细胞因子而起淋巴细胞的辅佐细胞的作用。
天然杀伤(NK)细胞与T细胞和B细胞具有共同的祖细胞 (progenitor cell)，并在免疫监督中起作用。含有多达15％血液 淋巴细胞的NK细胞不能表达抗原受体，并因此不会使用MHC识别作为 结合至靶细胞的需要。NK细胞参与识别并杀死某些肿瘤细胞和病毒感 染细胞。在体内，NK细胞被认为是需要被激活，然而，在体外，NK 细胞已显示可杀死一些类型的肿瘤细胞而无需激活。
白细胞介素是介导免疫应答(包括炎症)的一类细胞因子。白细 胞介素介导多种炎性病理学。免疫应答的中心是T细胞，其产生许多 细胞因子和对抗原的适应性免疫(adaptive immunity)。已经将由T 细胞产生的细胞因子分为1型和2型(Kelso，A.Immun.Cell Biol. 76：300-317，1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，并 且参与了炎症应答、病毒免疫、胞内寄生物免疫和同种异体移植物排 斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并且参 与了体液应答、蠕虫免疫和变应性反应。1型和2型之间共有的细胞 因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。存在一些证据显示，产生1型和2 型的T细胞优先迁移进不同类型的发炎地组织中。
皮肤在免疫系统中起着重要的作用并由多层组成。表皮是表面层。 表皮下面是真皮，一层结缔组织。真皮下面是皮下组织，一层大量的 脂肪组织。循环T淋巴细胞在正常和炎性条件下迁移至皮肤。皮肤淋 巴细胞抗原(CLA)被认为是一种对皮肤具有趋向性的T细胞的归巢受 体(homing receptor)。Santamaria-Babi，L.，Eur.J.Dermatol. 14：13-18，2004。
已知一些皮肤疾病表达高水平的CLA+T细胞，包括特应性皮炎、 接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性(skin-tropic)病 毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃(alopecia aerata)、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮。 存在对这类皮肤T细胞介导的疾病的需要。
所证实了的细胞因子家族的体内活性显示了其它细胞因子、细胞 因子激动剂和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力，以及对它们的需要。 IL-31，一种新鉴定的细胞因子。IL-31当在小鼠中过度表达时，导致 皮炎样症状。已经将皮肤归巢T细胞和表皮角质细胞(kerationcyte) 牵连于人类皮肤疾病的病理学中。本发明通过提供致炎细胞因子 IL-31的拮抗剂来解决这些需要。本发明的这种拮抗剂可阻断、抑制、 减少、对抗或中和IL-31的活性，包括可溶性IL-31RA受体和抗-IL-31 中和抗体。本发明进一步提供了在炎性疾病中为此的用途，以及相关 的组合物和方法。
发明详述
在详细陈述本发明之前，定义下列术语可能会有助于对它的理解：
如在此使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和-纯化的多克 隆抗体、单克隆抗体，以及抗原-结合片段，例如F(ab′)2和Fab蛋白 水解片段。一般而言，工程化的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、Fv 片段、单链抗体等，以及合成的抗原-结合肽和多肽也包括在内。非人 抗体可通过移植非人CDR至人的框架区和恒定区，或通过整合整个非 人的可变结构域(任选通过置换暴露残基用类似人的表面来“掩饰” 它们，其中产物是一种“镶嵌化的(veneered)”的抗体)来进行人 源化。在一些情况中，人源化抗体可在人可变区框架结构域中保留非- 人残基，以增强正常的结合特性。通过人源化抗体，可延长生物半衰 期，并减小在施用给人时不利的免疫反应的可能性。
术语“嵌合抗体”指其轻链和重链基因通常通过遗传工程，从属 于不同种属的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建而来的抗体。例如， 可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区片段与人恒定区片段，例如 γ1和γ3连接。因此，典型的性嵌合抗体是一种杂合蛋白，其由 来自小鼠抗体的可变或抗原-结合结构域和来自人抗体的恒定结构域 组成，虽然也可以使用其它哺乳动物物种。
如在此使用的，术语“免疫球蛋白”指由基本上通过免疫球蛋白 基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。一种形式的免疫球蛋白构 成了抗体的基本结构单位。这种形式是一个四聚体并由相同的两对免 疫球蛋白链组成，每对链具有一条轻链和一条重链。在每对链中，轻 链和重链的可变区一起负责结合至抗原，而恒定区负责抗体效应子作 用。
全长的免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)由NH2- 末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基 因编码。全长的免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类 似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一(约 330个氨基酸)编码。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并分别定义抗 体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区 和恒定区由约12个或更多氨基酸的“J”区连接，且重链还包含约10 个或更多氨基酸的“D”区。(通常参见，Fundamental Immunology (Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989)，Ch.7(为 所有目的通过全文引入作为参考)。
免疫球蛋白的轻链或重链可变区由通过3个高可变区中断的“框 架”区组成。因此，术语“高可变区”指负责抗原结合的抗体的氨基 酸残基。高可变区含有来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基 (即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3) 以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)) (Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health， Bethesda，Md.(1991))，和/或来自“高可变loop区”的那些残基 (即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3) 以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)； Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917)(将两者 都在此通过引入作为参考)。“框架区”或“FR”残基是那些可变结 构域的残基，而不是如在此定义的高可变区的残基。在一种物种中， 不同轻链或重链的框架区序列是相对保守的。因此，“人框架区”是 与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本一致的(约85％或更高，一 般为90-95％或更高)。抗体的框架区，即组成性轻链和重链的组合 框架区，用来定位和对齐CDR。CDR主要负责结合至抗原表位。
因此，术语“人源化的”免疫球蛋白指含有人框架区和来自非人 (通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。 提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋 白称为“受体”。不需要存在恒定区，但是如果它们存在，则它们必 须与人免疫球蛋白的恒定区基本一致，即至少约85-90％，优选约95％ 或更一致。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分(可能除了CDR)基 本上与天然的人免疫球蛋白序列的对应部分一致。“人源化抗体”指 含有人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体 将不包括如上定义的典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可 变区是非人的。
术语“遗传改变的抗体”表示其中氨基酸序列已与天然抗体的氨 基酸序列不同的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的实用性，人 们不需要受限于在天然抗体中发现的氨基酸序列；可重新设计抗体来 获得期望的特性。可能的改变有许多，从仅一个或少数氨基酸的改变 到例如可变区或恒定区的完全重新设计。一般而言，将对恒定区作改 变以便提高或改变特性，例如补体结合、与膜的相互作用以及其它效 应子作用。将会对可变区作改变以便提高抗原结合特性。
除了抗体，免疫球蛋白可以多种其它形式存在，包括例如单链或 Fv、Fab和(Fab′)2，以及双体、线性抗体、多价体或多特异性杂合抗 体(如上面描述的以及在Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105 (1987)中详述的)，以及单链(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等，Science，242， 423-426(1988)，将其在此通过引入作为参考)。(通常参见，Hood 等，“Immunology”，Benjamin，N.Y.，2nd ed.(1984)，以及 Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，将其在此通过 引入作为参考)。
如在此使用的，术语“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv” 指这样的抗体片段：其含有来自重链和轻链两者的可变区，但缺少恒 定区，但位于单个多肽链内。通常，单链抗体另外含有在VH和VL结 构域之间的多肽连接物，其使得它能形成将会供抗原结合用的期望结 构。单链抗体由Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore eds.Springer-Verlag， New York，pp.269-315(1994)中详细论述；还可参见国际专利申请 案出版号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203，将它 们的公开内容为任何目的通过引入作为参考。在特定的实施方案中， 单链抗体也可以是双特异性的和/或人源化的。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区组成。Fab分 子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链，该重链在CH1和CH2结构 域之间具有多个恒定区的，这样可在两条重链之间形成链间二硫键而 形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，重链在CH1和CH2结 构域之间具有一部分恒定区，这样链间二硫键在两条重链之间形成。
通过不精确的分析法(例如，凝胶电泳)测定的聚合物的分子量 和长度应该理解为是近似值。当这种值表示为“大约”X或“近似”X 时，所述的X值将理解为将会精确到±10％。
在此引用的所有参考文献在这里通过全文引入作为参考。
本发明部分是基于抗体用作IL-31的拮抗剂，从而普遍地抑制炎 症，以及皮炎症状和搔痒疾病的发现。如在此进一步描述的，本发明 提供了单克隆抗体的用途，用来抑制、减少、防止或使皮炎和搔痒疾 病的影响最小化。在一个实施方案中，皮炎是特应性皮炎。在另一个 实施方案中，皮炎是结节性痒疹。在另一实施方案中，皮炎是湿疹。 IL-31是一种新发现的T细胞细胞因子，其在小鼠中过度表达时导致 类似皮炎的症状。也参见，Dillon等，Nature Immunol.5：752-760， 2004。已经将皮肤归巢T细胞和表皮角质细胞牵连于人类皮肤疾病的 病理学中。在特应性皮炎(AD)患者和正常个体两者中，IL-31mRNA 和蛋白质的表达只限于皮肤归巢CLA+T细胞，同时通过免疫组织化 学(IHC)对IL-31的受体IL-31RA的分析显示，与正常个体比较，在 急性和慢性AD患者的皮肤活组织检查中，在皮肤角质细胞上有明显更 高水平的IL-31RA的表达。
L-31是先前已在公开的美国专利申请案中描述为Zcyto17rlig的 细胞因子的HUGO名称(参见，出版号20030224487，Sprecher，Cindy 等，2003，在此将其通过引入作为参考)。也参见，Dillon等，Nature Immunol.，同上。IL-31的异二聚体受体也在20030224487中描述为 zcytor17(HUGO名称，IL-31RA)，其与OncostatinM受体β(OSMR β)形成异二聚体。IL-31可从由根据CD3选择的活化的人外周血细 胞(hPBC)产生的cDNA文库分离。CD3是淋巴源细胞，尤其是T细胞 特有的一种细胞表面标记。人IL-31的多聚核苷酸和多肽序列分别在 SEQ ID NO：1和2中显示。鼠IL-31的多聚核苷酸和多肽序列分别在 SEQ ID NO：10和11中显示。如在此使用的，术语IL-31表示如在美 国专利出版号20030224487中使用的IL-31，如上文中显示。IL-31 的分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)至23(Ala)组成，而成熟的 多肽由氨基酸残基24(Ser)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2 中显示)。对来自293T细胞的纯化的IL-31的进一步N-端序列测定 分析显示，如在SEQ ID NO：2中显示的N-端位于残基27(Leu)，同 时成熟的多肽由氨基酸残基27(Leu)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2中显示)。
IL-31RA(IL-31受体)的多肽序列在SEQ ID NO：5中显示，而 OncostatinM受体β(OSMRβ)的多肽序列在SEQ ID NO：7中显示。
IL-31RA和OSMRβ受体属于I型细胞因子受体亚家族，该亚家族 包括，但不限于IL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、 GM-CSF和G-CSF的受体(关于综述，参见Cosman，“The Hematopoietin Receptor Superfamily”in Cytokine 5(2)：95-106， 1993)。IL-31RA亚基在公有的PCT专利申请案No.US01/20484(WIPO 出版号WO 02/00721)中得以充分描述。对IL-31RA亚基的mRNA的组 织分布分析显示了在激活的CD4+和CD8+T细胞亚类、CD 14+单核细 胞中的表达，以及在CD19+B细胞中较弱的表达。此外，mRNA存在于 休眠或活化的单核细胞系THP-1(ATCC No.TIB-202)、U937(ATCC No. CRL-1593.2)和HL60(ATCC No.CCL-240)中。
通过在此描述的IL-31拮抗剂抑制、中和、阻断信号转导可通过 本领域技术人员已知的大量测定法测量。例如，测量增生减少的测定 法包括用于染料例如AlamarBlueTM(AccuMed International公司， Westlake，Ohio)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯溴化四唑 (Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)、3，(4，5二甲基 噻唑-2基)-5-3-羧基甲氧基苯基-2H-四唑、2，3-双(2-甲氧基-4-硝 基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑氢氧化物(tetrazolium hydroxide)，以及氰基联甲苯(cyanoditolyl)-氯化四唑(其可从 Polysciences公司，Warrington，PA商业获得)减少的测定法；有丝 分裂发生测定法(mitogenesis assays)，例如对3H-胸苷的整合的测 量；使用例如萘黑或锥虫蓝的染料排除测定法；使用二乙酰基荧光素 的染料吸收法；以及铬释放法。通常，参见Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，3rd ed.，Wiley-Liss， 1994，将其在此通过引入作为参考。除了上述的，对于表达IL-31RA 和全长OSMRβ的BaF3细胞的实例，参见公开的美国专利出版号 20030224487(Sprecher，Cindy等，2003)。
通常，预测细胞因子具有四-α螺旋结构，螺旋A、C和D在配体- 受体相互作用中最为重要，并且在家族成员之间是更高度保守的。参 考SEQ ID NO：2中显示的人IL-31氨基酸序列，比对IL-31、人IL-3 和人细胞因子氨基酸序列，可预测IL-31螺旋A由氨基酸残基38-52 确定；螺旋B由氨基酸残基83-98确定；螺旋C由氨基酸残基104-117 确定；而螺旋D由氨基酸残基137-152确定；如在SEQ ID NO：2中显 示的。结构分析显示A/B环长，B/C环短，而C/D环长。这种环结构 导致上-上-下-下的螺旋结构。基于这4-螺旋束结构，IL-31中保守的 半胱氨酸残基对应在这里描述的SEQ ID NO：2的氨基酸残基72、133 和147，以及SEQ ID NQ：11的氨基酸残基74、137和151。一致的半 胱氨酸位置是对四-螺旋-束结构的进一步确认。在IL-31中也高度保 守的是如在SEQ ID NO：2中残基43处显示的Glu残基。IL-31的这些 螺旋可能是通过在此描述的抗体进行抑制、减少或中和，来阻断IL-31 通过其同源受体进行信号传递的作用的特异性靶标。
基于人和鼠IL-31的序列比较，发现保守残基在预测编码α螺旋 C和D的区域内。编码在此描述的人IL-31多肽区、结构域、基序、 残基和序列的相应多聚核苷酸如在SEQ ID NO：1中显示。IL-31的这 些螺旋可能是通过在此描述的抗体进行抑制、减少或中和，来阻断 IL-31通过其同源受体进行信号传递的作用的特异性靶标。
人和鼠IL-31之间螺旋D是相对保守的，而螺旋C是最保守的。 虽然这两种物种在该区域都具有占优势的酸性氨基酸，但差异可导致 IL-31和它的受体IL-31RA(包括单体、异二聚或多聚体受体)之间的 相互作用的种特异性。IL-31的环A/B和螺旋B在边界上是保守的， 并且在物种之间，螺旋C通过环C/D到螺旋D是最保守的；在该区域 中的保守性暗示了它在功能上是重要的。人和鼠IL-31的D螺旋也是 保守的。IL-31RA受体拮抗剂可通过在IL-31螺旋D中的突变来设计。 这些突变可包括从残基Thr156(SEQ ID NO：2)截短蛋白质，或者保 留使得配体结合受体，但减少信号传递活性的残基。
用于制备编码在此描述的抗体的多聚核苷酸(包括DNA和RNA) 的方法是本领域熟知的。可采用异硫氰酸胍提取，之后通过在CsCl 梯度中离心分离来制备总RNA(Chirgwin等，Biochemistry 18：52-94， 1979)。可采用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-12，1972)，从总RNA制备聚(A)+RNA。互补DNA(cDNA)用 已知的方法从聚(A)+RNA制备。备选地，可分离基因组DNA。随后，通 过例如杂交或PCR来鉴定和分离编码IL-31抗体的多聚核苷酸。
鼠IL-31的直系同源物的多聚核苷酸序列已得以确定并在SEQ ID NO：3中显示。鼠IL-31的成熟序列经推断开始于Met1，如SEQ ID NO：4 中显示的，其对应人序列中的Met1，如在SEQ ID NO：2中显示的。组 织分析显示，在睾丸、脑、CD90+细胞、前列腺细胞、唾液腺和皮肤中 发现了鼠IL-31的表达。对来自293T细胞的纯化的IL-31的进一步 N-端序列测定分析显示，如在SEQ ID NO：4中显示的，N-端位于残基 31(Ala)，同时成熟的多肽由氨基酸残基31(Ala)至163(Cys)组 成(如在SEQ ID NO：4中显示)。
可以产生如SEQ ID NO：2中显示的IL-31蛋白质序列的 Hopp/Woods亲水性图(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3828， 1981、Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986和Triquier等，Protein Engineering 11：153-169，1998)。该图是基于6-残基窗口。忽略了 埋藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基。例如，在人IL-31 中，亲水性区域包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基54-59、SEQ ID NO：2 的氨基酸残基129-134、SEQ ID NO：2的氨基酸残基53-58、SEQ ID NO：2 的氨基酸残基35-40和SEQ ID NO：2的氨基酸残基33-38。例如，在 鼠IL-31中，亲水性区域包含SEQ ID NO：11的氨基酸残基34-39、SEQ ID NO：11的氨基酸残基46-51、SEQ ID NO：11的氨基酸残基131-163、 SEQ ID NO：11的氨基酸残基158-163和SEQ ID NO：11的氨基酸残基 157-162。
本领域的那些技术人员将会理解，当设计IL-31多肽的氨基酸序 列中的修饰时，将会考虑亲水性或疏水性，以便不会破坏整个结构和 生物学性质。置换的特定目标是选自Val、Leu和Ile，或者Met、Gly、 Ser、Ala、Tyr和Trp的疏水性残基。例如，容许取代的残基可包括 Val、Leu和Ile，或者Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp残基，如SEQ ID NO：2中显示。在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：11中位置的保守的半 胱氨酸残基将相对不容许置换。
本发明还包括结合IL-31多肽的功能片段和编码这种功能片段的 核苷酸分子的抗体。如在此定义的，“功能性”IL-31或其片段表征 为它的增殖或分化活性、它诱导或抑制特定的细胞功能的能力，或者 它特异性结合至抗-IL-31抗体或IL-31RA或抗体或这些受体的 IL-31RA/OSMRβ异二聚体(可溶的或固定的)的能力。如先前在这里 描述的，IL-31表征为含有螺旋A(氨基酸残基38-52)、螺旋B(氨 基酸残基83-98)、螺旋C(氨基酸残基104-117)和螺旋D(氨基酸 残基137-152)的四-螺旋-束结构，如SEQ ID NO：2中显示的。因此， 本发明进一步提供了融合蛋白，所述的融合蛋白包含：(a)含有一个 或多个如上描述的螺旋的多肽分子；和(b)含有一个或多个这些螺旋 的功能性片段。该融合蛋白的其它多肽部分可由另外的四-螺旋-束细 胞因子，例如IL-15、IL-2、IL-4和GMCSF，或者由促使该融合蛋白 分泌的非天然和/或不相关的分泌信号肽提供。
本发明还提供了结合至多肽片段或肽的抗体，所述的多肽片段或 肽含有在此描述的IL-31多肽的带有表位的部分。这种片段或肽可含 有“免疫原性表位”，其为当整个蛋白质用作免疫源时，引起抗体应 答的蛋白质的一部分。带有免疫原性表位的肽可用标准的方法鉴定(参 见，例如Geysen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 81.：3998(1983))。 抗体结合这些功能性片段导致抑制、阻断、中和和/或减少了IL-31 在其同源受体上的信号转导。
比较而言，多肽片段或肽可含有“抗原表位”，其为抗体可特异 性与其结合的蛋白质分子的区域。某些表位由线性或连续的一段氨基 酸组成，并且这种表位的抗原性不会受变性剂破坏。本领域已经知道， 能模拟蛋白质表位的相对短的合成肽可用于刺激产生对抗该蛋白质的 抗体(参见，例如Sutcliffe等，Science 219：660(1983))。因此， 本发明的带有抗原表位的肽和多肽可用于产生与在此描述的多肽结合 的抗体(例如，中和抗体)。Hopp/Woods亲水性图可用于确定具有最 大抗原潜力的区域(Hopp等，1981，同时以及Hopp，1986，同上)。 例如，在人IL-31中，亲水性区域包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基 54-59、SEQ ID NO：2的氨基酸残基129-134、SEQ ID NO：2的氨基酸 残基53-58、SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-40，以及SEQ ID NO：2的 氨基酸残基33-38。例如，在鼠IL-31中，亲水性区域包括SEQ ID NO：11 的氨基酸残基34-39、SEQ ID NO：11的氨基酸残基46-51、SEQ ID NO：11 的氨基酸残基131-136、SEQ ID NO：11的氨基酸残基158-163，以及 SEQ ID NO：11的氨基酸残基157-162。
带有抗原表位的肽和多肽优选含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4 的至少4至10个氨基酸，至少10至14个氨基酸，或者约14至约30 个氨基酸。这种带有表位的肽和多肽可由IL-31多肽的片段，或通过 化学肽合成产生，如在此描述的。此外，表位可通过随机肽文库的噬 菌体展示选择(参见，例如Lane和Stephen，Curr.Opin.Immunol. 5：268(1993)；以及Cortese等，Curr.Opin.Biotechnol.7：616 (1996))。用于鉴定表位和从含有表位的小肽获得抗体的标准方法例 如，由Mole，“Epitope Mapping，”in Methods in Molecular Biology， Vol.10，Manson(ed.)，pages 105-116(The Humana Press公司， 1992)、Price，“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，”in Monoclonal Antibodies： Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter和 Ladyman(eds.)，pages 60-84(Cambridge University Press 1995)， 以及Coligan等(eds.)，Current Protocols in Immunology，pages 9.3.1-9.3.5和pages 9.4.1-9.4.11(John Wiley&Sons 1997) 描述。
如在此描述的抗体的活性可采用多种测量增殖和/或与表达 IL-31RA受体的细胞结合的测定法，通过它们抑制或减少增殖的能力 来测量。特别重要的是IL-31-依赖性细胞的改变。工程化为IL-31- 依赖性的合适的细胞系包括IL-3-依赖性BaF3细胞系(Palacios和 Steinmetz，Cell 41：727-734，1985、Mathey-Prevot等，Mol.Cell. Biol.6：4133-4135，1986)、FDC-P1(Hapel等，Blood 64：786-790， 1984)和MO7e(Kiss等，Leukemia 7：235-240，1993)。生长因子 -依赖性细胞系可根据公开的方法建立(例如，Greenberger等， Leukemia Res.8：363-375，1984；Dexter等，Baum等编辑， Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp. Hematol.1979，145-156，1980)。
在此描述的抗-IL-31抗体的活性可通过基于硅的生物感受器微 生理测量仪测量，该仪器可测量与受体结合以及随后的生理细胞反应 相关的细胞外酸化率(acidification rate)或质子分泌(proton excretion)。一种示例性装置是由Molecular Devices，Sunnyvale， CA生产的CytosensorTM微生理测量仪测量。多种细胞反应，例如细胞 增殖、离子转移、能量生产、炎症应答、调节和受体激活等都可通过 本方法测量。参见，例如McConnell，H.M.等，Science 257：1906-1912， 1992；Pitchford，S.等，Meth.Enzymol.228：84-108，1997； Arimilli，S.等，J Immunol.Meth.212：49-59，1998；Van Liefde， I.等，Eur.J.Pharmacol.346：87-95，1998。
拮抗剂还可用作用于鉴定配体-受体相互作用位点的研究试剂。拮 抗剂可用于抑制参与调控红细胞生成的细胞的扩增、增殖、激活和/ 或分化。IL-31活性的抑制剂(IL-31拮抗剂)包括抗-IL-31抗体和 可溶性IL-31受体，以及其它肽和非肽制剂(包括核酶)。
抑制IL-31的活性可通过多种测定法测量。除了在此公开的那些 测定法，可在多种设计用来测量受体结合、IL-31-依赖性细胞反应的 刺激/抑制或IL-31RA受体-表达细胞的增殖的测定法中，检测样品对 IL-31活性的抑制。
IL-31-结合多肽也可用于配体的纯化。将该多肽固定在在使用条 件下稳定的固体载体，例如琼脂糖小球、交联琼脂糖、玻璃、纤维素 树脂、基于硅的树脂(silica-based resins)、聚苯乙烯、交联聚丙 烯酰胺或类似的材料上。用于将多肽连接至固体载体的方法是本领域 已知的，并包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧 化物活化、巯基活化和酰肼活化。通常将会使得到的介质成形为柱的 形式，并且让含有配体的流体通过该柱一次或多次以使得配体结合至 受体多肽。随后，改变盐浓度、促溶剂(盐酸胍)或pH，用以破坏配 体-受体结合来洗脱出配体。
可有利地采用利用配体-结合受体(或抗体，补体/抗补体对的一 个成员)或其结合片段的检测系统，以及可商业获得的生物感受器装 置(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。将这种受 体、抗体、补体/抗补体对的成员或片段固定在受体芯片表面上。该装 置的使用由Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-40，1991以 及Cunningham和Wells，J.Mol.Biol.234：554-63，1993公开。 使用胺或巯基化学，将受体、抗体、成员或片段共价连接至葡聚糖纤 维上，葡聚糖纤维连接流式细胞仪(flow cell)中的金膜。让试验样 品通过该仪器。如果样品中存在配体、表位或补体/抗补体对的相对的 成员，则它会分别结合上述固定的受体、抗体或组成成分，导致介质 的屈光率改变，其可检测为金膜的质子表面共振的改变。该系统能够 测定结合速率和解离速率，可从中计算出结合亲合力，并评估结合的 化学定量关系。备选地，配体/受体结合可用SELDI(TM)技术 (Ciphergen公司，Palo Alto，CA)分析。
IL-31抗体可用于阻断致炎性IL-31的生物作用，并可用作如在 此描述的多种疾病的抗-炎性剂。本领域的技术人员将会理解，抗 原性的、带有表位的多肽含有至少6个，优选至少9个，并且更优选 至少15至约30个IL-31多肽(例如SEQ ID NO：2)的连续氨基酸残 基。含有更大部分的IL-31多肽，即从30至100个残基直至全长的氨 基酸序列的多肽也包括在内。抗原或免疫原性表位还可包括连接的标 记、佐剂、赋形物和载体，如在此描述的。合适的抗原包括由SEQ ID NO：2的氨基酸号24至氨基酸号164，或者其连续的9-141个氨基酸片 段编码的IL-31多肽。其它合适的抗原包括，全长和成熟的IL-31、 如在此描述的IL-31四-螺旋-束结构的螺旋A-D，以及单独的或多个 螺旋A、B、C和D。优选用作抗原的肽是亲水性肽，例如本领域技术 人员从如在此描述的疏水性图预测的那些亲水性肽，如SEQ ID NO：2 的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162，以 及SEQ ID NO：11的氨基酸残基34-39、46-51、131-136、158-163 和157-162。此外，将例如采用DNASTAR Protean程序(DNASTAR公 司，Madison，WI)，通过Jameson-Wolf图预测的IL-31抗原表位用 作优选的抗原，并且很容易由本领域的技术人员确定。
来自通过用这些抗原接种动物而产生的免疫应答的抗体可如在此 描述地进行分离和纯化。用于制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法 是本领域熟知的。参见，例如Current Protocols in Immunology， Cooligan等，(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，1989； 以及Hurrell，J.G.R.，Ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies： Techniques and Applications，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL， 1982。
对本领域一般技术人员显而易见的是，多克隆抗体可通过用 IL-31多肽或其片段给多种温血动物例如马、奶牛、山羊、绵羊、狗、 鸡、兔、小鼠和大鼠接种来产生。IL-31多肽的免疫原性可通过利用 佐剂，例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全佐剂或不完全佐剂来增强。 可用于免疫的多肽还包括融合多肽，例如IL-31或其部分与免疫球蛋 白多肽或者与麦芽糖-结合蛋白的融合。多肽免疫源可以是全长的分子 或其部分。如果多肽部分是“类半抗原”，则可将该部分有利地结合 或连接至大分子载体(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA) 或破伤风毒素)来用于免疫。
如果：1)抗体显示出阈水平的结合活性，和2)它们不会与相关 的多肽分子显著交联，则这些抗体认为是特异性结合。如果这里的抗 -IL-31抗体以比与对照(非-IL-31)多肽的亲合力大至少10倍的亲 合力结合IL-31多肽、肽或表位，则测定了结合的阀水平。优选的是， 抗体显示出106M-1或更大的亲合力(Ka)，优选107M-1或更大，更优 选108M-1或更大，并且最优选109M-1或更大。抗体的亲合力可例如通 过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672， 1949)，由本领域的一般技术人员容易地测定。
例如通过检测IL-31多肽而不是已知的相关多肽的抗体，用标准 的蛋白印迹分析(Ausubel等，ibid.)来显示抗-IL-31抗体是否不会 与相关的多肽分子显著交联。已知的相关多肽的实例是在当前领域中 公开的那些，例如已知的直系同源物，和paralog，以及蛋白质家族 中类似的已知成员。筛选也可采用非人IL-31和IL-31突变型多肽完 成。此外，抗体可“相对已知的相关多肽来筛选”，以分离出特异性 结合IL-31多肽的体。例如，让产生来对抗IL-31的抗体吸附至粘 附在不溶解基质上的相关多肽；对IL-31特异性的抗体将会在适当的 缓冲条件下流过基质。筛选使得能分离不与已知的密切相关多肽发生 交叉反应的多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual， Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988； Current Protocols in Immunology，Cooligan，等(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特 异性抗体的筛选和分离是本领域熟知的。参见，Fundamental Immunology，Paul(eds.)，Raven Press，1993；Getzoff等，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(eds.)，Academic Press Ltd.，1996； Benjamin等，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984。特异性结合的 抗-IL-31抗体可通过本领域中，以及在下文中公开的许多方法检测。
单克隆抗体可例如通过用纯化的成熟重组人IL-31多肽(SEQ I NO：2的氨基酸残基27(Leu)至167(Thr))，或这里列出的表达系 统产生的鼠直系同源物，来免疫斯普拉-道来氏大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)而制备。将每只大鼠给予初次的腹 膜内(IP)注射，注射弗氏完全佐剂(Pierce，Rockford，IL)中的 100μg纯化的人重组IL-31蛋白质，之后每两周加强IP注射弗氏不 完全佐剂中的50μg纯化的重组蛋白质。在实施第三次加强注射后7 至10天，将动物放血并收集血清。
通过ELISA鉴定人IL-31-特异性大鼠血清样品中靶向生物素化的 人IL-31的特异性抗体的滴定度。
从2只高滴度的大鼠中采集脾细胞和淋巴节细胞，并将其用PEG 1500，在两个独立的融合步骤中融合至SP2/0(鼠)骨髓瘤细胞(脾 细胞对骨髓瘤细胞为4∶1的融合比率，“Antibodies A Laboratory Manual，E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor Press)。在融 合后生长10天后，通过ELISA鉴定产生特异性抗体的杂交瘤。进一 步分析在两种ELISA方法中都为阳性的杂交瘤，分析它们阻断或减 少纯化的重组IL-31的受体结合活性的能力(“中和测定”)。
将只通过ELISA或者通过ELISA和“中和测定”产生阳性结果的 杂交瘤体通过有限稀释来克隆至少两次。
对从组织培养基中纯化的单克隆抗体进行鉴定，鉴定它们在 ELISA中定量测定重组和天然人IL-31的效用。选择抗体并进行定量 分析。
对从组织培养基中纯化的单克隆抗体进行鉴定，鉴定它们阻断或 减少BaF3/MPL-IL-31细胞上的纯化的重组huIL-31的受体结合活性 (“中和测定”)的能力。以这种方式确定了大量“中和性”单克隆 抗体。然后，可将所描述的表达人IL-31的中和性单克隆抗体的杂交 瘤作为原始的保藏物在布达佩斯条约下，交托给美国典型培养物保藏 中心(ATCC；Manassas VA)专利保藏。
单克隆抗体可通过用经裂解和纯化的IL-31重组融合蛋白免疫路 易鼠(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA)而制备。 对每只大鼠给予初次腹膜内(IP)注射，注射弗氏完全佐剂(Pierce， Rockford，IL)中的100μg纯化的重组融合蛋白，之后每两周加强 IP注射弗氏不完全佐剂中的50μg纯化的重组蛋白质，进行四周。 在最初的四周免疫后，每两周实施加强IP注射弗氏不完全佐剂中的 50μg经裂解纯化的重组蛋白质，实施四周，所述的重组蛋白质偶联 至载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH，Pierce，Rockford，IL)。在实施第 四次加强注射后7至10天，将动物放血并收集血清。采用500ng/ml 纯化的重组融合蛋白IL-31-Fc作为特异性抗体靶标，并将不相关的融 合蛋白用作非-特异性抗体靶标，通过ELISA来鉴定IL-31-特异性的 大鼠血清样品。从一只或多只高滴度的大鼠中采集脾细胞，并在优化 的PEG-介导的融合方法(Rockland Immunochemicals)中将其融合至 SP2/0(鼠)骨髓瘤细胞。在融合后生长12天后，采用500ng/ml每 种纯化的IL-31重组融合蛋白作为特异性抗体靶标，并将不相关的融 合蛋白用作非-特异性抗体靶标，通过ELISA来鉴定产生特异性抗体的 杂交瘤体。对只对特异性抗体靶标呈阳性的杂交瘤进行进一步分 析，分析它们阻断或减少BaF3/MPL-IL-31细胞上的重组huIL-31的受 体结合活性的能力(“中和测定”)，以及通过FACS分析结合抗体靶 标的能力。将在ELISA测定中产生特异性阳性结果，以及在FACS或“中 和测定”中产生阳性结果的杂交瘤通过有限稀释来克隆至少两次。
以类似的方式产生五只大鼠的抗-小鼠杂交瘤，并分别给定下列克 隆名称：克隆271.9.4.2.6、克隆271.26.6.6.1、克隆271.33.1.2.2、 克隆271.33.3.2.1和克隆271.39.4.6.5。见实施例1。由这些克隆产 生的单克隆抗体可通过多种方式鉴定，所述的方式包括分类法 (binning)(即测定是否每种抗体能抑制任何其它结合物的结合)、 相对亲合力，以及中和作用。单克隆抗体显示属于两种独立的表位类 (bin)，克隆271.33.3.2.1结合至与一个独立的表位，而其它四种 结合至另一表位。这四种单克隆抗体的相对亲合力在实施例14中描 述。
可以产生单克隆抗体的结合亲合力。将山羊-抗-大鼠IgG-Fcγ特 异性抗体(Jackson)固定在CM5 Biacore芯片上。优化该测定法以 使每个mAb结合至抗-大鼠捕获表面上，并随后将一浓度系列的IL-31 注射通过mAb来观察结合常数(Ka)和解离常数(Kd)。在每次运行 后，通过2次注射20mM HCl来使表面再生为抗-大鼠抗体。产生了每 种抗体的数据，并采用评估软件(BIAevaluation software version 3.2，Pharmacia BlAcore，Uppsala，Sweden)来评估抗-IL-31抗体 结合IL-31蛋白质的动力学。
鼠的抗-人IL-31mAb可如下产生。将6至12周大的敲除了IL-31 基因的小鼠以每两周一次方案，通过腹膜内注射25-50ug与Ribi佐 剂(Sigma)以1∶1(V∶V)混合的可溶性人IL-31-muFc蛋白质来免 疫。在第三次免疫后7至10天，通过眶后放血来获取血液样品，采集 血清并评估其在中和测定法(例如，在这里所描述的)中抑制IL-31 结合的能力，以及在FACS染测定法中使IL-31转染的293细胞染 (相对于未转染的293细胞)的能力。按如上描述的继续免疫小鼠并 提取和评估血液样品直到中和滴定度达到稳定水平。在这时，对具有 最高中和滴定度的小鼠血管内注射25-50ug PBS中的可溶性IL-31-Fc 蛋白质。3天后，采集这些小鼠的脾和淋巴结，并采用本领域已知的 标准方法，用本领域中的小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细 胞或其它合适的细胞系，来将它们用于杂交瘤的产生(例如，参见 Kearney，J.F.等，J Immunol.123：1548-50，1979；和Lane，R.D.J Immunol Methods 81：223-8，1985)。
可在融合8-10天后，采用HRP缀合的山羊抗-小鼠κ和抗-λ轻链 的第二步骤制剂，通过ELISA，根据它们结合IL-31-muFc蛋白质的能 力来对杂交瘤上清液进行初次筛选，以鉴定结合的小鼠抗体。
生物化学确认推定的抗-IL-31mAb识别的靶分子(IL-31)的确 是IL-31可通过标准的免疫沉淀，之后通过SDS-PAGE分析或蛋白质印 法来完成，这两种方法都采用来自IL-31转染的对未经转染的Baf3 细胞的可溶性膜制剂。对mAb进行检测，检测它们特异性免疫沉淀或 蛋白质印迹可溶性IL-31-muFc蛋白质的能力。
对从组织培养基中纯化的单克隆抗体进行鉴定，鉴定它们在中和 测定法中阻断或抑制IL-31结合其受体的能力。以这种方式确定了20 种“中和性”单克隆抗体。在第一轮克隆后已确定这20种的10种为 “好的中和剂”：克隆292.72.3、克隆292.118.6、克隆292.63.5、 克隆292.64.6、克隆292.84.1、克隆292.109.4、克隆292.12.3、 克隆292.51.5、克隆292.39.5和克隆292.105.4。在第一轮克隆后， 其它的10种具有下列克隆名称：克隆294.35.2、克隆294.146.5、克 隆292.152.4、克隆292.154.4、克隆294.154.5、克隆294.35.3、 克隆291.78.4、克隆294.155.6、克隆294.158.5、克隆294.163.2 和克隆294.144.3。
将特异性的单克隆抗体通过第二轮克隆，并且再次鉴定它们在中 和测定法中阻断或抑制IL-31结合其受体的能力。在第二轮克隆后， “好的中和剂”的克隆名称是：克隆292.12.3.1、克隆292.63.5.3、 克隆292.72.3.1、克隆292.84.1.6、克隆292.118.6.4、克隆 292.64.6.5.5、克隆292.39.5.3、克隆292.51.5.2、克隆292.109.4.4 和克隆292.105.4.1。其它10种中的6种具有下列克隆名称：克隆 292.152.4.1、克隆294.158.5.2、克隆294.32.2.6.3、克隆 294.144.3.5、克隆294.154.5.3和克隆294.163.2.1。
在布达佩斯条约下，将上述表达人IL-31的中和性单克隆抗体的 杂交瘤作为原始存放物交托给美国典型培养物保藏中心(ATCC； Manassas VA)patent depository，并且给予下列ATCC登记号：克 隆292.12.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6815)、克隆292.72.3.1 (ATCC专利保藏名称PTA-6816)、克隆292.63.5.3(ATCC专利保 藏名称PTA-6829)、克隆292.118.6.4(ATCC专利保藏名称 PTA-6830)、克隆294.163.2.1(ATCC专利保藏名称PTA-6831)、 克隆292.84.1.6(ATCC专利保藏名称PTA-6871)、克隆294.35.2.6.3 (ATCC专利保藏名称PTA-6872)、克隆294.154.5.6(ATCC专利 保藏名称PTA-6875)和克隆294.144.3.5(ATCC专利保藏名称 PTA-6873)。
在布达佩斯条约下，将在此描述的表达小鼠IL-31的中和单克隆 抗体的一种杂交瘤作为原始存放物交托给美国典型培养物保藏中心 (ATCC；Manassas VA)patent depository，并给予下列ATCC登记号： 克隆271.26.6.6.1(ATCC专利保藏名称PTA-6874)。
由这些杂交瘤克隆产生的单克隆抗体可在含有2mM L-谷氨酰胺、 100g/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素，以及10％Fetal Clone I Serum(Hyclone Laboratories)的90％Iscove’s Modified Dulbecco’s培养基的生长培养基中培养。可通过在37℃和5-6％的 CO下，以2×105个细胞/ml起始培养并维持在1×105和5×105个细胞 /ml之间来使克隆增殖。可在随后的转移后让细胞适应无血清条件。 将冷冻的细胞存储于90％的血清、10％的DMSO中并存储于液氮冷藏 箱内的气相中。
对组织培养基中的单克隆抗体进行鉴定，鉴定它们在有纯化的重 组蛋白人IL-31的情况下生长时，阻断、抑制、防止或减少受体结合 的能力。例如，由这些克隆产生的单克隆抗体可通过多种方式鉴定， 所述的方法包括分类法(即测定是否每种抗体能抑制任何其它结合物 的结合)、相对亲合力，以及中和作用。10种好的中和抗体显示处于 相同的表位类中，其它单克隆抗体则归为三个不同的表位类。另外， 所述好的中和抗体中的8种是IgG1同种型，而其它两种是IgG2a同种 型。
用山羊抗鼠Fc pAb捕获来自杂交瘤上清液的单克隆抗体，并测量 生物素化的IL-31的表观结合亲合力(EC50)。在这些测定条件下， 好的中和剂具有最低且相当的EC50值～4ng/mL Bt-IL31。弱的中和剂 的表观亲合力的范围是～10ng/mL至236ng/mL Bt-IL31。
可通过多种方法来检测通过在此描述的方法产生的单克隆抗体的 中和作用。例如，可采用如在公开的美国专利申请(参见出版号 20030224487，Sprecher，Cindy等，2003)中描述的荧光素酶测定法。 另外，中和作用可通过测量在存在配体和单克隆抗体时，角质细胞培 养物中致炎趋化因子例如TARC和MDC的产生的减少来检测。中和作用 还可通过在此描述的体内模型测量。
在一个实施方案中，本发明的抗体是本发明的人抗原-结合抗体片 段，并且包括但不限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、 单链抗体、二硫键-连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH结构域的片段。 抗原-结合抗体片段(包括单链抗体)可以只含有可变区，或者含有可 变区与全部或部分以下区域：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的组合。 还包含于本发明内的是也含有可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域 的任意组合的抗原-结合片段。
在另一实施方案中，本发明的抗体可以是单一特异性的、双特异 性的、三特异性的或有更多的多特异性。多特异性抗体可以是对本发 明多肽的不同表位有特异性，或者可以是对本发明多肽以及异源表位， 例如异源多肽或固体载体物质两者都有特异性。参见，例如PCT出版 物WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793、Tutt 等，J.Immunol.147：60-69(1991)、美国专利号4,474,893、 4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819、Kostelny等，J. Immunol.148：1547-1553(1992)。
本发明还包括功能上等价于上述抗体的经遗传改变的抗体。优选 提供增强的稳定性和/或效果的经修饰的抗体。经修饰的抗体的实 例包括，具有氨基酸残基的保守置换，以及一个或多个不会显著有害 改变抗原结合效用的氨基酸的缺失或添加的那些抗体。置换可从改变 或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计一个区域，只要效 果得以维持。可翻译后修饰(例如，乙酰化和磷酸化)或合成修饰(例 如，连接标记基团)本发明的抗体。
遗传改变的抗体还包括源于抗IL-31抗体的嵌合抗体。嵌合抗体 含有源自小鼠或大鼠的可变区以及源自人的恒定区，这样在施用给人 受试者时，该嵌合抗体具有更长的半衰期并且是较低免疫原性的。制 备嵌合抗体的方法是本领域已知的。可将这些抗体的可变区与人IgG 的恒定区连接，以形成期望的嵌合抗体。
本发明中使用的遗传改变的抗-IL-31抗体包括在此描述的人源 化形式的抗体。人源化抗体含有小鼠供体免疫球蛋白的CDR以及人受 体免疫球蛋白的重链和轻链框架区。制备人源化抗体的方法公开于美 国专利号5301101、5585089、5693762和6180370中(将它们每一篇 通过全文引入作为参考)。然后，可将这些抗体的CDR移植到任意选 择的人框架区内，这是本领域已知的，以便产生期望的人源化抗体。
本发明的抗体可用它们识别或特异性结合的本发明的表位或多肽 部分来描述和说明。表位或多肽部分可以如在此描述的，例如通过N- 端和C-端位置，通过连续氨基酸残基的大小，或在表和图中列出的来 说明。特异性结合本发明的任意表位或多肽的抗体也可排除在外。因 此，本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，并允许排除特异性结 合本发明多肽的抗体。
本发明还提供了竞争性抑制单克隆抗体结合至本发明的多肽，优 选SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽的抗体。竞争性抑制可通过本 领域的任何已知方法测定，例如，采用在此描述的竞争性结合测定法。 在优选的实施方案中，所述的抗体至少90％、至少80％、至少70％、 至60％或至少50％地竞争性抑制本发明的单克隆抗体结合至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽。
本发明还提供了竞争性抑制抗体结合至本发明的表位的抗体，如 通过本领域中用于测定竞争性结合的任意已知方法，例如在此描述的 免疫测定法测定。在优选的实施方案中，该抗体至少90％、至少80％、 至少70％、至60％或至少50％地竞争性抑制了与表位的结合。
本发明的抗体包括经修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共 价连接至抗体来修饰而使得该共价连接不会防止抗体产生抗-个体基 因型应答。例如，但不作为限制，抗体衍生物包括已例如通过糖基化、 乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/阻断 基团的衍生、溶蛋白性裂解、连接至细胞配体或其它蛋白质等修饰的 抗体。众多化学修饰的任意一种可通过已知的技术完成，包括，但不 限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外， 衍生物可含有一种或多种非-典型的氨基酸。
本发明抗体也包括在哺乳动物，优选人中具有长于15天，优选长 于20天、长于25天、长于30天、长于35天、长于40天、长于45 天、长于2个月、长于3个月、长于4个月或长于5个月的半衰期(例 如，血清半衰期)的抗体或其片段。在哺乳动物，优选人中，本发明 的抗体或其片段增加的半衰期导致哺乳动物中所述抗体或抗体片段的 血清滴定度更高，并从而减少了所述抗体或抗体片段的施用频率和/ 或降低了要施用的上述抗体或抗体片段的浓度。
具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可通过本领域中那些技术 人员已知的技术产生。例如，具有增加的体内半衰期的抗体或其片段 可通过修饰(例如，取代、删除或添加)已确定为参与Fc结构域和 FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基来产生(参见，例如国际出版 物号WO 97/34631和WO 02/060919，将其在此通过全文引入作为参考)。 具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可通过将聚合物分子，例如高 分子量的聚乙二醇(PEG)连接至所述的抗体或抗体片段来产生。可以 用或不用多功能连接物，通过将PEG位点-专一性缀合至所述抗体或抗 体片段的N-或C-端，或者通过存在于赖氨酸残基上的ε-氨基基团， 将PEG连接至所述的抗体或抗体片段上。将会使用导致生物活性损失 最小化的线性或分支聚合物。缀合水平将会通过SDS-PAGE和质谱法密 切监控，以确保PEG分子适当地缀合至抗体。未反应的PEG可通过， 例如分子排阻谱或离子交换谱来与抗体-PEG缀合物分离。
应理解，通过本发明方法设计的人源化抗体可具有另外的保守氨 基酸置换，其基本上不会影响抗原结合或其它的免疫球蛋白功能。保 守置换意指组合例如gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln； ser，thr；lys，arg；以及phe，tyr。
用于使非-人抗体人源化的方法是本领域中所熟知的。通常，人源 化免疫球蛋白，包括人源化抗体，已通过基因工程构建。先前已描述 的大多数人源化免疫球蛋白(Jones等，如前述所引用的；Verhoeyen 等，如前述所引用的；Riechmann等，如前述所引用的)含有与特殊 的人免疫球蛋白链(受体)的框架区一致的框架区、以及来自非-人供 体免疫球蛋白链的三个CDR。特别地，人源化抗体是来自结合期望的 抗原的非-人种抗体的、具有来自非-人种的一个或多个互补性决定区 (CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。
本发明包括这样的标准，通过该标准，选择人源化免疫球蛋白链 的框架中的有限数量氨基酸，使其与供体而不是受体中那些位置处的 氨基酸相同，以便增加含有人源化免疫球蛋白链的抗体的亲合力。
本发明的抗体部分是基于这样的模式产生：在先前产生人源化抗 体(例如，用小鼠抗体作为CDR的来源)的方法中导致亲合力丧失的 两个起作用的原因是：
(1)当小鼠CDR与人框架结合时，靠近CDR的框架区中的氨基酸 变成是人的而不是小鼠的。尽管不愿受理论束缚，这些改变的氨基酸 可能使CDR稍微变形，因为它们产生了与供体小鼠抗体中不同的静电 力或疏水性力，并且变形的CDR可能不会与抗原产生与CDR在供体抗 体中进行的一样有效的接触；以及
(2)靠近CDR，但不是它的一部分(即，仍然是框架区的一部分) 的初始小鼠抗体中的氨基酸可与抗原进行有助于亲合性的接触。当抗 体进行人源化时丧失了这些氨基酸，因为所有的框架氨基酸都是人的。
为了避免这些问题，并且为了产生对期望的抗原具有非常强的亲 合力的人源化抗体，本发明采用了一条或多条下列原则用于设计人源 化免疫球蛋白。同样，所述标准可单独使用，或者当需要时组合使用， 来获得期望的亲合力或其它特性。
一条原则是，作为受体，采用来自与要进行人源化的供体免疫球 蛋白显著同源的特殊的人免疫球蛋白的框架区，或者采用来自许多人 抗体的共有框架区。例如，比较数据库(例如，National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource)中的小 鼠重链(或轻链)可变区与人重链(或轻链)可变区的序列显示，对 于不同的人区域，同源性程度变化很大，通常约40％至约60-70％。 通过选择与供体免疫球蛋白的重链(各自的轻链)可变区最同源的人 重链(各自的轻链)可变区作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋 白变成人源化免疫球蛋白中将会改变较少的氨基酸。因此，尽管再次 不愿受理论束缚，据信仅存在更小的可能性来改变CDR附近的氨基酸 而使它们的构象变形。此外，含有人源化免疫球蛋白链的人源化抗体 的精确的总体形状可更接近类似于供体抗体的形状，这也减少了使 CDR变形的可能性。
通常，将会选择代表性收集的至少约10至20种不同的人重链中 的，3-5个最同源的重链可变区序列之一来作为受体，以提供重链框 架，并且对轻链也类似操作。优选地，将会使用1-3个最同源的可变 区中的一种。所选择的受体免疫球蛋白链将最优选在框架区与供体免 疫球蛋白具有至少约65％的同源性。
在许多情形中，将来自相同人抗体的轻链和重链用作受体序列可 认为是优选的，以确保人源化的轻链和重链将会彼此发生有利的接触。 在该情况下，供体的轻链和重链将会只与来自其整个序列已知的人抗 体，例如Eu、Lay、Pom、Wol、Sie、Gal、Ou和WEA抗体的链进行比 较(Kabat等，如前述所引用的；有时候，人链的最后几个氨基酸是 未知的并且必须根据与其它人抗体的同源性来推断)。将会选择其中 轻链和重链可变区序列(一并考虑)整体与供体的轻链和重链可变区 序列最同源的人抗体。有时，将会更偏重于重链序列。所选择的人抗 体则将会提供轻链和重链受体序列。实际上，经常发现人Eu抗体会起 到该作用。
根据所谓的“最佳-匹配”方法，相对于已知的人可变-结构域序 列的整个库，筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后，把与啮齿 动物的序列最接近的人序列用作人源化抗体的人框架(FR)(Sims等， J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196： 901(1987))。另一种方法采用了一种特殊框架，该框架源自特殊轻 链或重链亚组的所有人抗体的共有序列。相同的框架可用于多种不同 的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285 (1992)；Presta等，J.Immnol.，151：2623(1993))。
不管怎样选择受体(acceptor)免疫球蛋白，更高的亲合力可通 过选择人源化免疫球蛋白链框架中的少量氨基酸，使其与供体而不是 受体中那些位置的氨基酸一样来实现。通常，人框架区中的框架残基 将会用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选提高抗原结 合。这些框架取代可通过本领域熟知的方法确定，例如通过模拟CDR 和框架残基的相互作用来确定对抗原结合重要的框架残基，并通过序 列比较来确定在特殊位置的特殊框架残基。(参见，例如Queen等， 美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，其 在此通过全文引入作为参考)。可采用多种本领于已知的技术来使抗 体人源化，例如CDR-嫁接(EP 239,400、PCT出版物WO 91/09967、 美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶嵌术(veneering) 或表面重建(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan， Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等， Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等，PNAS 91：969-973(1994))，以及链替换(美国专利号5565332)。因此， 这种“人源化”抗体是其中基本上少于完整的人可变结构域已由非- 人种的相应序列取代的嵌合抗体(美国专利号4816567)。
第二条原则是，下列类型确定了什么氨基酸可从供体选择。优选 地，在一种这些类型中的许多或所有氨基酸位置，实际上将会选择供 体氨基酸。
类型1：CDR中的氨基酸位置由Kabat等(如前述所引用的)确定。
类型2：如果人受体免疫球蛋白框架中的氨基酸是特殊的(即， “稀有的”，如在此使用的，其表示在典型的数据库中，在少于约20 ％，但通常少于约10％的人重链(各自的轻链)V区域序列中的该位置 存在的氨基酸)，并且如果在该位置的供体氨基酸对于人序列而言是 典型的(即“普通的”，如在此使用的，其表示在典型的数据库中， 在大于约25％，但通常大于约50％的序列中存在的氨基酸)，那么 可选择供体氨基酸而不是受体氨基酸。该标准有助于确保人框架中的 非典型氨基酸不会破坏抗体结构。此外，通过用来自供体抗体的，对 于人抗体是典型的氨基酸取代特殊的氨基酸，可以使人源化抗体具有 更低的免疫原性。将所有的人轻链和重链可变区序列分别分成彼此特 别同源并且在一些关键性位置具有相同的氨基酸的序列“亚组” (Kabat等，如前引用的)。当确定人受体序列中的氨基酸序列在人 序列中是是“稀有”还是“普通”时，通常将优选仅考虑在相同亚组 中的那些人序列作为受体序列。
类型3：在人源化免疫球蛋白链一级序列中直接与一个或多个3 CDR邻接的位置中，可选择供体氨基酸而不是受体氨基酸。如果从受 体中选择，这些氨基酸特别容易与CDR中的氨基酸相互作用，并且容 易使供体CDR变形并减小亲合力。而且，邻近的氨基酸可能直接与抗 原相互作用(Amit等，Science，233，747-753(1986)，将其在此通 过引入作为参考)，从供体选择这些氨基酸可能对于保留在原始抗体 中提供亲合力的所有抗原接触是理想的。
类型4：代表性的初始供体抗体的一个3维模型显示，在CDR外 的一些氨基酸接近CDR，并很有可能通过氢键、范德华力、疏水性相 互作用等与CDR内的氨基酸相互作用。在那些氨基酸位置处，可选择 供体免疫球蛋白氨基酸而不是受体免疫球蛋白氨基酸。根据本标准的 氨基酸将将在CDR中的一些原子约3埃单位内具有侧链原子，并且一 定含有可根据确定的化学力，例如上面列出的那些与CDR原子相互作 用的原子。
在可形成氢键的原子的情况下，3埃是在它们的原子核之间测量， 但是对于不形成键的原子，3埃是在它们的范德华表面之间测量。因 此，在后一种情况中，对于认为能够相互作用的原子，原子核必须在 约6埃(3+范德华半径)内。在许多情况下，原子核将相距4或5至 6埃。在确定氨基酸是否能与CDR相互作用中，优选不将重链CDR 2 的最后8个氨基酸考虑为CDR的一部分，因为从结构观点来看，这8 个氨基酸更表现为框架部分。
能够与CDR内的氨基酸相互作用，并因此其属于类型4的、框架 中的氨基酸可以另外的方式区分。每个框架氨基酸的溶剂可接近表面 积以以下两种方式计算：(1)在完整的抗体中，以及(2)在由已去 除其CDR的抗体组成的假定分子中。约10平方埃或更大的这些数值间 的显著差异显示，溶剂可接近的框架氨基酸至少部分受CDR阻挡，并 因此显示，该氨基酸与CDR接触。氨基酸的溶剂可接近表面积可基于 抗体的3维模型，用本领域已知的算法计算(例如，Connolly，J.Appl. Cryst.16，548(1983)以及Lee和Richards，J.Mol.Biol.55，379 (1971)，将两者在此通过引入作为参考)。框架氨基酸有时候还可以 通过影响另一个框架氨基酸的构象，使其接着与CDR接触，从而间接 与CDR相互作用。
已知框架中多个位置处的氨基酸能够与许多抗体中的CDR相互作 用(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196，901(1987)，Chothia等， Nature 342，877(1989)，以及Tramontano等，J.Mol.Biol.215， 175(1990)，所有这些都在这里通过引入作为参考)，值得注意的是 轻链的位置2、48、64和71和重链的位置26-30、71和94(根据Kabat， 如前述所引用的，编号)，并且因此这些氨基酸通常会在类型4中。通 常，除了这些之外本发明的人源化免疫球蛋白将会包括类型4中的供 体氨基酸(其中有所不同)。在轻链的位置35处以及重链的位置93-103 处的氨基酸也可能会与CDR相互作用。在所有这些编号的位置上，优 选选择供体氨基酸而不是受体氨基酸(当它们不同时)进人源化免疫 球蛋白中。在另一方面，可能是类型4中的某些位置例如轻链的第5 个氨基酸有时可选自受体免疫球蛋白，而不丧失人源化免疫球蛋白中 的亲合力。Chothia和Lesk(如前述所引用的)与Kabat等(如前述 所引用的)不同地定义了CDR。值得注意的是，将CDR1定义为包含残 基26-32。因此，Riechmann等(如前述所引用的)从供体免疫球蛋白 中选择这些氨基酸。
同样重要的是，对抗体进行人源化而保留对抗原的高亲和性以及 其它有利的生物学特性。为了达到这个目的，根据优选的方法，通过 利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念化的 人源化产品的方法制备人源化抗体。说明和显示所选择的候选免疫球 蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可利用的。观察这些显 示结果使得能分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能起到的作 用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方 式，可从受体和重要的序列中选择并组合FR残基而使得获得期望的抗 体特性，例如增加的对靶标抗原的亲合力。一般而言，CDR残基直接 并最充分涉及影响抗原结合。用于产生蛋白质例如抗体的模型的计算 机程序通常是可获得的，并且是本领域那些技术人员熟知的(参见， Levy等，Biochemistry，28，7168-7175(1989)；Bruccoleri等， Nature，335，564-568(1988)；Chothia等，Science，233，755-758 (1986)，将所有这些文献在此通过引入作为参考)。这些不构成本发 明的部分。的确，因为所有抗体都具有类似的结构，如果需要，可将 可从Brookhaven Protein Data Bank获得的已知抗体结构用作其它 抗体的粗的模型。可商业获得的计算机程序可用于在计算机屏幕上显 示这些模型，用以计算原子间的距离，并用来估计不同氨基酸相互作 用的可能性(参见，Ferrin等，J.Mol.Graphics，6，13-27(1988))。
除了描述人源化免疫球蛋白中的氨基酸在什么时候可取自供体的 上述类型外，人源化免疫球蛋白中的某些氨基酸可既不取自供体又不 取自受体，只要它们属于：
类型5：如果供体免疫球蛋白中给定位置处的氨基酸是人序列所 “稀有的”，并且受体免疫球蛋白中该位置的氨基酸也是人序列“稀 有的”，如上述定义的，则人源化免疫球蛋白中该位置的氨基酸可以 选择为一些人序列的“典型”氨基酸。一种优选的选择是，在与受体 序列属于相同亚组的已知人序列中的该位置最经常出现的氨基酸。
对于人中的使用，人源化抗体通常具有优于小鼠或在某些情 况下优于嵌合抗体的至少3个潜在优势：
(1)由于效应子部分是人的，它可与人免疫系统中的其它部分更 好的相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体-依赖 性细胞毒性(ADCC)来更有效地破坏靶细胞)。
(2)人免疫系统将不会将人源化抗体的框架或恒定区识别成外来 物，并从而对抗这种注入的抗体的抗体反应应该比对抗完全外源的小 鼠抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体反应弱。
(3)已报道注入的小鼠抗体在人循环中具有比一般抗体的半衰期 短许多的半衰期(D.Shaw等，J.Immunol.，138，4534-4538(1987))。 注入的人源化抗体将大概具有与天然存在的人抗体更相似的半衰期， 使得能施用更少以及较少频率的剂量。
在一个方面，本发明旨在设计通过表达连接至编码受体人框架区 的DNA片段的重组DNA片段产生的人源化抗体，所述的重组DNA片段 编码能够结合至期望抗原，例如IL-31的供体免疫球蛋白的重链和轻 链CDR。
DNA片段通常将会进一步含有可操作性地连接至人源化免疫球蛋 白编码序列的表达控制DNA序列，包括天然-相关的或异源的启动子 区。该表达控制序列将会是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的 真核启动子系统，但是也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体 已整合进合适的宿主中，将该宿主保持在适合高水平表达所述核苷酸 序列的条件下，并且，根据需要，之后可收集和纯化人源化的轻链、 重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形 式(参见，S.Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis， Academic Press，N.Y.，(1979)，将其在此通过引入作为参考)。
人恒定区DNA序列可按照熟知的方法，从多种人细胞，但优选从 永生化B-细胞中分离(参见，Kabat(如前述所引用的)和WP87/02671)。 用于产生本发明免疫球蛋白的CDR将会类似地源自能够结合预定抗 原，例如IL-31的单克隆抗体，并通过熟知的方法在能够产生抗体的 任何合适的哺乳动物源(包括小鼠、大鼠或其它脊椎动物)中产生。 恒定区和框架DNA序列的合适的源细胞，以及用于免疫球蛋白表达和 分泌的宿主细胞可从许多来源，例如美国典型培养物保藏中心获得 (“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”，sixth edition(1988) Rockville，Md.U.S.A.，将其在此通过引入作为参考)。
除了特别在此描述的人源化免疫球蛋白外，其它与天然序列“充 分同源”的经修饰的免疫球蛋白可采用本领域那些技术人员熟知的多 种重组DNA技术容易设计和产生。多种不同的人框架区可单独或组合 使用，用作本发明的人源化免疫球蛋白的基础。一般而言，基因的修 饰可容易通过多种熟知的技术，例如定位诱变完成(参见，Gillman 和Smith，Gene，8，81-97(1979)以及S.Roberts等，Nature，328， 731-734(1987)，将两者在在此通过引入作为参考)。
本发明的人源化抗体包括片段以及完整的抗体。通常，这些片段 与它们源自的完整抗体竞争结合抗原。片段通常以至少107M.-1，并 且通常以108或109M.-1的亲合力结合(即在与完整的抗体相同的范 围内)。人源化的抗体片段包括单独的重链、轻链Fab、Fab’F(ab’)2 和Fv。片段通过重组DNA技术，或者通过完整的免疫球蛋白的酶学性 或化学性分裂产生。
对于人源化抗体的进一步详细的内容，可参见欧洲专利No.EP 239400、EP 592106和EP 519596；国际出版物No.WO 91/09967和 WO 93/17105；美国专利No.5225539、5530101、5565332、5585089、 5766886和6407213；以及Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489498；Studnicka等，1994，Protein Engineering 7(6)： 805814；Roguska等，1994，PNAS 91：969973；Tan等，2002，J. Immunol.169：111925；Caldas等，2000，Protein Eng.13：35360； Morea等，2000，Methods 20：26779；Baca等，1997，J.Biol.Chem. 272：1067884；Roguska等，1996，Protein Eng.9：895904；Couto 等，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s 5977s；Couto等，1995， Cancer Res.55：171722；Sandhu，1994，Gene 150：40910；Pedersen 等，1994，J.Mol.Biol.235：95973；Jones等，1986，Nature 321： 522-525；Reichmann等，1988，Nature 332：323-329；以及Presta， 1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
已经发展了多种技术来用于产生抗体片段。传统上，这些片段通 过蛋白水解消化完整的抗体产生(参见，例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和 Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段目前可直 接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可从如上讨论的抗体噬菌体 文库中分离。备选地，Fab’-SH片段可从大肠杆菌直接回收并经化学 偶联而形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167 (1992))。根据另一种方法，F(ab’)2片段可从直接重组宿主细胞培 养物中分离。用于产生抗体片段的其它技术对熟练从业人员来说将是 显而易见的。此外，可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美 国专利4946778和5258498、Huston等，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)、Shu等，PNAS 90：7995-7999(1993)，以及Skerra 等，Science 240：1038-1040(1988)中描述的那些。
本发明包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至本 发明的多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20或50个氨基酸) 来产生融合蛋白的抗体。因此，本发明还涉及含有在此描述的抗体的 免疫缀合物，其中所述抗体缀合至细胞毒素剂，例如化学剂、毒 素(例如细菌、真菌、植物或动物源的酶促活性毒素，或其片段)或 放射性同位素(即，放射缀合物)。
本发明包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至本 发明的多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20或50个氨基酸) 来产生融合蛋白的抗体。融合不一定是直接的，而是可通过连接序列 发生。抗体可以是对不同于本发明的多肽(或其部分，优选多肽的至 少10、20或50个氨基酸)特异性的。例如，抗体可通过融合或缀合 本发明多肽至对特殊的细胞表面受体特异性的抗体，用于体外或体内 靶向本发明多肽至特殊的细胞类型。融合或缀合至本发明多肽的抗体 也可采用本领域已知的方法，用于体外免疫测定法和提纯方法。参见， 例如Harbor等，同上，以及PCT出版物WO 93/21232、EP 439,095、 Naramura等，Immunol.Lett.39：91-99(1994)、美国专利5,474,981、 Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)、Fell等，J.Immunol. 146：2446-2452(1991)，将其通过全文引入作为参考。
本发明进一步包括含有融合或缀合至异源多肽序列(例如，不是 可变区的抗体的结构域)的本发明多肽(例如，含有免疫原性表位或 抗原表位的那些多肽)的组合物。例如，本发明的多肽可融合或缀合 至抗体的Fc区，或其部分。例如，本发明的多肽(包括其片段或变体) 可与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域，或其部分(CH1、 CH2、CH3或它们以及其部分的任意组合)融合，产生嵌合多肽。融合至 本发明多肽的抗体部分可包括恒定区、绞链区、CH1结构域、CH2结构 域和CH3结构域，或者全部结构域或其部分的任意组合。多肽也可融合 或缀合至上述抗体部分而形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的Fc 部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。更高的多聚体形式可通 过将多肽与IgA和IgM部分融合而产生。用于融合或缀合本发明的多 肽至抗体部分的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号 5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、 5,112,946、EP 307,434、EP 367,166、PCT出版物WO 96/04388、WO 91/06570、Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539 (1991)、Zheng等，J.Immunol.154：5590-5600(1995)，以及Vil 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)(将所述 的参考文献通过全文引入作为参考)。作为另一个非限制性实例，本 发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可与白蛋白(包括但不限 于重组的人血清白蛋白或其片段或变体(参见，例如美国专利 5,876,969，出版于1999年3月2日，EP专利0413622，以及美国 专利5,766,883，出版于1998年6月16日，将其在这此通过全文引 入作为参考))融合。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体) 可融合至异源蛋白质(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽) 的N-或C-末端。编码本发明的融合蛋白的多聚核苷酸也包括在本发明 内。
如上讨论的，本发明的多肽可采用本领域已知的方法，与上述抗 体部分融合或缀合以延长该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。此外， 可将本发明的多肽融合或缀合至上述抗体部分以促进纯化。一个报道 的实例描述了由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白 的重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白质。(参见，例如 EP 394,827；Traunecker等，Nature 331：84-86(1988))。已证实 了关于与FcRn结合伴侣例如IgG或Fc片段缀合的抗原(例如，胰岛 素)具有增强的递送抗原穿过上皮屏障到达免疫系统的能力(参见， 例如PCT出版物WO 96/22024和WO 99/04813)。与具有二硫键-连接 的二聚体结构(由于IgG)的抗体融合或缀合的本发明多肽也比单独 的单体分泌性蛋白质或蛋白质片段更有效地结合和中和其它分子。 (Fountoulakis等，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多 情形中，融合蛋白中的Fc部分在和诊断中是有利的，并因此可导 致，例如改善的药代动力学特性。(EP A 232,262)。备选地，在融 合蛋白已经表达、检测和纯化后除去Fc部分将是期望的。例如，如果 融合蛋白用作用于免疫接种的抗原，则Fc部分可能妨碍和诊断。 在药物发现中，例如，已将人蛋白质，例如hIL-5与Fc部分融合，以 用于鉴定hIL-5的拮抗剂的高通量筛选测定法。(参见，D.Bennett 等，J.Molecular Recognition 8：52-58(1995)；K.Johanson等， J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995)0)。该技术还包括(但不限 于)利用双功能缀合剂(参见例如，U.S.Pat.Nos.5,756,065、 5,714,631、5,696,239、5,652,361、5,505,931、5,489,425、 5,435,990、5,428,139、5,342,604、5,274,119、4,994,560和 5,808,003，特此将它们每一个的内容通过全文引入作为参考)。
此外，可将本发明的多肽(例如抗体或其片段)融合至标记序列， 例如肽来帮助它们的纯化。在进一步的实施方案中，编码本发明多肽 的核酸(包括，但不限于编码免疫原和/或抗原表位的核酸)也可与作 为表位标签的目标基因(例如，血凝素标签“HA”或flag标签)重组， 来帮助检测和纯化所表达的多肽。在优选的实施方案中，标记氨基酸 序列是六-组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue， Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标记，其中，多数可商业获得。 如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：821-824(1989)中所 描述的，例如，将六-组氨酸用于方便纯化融合蛋白。可用于纯化的其 它肽标签包括，但不限于对应源于流感血凝素蛋白质的表位的“HA” 标记(Wilson等，Cell 37：767(1984))，以及“flag”标签。
本发明进一步包括缀合至诊断剂或剂的抗体或其片段。该抗 体可在诊断上用于，例如，监控肿瘤的发生或进展(作为临床检测程 序的部分)，来例如测定所提供的、诊断、检测和/或预防方案的 效力。可通过将该抗体偶联至可检测物质来方便检测。可检测物质的 实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射 性物质、使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属，以及非 放射性顺磁性金属离子。关于可与抗体缀合而用作根据本发明的诊断 剂的金属离子，参见，例如美国专利4741900。合适的酶的实例包括 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适 的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生 物素；合适的荧光物质的实例包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸 荧光素、若丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发 光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光 素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、111In 或99Tc。
此外，抗体或其片段可与性部分例如细胞毒素，例如细胞抑 制剂或杀细胞剂、剂或放射性金属离子缀合。细胞毒素或细胞毒 素剂包括对细胞有害的任何制剂。实例包括紫杉醇(paclitaxol)，细 胞松弛素B、D短杆菌肽、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、 依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春 花碱、秋水仙碱、阿霉素、红比霉素、二羟基菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素、放线 菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、 利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素 (puromycin)及其类似物或同系物。剂包括，但不限于抗代谢物 (例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧 啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、瘤可宁(thioepa chlorambucil)、 美法兰(melphalan)、卡氮芥(carmustine)(BSNU)和罗氮芥 (lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、 二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C，以及顺二氯二氨铂(II)(DDP) 顺铂)、蒽环类抗生素(例如，红比霉素(以前叫道诺霉素(daunomycin)) 和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素(dactinomycin)(以前叫更生 霉素(actinomycin))、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))， 以及抗有丝分裂制剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
本发明的缀合物可用于调节给定的生物应答，不能把剂或药 物部分理解为限于传统的化学剂。例如，药物部分可以是具有期 望的生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如，毒素如相 思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿 瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的 生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血栓形成制剂(thrombotic agent)或抗-血栓形成剂，例如血管他丁或内皮他丁；或者生物应答 调节剂例如，淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2 (“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒-巨噬细胞集落刺 激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它 生长因子。
抗体还可连接至固体载体，其尤其可用于靶标抗原的免疫测定或 纯化。这种固体载体包括，但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼 龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
用于将这种剂部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如 Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld等，(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)； Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等，(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies “84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等，(eds.)， pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等，(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)， 以及Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
备选地，如由Segal在美国专利4676980中描述的，抗体可与 另一种抗体缀合而形成抗体异缀合物(heteroconjugate)，将其在在 此通过全文引入作为参考。
可将单独施用或与细胞毒素因子和/或细胞因子组合施用的、与或 不与剂部分缀合的抗体用作剂。
在另一实施方案中，可将抗体缀合至“受体(receptor)”(例 如抗生蛋白链菌素)用于肿瘤预靶向(pretargeting)，其中将该抗 体-受体缀合物施用给患者，随后用清除剂将未结合的缀合物从循环中 去除，然后施用与细胞毒素剂(例如放射性核素)缀合的“配体”(例 如卵白素)。
本领域那些技术人员已知的多种测定法可用于检测结合至IL-31 蛋白质或多肽的抗体。示例性的测定法在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中详细描述。这种测定法的代表性实例包括：并行免疫 电泳(concurrent immunoelectrophoresis)、放射免疫测定法、放 射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、斑点印迹或蛋白质印 迹测定法、抑制或竞争测定法，以及夹心测定法。另外，可根据结合 野生型对突变型IL-31蛋白质或多肽筛选抗体。
IL-31抗体可用于对表达IL-31的细胞进行标签；用于通过亲和 提纯来分离IL-31；用于测定IL-31多肽的循环水平的诊断测定；用 于测定或定量可溶性IL-31作为潜在的病理或疾病的标志；用于采用 FACS的分析方法；用于筛选表达库；用于产生抗-个体基因型抗体； 以及用作中和抗体或用作拮抗剂来阻断体外和体内的IL-31活性。合 适的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制因 子、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等；间接标签或标记可特征 性地使用生物素-亲和素或其它补体/抗补体对作为媒介物。在这里， 还可以直接或间接地将抗体与药物、毒素、放射性核素等缀合，并且 这些缀合物用于体内诊断或应用。而且，IL-31的抗体或其片段 可在测定法，例如本领域已知的蛋白质印迹或其它测定法中，用于体 外检测变性的IL-31或其片段。
合适的可检测分子可直接或间接连接至多肽或抗体，并且包括放 射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制因子、荧光标记、化学发光标 记、磁性颗粒等。合适的细胞毒素分子可直接或间接连接至多肽或抗 体，并且包括细菌或植物毒素(例如白喉毒素、皂草素、假单胞菌外 毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素等)，以及性放射性核素，例如碘 -131、铼-188或钇-90(可直接连接至多肽或抗体，或者通过利用例 如螯合部分来间接连接)。多肽或抗体还可以与细胞毒类药物，例如 阿霉素缀合。为了间接连接可检测分子或细胞毒素分子，可将可检测 分子或细胞毒素分子与补体/抗补体对的一个成员缀合，而另一个成员 则与多肽或抗体部分结合。为此目的，生物素/抗生蛋白链菌素是一种 示例性的补体/抗补体对。
结合多肽还可用作IL-31“拮抗剂”来体外和体内阻断IL-31结 合以及信号转导。这些抗-IL-31结合多肽应该可用于抑制IL-31活性 或蛋白质-结合。
多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可用于靶向的细胞或组 织的抑制或切除(例如，来癌细胞或组织)。备选地，如果所述 的多肽具有多个功能结构域(即，活化结构域或受体结合结构域，加 上靶向结构域)，则仅包含靶向结构域的融合蛋白可适合用于引导可 检测分子、细胞毒素分子或补体分子至目标细胞或组织类型中。在其 中仅有该结构域的融合蛋白包括补体分子的情况下，可将抗-补体分子 与可检测分子或细胞毒素分子缀合。这种结构域-补体分子融合蛋白因 而代表了用于细胞/组织-特异性递送通用的抗-补体-可检测/细胞毒 素分子缀合物的通用靶向载体或媒介物。
在另一个实施方案中，IL-31抗体-细胞因子融合蛋白可用于体内 杀死靶组织(例如白血病、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、 卵巢癌、皮肤癌、血和骨髓癌，或其中表达IL-31受体的其它癌)(通 常参见，Hornick等，Blood 89：4437-47，1997)。所描述的融合蛋 白能够使抗体靶向至期望的作用位点，从而提供提高了局部浓度的抗 体。合适的IL-31多肽或抗-IL-31抗体靶向不希望有的细胞或组织(即 肿瘤或白血病)，并且融合的细胞因子介导了提高的由效应细胞进行 的靶细胞溶解。用于此目的的合适的细胞因子包括，例如白细胞介素 2和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在又一个实施方案中，如果IL-31多肽或抗-IL-31抗体靶向血管 细胞或组织，则该多肽或抗体可与放射性核素，并且尤其与β-发射放 射性核素缀合来减少再狭窄。
可测量本发明的单克隆抗体抑制、阻断或中和IL-31配体的能力， 如通过本领域已知的和在此描述的多种体内模型，包括但不限于 NC/Nga模型、Ova上表皮模型(epicutaneous model)、慢性过敏反 应模型和慢性半抗原模型(chronic hapten model)测定。
已经将皮肤归巢T细胞(skin-homing T Cell)和表皮角质细胞 牵连于人类皮肤疾病的病理学中。在人中，IL-31mRNA和蛋白质表达 局限于皮肤-归巢CLA+T细胞。因而，IL-31的拮抗剂，包括抗体 或受体拮抗剂将可用于具有CLA+T细胞表达的皮肤和表皮疾病。 这种疾病包括，例如特应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反 应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴 瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮。 趋化因子标记例如TARC和MDC可用于测量中和性单克隆抗体对IL-31 的效力。如实施例15中显示的，用在此描述的抗-IL31抗体的抑 制效果可通过监控TARC和MDC的水平测量。
接触性皮炎
过敏性接触性皮炎可定义为T细胞介导的对与皮肤接触的抗原的 免疫反应。由于变应原依赖性T细胞应答很大程度上限于CLA+细胞 (参见Santamaria-Babi，L.F.，等，J Exp Med：181，1935，(1995))， CLA+T细胞被认为涉及皮炎的引发。最近的数据已发现，只有记忆 性(CD45RO+)CD4+CLA+而不是CD8+T细胞在响应镍(一种普通的接 触性过敏变应原)时增殖并产生了1型(IFN-)和2-型(IL-5)细胞 因子。此外，表达CLA与CD4、CD45RO(记忆)或CD69组合的细胞在 镍-特异性刺激后增加，并表达了趋化因子受体CXCR3、CCR4、CCR10而 不是CCR6。参见Moed H.，等，Br J Dermatol：51，32，(2004)。
在动物模型中，已证明过敏性接触性皮炎是T-细胞依赖性的，而 且过敏性-应答T细胞迁移到了变应原作用位点。一般参见：Engeman T.M.，等，J Immunol：164，5207，(2000)、Ferguson T.A.&Kupper T.S.J Immunol：150，1172，(1993)，以及Gorbachev A.V.& Fairchild R.L.Crit Rev Immunol：21，451(2001)。由于CLA+T细 胞产生IL-31并且IL-31刺激皮肤角质细胞可诱发炎症促进趋化因子， 例如TARC和MDC，IL-31可能涉及接触性皮炎的病理生理学。在接触 性过敏反应的小鼠模型中使用中和性IL-31抗体。参见实施例8。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31可用于通过抑制、减少、 中和、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓，来改善接触性过敏反 应的临床效果。
特应性皮炎
特应性皮炎(AD)是一种近十年来具有显著增加的发病率的、慢 性复发性炎性皮肤病。临床上AD表征为高搔痒性的、通常为显示一个 慢性复发性病程的表皮剥脱斑和丘疹。AD的诊断主要基于重大的及较 小的临床发现。参见Hanifin J.M.，Arch Dermatol；135，1551 (1999)。，组织病理学显示为急性病患中的棘细胞层水肿、过度不全 角化和灶性角化不全，然而伴随有过度不全角化和灶性角化不全、棘 皮症/颗粒层增厚的明显的表皮超常增生，以及淋巴细胞和大量肥大细 胞在真皮的血管周围浸润是慢性病患的标志。
T细胞在组织的局部免疫应答的引发中起着重要的作用，并且有 证据显示，皮肤-浸润性T细胞尤其在皮肤的失调的免疫应答的引发和 维持中起关键作用。在表皮的炎性位点中，约90％的浸润性T细胞表 达结合内皮细胞选择素(在内皮上的一种诱导性黏附分子)的皮肤淋 巴细胞-相关的Ag(CLA+)(在Santamaria-Babi L.F.等，Eur J Dermatol.14，13，(2004)中综述)。与对照个体比较，在AD患者中 循环CLA+T细胞的显著增加已得以证明(参见，Teraki Y.等，Br J Dermatol：143，373(2000))，同时其它研究已证明，与CLA-比 较，AD患者的记忆CLA+T细胞优先相应变应原浸出物(参见 Santamaria-Babi，L.F.等，J Exp Med：181，1935，(1995))。在人 中，已将皮肤特应性疾病的发病机理与表达增加水平的Th-2-型细胞 因子，如IL-5和IL-139、10的CLA+T细胞的增加联系起来。参见， Akdis M等，Eur J Immunol：30，3533(2000)，以及Hamid Q等，J Allergy Clin Immunol：98，225(1996)。
约6-8周大的NC/Nga小鼠在无非特异性病原体的(非-SPF)条件 下圈养时，会自发地产生类似AD的损伤，其在许多方面类似人AD， 包括临床过程和征兆、组织病理学和免疫病理学。相反，保持在SPF 条件下的NC/Nga小鼠不会发生皮肤病损。然而，可通过每周皮内注射 粗的粉尘螨抗原，来使在SPF实验室中圈养的NC/Nga小鼠同步发生自 发性皮肤病损和搔抓行为。参见Matsuoka H等，Allergy：58，139 (2003)。因此，NC/Nga中AD的发生是用于评估用于AD的新 剂的有用模型。
除了自发性AD的NC/Nga模型，使用OVA的小鼠的上表皮致敏作 用也可用作模型来在致敏的小鼠的皮肤中，诱导抗原-依赖性表皮和真 皮增厚，同时单核细胞侵润其中。这通常与总的和特异性IgE的血清 水平升高同时发生，然而，在该模型中一般不会发生皮肤屏障机能障 碍或搔痒症。参见Spergel J.M等，J Clin Invest，101：1614，(1998)。 可以修改本方法以便通过用OVA使DO11.10 OVA TCR转基因小鼠致敏 来诱导皮肤屏障失调和搔痒症。增加能够识别致敏性抗原的抗原-特异 性T细胞的数量可增加皮肤的炎症水平而诱导明显的皮肤搔抓行为和 皮肤苔癣化/鳞屑化。
NC/Nga自发性AD模型和OVA表皮DO11.10模型都可用于研究AD 中IL-31和IL-31RA的表达，以及在此描述的抗体抑制、减少或中和 IL-31的效果的能力。见这里的实施例9和10。在一个使用NC/Nga 体内模型的研究(实施例10)中，施用大鼠抗-小鼠IL-31抗体显示 了搔抓行为的减少，但未减少皮炎。在此描述的抗体可用于抑制与皮 炎和搔痒性疾病，包括特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹相关的骚抓行 为。单独抑制、减少或防止搔抓行为可有效地搔痒性疾病，包括 但不限于特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹，因为搔抓行为的停止将会 使皮炎停止发展，皮炎的发生依赖于搔抓行为。
用于测量在此描述的抗-IL-31抗体的抑制效果的另外的模型由 Umeuchi，H.等，European Journal of Pharmacology，518：133-139， 2005，以及由Yoo，J等，J.Experimental Medicine，202：541-549， 2005描述。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善皮炎和搔痒性疾 病，包括特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹的临床结果。
药物-诱导的迟发型皮肤变应性反应
药物-引发的迟发型皮肤变应性反应是十分异质性的，并且可反映 出许多特殊的病理生理事件。参见Brockow K等，Allergy：57，45 (2002)。涉及这些反应的免疫机理已显示为抗体或细胞介导的。在即 发型药物过敏中，IgE-介导的抗体反应可通过阳性皮肤穿刺和/或皮内 试验在20分钟后证明，而对药物的非-即刻反应可在最后用药长于1 小时后发生，并且通常是T-细胞介导的。非-即刻T-细胞介导的迟发 型反应可例如在对青霉素类产生有害的药物反应的患者中发生。已显 示，对青霉素类的增殖性T细胞反应局限于来自青霉素过敏患者的T 细胞的记忆(CD45RO+)CLA+亚，而CD45RO+CLA-亚未显示增殖反 应。参见Blanca M.，Leyva L等，Blood Cells Mol Dis：31，75(2003)。 迟发型过敏(DTH)反应可在小鼠中人为地再现，使得能评估可参与 DTH反应的起始和维持的因子。I1-31中和抗体在迟发型变应性反应中 是有效的。参见实施例51。
中毒性表皮坏死溶解(TEN)是一种非常罕见但非常严重的药物反 应，其特征在于伴随有大量水疱的大范围表皮细胞调亡。研究已经显 示，浸润水疱的淋巴细胞是CLA+T细胞并且可显示出对表皮角质细胞 的细胞毒性。参见Leyva L等，J Allergy Clin Immunol：105，157 (2000)，以及Nassif A.，Bensussan A等，J Allergy Clin Immunol：114， 12092004。已产生了一种转基因小鼠系统来建立TEN的动物模型，所 述的转基因小鼠系统中，OVA在角蛋白-5(K5)启动子的控制下在小 鼠的表皮和毛囊的角质细胞中表达。OVA特异性CDg+T细胞在获得性 地转移进K5-OVA小鼠中时，在皮肤-引流淋巴结中得到激活和增殖并 靶向K5-OVA小鼠的皮肤，导致表明TEN的皮肤病损产生。参见 Azukizawa H等，Eur J Immunol：33，1879(2003)。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善TEN的临床结 果。
大疱性类天疱疮
大疱性类天疱疮是一种表皮下障碍，其表现为表皮下的水疱，伴 随有中性粒细胞和嗜酸性细胞的皮肤浸润。诊断的特征是，对抗表皮 和真皮-表皮交界部的特异性黏着蛋白的抗原-特异性抗体的存在。参 见Jordon R.E等，JAMA：200，751(1967)。通过分析PBL和皮肤水 泡T细胞，来分析T细胞在大疱性类天疱疮的发病机理中的作用的研 究已经发现了占优势的CLA+T细胞，其表达增加水平的Th2-细胞因子， 例如IL-4和IL-13。参见Teraki Y等，J Invest Dermatol：117，1097 (2001)。在全身性皮质类固醇后的大疱性类天疱疮患者中，产生 白细胞介素-13的CLA+细胞而不是CLA-细胞的频率显著减少。皮质类 固醇后CLA+细胞的减少与临床改善有关。参见Teraki，同上。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善大疱性类天疱疮 的临床结果。
斑秃(Alopecia areata)
斑秃(AA)认为是一种毛囊的组织-限制性自身免疫性疾病，其中 毛囊活性由于持续的淋巴细胞性浸润活性而受到抑制。AA导致身体任 何部位块状的全部毛发脱落，可是不发生实际上的毛囊的丧失，甚至 是在无毛病变处。虽然不存在炎症的临床征兆，但是活动性疾病位置 的皮肤活组织检查显示出毛囊周围的原发性CD4+细胞的淋巴细胞性 炎症，伴随有CD8+毛囊内的浸润。参见Kalish R.S.&Gilhar A.J Investig Dermatol Symp Proc：8，164(2003)。
研究已显示，头皮皮肤浸润性CD4+或CD8+淋巴细胞表达CLA并且， 在患有AA的个体的外周血液中，CLA+CD4+或CD8+淋巴细胞的百分比 明显高于正常对照的百分比。此外，患有严重或进行性AA的患者与该 疾病痊愈的患者比较，显示出高得多的CLA-阳性，并且CLA+细胞百分 比的减少与良好的临床过程一致。参见Yano S等，Acta Derm Venereol： 82，82(2002)。因此这些研究表明，CLA+淋巴细胞可能在AA中起重 要作用。异种移植模型已证实，活化的T细胞可能在AA的发病机理中 起作用。移植在裸小鼠上的、来自AA患者的病患处的头皮再生长了毛 发，同时伴随有移植物的浸润性淋巴细胞的消失并且，将活化的病患 处的T细胞转移至SCID小鼠可使SCID小鼠上的人头皮移植物毛发脱 落。参见Kalish R.S.&Gilhar A.J Investig Dermatol Symp Proc： 8，164(2003)。
多种免疫调节疗法是对这种疾病的常见的一部分，可是这些 的效力都不一致。参见Tang L等，J Invest Dermatol：120，400 (2003)；Tang L等，(2004)，以及Tang L等，JAm Acad Dermatol：49， 1013(2003)。然而，它们在有效的动物模型中的使用提供了剖析 效果的分子机理的工具。参见Shapiro J等，J Investig Dermatol Symp Proc：4，239(1999)；Tang L等，Old wine in new bottles：reviving old therapies for alopecia areata using rodent models(2003)， 以及VermaD.D等，EurJDerinatol：14，332(2004)。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善斑秃的临床结 果。
红斑痤疮(Acne Rosacea)/普通粉刺(Acne vulgaris)
普通粉刺是一种毛囊皮脂腺器障碍，为最常见的青春期皮肤问题。 毛囊角质化异常认为会引起痤疮病患。红斑痤疮通过存在有红丘疹、 脓疱、囊肿和大面积毛细管扩张，但没有粉刺(粟粒疹)来同普通粉 刺区分。在普通粉刺的病理生理学中，皮脂腺增加的皮脂分泌是主要 因素。其它的皮脂腺功能也与痤疮的发生有关，包括皮脂的促炎症反 应脂类；局部产生的不同的细胞因子；腺周围肽和神经肽，例如促肾 上腺皮质素释放激素，其通过皮脂细胞(sebocyte)产生；以及P物 质，其在痤疮患者看似健康的腺附近的神经末梢中表达。参见 Zouboulis C.C.Clin Dermatol：22，360(2004)。
虽然尚未知道普通粉刺和红斑痤疮的病理生理学，但临床观察和 组织病理学研究表明，毛皮脂腺囊炎症可能对红斑痤疮和普通粉刺的 发病机理来说是重要的。对T细胞亚浸润红斑痤疮病患处分析的早 期研究表明，大多数T细胞表达CD4。参见Rufli T.&Buchner S.A. Dermatologica：169，1(1984)。
CD4+T细胞产生IL-31并且对皮肤的IL-31表达的IHC分析显示， IL-31在皮脂腺和汗腺中表达。IL-31刺激表皮角质细胞诱导了可能导 致细胞浸润的趋化因子的表达，表明IL-31可能有助于皮肤中的促炎 症反应。参见Dillon S.R等，Nat Immunol：5，752(2004)。从而， IL-31可能有参与红斑痤疮和普通粉刺的病理生理学。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善普通粉刺的临床 结果。
结节性痒疹(Prurigo nodularis)
结节性痒疹是由难的顽固性搔痒症引起的、苔藓化或表皮剥 脱的结节的疹。当长期摩擦导致苔藓化，而搔抓导致线状的表皮脱落， 在他们发痒的、受刺激的皮肤处挖挤和摩擦的个体易于产生称为痒疹 结节的明显增厚的丘疹。虽然结节性痒疹不是特应性皮炎特异性的， 但许多具有这些结节的患者也具有特应性反应，其表现为变应性鼻炎、 哮喘或食物过敏。T细胞代表了痒疹病患中的大多数浸润细胞，并且 这些病患常常代表了特应性患者中的多数搔痒性皮肤病患。
用辣椒碱(capsaicin)对结节性痒疹的局部已证明是一种导 致皮肤病患消除的有效且安全的方案，所述辣椒碱是一种在小的感觉 皮神经中，通过耗尽神经肽像P物质来干扰对搔痒和疼痛的感觉的抗- 搔痒生物碱。参见Stander S等，J Am Acad Dermatol：44，471(2001)。 用辣椒碱处理来研究NC/Nga小鼠中的搔痒反应显示，几乎完全阻止了 皮炎损伤的自发性发展。而且，血清IgE水平的升高受到明显抑制， 并且在辣椒碱的小鼠的受损皮肤中，浸润性嗜酸性细胞和肥大细 胞的数量减少。参见Mihara K等，Br J Dermatol：151，335(2004)。 对该体的观察表明，骚抓行为可通过增强多种免疫应答来促进皮炎 的发展，从而意味着，阻止搔痒感觉和/或搔痒-相关的搔抓行为可能 会是一种对AD的有效。参见Mihara K等，Br J Dermatol：151， 335(2004)。因此，在这里描述的抗-I1-31抗体将可用于使AD、结节 性痒疹和其它搔痒性疾病的影响最小化，因为它们在这里显示能减少 NC/Nga小鼠中的搔抓次数。
IL-31的缓慢递送可在小鼠中诱发搔痒症和脱毛症，之后发展类 似皮炎的皮肤病患，表明IL-31可能诱发搔痒。参见Dillon S.R等， Nat Immunol：5，752(2004)。IL-31参与诱导搔痒反应可通过两种 方法检测：(i)对用IL-31-处理的小鼠进行辣椒碱和(ii)用 IL-31处理敲除了Tac 1基因小鼠，其中所述的敲除了Tac 1基因小 鼠由于缺乏实施例52中的神经肽的表达而明显减少了伤害性疼痛反 应。另外，中和IL-31在用IL-31处理的小鼠中是否能预防搔痒症和 脱毛症已在实施例12中检验。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善结节性痒疹的临 床结果。
与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症
外周血液中的单纯疱疹病毒(HSV)-特异性CD8+T细胞和从疱疹 病患处回收的HSV-特异性CD8+T细胞表达高水平的CLA，而非-皮肤向 性疱疹病毒-特异性的CD8+T细胞缺少CLA表达。参见Koelle D.M 等，J Clin Invest：110，537(2002)。HSV-2反应性CD4+T淋巴 细胞也表达CLA，但以低于先前观察到的关于CD8+T淋巴细胞的水平 表达。参见Gonzalez J.C等，J Infect Dis：191，243(2005)。搔 痒症还与疱疹病毒感染有关(参见Hung K.Y等，Blood Purif 16，147 (1998))。可是其它病毒病例如HIV也与搔痒性皮肤病患有关。通常 与红斑丘疹性(erythematopapular)皮肤病患以及嗜伊红细胞增多症 有关的、严重的顽固性搔痒症是一种在一些非特应性、HIV-感染的患 者36中观察到的病状。参见Singh F.&Rudikoff D，Am J Clin Dermatol；4，177(2003)，以及Milazzo F.，Piconi S等，Allergy： 54，266(1999)。
皮肤-向性病毒与搔痒症以及CLA+T细胞之间的关联表明，产生 IL-31的T细胞可能涉及病毒感染的病理生理学。
因此，通过在此描述的抗体中和IL-31，可用于通过抑制、减少、 防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善与皮肤-向性病 毒相关的搔痒症的临床结果。
此外，炎症是生物体避开侵入物的保护性应答。炎症是涉及许多 细胞和体液性介质的级联事件。在一个方面，对炎症应答的抑制可使 宿主免疫妥协；然而，如果让其未加抑制，炎症可导致严重的并发症， 包括慢性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠 病等)、败血症性休克和多器官衰竭。重要地是，这些不同的疾病状 态拥有共同的炎症介质。表征为炎症的全体疾病对人的发病率和死亡 率有巨大影响。因此显然，抗-炎性抗体和结合多肽，例如在此描述的 抗-IL-31抗体和结合多肽可具有对大量人和动物疾病(从哮喘和变态 反应到自身免疫和败血症性休克)的重大潜力。因而，在此描述 的抗-炎性抗IL-31抗体和结合多肽可在上尤其在疾病例如关节 炎、内毒素血症、炎性肠病、银屑病、相关疾病等中，用作在此描述 的IL-31拮抗剂。
1.关节炎
关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由损伤引起的关节炎 性连接(arthritic joint)等，是普通的炎性病症，其将会受益于抗 -炎性抗体和结合多肽，例如本发明的抗IL-31抗体和结合多肽的 用途。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病， 并且是一种最常见形式的关节炎。它表征为关节处的膜的炎症，其引 起疼痛、僵硬、发热(warmth)、发红和肿胀。炎症细胞释放出可消 化骨和软骨的酶。作为类风湿性关节炎的结果，发炎的关节衬里(滑 膜)可侵入和损伤骨和软骨，导致其它生理效应中的关节变坏和重度 疼痛。所涉及的关节可能会丧失它的形状和对准，导致疼痛和丧失运 动能力。
类风湿性关节炎(RA)是一种免疫-介导的疾病，特别是表征为炎 症和随后的组织损伤，导致严重的残疾和增加死亡率。多种细胞因子 在患风湿性关节中局部产生。许多研究已证明，IL-1和TNF-α这两种 原型的致炎性细胞因子，在涉及滑液炎症和进行性关节破坏的机制中 起重要作用。的确，在RA患者中施用TNF-α和IL-1抑制剂已导致炎 症的临床和生物学病征显著改善，以及骨质侵蚀和软骨破坏的放射性 信号减少。然而，尽管有这些鼓舞人心的结果，但显著比例的患者对 这些制剂不响应，表明其它介质也涉及关节炎的病理生理学(Gabay， Expert.Opin.Biol.Ther.2(2)：135-149，2002)。那些介质之 一可能是IL-31，并因而结合或抑制IL-31的分子，例如抗IL-31抗 体或结合伴侣，可作为有用的剂来减少类风湿性关节炎，以及其 它关节炎疾病中的炎症。
在本领域中存在多个已知的类风湿性关节炎的动物模型。例如， 在胶原-诱发的关节炎(CIA)模型中，小鼠产生了非常类似于人风湿 性关节炎的慢性炎性关节炎。由于CIA具有与RA类似的免疫学和病理 学特征，这使得它成为用于筛选潜在的人抗-炎症化合物的理想模型。 CIA模型是一种熟知的小鼠模型，其依赖于免疫反应和炎症应答以便 发生。免疫应答包括B-细胞和CD4+T-细胞响应作为抗原的胶原的相互 作用，并导致抗-胶原抗体的产生。炎症阶段是炎症介质的组织反应的 结果，是由于这些抗体中的一些与小鼠的天然胶原交叉-反应并激活了 补体级联。利用CIA模型的一个优势是，发病机理的基础机制是已知 的。已经鉴定II型胶原上的相关T-细胞和B-细胞表位，并且已确定 与免疫-介导的关节炎相关的多种免疫学参数(例如，迟发型超敏反应 和抗-胶原抗体)和炎性参数(例如，细胞因子、趋化因子和基质-降 解酶)，并因此可用于在CIA模型中评估试验化合物的效力(Wooley， Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等，Immunol. 89：9784-788，1992；Myers等，Life Sci.61：1861-78，1997，以及 Wang等，Immunol.92：8955-959，1995)。
将含有可溶性IL-31RA的多肽(包括在此描述的异二聚受体和多 聚受体)，例如IL-31RA-Fc4或其它IL-31RA可溶蛋白和融合蛋白施 用至这些CIA模型小鼠，可用来评估IL-31RA对改善症状和改变病程 的用途。作为调节免疫应答和炎症应答的分子，IL-31可诱导涉及类 风湿性关节炎发病机理的SAA的产生，IL-31拮抗剂可减少SAA的体 外和体内活性，全身或局部施用IL-31拮抗剂，例如抗-IL-31抗体或 结合伴侣、含有IL-31RA的多肽(包括在此描述的异二聚受体和多聚 受体)，例如IL-31RA-Fc4或其它IL-31RA可溶蛋白和融合蛋白，可 潜在地抑制RA中的炎症应答。其它可能的剂包括本发明的 IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或者抗IL-31 抗体或结合伴侣等。
2.内毒素血症
内毒素血症是一种通常由传染原(例如细菌以及其它传染性疾病 媒介物)、脓毒症、中毒性休克综合征，或者在受机会性感染的免疫 妥协的患者等中产生的严重病症。抗-炎症抗体和结合多肽，例如本发 明的抗-IL-31抗体和结合多肽的用途可帮助预防和人和动 物中的内毒素血症。其它潜在的剂包括本发明的IL-31RA多肽、 可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或抗IL-31抗体或结合伴侣 等，可作为用于减轻内毒素血症中的炎症和病理学影响的有用剂。
脂多糖(LPS)诱发的内毒素血症涉及许多在传染病中产生病理学 效果的促炎介质，并且啮齿类中LPS诱发的内毒素血症是一种广泛使 用且可接受的模型，用于研究潜在的致炎剂或免疫调度剂的药理学作 用。革兰氏阴性细菌中产生的LPS是败血症性休克的发病机理中主要 的致病因子(Glausner等，Lancet 338：732.1991)。通过单次注 射LPS进动物中的确可在实验上诱导类似休克的状态。由细胞相应LPS 而产生的分子可直接或间接地靶向病原体。虽然这些生物反应可保护 宿主对抗侵入的病原体，但它们也可导致伤害。因此，由于严重的革 兰氏阴性细菌感染而发生的先天免疫的大量刺激，导致细胞因子和其 它分子的过量产生，以及致命性的综合征即败血症性休克综合征的发 生，其表征为发热、低血压、播散性血管内凝血和多器官衰竭(Dumitru 等，Cell 103：1071-1083，2000)。
LPS的这些毒性作用通常与导致多种炎症介质释放的巨噬细胞活 化相关。在这些介质中，TNF显示起了重要作用，如通过施用中和性 抗-TNF抗体来预防LPS毒性所说明的(Beutler等，Science 229：869， 1985)。已很好地确定了，将大肠杆菌的LPS肺部注射进C57B1/6小 鼠中将会导致循环IL-6、TNF-α、IL-1以及急性期蛋白质(例如，SAA) 在注射约2小时后显著增加。由于对抗这些介质的被动免疫可导致死 亡率减小，LPS的毒性显示可通过这些细胞因子调节(Beutler等， Science 229：869，1985)。用于预防和/或败血症性休克的可能 的免疫干扰方案包括抗-TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和 G-CSF。由于LPS诱导可能有助于内毒素血症病理学的促炎因子的产 生，通过对抗IL-31多肽来中和IL-31活性、SAA或其它促炎因子可 用于减轻内毒素血症的症状，例如在内毒素性休克中观察到的症状。 其它潜在的剂包括本发明的IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多 肽和多聚受体多肽，或者抗IL-31抗体或结合伴侣等。
3.炎性肠病IBD
在美国，约500000人患有炎性肠病(IBD)，其可影响结肠和直 肠(溃疡性结肠炎)或两者、小肠和大肠(克隆氏病)。这些疾病的 发病机理尚未清楚，但它们伴随有受影响组织的慢性炎症。潜在的治 疗剂包括本发明的IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体 多肽，或抗IL-31抗体或结合伴侣等，可作为用于减轻IBD和相关疾 病中的炎症和病理学影响的有用剂。
溃疡性结肠炎(UC)是一种大肠(通常称为结肠)炎性疾病，表 征为结肠的粘膜或最内层膜发炎和溃烂。该炎症导致结肠频繁地排空， 导致腹泻。症状包括粪便松散以及伴随的腹部绞痛、发热和体重减轻。 虽然尚未知道UC的准确原因，但最近的研究显示，身体的自然防御对 抗身体认为是外来物的体内蛋白质(“自身免疫反应”)。可能因为 它们类似肠内的细菌蛋白质，这些蛋白质可激起或刺激炎性过程，开 始破坏结肠内膜。由于结肠的内膜受损，溃疡形成，释放出粘液、脓 液和血液。该疾病通常开始于直肠区域并可最终延伸到整个大肠。炎 症的反复发作导致具有瘢痕组织的肠和直肠的壁增厚。严重的疾病可 发生结肠组织的死亡或脓毒症。溃疡性结肠炎的症状在严重性程度不 同，并且它们的发作可以是逐渐发生的或突然发作的。发作可由许多 因素引起，包括呼吸道感染或压力。
虽然目前不能获得对UC的治愈，但集中于抑制结肠内膜中的 异常炎性过程。包括皮质激素免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、巯嘌呤 和甲氨喋呤)和氨基水杨酸盐的剂可用于该疾病。然而，免 疫抑制剂例如皮质激素和硫唑嘌呤的长期使用可产生严重的副作用， 包括使骨变薄、白内障、感染，以及肝和骨髓效应。在当前不起 作用的患者中，手术是一种选择。手术包括整个结肠和直肠的切除。
存在多个可部分模拟慢性溃疡性结肠炎的动物模型。最广泛使用 的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱发的结肠炎模型，其 在结肠内诱导了慢性炎症和溃疡。当将TNBS通过直肠内滴注引入易感 小鼠的结场内时，它在结肠粘膜中诱发了T-细胞介导的免疫应答，在 该情况中导致大块的粘膜炎症，表征为T-细胞和巨噬细胞的密集浸润 整个大肠壁。此外，该组织病理学现象伴随有体重逐渐减轻(消瘦)、 血性腹泻、直肠脱出以及大肠壁增厚的临床现象(Neurath等，Intern. Rev.Immunol.19：51-62，2000)。
另一结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，其可诱导通过血性 腹泻、体重减轻、结肠缩短以及有中性粒细胞浸润的粘膜溃疡形成为 征候的急性结肠炎。DSS-诱导的结肠炎在组织学上表征为炎症细胞浸 润进固有层中，伴随有淋巴样增生、病灶性隐窝损伤和上皮溃疡。这 些变化认为是由于DSS对上皮组织的毒性作用，并通过对固有层细胞 的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生而发生。尽管它的普遍使用， 有关DSS的机制与人疾病的相关性的多个问题仍然未得到解决。DSS 被认为是一种T细胞-非依赖性模型，因为它可在T细胞-缺陷的动物 例如SCID小鼠中观察到。
将抗-IL-31抗体或结合伴侣、含有可溶性IL-31RA的多肽(包括 异二聚受体和多聚受体)，例如IL-31RA-Fc4或其它IL-31RA可溶蛋 白和融合蛋白施用至这些TNBS或DSS模型，可用于评估IL-31拮抗剂 改善症状并改变胃肠道病症的病程的用途。IL-31可在结肠炎的炎症 应答中起作用，并且通过施用IL-31拮抗剂中和IL-31活性是IBD的 潜在方法。其它潜在的剂包括本发明的IL-31RA多肽、可溶 性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或者抗IL-31抗体或结合伴侣等。
4.银屑病
银屑病是一种影响7百万以上的美国人的慢性皮肤病。当新皮肤 细胞异常生长，导致在老皮肤还未足够迅速脱落处的皮肤的发炎、肿 胀且呈鳞状的斑块时发生银屑病。斑块状银屑病(最常见的形式)的 特征是覆盖有银白鳞片的发炎的皮肤斑块(“损伤”)。银屑病可 以限于一些斑块或涉及中度至大面积范围的皮肤，最普遍出现在头皮、 膝、肘和躯干上。虽然它是非常明显的，但银屑病不是一种接触性传 染病。该疾病的发病机理涉及受影响组织的慢性炎症。本发明的 IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或抗IL-31 抗体或结合伴侣等可作为用于减轻银屑病、其它炎性皮肤病、皮肤和 粘膜变态反应以及相关疾病中的炎症和病理学影响的有用剂。
银屑病是一种T-细胞介导的炎性皮肤障碍，其可以引起相当的不 适。它是一种不可治愈且侵袭所有年龄段的人的疾病。银屑病影响了 约百分之二的欧洲和美国人口。虽然患有轻度银屑病的个体通常可用 局部用药剂来控制他们的疾病，但世界范围内多于一百万的患者需要 紫外线或全身性免疫抑制。不幸的是，紫外线照射的不便和风险 以及许多疗法的毒性限制了对它们的长期使用。而且，在一些情况下， 患者通常会复发银屑病。
从已知具有重要免疫生物学功能以及含有在免疫系统中起作用的 细胞的组织中分离IL-31。IL-31在CD3+选择的，活化的外周血细胞 中表达，并且已显示，IL-31的表达在T细胞活化后增强。此外，在 这里的实施例部分描述的实验结果表明，本发明的多肽可影响单核细 胞/巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞和/或分化状态的单核细胞/ 巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞或这些细胞的祖细胞的生长/扩 张。既刺激造血祖细胞的增殖又活化成熟细胞的因子通常已知，可是， 增殖和激活还需要另外的生长因子。例如，研究已显示，IL-7和青灰 因子(Steel Factor)(c-kit配体)是NK祖细胞集落形成所需的。 IL-15+IL-2与IL-7和青灰因子组合是更有效的(Mrózek等，Blood 87：2632-2640，1996)。然而，未鉴定的细胞因子可能是NK细胞和/ 或NK祖细胞的特异性亚的增殖所需的(Robertson等，Blood 76：2451-2438，1990)。同样，IL-31可单独或与其它细胞因子一致 或者协同作用，来提高单核细胞/巨噬细胞、T-细胞、B-细胞或NK细 胞分化的生长、增殖扩张和修饰。
本发明提供了用于抑制单核细胞/巨噬细胞的活化或分化的方法。 单核细胞是不完全分化的细胞，其迁移至它们成熟和变成巨噬细胞的 多种组织中。巨噬细胞通过递呈抗原至淋巴细胞来在免疫应答中起重 要作用，并且通过分泌许多细胞因子来作为淋巴细胞的辅助细胞而起 支持性作用。巨噬细胞可内化细胞外的分子，并且一旦激活就具有增 强的杀死细胞内微生物和肿瘤细胞的能力。活化的巨噬细胞还参与刺 激急性或局部性炎症。
给定细胞因子的受体的组织分布为该细胞因子的可能作用位点提 供了强的指示。IL-31RA的表达可在单核细胞和B-细胞中观察到，一 旦激活CD3+、CD4+和CD8+ T-细胞，表达就会显著增加。另外，两种 单核细胞系，THP-1(Tsuchiya等，Int.J.Cancer 26：171-176，1980) 和U937(Sundstrom等，Int.J.Cancer 17：565-577，1976)也对 IL-31RA表达呈阳性。
据报道OSMR的表达是非常广泛的(Mosley等，JBC 271：32635-32643，1996)。IL-31RA和OSM受体的这种分布支持IL-31 在免疫应答，尤其是T-细胞在激活时的扩张中的作用，或者支持它在 免疫系统的单核细胞/巨噬细胞武装中的作用。
因此，本发明特别的实施方案集中于将可溶性IL-31RA/OSMR异二 聚体在炎性和免疫性疾病或病症，例如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、 胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、炎性肠病(IBD)、 克隆氏病、结肠癌和肠癌、憩室病、自身免疫性疾病、脓毒症、器官 或骨髓移植、由损伤、手术或感染引起的炎症、淀粉样变性病、脾大、 移植物抗宿主病中用作拮抗剂；并且其中抑制炎症、抑制免疫、减少 造血细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细胞、T-细胞(包 括Th1和Th2细胞，CD4+和CD8+细胞)的增殖，抑制病原体或抗原的 免疫应答。此外，IL-31RA表达在活化的免疫细胞例如活化的CD4+ 和CD19+细胞中的存在说明，IL-31RA受体可能参与对抗外来侵入物： 例如微生物和细胞碎片的身体免疫防御反应，并且能够在炎症和癌症 形成中的免疫应答中起作用。这样，对抗或拮抗IL-31RA受体功能的 本发明抗体和结合伴侣，例如IL-31可用于调节免疫应答和炎症。
IL-31可能可用于免疫系统的抑制，例如用于在自身免疫性 疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病、炎性肠病、克 隆氏病等。免疫抑制还可用来减小对组织或器官移植物和嫁接物的排 斥，并用于通过抑制受影响的细胞类型的增殖来T-细胞、B-细胞 或单核细胞-特异性白血病或淋巴瘤，以及其它癌。此外，IL-31可用 来检测单核细胞、巨噬细胞和活化的T-细胞，并帮助诊断这种自身免 疫性疾病，尤其是其中单核细胞升高或活化的疾病状态。
IL-31多肽、肽、抗体等还可在用于检测循环的IL-31水平的诊 断系统中使用。在相关的实施方案中，特异性结合IL-31多肽的抗体 或其它制剂可用来检测循环的IL-31多肽。升高或降低水平的配体多 肽可指示病理状态，包括癌。IL-31多肽可能有助于病理过程，并可 作为潜在疾病的间接标记。
而且，本领域的技术人员应该会认识到IL-31的拮抗剂是有用的。 例如，在动脉粥样硬化病患中，异常之一是单核细胞/巨噬细胞定位于 上皮细胞。这些病患可以通过利用IL-31拮抗剂预防。抗-IL-31抗体 (例如，IL-31中和抗体)、IL-31RA可溶性受体、异二聚体和多聚体， 以及IL-31结合伴侣也可用作IL-31的拮抗剂。此外，单核母细胞白 血病与多种临床异常有关，所述的临床异常反应了巨噬细胞的生物产 物的释放，实例包括血清和尿液中高水平的溶菌酶以及高热。而且， 这种白血病表现出单核细胞的异常增加。这些效应可能可通过IL-31 拮抗剂，例如在此描述的IL-31拮抗剂预防。此外，如在此描述的， 抗IL-31可与分子例如毒性部分和细胞因子缀合，来引导杀死白血病 的单核细胞。
由于IL-31以T-细胞、巨噬细胞和单核细胞-特异性的方式表达， 并且这些疾病涉及单核细胞异常，例如细胞增殖、功能、定位和激活， 本发明的多核苷酸、多肽和抗体可用作诊断剂来检测这种单核细胞的 异常，并指示疾病的存在。该方法包括从患者中提取生物样品，例如 血液、唾液或活组织检查，并将其与正常的对照样品比较。组织学方 法、细胞学方法、流式细胞计数方法、生物化学方法和其它方法可用 于测定与正常对照比较的患者样品中IL-31，或表达IL-31的细胞即 单核细胞的相应水平或位置。与对照比较，IL-31表达水平的变化(增 加或减少)或单核细胞的数量或位置的变化(例如，单核细胞在它们 通常不存在的组织中增加或浸润)将指示疾病。这种诊断方法还可包 括使用连接至本发明的多聚核苷酸、多肽或抗体的放射性标记、荧光 标记以及比标记。这些方法是本领域熟知的并在这里公开。
已经显示IL-31在活化的单核细胞中表达，并且可能参与调节炎 症。这样，可以检测和利用本发明的多肽调节炎症的能力，或可用作 炎症标记。用于测定IL-31的促炎症反应和抗炎性质的方法是本领域 已知的，并在此讨论。此外，它可参与上调急性期反应物，例如血清 淀粉样蛋白A(SAA)、α1-抗糜蛋白酶和结合珠蛋白的产生，而且一 旦体内注入参与炎症应答的脂多糖(LPS)，IL-31RA受体配体的表达 可增加(Dumoutier，L等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149， 2000)。急性期蛋白质例如SAA的产生被认为是其中炎症是有利的短 期幸存机制；然而，急性期蛋白质保持更长时间促进慢性炎症并对人 健康有害。综述可参见Uhlar，CM和Whitehead，AS，Eur.J.Biochem. 265：501-523，1999，以及Baumann H.和Gauldie，J.Immunology Today 15：74-80，1994。此外，急性期蛋白质SAA涉及一些慢性炎性 疾病的发病机理，涉及动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，并且是淀粉 样变性病中沉积的淀粉样A蛋白的前体(Uhlar，CM和Whitehead，同 上)。因此，如果配体例如IL-31用作促炎分子并诱发SAA的产生， 拮抗剂可用于与由该配体诱导的急性期反应蛋白质相关的炎性疾 病和其它疾病。这种拮抗剂由本发明提供。例如，减轻炎症的方法包 括，施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的IL-31，或抗 -IL-31抗体(例如中和抗体)的组合物。此外，抑制患有炎症的哺乳 动物中的炎症应答的方法可包括：(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平； (2)施用可药用载体中的含有如在此描述的IL-31多肽或抗-IL-31 抗体的组合物；(3)测定施用后的血清淀粉样A蛋白水平；(4)将 步骤(1)中的血清淀粉样A蛋白水平与步骤(3)中的血清淀粉样A 蛋白水平比较，其中血清淀粉样A蛋白水平未增加或减少表明抑制了 炎症应答。
像IL-31，分析对应其IL-31RA受体cDNA的mRNA的组织分布显 示，mRNA水平在单核细胞和前列腺细胞中最高，并且在活化的单核细 胞，以及活化的CD4+、活化的CD8+，和活化的CD3+细胞中升高。因 此，IL-31RA受体还涉及诱导炎症应答和免疫应答。因此，本发明特 定的实施方案指向于IL-31-抗体和IL-31，以及可溶性IL-31RA受体 异二聚体在炎性和免疫性疾病或病症，例如胰腺炎、I型糖尿病 (IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、炎性 肠病(IBD)、克隆氏病、结肠癌和肠癌、憩室病、自身免疫性疾病、 脓毒症、器官或骨髓移植、由损伤、手术或感染引起的炎症、淀粉样 变性病、脾大、移植物抗宿主病中用作拮抗剂；并且其中抑制炎症、 抑制免疫、减少造血细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细 胞、T-细胞(包括Th1和Th2细胞，CD4+和CD8+细胞)的增殖，抑制 病原体或抗原的免疫应答。此外，IL-31RA受体和IL-31表达在活化 的免疫细胞例如活化的CD3+、单核细胞、CD4+和CD19+细胞中的存在 说明，IL-31RA受体可参与对抗外来侵入物：例如微生物和细胞碎片 的身体免疫防御反应，并且能够在炎症和癌形成过程中的免疫应答中 起作用。这样，对抗或拮抗IL-31RA受体功能的本发明IL-31和IL-31- 抗体可用于调节免疫应答和炎症。
结合IL-31RA受体多肽的IL-31多肽，以及IL-31RA受体的抗体 可用于：
1)在急性炎、由创伤、组织损伤、手术、脓毒症或感染引发 的炎症，以及慢性炎性疾病例如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、 脾大、类风湿性关节炎、复发性急性炎性发作(例如结核病)，以及 淀粉样变性病和动脉粥样硬化、卡斯尔曼氏病、哮喘，以及其它 与诱导急性期反应相关的疾病中，对抗或阻断经由含有IL-31RA的受 体的信号传导。
2)在自身免疫性疾病例如IDDM、多发性硬化症(MS)、全 身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD中，对抗 或阻断经由IL-31RA受体的信号传导预防或抑制免疫细胞(例如淋巴 细胞、单核细胞、白细胞)中的信号传导(Hughes C等，J.Immunol 153：3319-3325，1994)。备选地，抗体例如IL-31的单克隆抗体(MAb) 也可用作拮抗剂来消灭不希望有的免疫细胞，用以自身免疫性疾 病。哮喘、变态反应和其它特应性疾病可用对抗IL-31的MAb，例如 抗IL-31抗体、可溶性IL-31RA受体或IL-31RA/CRF2-4异二聚体治 疗，来抑制免疫应答或清空攻击性细胞。使用本发明的多肽和抗体阻 断或抑制经由IL-31RA的信号传导，也可有益于胰腺、肾、垂体和神 经细胞的疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌可能受益。IL-31RA可 用作癌的MAb的靶标，其中对抗性MAb抑制了癌生长并靶向免疫- 介导杀死。(Holliger P.和Hoogenboom，H：Nature Biotech.16： 1015-1016，1998)。可溶性IL-31RA受体单体、同型二聚体、异二聚 体和多聚体的Mab也可用于肾病，例如肾小球硬化症、膜性神经 病变(membranous neuropathy)、淀粉样变性病(其在其它组织中也 影响肾)、肾动脉硬化症、多种起因的肾小球炎、肾的纤维增生性疾 病，以及与SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、肾肿瘤和其它疾病相 关的肾机能障碍。
3)在自身免疫性疾病例如IDDM、MS、SLE、重症肌无力、类 风湿性关节炎和IBD中，激动或激发经由IL-31RA受体的信号传导。 IL-31可传递信号给淋巴细胞或其它免疫细胞进行分化、改变增殖或 改变改善自身免疫的细胞因子或细胞表面蛋白的生产。特别是，调节 T-辅助细胞对改变模式的细胞因子分泌的响应可以偏离自身免疫应 答，来改善疾病(Smith JA等，J.Immunol.160：4841-4849，1998)。 同样，IL-31可用来传递信号、排除和偏离涉及哮喘、变态反应和特 应性疾病的免疫细胞。经由IL-31RA受体的信号传导也可有益于胰腺、 肾、垂体和神经细胞疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌可能受益。 IL-31RA可以用作胰腺癌的MAb的靶标，其中信号MAb抑制了癌 生长并靶向免疫-介导的杀伤(Tutt，AL等，J Immunol 161：3175-3185， 1998)。同样，T-细胞特异性的白血病、淋巴瘤、浆细胞恶性增生(例 如多发性骨髓瘤)以及癌瘤可用本发明的，含有IL-31RA的可溶性受 体的单克隆抗体(例如，中和抗体)。
在如上描述的自身免疫性疾病、特应性疾病、NIDDM、胰腺炎和肾 机能障碍的中，在此描述的抗-IL-31抗体、可溶性IL-31RA受体 单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体的多肽可用来中和/阻断 IL-31RA受体配体活性。
抗IL-31抗体和含有可溶性IL-31RA的受体可用作IL-31的拮抗 剂。这种拮抗作用可通过直接中和或结合它的天然配体来实现。除了 拮抗效用，可溶性受体可结合IL-31并作为载体或载体蛋白，以便运 输IL-31到体内的不同组织、器官和细胞。同样，可溶性受体可与引 导可溶性受体-配体复合物至特定位点，例如组织、特定免疫细胞、单 核细胞或肿瘤的分子、多肽或化学部分融合或偶联。例如，在急性感 染或一些癌中，炎症和局部急性期反应蛋白质的诱导可产生益处。因 此，在此描述的可溶性受体或本发明抗体可用于特异性地引导促炎 IL-31配体的作用。参见，Cosman，D.Cytokine 5：95-106，1993， 以及Fernandez-Botran，R.Exp.Opin.Invest.Drugs 9：497-513， 2000。
通常，施用的IL-31多肽(或IL-31RA类似物或融合蛋白)的剂 量将会不同，其取决于这些因素：患者的年龄、体重、身高、性别、 一般的医学状态和既往病史。通常，期望提供给受试者约1pg/kg至 10mg/kg(剂量/患者的体重)范围的IL-31多肽剂量，但也可按详情 所指示的施用更低或更高的剂量。本领域中的技术人员可采用本领域 已知的方法，容易地确定这种剂量以及对它的调整。
施用IL-31多肽给受试者可以是局部、吸入、静脉内、动脉内、 腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、通过局部导管灌注，或通过直 接病患处注射。当通过注射施用用蛋白质时，施用可以是通过连 续输注或通过单次或多次推注。
另外的施用途径包括经口、经粘膜、经肺和经皮。经口递送适合 于聚酯微球、玉米醇溶蛋白微球、类蛋白微球体、聚腈基丙烯酸酯微 球，以及基于脂质的系统(参见，例如DiBase和Morrel，“Oral Delivery of Microencapsulated Proteins，”in Protein Delivery： Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 255-288 (Plenum Press 1997))。鼻内递送的可行性通过胰岛素施用的这样一 种模式来举例说明(参见，例如Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev 35：199(1999))。可制备含有IL-31的干的或流体颗粒 并借助于干粉分散剂、液体烟雾发生器或喷雾器吸入(例如Pettit 和Gombotz，TIBTECH 16：343(1998)；Patton等，Adv.Drug Deliv. Rev.35：235(1999))。这种方法可通过AERX糖尿病系统来举例 说明，其为递送雾化的胰岛素进入肺中的手持电动吸入器。研究已显 示，48000kDa大小的蛋白质已借助于低频率的超声以用浓度递 送穿过皮肤，这说明了经皮施用的可行性(Mitragotri等，Science 269：850(1995))。采用电穿孔的经皮服递送提供了另一种施用具有 IL-31结合活性的分子的方法(Potts等，Pharm.Biotechnol.10：213 (1997))。
含有具有IL-31结合活性的蛋白质、多肽或肽的药物组合物可根 据制备可药用组合物的已知方法配制，从而将用蛋白质与可药用 载体组合进混合物中。如果组合物的施用是受试患者耐受的，则该组 合物称为“可药用载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是可药用载体的一个 实例。其它合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如Gennaro (ed.)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，19th Edition(Mack Publishing Company 1995)。
为目的，将具有IL-31结合活性的分子和可药用载体以 有效量施用给患者。如果施用的剂量是生理学上有效的，则具有IL-31 结合活性的蛋白质、多肽或肽以及可药用载体的组合称为以“有 效量”施用。如果制剂的存在导致受试患者的生理发生可检测的变化， 则该制剂是生理学上有效的。例如，如果用于炎症的制剂的存在 缓和了至少一部分炎症应答，则该制剂是生理学有效的。
含有IL-31(或IL-31类似物或融合蛋白)的药物组合物可以流 体形式、气溶胶或固体形式提供。流体形式通过可注射溶液、气溶胶、 小滴、局部溶液剂(topological solution)和口服混悬剂来举例说 明。示例性的固体形式包括胶囊剂、片剂和控释剂型。后面的形式通 过微渗透泵(miniosmotic pump)和埋植剂举例说明(Bremer等，Pharm. Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade and Hollinger (eds.)，pages 95-123(CRC Press 1995)；Bremer等，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 239-254(Plenum Press 1997)；Yewey等，“Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant，”in Protein Delivery：Physical Systems， Sanders和Hendren(eds.)，pages 93-117(Plenum Press 1997))。 其它固体形式包括乳剂、糊剂、其它局部用敷贴剂(topological applications)等。
在此公开的抗IL-31抗体还可制备成免疫脂质体。含有抗体的脂 质体可通过本领域已知的方法，例如在Epstein等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，82：3688(1985)、Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77：4030(1980)，以及美国专利4485045和4544545中描述的 方法制备。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利5013556中公 开。
特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷 脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，通过反相蒸发法制备。将脂质 体挤出通过确定孔径的过滤器来获得具有期望直径的脂质体。本发明 抗体的Fab’片段可通过二硫互换反应，如Martin等，J.Biol.Chem. 257：286-288(1982)中描述的，与脂质体缀合。化学剂(例如阿 霉素)可任选包含于脂质体中。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
抗体的用制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选生理可接受 载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或含水溶液剂形式制备用于 储存(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol， A.Ed.(1980))。所采用的量和浓度的可接受载体、赋形剂或稳定剂 是对受试者无毒性的，并且包括缓冲剂例如磷酸、柠檬酸和其它有机 酸；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(例如十八烷基二 甲基苄基氯化铵、氯己双铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙铵、苯酚、丁 醇或苯甲醇、烷基对羟苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲 酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子 量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免 疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨 酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类 包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、 海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋 白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TweenTM、PluronicsTM 或聚乙二醇(PEG)。
根据接受的特殊适应症的需要，这里的制剂还可包含多于一 种的活性化合物，优选具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性 化合物。例如，在一种制剂中另外提供结合IL-31的抗体可能是期望 的。备选地，或此外，组合物可含有化学剂或细胞因子。该分子 适合以有效用于期望目的的量组合。
也可将活性成分圈闭(entrap)于分别通过，例如凝聚技术或通 过界面缩聚法制备的微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚 合(甲基丙烯酸甲脂)微胶囊中，或圈闭于胶质药物递送系统(如， 脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒和纳米胶囊)中或巨乳液中。 这类技术在Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition， Osol，A.Ed.(1980)中公开。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这容易通过滤过无菌滤膜完 成。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括，含有抗体的固体疏 水性聚合物的半透性基质，该基质是成形的商品形式，例如薄膜或微 胶囊剂。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟乙基-甲基丙 烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号：3773919，在此 将其通过全文引入作为参考)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚 物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如 Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注 射微球体)和聚-D-(-)3-。聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳 酸-羟基乙酸能够使分子释放超过100天，而某些水凝胶在较短时间段 内释放蛋白质。当胶囊包封的抗体长时间保留在体内时，它们由于暴 露于37℃的潮湿中而可能变性或聚集，导致生物活性丧失并可能使免 疫原性改变。取决于所涉及的机理，可设计合理的策略来稳定。例如， 如果发现聚集机理是通过硫-二硫化物互换而形成分子间的S--S键， 则稳定可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中低压冻干、控制湿度、采 用合适的添加剂，以及研发出特殊的聚合物基质组合物来实现。
脂质体提供了一种静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下，或通过 经口施用、吸入或鼻内施用递送多肽给受试者的方法。脂质体是 由围绕含水小室的一个或多个脂质双层膜组成的微小囊泡(通常，参 见Bakker-Woudenberg等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs 46：618(1993)，和Ranade， “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers，” in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 3-24 (CRC Press 1995))。脂质体在组成上与细胞膜类似并因此，脂质体 可安全地施用并且是可生物降解的。取决于制备方法，脂质体可以是 单层或多层的，并且脂质体可在大小方面不同，直径范围是0.02μm 至大于10μm。多种制剂可包被于脂质体中：疏水性制剂分配于双分 子层中，而亲水性制剂分配于内部的含水空间内(参见，例如Machy 等，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)，以及Ostro等，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。 此外，有可能通过改变脂质体大小、双分子层数量、脂质组分，以及 脂质体的电荷和表面特性来控制所包被的制剂的可用性。
脂质体几乎可吸附至任何类型的细胞并随后缓慢释放所包被的制 剂。备选地，吸附的脂质体可通过吞噬性的细胞内吞。内吞作用后， 进行脂质体脂质的溶酶体内降解并释放所包被的制剂(Scherphof等， Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。在静脉内施用后，小脂 质体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝和脾中的网状内皮系统的细 胞吸收，而大于3.0μm的脂质体则沉积于肺中。网状内皮系统的细 胞对较小脂质体的优先吸收已用于递送化学剂至巨噬细胞以及递 送至肝的肿瘤中。
可通过多种方法，包括用大剂量的脂质体颗粒饱和，或通过药理 学方法进行选择性的巨噬细胞失活来避开网状内皮系统(Claassen 等，Biochim.Biophy s.Acta 802：428(1984))。另外，将糖脂-或 聚乙二醇-衍生的磷脂整合进脂质体膜中已显示导致网状内皮系统的 吸收明显减少(Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1068：133(1991)、 Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。
脂质体还可通过改变磷脂成分或通过插入受体或配体进脂质体中 来制备成靶向特定的细胞或器官。例如，用高含量的非离子型表面活 性剂制备的脂质体已用于靶向肝脏(Hayakawa等，Japanese Patent 04-244，018、Kato等，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。这些 制剂通过这样制备：将大豆磷脂酰胆碱、维生素E和乙氧基化的氢化 蓖麻油(HCO-60)在甲醇中混合，真空下浓缩该混合物，并随后用水 重构该混合物。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与源于大豆的甾基糖苷 混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体制剂也显示靶向肝脏(Shimizu 等，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
备选地，多种靶向配体(targeting ligand)可结合至脂质体的 表面，例如抗体、抗体片段、糖类、维生素和运输蛋白。例如，脂质 体可用分支型的半乳糖苷脂衍生物修饰，以靶向专一地在肝细胞表面 上表达的去唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体(Kato和Sugiyama，Crit.Rev. Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)、Murahashi等，Biol.Pharm. Bull.20：259(1997))。同样，Wu等，Hepatology 27：772(1998) 已显示，用无唾液酸基胎球蛋白标记脂质体导致脂质体的血浆半衰期 缩短，并显著提高了肝细胞对无唾液酸基胎球蛋白-标记的脂质体的吸 收。在另一方面，含有分支型半乳糖脂衍生物的脂质体的肝积聚可通 过预先注入无唾液酸基胎球蛋白来抑制(Murahashi等，Biol.Pharm. Bull.20：259(1997))。聚氰化的(Polyaconitylated)的人血清 白蛋白脂质体提供了用于靶向脂质体至肝细胞的另一种方法(Kamps 等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 94：11681(1997))。此外，Geho 等，U.S.Patent No.4,603,044描述了定向肝细胞的脂质体小囊泡 递送系统，其对与肝脏专门的代谢细胞有关的肝胆受体具有特异性。
具有IL-31结合活性的多肽可用蛋白质微胶囊化的标准技术包被 于脂质体中(参见，例如Anderson等，Infect.Immun.31：1099 (1981)、Anderson等，Cancer Res.50：1853(1990)，以及Cohen等， Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)、Alving等，“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies，”in Liposome Technology，2nd Edition，Vol.III，Gregoriadis(ed.)，page 317 (CRC Press 1993)、Wassef等，Meth.Enzymol.149：124(1987))。 如上提到的，在上有用的脂质体可含有多种成分。例如，脂质体 可含有聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。
已经设计了可降解的聚合物微球来保持高系统性水平的性蛋 白质。微球从可降解的聚合物例如聚乙丙交酯(PLG)、聚酐、聚(原 酸酯)、非生物可降解的乙基乙烯基醋酸酯聚合物制备，其中蛋白质被 圈闭于聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332 (1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages 51-93(CRC Press 1995)；Roskos和Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 45-92(Plenum Press 1997)；Bartus等，Science 281：1161(1998)； Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney， Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)-包被 的毫微球还可提供用于静脉内施用用蛋白质的载体(参见，例如 Gref等，Pharm.Biotechnol 10：167(1997))。
其它剂型可由本领域的那些技术人员设计，如例如由Ansel和 Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems， 5th Edition(Lea&Febiger 1990)，Gennaro(ed.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition(Mack Publishing Company 1995)，以及由Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)所显示的。
作为一个示例性说明，药物组合物可作为试剂盒提供，所述试剂 盒包括含有IL-31多肽或IL-31拮抗剂(例如结合IL-31多肽的抗体 或抗体片段)的容器。用多肽可以单次剂量或倍剂量的可注射溶 液剂的形式提供，或作为将在注射前重构的无菌粉剂提供。备选地， 这种试剂盒可包含用于施用用多肽的干粉扩散器、液体烟雾发生 器或喷雾器。
在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体 包括特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆抗体， 其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述的杂交瘤由美 国典型菌种保藏中心储存，具有选自下列的ATCC专利保藏名称：a) ATCC专利保藏名称PTA-6815、b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、c) ATCC专利保藏名称PTA-6829、d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、e) ATCC专利保藏名称PTA-6831、f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、g) ATCC专利保藏名称PTA-6872、h)ATCC专利保藏名称PTA-6875， 以及i)ATCC专利保藏名称PTA-6873。在一实施方案中，该抗体中和 了IL-31(SEQ ID NO：2)与IL-31RA(SEQ ID NO：5)的相互作用。 在另一个实施方案中，抗体是(a)鼠单克隆抗体、(b)源自(a)的 人源化抗体，或(c)抗体片段，或(d)人单克隆抗体。在另一实施 方案中，抗体进一步含有放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标 记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒或毒素。在另一实施方案中， 抗体另外包含聚乙二醇化。在另一实施方案中，抗体是中和抗体。在 另一实施方案中，施用抗体至哺乳动物抑制、防止、减少或阻断了多 肽的促炎活性。在另一实施方案中，施用抗体至哺乳动物抑制、防止、 减少或阻断了与所述多肽的促炎活性相关的骚抓行为和皮炎。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO： 2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆 抗体，所述的杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列 的ATCC专利保藏名称：a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、b)ATCC专 利保藏名称PTA-6816、c)ATCC专利保藏名称PTA-6871、d)ATCC专 利保藏名称PTA-6829和e)ATCC专利保藏名称PTA-6830。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO： 2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆 抗体，所述的杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列 的ATCC专利保藏名称：a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、b)ATCC专 利保藏名称PTA-6816和c)ATCC专利保藏名称PTA-6871。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO： 2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆 抗体，所述的杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列 的ATCC专利保藏名称：a)ATCC专利保藏名称PTA-6829和b)ATCC 专利保藏名称PTA-6830。
在另一方面，提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2 的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗 体，所述的杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的 ATCC专利保藏名称：a)ATCC专利保藏名称PTA-6872和b)ATCC专 利保藏名称PTA-6875。
在另一方面，提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：11 的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗 体，所述的杂交瘤由美国典型培养物保藏中心保藏，具有ATCC专利 保藏名称PTA-6874。在一个实施方案中，所述抗体是中和抗体。在一 个实施方案中，施用所述抗体至哺乳动物抑制、防止、减少或破坏了 所述多肽的促炎活性。在一个实施方案中，施用所述抗体至哺乳动物 抑制、防止、减少或破坏了与所述多肽的促炎活性相关的骚抓行为和 皮炎。
在另一方面，本发明提供了减轻哺乳动物中的炎症的方法，所述 方法包括施用给哺乳动物一定量的在此描述的IL-31抗体，借此减轻 炎症。
在另一方面，本发明提供了受其中IL-31起作用的炎性疾病 折磨的哺乳动物的方法，所述的方法包括：施用IL-31拮抗剂给该哺 乳动物，这样炎症得以减轻，其中所述拮抗剂包括(i)特异性结合 IL-31RA的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，或者(ii) IL-31RA的多肽或多肽片段；并且其中IL-31的炎性活性得以减少。 在一个实施方案中，所述的疾病是炎性疾病，包括搔痒性疾病。在一 个实施方案中，所述的疾病是特应性皮炎。在一个实施方案中，所述 的疾病是结节性痒疹。
在另一方面，本发明提供了在哺乳动物中减小、抑制或防止其中 IL-31起作用的搔痒症的影响的方法，所述的方法包括：施用IL-31 拮抗剂给哺乳动物，这样搔痒症得以减轻，其中所述的拮抗剂包括(i) 特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2或其片段的多肽的多肽或多 肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，并且其中IL-31的骚痒行为得 以减少。在一个实施方案中，哺乳动物的疾病是特应性皮炎。在一个 实施方案中，哺乳动物的疾病是皮炎。在一个实施方案中，抗体是如 在此描述的抗体。
在另一方面，本发明提供了在哺乳动物中减小、抑制或防止其中 IL-31起作用的搔痒症的影响的方法，所述的方法包括：施用IL-31 拮抗剂给哺乳动物，这样使得哺乳动物中的骚痒得以减轻，其中所述 的拮抗剂包括(i)特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，或其片 段的多肽的多肽或多肽片段的抗体、抗体片段或结合多肽，并由此 IL-31的搔抓活性得以减少。在一个实施方案中，哺乳动物的疾病是 特应性皮炎。在一个实施方案中，哺乳动物的疾病是皮炎。在一个实 施方案中，抗体是如在此描述的抗体。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO： 2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由选自以下杂交瘤克隆 名称号产生的单克隆抗体：a)克隆292.12.3.1(ATCC专利保藏名称 PTA-6815)、b)克隆292.63.5.3(ATCC专利保藏名称PTA-6829)、 c)克隆292.72.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6816)、d)克隆 292.84.1.6(ATCC专利保藏名称PTA-6871)和e)克隆292.118.6.4 (ATCC专利保藏名称PTA-6830)。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有氨基酸序列SEQ ID NO： 2的多肽的单克隆抗体，其中该多肽能够结合由选自以下杂交瘤克隆 名称号产生的单克隆抗体：a)克隆294.35.2.6.3(ATCC专利保藏名 称PTA-6872)、b)克294.144.3.5(ATCC专利保藏名称PTA-6873)、 c)克隆294.154.5.6(ATCC专利保藏名称PTA-6875)和d)克隆 294.163.2.1(ATCC专利保藏名称PTA-6831)。
在另一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体 包括能够竞争结合含有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的单克隆抗体， 其中所述的多肽能够结合由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述的杂交瘤 由美国典型培养物保藏中心保藏，具有选自下列的ATCC专利保藏名 称：a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、 c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、 e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、 g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、h)ATCC专利保藏名称PTA-6875， 以及i)ATCC专利保藏名称PTA-6873。
在另一方面提供了杂交瘤，其中该杂交瘤由美国典型培养物保藏 中心保藏，具有选自以下的ATCC专利保藏名称：a)ATCC专利保藏 名称PTA-6815、b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、c)ATCC专利保 藏名称PTA-6829、d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、e)ATCC专利 保藏名称PTA-6831、f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、g)ATCC专 利保藏名称PTA-6872、h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，以及i) ATCC专利保藏名称PTA-6873。
在另一方面，本发明提供了产生IL-31多肽的抗体的方法，所述 的方法包括：用选自下列的多肽给动物接种：(a)由9-141个氨基酸组 成的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO：2中从氨基酸号24(Ser)到氨 基酸号164(Thr)的氨基酸残基的连续序列一致：(b)如上面公开 的多肽；(c)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号38-52)的多 肽；(d)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号83-98)的多肽； (e)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号104-117)的多肽； (f)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号137-152)的多肽； (g)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号38-152)的多肽；(h) 含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(氨基酸号24-164)的多肽；(c)含 有SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号38-52)的多肽；(d)含有 SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号85-98)的多肽；(e)含有 SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号104-118)的多肽；(f)含有 SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号141-157)的多肽；(g)含有 SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号38-157)的多肽；(h)含有 SEQ ID NO：11的氨基酸序列(氨基酸号24-163)的多肽；(i)含有根 据SEQ ID NO：2或SEQ I NO 11的Hopp/Woods亲水性图的抗原表位 的多肽，其中该图是基于6-残基窗口，忽略了埋藏的G、S和T残基 以及暴露的H、Y和W残基；并且其中该多肽在动物中引发免疫应答来 产生抗体；以及从动物体内分离出抗体。
在另一方面，本发明提供了通过如上公开的方法产生的抗体(例 如中和抗体)，其中该抗体结合SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11的多 肽。在一个实施方案中，如上公开的抗体特异性结合在SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：11中显示的多肽。
在另一方面，本发明提供了检测生物样品中IL-31的存在的方法， 所述的方法包括步骤：(a)将生物样品与如上公开的抗体，或抗体片 段接触，其中所述的接触是在允许抗体或抗体片段结合生物样品的条 件下完成，以及(b)检测任意的结合的抗体或结合的抗体片段。
在另一方面，本发明提供了杀死癌细胞的方法，方法包括：从患 者获取含有癌细胞的离体组织或生物样品，或鉴定体内的癌细胞；通 过如在此公开的方法生产多肽；将该多肽配制进可药用载体中；以及 将该多肽施用给患者或让癌细胞暴露于该多肽；其中所述的多肽杀死 癌细胞。在一个实施方案中，杀死癌细胞的方法是如上文中公开的， 其中所述的多肽进一步与毒素缀合。在一个实施方案中，抗体是如上 文中公开的，其中抗体选自：(a)多克隆抗体、(b)鼠单克隆抗体、(c) 源自(b)的人源化抗体、(d)抗体片段，和(e)人单克隆抗体。
在另一方面，本发明提供了特异性结合含有选自下列氨基酸残基 序列的多肽的抗体或抗体片段：(a)如在SEQ ID NO：2中显示的，残 基38(Val)至152(Leu)显示的多肽、(b)如在SEQ ID NO：2中显 示的，残基27(Leu)至164(Thr)显示的多肽、(c)如在SEQ ID NO：2 中显示的，残基24(Thr)至164(Thr)显示的多肽，以及(d)如在 SEQ ID NO：2中显示的，残基1(Met)至164(Thr)显示的多肽。在 另一实施方案中，抗体是如上文中公开的，其中所述抗体另外含有放 射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、 磁性颗粒、药物或毒素。
在另一方面，本发明提供了用于用一种组合物来抑制IL-31-诱导 的造血细胞及造血细胞祖细胞(包括培养的骨髓细胞或外周血细胞) 的增殖和分化的方法，其中所述的组合物含有一定量的如在此描述的 抗体，与缺少可溶性细胞因子受体时培养的骨髓细胞或外周血细胞比 较，所述抗体足以减少骨髓细胞或外周血细胞中造血细胞的增殖或分 化。在一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞 祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中所述的造血细胞和 造血细胞祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，用于抑制 IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上 面公开的，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
在另一方面，本发明提供了减轻IL-31-诱导的炎症的方法，该方 法包括施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的如在此公开的 抗体组合物。
在另一方面，本发明提供了抑制患有炎症的哺乳动物中的炎症应 答的方法，该方法包括：(1)测定炎性分子的水平；(2)施用含有在 可药用载体中的如在此公开的抗体的组合物；(3)测定施用后的炎性 分子的水平；(4)将步骤(1)中的炎性分子水平与步骤(3)中的炎性分子 水平比较，其中炎性分子水平没有增加或炎性分子水平减小指示抑制 了炎症应答。在一个实施方案中，抗体是如上面公开的，其中所述抗 体另外含有放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记、化学发光 标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
在另一方面，本发明提供了用于用一种组合物来抑制IL-31-诱导 的造血细胞及造血细胞祖细胞(包括培养的骨髓细胞或外周血细胞) 的增殖或分化的方法，所述的组合物含有一定量的如在此公开的抗体， 与缺少可溶性细胞因子受体时培养的骨髓细胞或外周血细胞比较，所 述的抗体足以减少骨髓细胞或外周血细胞中造血细胞的增殖或分化。 在一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细 胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中造血细胞和造血细胞祖 细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造 血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中 淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
在另一方面，本发明提供了减轻IL-31-诱导的炎症的方法，该方 法包括施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的如在此公开的 抗体组合物。
在另一方面，本发明提供了抑制患有炎症的哺乳动物中的炎症应 答的方法，该方法包括：(1)测定炎性分子的水平；(2)施用含有 可药用载体中的如在此公开的抗体的组合物；(3)测定施用后的炎性 分子的水平；(4)将步骤(1)中的炎性分子水平与步骤(3)中的炎性分子 水平比较，其中炎性分子水平没有增加或炎性分子水平减小指示抑制 了炎症应答。
在另一方面，本发明提供了受其中IL-31起作用的炎性疾病 折磨的哺乳动物的方法，所述的方法包括：施用IL-31拮抗剂给哺乳 动物，这样炎症得以减轻，其中所述的拮抗剂选自特异性结合IL-31 (SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段的抗体或结合多肽。在一个实施方 案中，受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中 所述的疾病是慢性炎性疾病。在另一个实施方案中，受炎性疾病 折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中所述的疾病选自：炎性 肠病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、特应性皮炎、湿疹和银屑病的慢性 炎性疾病。在另一个实施方案中，受炎性疾病折磨的哺乳动物的 方法是如上面公开的，其中所述的疾病是急性炎性疾病。在另一个实 施方案中，受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的， 其中该疾病选自：内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征和传染性 疾病的急性炎性疾病。在另一实施方案中，受炎性疾病折磨的哺 乳动物的方法是如上面公开的，其中所述抗体另外含有放射性核素、 酶、底物、辅助因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、 药物或毒素。
在另一方面，本发明提供了用于检测患者中的炎症的方法，该方 法包括：从患者体内获取组织或生物样品；在其中抗体可结合组织或 生物样品中它的互补性多肽的条件下，将该组织或生物样品与如在此 公开的抗体一起孵育；显影组织或生物样品中结合的抗体；以及将来 自患者的组织或生物样品中结合的抗体的水平与正常对照组织或生物 样品中结合的抗体的水平比较，其中相对于正常的对照组织或生物样 品，结合患者的组织或生物样品的抗体水平增加指示患者中的炎症。
在另一方面，本发明提供了用于检测患者中的炎症的方法，该方 法包括：从患者体内获取组织或生物样品；标记含有SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：1的补体的至少14个连续核苷酸的多聚核苷酸；在其 中该多聚核苷酸将会与互补的多聚核苷酸序列杂交的条件下，将该组 织或生物样品与如在此公开的多聚核苷酸一起孵育；显影组织或生物 样品中标记的多聚核苷酸；以及将来自患者的组织或生物样品中标记 的多聚核苷酸的杂交水平与正常对照组织或生物样品中的杂交水平比 较，其中相对于正常的对照组织或生物样品，患者的组织或生物样品 中标记的多聚核苷酸的杂交增加指示患者中的炎症。
本发明进一步通过下面的非限制性实例来说明。
实施例
实施例1
大鼠抗-小鼠IL-31MAb的产生
A.大鼠的免疫和血清筛选
将四只3个月大的雌性斯普拉-道来氏大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)用小鼠IL-31免疫。按照每个产商 的说明书，通过腹膜内注入与完全弗氏佐剂(Pierce，Rockford，IL) 组合的～290μg经纯化的重组小鼠IL-31(BHK细胞中产生的)来初 次免疫大鼠，所述的重组小鼠IL-31在C-端处与由序列EYMPME(SEQ ID NO：7)组成的肽融合(在下文中称为mIL31-CEE)。在初次免疫接种 后，在6周期间，每只大鼠每两周通过腹膜内途径接受另外的完全弗 氏佐剂中的150μg mIL-31-CEE。在第三次和第四次免疫接种7天后， 将大鼠经由眶后丛放血并将血清从血液中分离，用于分析它结合溶液 中的mIL-31-CEE的能力，以及其抑制(通过中和测量)mIL-31-CEE 对用小鼠IL-31RA转染的细胞系的刺激活性的能力。
抗血清中的大鼠抗-小鼠IL-31抗体结合mIL-31-CEE的能力可采 用“捕获”型ELISA测定法检测。在该测定法中，将96孔聚苯乙烯 ELISA平板的孔首先用100μL/孔的、在0.1M Na2CO3，pH 9.6中浓 度为500ng/mL的山羊抗-大鼠IgG，Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch)包被。将平板在4℃下孵育过夜，之后吸出未结合 的抗体，并用300L/孔的PBS-Tween(0.137M NaCl、0.0027M KCl、 0.0072M Na2HPO4、0.0015M KH2PO4、0.05％v/v吐温20，pH 7.2)洗 涤平板两次。在室温(RT)下用200L/孔的SuperBlock(Pierce， Rockford，IL)封闭孔5分钟，将SuperBlock从平板中弹去并再一次 重复封闭，之后用PBS-Tween洗涤平板两次。血清的系列10-倍稀释 物(PBS-Tween加上1％w/v牛血清白蛋白(BSA)和0.05％v/v Proclin 300，pH 7.2＝稀释缓冲液中)从1∶1000的最次稀释开始到1∶1000000 来制备。随后，将三份每种稀释物样品转移至测定平板(100μL/孔)， 以便通过分子的Fc部分来结合血清中的大鼠IgG至测定平板上。正常 的大鼠血清用作阴性对照。在RT下孵育1小时后，如上描述的将孔吸 空并洗涤平板两次。然后将浓度为500ng/mL的生物素化的 mIL-31-CEE(12∶1的生物素：蛋白质摩尔比率)加入孔中，100μL/ 孔。在RT下孵育1小时后，将未结合的生物素化的mIL-31-CEE从孔 中吸出，并将平板洗涤两次。随后加入500ng/mL浓度的辣根过氧化 物酶标记的抗生蛋白链菌素(Pierce，Rockford，IL)以100μL/ 孔加入至每个孔中，并在RT下孵育平板1小时。在除去未结合的 HRP-SA后，将平板洗涤5次，将100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB) (BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)加入至每孔中，并在RT 下孵育平板5分钟。通过添加100μL/孔的450nm TMB终止试剂 (BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)来终止显，并在 Molecular Devices Spectra MAX 340仪器中于450nm下读取孔的吸 光度值。
抗血清中的大鼠抗-小鼠IL-31抗体抑制(通过中和测量)小鼠 IL-31通过其同源受体的刺激活性的能力用基于细胞的中和测定法评 估，所述中和测定法采用具有萤光素酶报告系统 (Baf3/KZ134/mcytor17/mOSMRβ)的mIL-31RA/OSMRβ转染的Baf3 细胞系，该报告系统可以通过小鼠IL-31对细胞的刺激来激活。对于 该检测法，制备每种抗血清的检测培养基(RPMI 1640、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1x青毒素-链霉素-新霉素(Invitrogen， Carlsbad，CA))中的最初1∶250稀释物，然后将这些稀释物的每一 种连续2-倍稀释成1∶32000的最终稀释物。加入等体积的mIL-31-CEE 至孔中的每种抗血清稀释物，总体积为100μL，所述的mIL-31-CEE 在检测缓冲液中稀释成4ng/mL。将该抗体/细胞因子混合物在RT下 孵育0.5小时，之后将靶细胞从它们的生长培养基中洗出，调节至 300000个细胞/mL的密度，并以100μL/孔加入抗体/细胞因子混合 物中。含有2ng/mL mIL-31且不含抗血清的检测培养基用作阴性对照， 表示在测定中可达到的最大刺激。在37℃，5％的CO2下孵育16-24 小时后，将平板在1500RPM下离心5分钟，小心地弹去培养基并加入 25μL的1x细胞溶解缓冲液(Promega，Madison，WI)至每个孔中。 将平板在RT下轻微摇动10分钟以使细胞完全溶解，然后将该细胞溶 解产物转移至固体白96孔平板(Corning/Costar 3917，Acton，MA) 中。加入40μL荧光素酶检测底物(Promega)至每孔中。然后，采 用5秒的积分间隔(integration interval)，在光度计上评估孔的 荧光素酶活性(表示STAT报告构建体的IL-31活性)。
“捕获”型ELISA测定法以及基于细胞的中和测定法都表明，所 有这四只大鼠都发生了明显的对mIL-31的抗体应答，但是一只小鼠明 显产生了比其它小鼠更强的反应。总的来说，通过“捕获”ELISA测 量的反应与基于细胞的中和测定法中观察到的反应非常一致，表明 IgG型抗体是造成对mIL-31的抑制的主要原因。
B.融合
在最后的腹膜内免疫接种4周后，将具有最显著的mIL-31中和滴 定度的大鼠用约150ug PBS中的mIL-31-CEE，通过覆膜内注射来进 行最后一次免疫。5天后，采集该小鼠的脾和淋巴结，制备成单一的 细胞悬液并采用本领域已知的标准方法(Harlow，E.和Lane，D.1988. “Antibodies A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)，用PEG 1500将其与以Sp2/0 小鼠骨髓瘤细胞系(Shulman，M等，Nature 276：269-270，1976)以 4∶1的淋巴样细胞∶骨髓瘤细胞比率融合。将该融合混合物与作为饲养 层的BALB/c胸腺细胞一道分配进一系列的96孔平底平板中(Oi，V.T. 和Herzenberg，L.A..1980.“Selected Methods in Cellular Immunology”，B.B.Mishell和S.M.Shiigi，eds.，pp.351-372， Freeman，San Francisco)。在4天后，通过替换70％的培养基和胸 腺细胞给融合平板加料一次，并在两天后再次只提供培养基。在接种 平板融合细部8天后检测孔。
C.融合细胞的筛选
将如上描述的用于mIL-31的“捕获”ELISA用于初步筛选，只是 将杂交瘤上清液未经稀释检测，并相同地将其从培养平板接种到检测 平板上。鉴定了约170个阳性的孔。然后，在先前描述的基于细胞的 中和测定法中，评估来自每个这些孔以及一些阴性孔的上清液抑制 mIL-31的能力。每种上清液在检测培养基中以1∶8终稀释度检测。在 后面的稀释物中，杂交瘤上清液中的非-特异性刺激成分明显减少，这 样它们对观察到的刺激指数起最小的作用。多数上清液显示在某种程 度上中和了mIL-31，它们中约十种表现出基本上完全中和，而剩余的 上清液显示出抑制持续，一直到其中约另外十种上清液显示出具有非 常小(如果有的话)的中和潜能。将约150个“捕获”ELISA阳性孔 中的杂交瘤细胞成功地扩展到24孔平板的培养基中。当24孔培养物 的密度是约4-6x105细胞/mL时，分别收集并储存每孔中的上清液(约 1.5mL)并将每个孔的细胞冷冻保存。
将每种24孔上清液在融合筛选中采用的“捕获”ELISA和基于细 胞的IL-31中和测定法两者中再次分析。另外，将这些上清液也在使 用人IL-31同系物的“捕获”ELISA中检测，所述的人IL-31同系物 也用融合至IL-31分子C-端的EYMPME(SEQ ID NO：7)标签构建，并 也在BHK细胞中产生。结果表明，在扩增后，多数孔的上清液保留了 它们识别溶液中的小鼠IL-31的能力。在这些“捕获”测定阳性孔中， mIL-31的抑制活性从约20种上清液的完全抑制到10-15种上清液的 基本无抑制作用。在捕获测定中未观察到人IL-31-CEE的交叉反应性 表明，大鼠抗-mIL-31抗体都不与人IL-31同系物交叉反应或都不识 别融合至mIL-31-CEE分子C-端的CEE标记。
D.产生中和抗-mIL31 MAb的杂交瘤的选择和克隆
将最高的10个IL-31中和性原版孔(master well)的7个 (271.5.7、271.9.4、271.26.6、271.27.4、271.33.1、271.33.3和 271.39.4)中的细胞克隆，以便分离出产生中和的目标mAb的克隆杂 交瘤。采用标准的低密度稀释(少于每孔1个细胞)法，在存在胸腺 细胞的96孔微量滴定细胞培养平板中克隆上述细胞，并在检测前通过 显微镜检查孔来评估单个生长灶的单克隆性。在接种6天后，通过“捕 获”ELISA筛选平板上的所有孔的mIL-31特异性的IgG。从每个克隆 组收集6-10个对特定mAb呈阳性且源自只有单克隆杂交瘤生长的孔的 上清液，并在“捕获”ELISA以及基于细胞的中和测定法中，在多种 稀释度时对其进行再次筛选，以鉴定“最好的”产生中和mAb的克隆。 这些试验的结果表明，产生适合的中和性mAb的杂交瘤克隆只在组 271.9.4、271.26.6、271.33.1、271.33.3和271.39.4中获得。将这 些组的每组中“最好的”克隆再次克隆，并按所描述的筛选亚克隆以 获得最终的杂交瘤系271.9.4.2.6、271.26.6.6.1、271.33.1.2.2、 271.33.3.2.1和271.39.4.6.5。通过每种这些杂交瘤产生的大鼠IgG 同种型mAb用ELISA测定，所述ELISA采用生物素化的小鼠抗-大鼠 IgG同种型特异性mAb。发现所有这5种mAb都属于IgG1亚型。在布 达佩斯条约下，将杂交瘤271.26.6.6.1作为原始保藏物保藏于美国典 型组织培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)专利保藏所，并给予 ATCC登记号PTA-6874。
让每种完全克隆的，产生抗-小鼠IL-31mAb的杂交瘤适应无杂交 瘤血清的培养基(杂交瘤-SFM，Invitrogen)中生长。将来自在杂交 瘤-SFM中生长的高细胞密度培养物的上清液离心，以除去细胞和细胞 碎片，将其通过0.2m的过滤器过滤并使用本领域已知的标准方法， 通过G蛋白谱来纯化mAb。
E.MAb的体外特异性中和活性的排序
为了排序这5种大鼠抗-小鼠IL-31mAb的每种的体外特异性中和 活性，将每种纯化的mAb在先前描述的基于细胞的中和测定法中再次 检测，除了将mIL-31首先加入细胞中并随后将该混合物加入至抗体 外。除了对抗mIL-31-CEE的中和活性，还对mAb对抗另一种形式的小 鼠IL-31(称为c108smIL-31)进行了评估，所述的c108smIL-31中， 位置108的半胱氨酸残基已转化为丝氨酸残基。后面的物质在大肠杆 菌中产生，没有C-EE肽。这两种形式的mIL-31都以1和5ng/mL的 终浓度使用。将mAb在检测培养基中调节至浓度为20μg/mL，并作 为检测混合物中10μg/mL至0.00001μg/mL终浓度范围的连续10- 倍稀释物进行一式两份的检测。IC50值用Softmax软件(Molecular Devices)测定。结果在表1中显示，并表明，mAb 271.26.6.6.1、 271.33.1.2.2和271.39.4.6.5是最有效的中和性mAb，并且在这种 体外试验中具有相似的效力。有趣地是，mAb 271.33.3.2.1比其它mAb 效力小得多地对抗c108smIL-31型的mIL-31，这支持了表位分类法 (epitope binning)研究得出的结论：这种抗体可能性很大的具有与 其它四种mAb不同的表位特异性。与对抗mIL-31-CEE型mIL-31比较， 这种mAb也效力小得多地对抗c108smIL-31型的mIL-31这一事实表 明，271.33.3.2.1识别的表位可能部分包括IL-31分子上的糖基化位 点。
表1：大鼠抗-小鼠IL-31MAb的体外基于细胞的中和活性
实施例2
小鼠抗-人IL-31mAb的产生
A.小鼠的免疫和血清筛选
将两组6至8周大的雌性BALB/c小鼠(每组5只动物)用人IL-31 免疫。按照每个产商的说明书，通过腹膜内注射与Ribi佐剂组合的纯 化的重组人IL-31免疫组1中的小鼠，所述的人IL-31在C-端与由序 列EYMPME(SEQ ID NO：7)组成的肽融合(在下文中称为IL-31-CEE)。 该蛋白质在BHK细胞中产生。同样地，将组2中的小鼠用纯化的、重 组的、突变形式的人IL-31免疫，在所述的人IL-31中，位置108的 半胱氨酸残基已转化为丝氨酸残基(在下文中称为c108sIL-31)。这 种材料在大肠杆菌中产生，没有C-EE肽。所有小鼠在10周期间每两 周接受50μg的蛋白质。在第三次和第四次免疫接种7至10天后， 将小鼠眶后丛放血并将血清从血液中分离，用于分析它抑制人IL-31 结合用人IL-RA转染的细胞系并随后对其的刺激活性的能力。
单独的抗血清抑制人IL-31的能力用基于荧光素酶的中和测定法 评估，所述的中和测定法使用IL-31-CEE或c108sIL-31以及 BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ细胞(见实施例3和4)，具有下列改变。 将单独的抗血清(一式两份)通过在96孔、平底的白聚苯乙烯平板 (Corning/Costar 3917)上的连续4-倍稀释物来滴定，所述稀释从 最初的1∶250的检测缓冲液(RPMI 1640、10％FBS、1mM丙酮酸钠、 2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素) 中的抗血清稀释物开始。为了使该测定法中小鼠血清的刺激效应稍微 标准化，除了最初的1∶250稀释，所有稀释物都在加上0.2％正常的 BALB/c小鼠血清的检测缓冲液中进行。每个孔中稀释的抗血清的体积 是100μL。将细胞在检测缓冲液中洗涤1.5次，调节至3x106/mL 的浓度，将其与IL-31-CEE(100pg/mL)或c108sIL-31(30pg/mL) 混合，并将该混合物随后以100μL/孔加入至平板中。总的测定量为 200μL/孔，由30,000个细胞、终浓度为50pg/mL(IL-31-CEE)或 15pg/mL(c108sIL-31)的IL-31以及以1∶500、1∶2000、1∶8000、 1∶32000、1∶128000、1∶512000、1∶2048000和1∶8192000的最终稀释 度的抗血清组成。在37℃，5％的CO2下孵育平板16-24小时，之后 将平板在1250RPM下离心5分钟，小心地弹去培养基并加入25μL 的1x细胞溶解缓冲液至每个孔中。将平板轻微摇动10分钟以使细胞 溶解，之后加入40μL荧光素酶检测底物至每个孔中。然后，采用4 秒的积分间隔，在光度计上评估孔的荧光素酶活性(表示STAT报告构 建体的IL-31活性)。
总的来说，在该测定法中，发现来自用IL-31-CEE免疫的小鼠的 抗血清有效地抑制了IL-31-CEE和c108sIL-31的刺激活性，反之亦然。 为此目的，通常只用IL-31-CEE来实施进一步的中和测定法。
将具有最强中和滴定度的那些小鼠用于一系列的三次融合，旨在 得到产生能非常有效地中和IL-31与其同源受体相互作用的单克隆抗 体的杂交瘤。
B.融合细胞
融合细胞291
第一次融合采用来自一只用IL-31-CEE免疫的小鼠以及一只用 c108sIL-31免疫的小鼠的淋巴结细胞。每只这些动物用15μg在PBS 中稀释的各种免疫原进行第六次免疫，并在它们最后一次免疫3周后 通过血管内注射施用。三天后，采集这些小鼠的脾和淋巴结，将其合 并、加工成单一的细胞悬液(总共4.69x108个细胞)，并随后采用 本领域已知的标准方法(Lane，R.D.J Immunol Methods 81：223-8， 1985)，用3mL PEG 1500将其与小鼠骨髓瘤细胞系克隆 P3-X63-Ag8.653(Kearney，J.F.等，J Immunol.123：1548-50，1979) (称为P3-X63-Ag8.653.3.12.11)以2.3∶1淋巴样细胞∶骨髓瘤细胞 比率融合2分钟55秒，将该融合混合物分配到一系列的96孔平底平 板中，在4天后通过替换70％的培养基来加料一次，并在6天后检测。
融合细胞292
第二次融合用来自一只用IL-31-CEE免疫的小鼠的淋巴样细胞。 除了上面提及的五次腹膜内免疫接种，该小鼠在最后一次腹膜内注射 3周后接受血管内注射15μg PBS中的IL-31-CEE，并在第一次血管 内免疫3周后接受类似的注射。3天后，处理脾和淋巴结(总共为2.27 x108个细胞)，并如上描述的用1.8mL PEG 1500将其与 P3-X63-Ag8.653.3.12.11以2∶1的淋巴样细胞∶骨髓瘤细胞比率融合 2分钟55秒。将该融合混合物分配到一系列的96孔平底平板中，在4 天后通过替换70％的培养基来加料一次，并在5天后检测。
融合细胞294
最后一次融合使用来自一只仅用c108sIL-31免疫的小鼠的淋巴 样细胞。除了用先前描述的这种抗原进行的5次腹膜内免疫接种，该 小鼠在最后一次腹膜内注射6周后接受血管内注射15μg PBS中的 c108sIL-31，然后在第一次血管内注射2周后再次接受血管内注射。3 天后，处理脾和淋巴结(总量为1.586x108个细胞)，并如上描述的， 用1.5mL PEG 1500将其与P3-X63-Ag8.653.3.12.11以2∶1的淋巴 样细胞∶骨髓瘤细胞比率融合2分钟55秒。将该融合混合物分配到一 系列的96孔平底平板中，在4和6天后通过替换70％的培养基加料 两次，并在最后一次加料3天后进行检测。
C.融合细胞的筛选
使用有两处改变的如上描述的基于细胞的IL-31中和测定法筛选 所有这三种融合细胞。第一处改变是，取代检测平板中的稀释的抗血 清，将融合平板上每个孔中的100μL上清液拷贝接种到检测平板上。 第二处改变是，检测混合物中IL-31-CEE的终浓度是150pg/mL。
除了中和测定，对来自每次融合的多个平板(随机选择)进行筛 选，筛选出能结合预先已吸附至聚苯乙烯ELISA平板上的IL-31-CEE 的IgG抗体。该测定法的目的是，确定含有产生很差地中和IL-31或 完全不中和该细胞因子的抗-IL31抗体的杂交瘤的原版孔。在该测定 法中，将96孔聚苯乙烯ELISA平板的孔最初用50μL/孔的0.1M Na2CO3，pH 9.6中浓度为200ng/mL的IL31-CEE包被。将平板在4℃ 下孵育过夜，之后，吸出未结合的抗原并将平板用300μL/孔的 PBS-Tween(0.137M NaCl、0.0027M KCl、0.0072M Na2HPO4、0.0015M KH2PO4、0.05％v/v聚山梨醇酯20，pH 7.2)洗涤两次。用200μL/ 孔的PBS-Tween+1％BSA在室温(RT)下封闭孔1小时。然后弹去 平板中的封闭溶液，并将融合平板每个孔中的50μL条件培养基拷贝 接种到检测平板的孔中。将平板在RT下孵育1小时，之后，吸出未结 合的抗体并用300μL/孔的PBS-Tween洗涤平板两次。将HRP缀合的 山羊抗-小鼠IgG Fc特异性抗血清(Jackson Immunoresearch)在 PES-Tween+1％BSA中以1∶5000稀释，并加入至检测平板的孔中(100 μL/孔)。在RT下孵育1小时后，将未结合的第二步骤的抗体从孔中 吸出，并将平板洗涤5次。然后加入100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB) (BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)至每个孔中，并在RT 下孵育平板5分钟。通过添加100μL/孔的450nm TMB Stop Reagent (BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)来终止显，在Molecular Devices Spectra MAX 340仪器上于450nm下读取孔的吸光度值。
中和测定法的结果显示，在融合细胞291和292中分别有52和 139个孔含有抑制至少40％的IL-31刺激活性的抗体。对融合细胞294 进行更严格的阳性定义，其中观察到131个孔含有抑制至少70％的 IL-31活性的抗体。检测结合至IL-31-CEE的mAb的ELISA测定结果 表明，在多数情况下，如果发现原版孔含有结合IL-31-CEE的IgG抗 体，则其还含有在基于细胞的中和测定法中抑制IL-31-CEE的抗体。 然而，存在一些孔，其在ELISA测定中为阳性但其在基于细胞的中和 测定中则显示相对弱的抑制能力，并将它们保留用于如下面描述的后 面的分析。
将在阳性的原版孔中生长的杂交瘤细胞扩增到24孔平板的培养 基中。当24孔培养物的密度为约4-6x105个细胞/mL时，分别收集并 保存每个孔中的上清液(约1.5mL)，并将每个孔的细胞冷冻保存。
D.选择和克隆原版孔来分离产生有效的IL-31中和MAb的杂交瘤
使用在融合细胞筛选中采用的基于细胞的IL-31中和测定法，来 再次分析每种新的24孔上清液的IL-31中和能力。每种上清液未经稀 释且一式两份的进行分析。结果显示，在扩展后，多数原版孔的上清 液保留了与在初始的原来的筛选中观察到的相等或更好的抑制活性。 为了更好地确定新的原版孔的上清液中哪种具有最强的抑制能力，将 在该测定法中表现出大约90％或更好地抑制IL-31-CEE的那些上清液 通过在基于细胞的中和测定中检测这些上清液的稀释物来再次分析。 将上清液通过连续-3倍稀释滴定进检测平板上的融合介质中，来使下 列稀释度的每个孔中达到100μL：纯的、1∶3、1∶9、1∶27、1∶81和 1∶243，并且如上面描述用于融合细胞的筛选中完成检测。虽然这种检 测清楚地确定了最具抑制性的上清液，但其不能确定哪种上清液具有 最高的特异性活性，因为上清液中抗IL-31的浓度是未知的。
为了解决特异性抗体浓度问题，在上述的直接ELISA测定中，采 用连续2-倍或4-倍稀释，用IL-31-CEE以滴定的形式检测每种上清液。 在Microsoft EXCEL中数据绘图后，确定了该测定中观察到的产生半 数最大光密度(OD)的上清液稀释度，其接下来提供了一些有关上清 液中抗-IL-31抗体的相对浓度的指示。
通过合并来自中和测定法的数据和来自ELISA测定法的数据，确 定了每种上清液的相对特异性活性，并确定了含有最高的抗-IL-31中 和特异性活性的20个原版孔。有趣地是，所有最有效的中和抗IL-31 的原版孔源自融合细胞292。从这些原版孔的中和数据注意到，虽然 最大的IL-31抑制在纯的和1∶3稀释度的每种上清液中获得，但一些 上清液的绝对中和程度只稍微高于其它上清液，如在稍微较低的相对 荧光素酶单位计数中反映的。这可解释为稍微不同的程度的“完全” IL-31中和。通过将有关每个原版孔的该观察结果和相对中和特异性 活性结合，20个最有效中和的原版孔的个数减少为明显最好的10个。 这包括292.12、292.39、292.51、292.63、292.64、292.72、292.84、 292.105、292.109和292.118。
克隆这最好的10个中和IL-31的原版孔的每个孔中的细胞，以便 分离产生目标中和mAb的克隆杂交瘤。使用标准的低密度稀释(少于 每孔1个细胞)法，在96孔微量滴定细胞培养平板中克隆细胞，并在 测定前通过显微镜检查孔来评估单个生长灶的单克隆性。克隆培养基 由缺少HAT成分的融合培养基(IMDM、10％FCl血清、2mM L-谷氨 酰胺、1X青霉素/链霉素、10％杂交瘤克隆因子(Roche Applied Science))组成。在接种6-8天后，通过ELISA在结合有IL-31-CEE 的平板上筛选所有孔中的上清液。将来自每个组中4-6个孔的细胞扩 展到24孔培养基中，并且通过ELISA在结合有IL-31-CEE的平板上， 以及通过基于细胞的IL-31中和测定来再次检验得到的上清液，其中 所述的组中，上清液是对特异性mAb强阳性的并且显示只存在单个杂 交瘤生长集落。基于这些结果，将每组中明显最有效的中和克隆再次 克隆并通过如上描述的ELISA筛选。如果95％或更多的生长阳性孔也 是特异性mAb阳性的，则认为不需要进行进一步的亚克隆，并表明该 杂交瘤为无性系的。在获得的克隆中，只有一个原版孔292.64是需要 第二轮亚克隆来达到期望的特定mAb阳性百分比。将来自其中上清液 是特异性mAb强阳性的，并且显示只存在单个杂交瘤生长集落的每个 最终亚克隆组中5-6个孔中的细胞扩展到24孔培养基中。然后让这些 杂交瘤克隆的每种适应于在没有杂交瘤克隆因子的培养基(IMDM、10％ FCl血清、2mM L-谷氨酰胺、1X青霉素/链霉素)中生长，这通过在 细胞密度合适时将细胞分盘进后面的培养基中完成。在适应后，从每 组中的亚克隆收集上清液，并通过ELISA在结合有IL-31-CEE的平板 上筛选。基于相对于在上清液收集时的细胞密度的滴定度，选择“最 好的”最终克隆，导致选择了下列组的最终克隆：292.12.3.1、 292.39.5.3、292.51.5.2、292.63.5.3、292.64.6.5.5、292.72.3.1、 292.84.1.6、292.105.4.1、292.109.4.4和292.118.6.4。
由每种这些杂交瘤产生的小鼠IgG同种型mAb用Mouse Monoclonal Antibody IsoStrip test(Roche Applied Science)测 定。发现292.72.3.1和292.84.1.6除外，所有mAb都属于IgG1亚 型，292.72.3.1和292.84.1.6显示属于IgG2a亚类。
E.有效的IL-31中和MAb的体外特异性中和活性的排序
为了对这10种有效的小鼠抗人IL-31mAb的体外特异性中和活性 进行排序，将每种第一轮克隆的用过的上清液在先前描述的基于细胞 的中和测定中再次检测。首先，将已知浓度的mAb用作标准，在G蛋 白柱上通过HPLC分析测定每种上清液中IgG的量。然后，将每种上清 液在用于产生用过的上清液的相同培养基中稀释至1μg/mL的IgG 浓度。然后将所述稀释的上清液通过在培养基中10-倍连续稀释达到1 μg/mL至0.0001μg/mL的浓度范围滴定，并且在IL-31-CEE终浓度 设置为300pg/mL(18.27pM)的先前描述的基于细胞的中和测定中进 行一式三份检测。检测结果在表2中显示，mAb以从最有效到有效性 最小的顺序列出。MAb 292.84.1和292.12.3是最有效的中和剂，之 后依次为mAb 292.72.3和292.63.5，其显示为约前两种Mab一半有 效。剩余的mAb显示比最好的两种mAb的有效性约低6-9倍。
表2.通过体外特异性中和活性对有效的抗IL31中和MAb的排序
*采用的抗体的分子量＝150000道尔顿
基于上面的结果，选择杂交瘤292.84.1.6、292.12.3.1、 292.72.3.1、292.63.5.3和292.118.6.4作为不同水平的特异性中和 能力的代表，它们将会在在布达佩斯条约下，作为原始保藏物交托给 美国典型组织培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)专利保藏所，并 赋予下列ATCC登记号：克隆292.12.3.1(ATCC专利保藏名称 PTA-6815)、克隆292.72.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6816)、克 隆292.63.5.3.(ATCC专利保藏名称PTA-6829)、克隆292.118.6.4 (ATCC专利保藏名称PTA-6830)和克隆292.84.1.6(ATCC专利保藏名 称PTA-6871)。
F.选择并克隆原版孔以分离产生弱的IL-31中和性MAb的杂交瘤
产生抗人IL-31mAb的目的是分离出mAb对，该mAb对可用于夹心 测定法以定量不同流体中IL-31的量。这些mAb对通常对靶分子上的 不同表位具有特异性，并优选不会交叉竞争结合至该分子。为了分离 候选的这种mAb对，选择一种策略来将一种极好的IL-31中和性mAb 与一种具有很少(如果有的话)中和效力的mAb配对，假定这两种不 同的功能性抗体很可能会与不-重叠(空间上分离的)表位结合。
如先前融合筛选中注意到的，将来自每次融合的多个平板在结合 有IL-31-CEE的平板上通过ELISA筛选来鉴定抗IL-31抗体阳性的原 版孔中的上清液。将ELISA结果与基于细胞的中和测定的那些结果比 较表明，存在这样的原版孔，其含有很好结合IL-31-CEE但在基于细 胞的中和测定中不会很好地中和该分子的抗体。如用更有效的中和性 原版孔进行的，将在这些原版孔中生长的杂交瘤细胞扩展到24孔平板 中的培养基中。当24孔培养物的密度是约4-6x105个细胞/mL时， 单独收集并保存每个孔中的上清液(约1.5mL)并将每个孔的细胞冷 冻保存。
这些新的上清液采用基于细胞的中和测定法(连续3-倍稀释，从 纯的上清液开始并进行到最终的1∶243稀释)以及类似于在产生大鼠 抗-鼠IL-31mAb中使用的“捕获”型ELISA测定法来检测，所述方法 具有下列不同：1)山羊抗-小鼠IgG Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch)(1μg/mL)作为包被平板的抗体；2)平板用 PBS-Tween+1％BSA封闭一次，封闭1小时；3)将单个滴定的每种上 清液加入孔中(连续3-倍稀释，从纯上清液开始进行到最终的1∶2187 稀释)，和4)加入200ng/mL的生物素化的IL-31-CEE(3∶1的生物 素∶蛋白质摩尔比)。感觉该检测比抗体结合至结合有IL-31-CEE的 平板更恰当，因为它评估了抗体结合溶液中的IL-31-CEE的能力，这 是夹心型ELISA中好的抗体必备的特性。实际上观察到，许多原版孔 中含有很好地结合至结合平板的IL-31-CEE的抗体的上清液在溶液中 较弱地识别该分子。
为了选择从中克隆合适的分泌抗体的杂交瘤的孔，确定了10个孔 (291.78、292.152、292.154、294.35、294.144、294.146、294.154、 294.155、294.158和294.163)，它们的上清液在中和测定法中很弱 地中和IL-31-CEE(低于50％但优选只有1-20％)，并且还相对好地 结合溶液中的IL-31-CEE(如通过纯浓度的上清液中大于2.0的OD表 明)。对于有效中和的孔，克隆的克隆、筛选，以及最好的第一轮克 隆的选择可如上描述的完成。
为了减少需进行进一步亚克隆的杂交瘤的数目，用来自每种选择 的第一轮克隆的用过的上清液进行两次新的测定。第一次评估是使用 Biacore 3000表面等离子共振仪，基于表位特异性(“分类法”)来 试图给mAb分组。将其中一种好的中和性mAb上清液(292.64.6)与 10种较弱的中和性第一轮克隆的上清液彼此进行上述评估，导致确定 了4个明显的“类(bin)”。类1只由好的中和性抗体组成。类2 由292.152.4、292.154.4、29435.2、294.146.5和294.154.5组成。 类3包括291.78.4、294.155.6、294.158.5和294.163.2。类4只包 括294.144.3。第二次测定涉及这一次只重复“捕获”型ELISA，由于 与最初的原版24孔的培养上清液比较，该上清液中有更高的特异性抗 体浓度，从而获得了更完整的滴定曲线并使得能测定结合至 IL-31-CEE的抗体的EC50。结果在表3中显示(连同分类法结果和基 于细胞的中和测定法中IL-31-CEE活性的％抑制)，并表明对于不同的 mAb，存在广范围的EC50值(以及通过推断得到mAb对IL-31-CEE的 亲和力)。
表3.来自低效力的中和IL-31的杂交瘤的第一轮克隆培养上清液 的总结数据
由于着重于选择产生这样的mAb的杂交瘤：1)其处于不同于好的 中和性mAb(292.64.6)的表位类中，以及2)具有如在捕获型测定中 通过EC50表示的最高的亲和力，只有第一轮克隆294.35.2、 294.144.3、294.154.5和294.163.2进入如上面描述的更有效的中和 mAb的最终克隆阶段。这种进一步的亚克隆产生了对下列组的最终克 隆的选择：294.35.2.6.3、294.144.3.5、294.154.5.6和294.163.2.1。
由每种上述杂交瘤产生的小鼠IgG同种型mAb用小鼠单克隆抗体 分离条带检测仪(Roche Applied Science)测定。发现所有这4种 mAb都属于IgG1亚型。将这四种杂交瘤的每种的样品在布达佩斯条约 下作为原始保藏物交托给美国典型组织培养物保藏中心(ATCC， Manassas，VA)专利保藏所，并赋予下列ATCC登记号：克隆 294.163.2.1(ATCC专利保藏名称PTA-6831)、克隆294.35.2.6.3 (ATCC专利保藏名称PTA-6872)、克隆294.154.5.6ATCC专利保藏 名称PTA-6875)和克隆294.144.3.5(ATCC专利保藏名称 PTA-6873)。
G.小鼠抗-人IL-31mAb与小鼠IL-31的交叉反应
将来自10种有效的中和性mAb以及10种低效的中和性mAb的所 有第一轮克隆上清液通过ELISA，在结合有mIL-31-CEE的平板上进行 检测，检测它们识别小鼠IL-31的能力。未观察到任何mAb的交叉反 应，说明这些mAb显示对人IL-31具有特异性。此外，这些结果显示， 没有抗体识别为这些研究中使用的人和小鼠IL-31重组分子两者的C- 末端所共有的CEE肽标签，该测定结果在初始的原版孔的上清液中未 获得。
实施例3
IL-31RA/OSMRβ受体荧光素酶测定法
KZ134质粒用含有来自4种基因的STAT转录因子结合元件的互补 寡核苷酸构建，其包括经修饰的c-fos Sis诱导元件(m67SIE或hSIE) (Sadowski，H.等，Science 261：1739-1744，1993)、来自p21WAF1 基因的p21 SIE1(Chin，Y.等，Science 272：719-722，1996)、β -酪蛋白基因的乳腺反应元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.Cell.Biol. 11：3745-3755，1991)，以及Fcg RI基因的STAT诱导元件(Seidel， H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.92：3041-3045，1995)。这些寡核 苷酸含有Asp718-XhoI兼容性末端，并采用标准方法，用经相同的酶 消化且含有新霉素可选标记的c-fos启动子(Poulsen，L.K.et al.， J.Biol.Chem.273：6229-6232，1998)连接进可接受的荧火虫荧光 素酶报告载体中。采用标准的转染和选择方法，将KZ134质粒用于稳 定转染BaF3细胞以产生BaF3/KZ134细胞系。
构建表达全长IL-31RA或IL-31RA/OSMRβ受体的稳定的 BaF3/KZ134指示细胞系。采用标准技术稀释、接种和选择克隆。用人 IL-31条件培养基或纯化的IL-31蛋白质作为诱导物，通过荧光素酶 测定法(见B，下文中)筛选克隆。选择具有最高荧光素酶反应(通 过STAT荧光素酶)和最低背景的克隆。选择稳定的转染子细胞系。该 细胞系称为BaF3/KZ134/IL-31RA或BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ，这 取决于转染进细胞系的受体。
类似地，还采用在这里描述的方法构建BHK细胞系，并用于在此 描述的荧光素酶测定法。该细胞系称为BHK/KZ134/IL-31RA或BHK /KZ134/IL-31RA/OSMRβ，这取决于转染进该细胞系的受体。
将BaF3/KZ134/IL-31RA和BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ细胞离心 并在无mIL-3的培养基中洗涤。将细胞离心并洗涤3次以确保除去 mIL-3。然后在血细胞计数器中对细胞计数。采用无mIL-3的培养基， 将细胞以每孔约30000个细胞(体积为每孔100μl)接种至96孔型 板中。对未转染的BaF3/KZ134细胞实施相同的步骤以在随后的检测中 用作对照。将BHK/KZ134/IL-31RA或BHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ细胞 以每孔15000个细胞接种至96孔板中的100μl培养基中。将亲代 BHK/KZ134细胞用作对照。
BaF3/KZ134/IL-31RA、BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ、BHK/KZ134/ IL-31RA或BHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ细胞的STAT激活用条件培养 基或纯化的蛋白质评估。将100微升稀释的条件培养基或蛋白质加入 至BaF3/KZ134/IL-31RA、BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ、BHK/KZ134/ IL-31RA或BHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ细胞中。在作为对照的未转染 的BaF3/KZ134或BHK/KZ134细胞上平行进行使用条件培养基的测定。 总检测体积为200μl。将检测平板在37℃、5％CO2下孵育24小时， 同时将BaF3细胞通过以2000rpm离心10分钟来沉淀，并且吸出培养 基并加入25μl的溶解缓冲液(Promega)。对于BHK细胞系，不需 要离心步骤，因为该细胞是粘附合的。在室温下10分钟后，以5秒积 分间隔，在光度计(Labsystems Luminoskan，model RS)上读取加 入了40μl荧光素酶检测底物(Promega)的STAT报告构建体来测量 平板的STAT报告构建体的激活。
实施例4
通过用腺病毒性STAT/SRE报道基因瞬时感染对人转化的上皮细 胞系进行荧光素酶测定
对IL-31活性的抑制、减少和/或中和可通过荧光素酶测定来测 量。例如，可将人转化的细胞系以10,000个细胞/孔接种在96孔平底 平板中的、对每种细胞类型指定的合适生长培养基中。第二天，将细 胞用腺病毒报告构建体KZ136，以5000的多重性感染来感染。除了血 清效应元件，KZ136报告构建体含有STAT元件。使用补充有2mM L- 谷氨酰胺(GibcoBRL)、1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)和1x胰岛素- 转铁蛋白-硒添加剂(GibcoBRL)的DMEM(下文中称为无血清培养基)， 总体积为100μL/孔。将细胞培养过夜。
第二天，除去培养基并替换成100μl的诱导培养基。诱导培养 基是100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、 3.125ng/ml和1.56ng/ml的稀释于无血清培养基中的人IL-31。将 20％FBS的阳性对照用来验证该检测并确保腺病毒的感染是成功的。 将细胞诱导5小时，那时吸出培养基。然后，将细胞在50μl/孔的 PBS中洗涤，并随后在30μl/孔的1x细胞溶解缓冲液(Promega) 中溶解。在室温下孵育10分钟后，将25μl/孔的溶解产物转移至不 透明的白96孔平板中。然后，采用5-秒积分间隔，以40μl/孔注 射荧光素酶底物(Promega)在光度计上读取平板。
实施例5
IL-31抗体抑制细胞因子产生
已显示IL-31能刺激DU145(病变的和正常的细胞系)中的IL-6 产生，以及刺激A549细胞系(病变的和正常的)来刺激IL-8产生， 并能减少U2OS细胞系(病变的和正常的)中IL-8的生产。参见公开 的美国专利申请(见公开号20030224487，Sprecher，Cindy等，2003) 因而，在此描述的IL-31单克隆抗体的活性可通过对这些人疾病-状态 的上皮细胞系中的IL-31活性的抑制、减少和/或中和来测量。
A.对与人IL-31-起培养的人疾病-状态的上皮细胞系的细胞因 子产生的抑制
将细胞以每孔4.5x105个细胞的密度接种到6孔平板(Costar) 中并在各自的生长培养基中培养。将细胞与检测试剂：100ng/mL IL-31 (用和不用抗体刺激)、10ng/mL干扰素γ(IFNγ)(R&D Systems， Minneapolis，MN)、10ng/mL肿瘤坏死因子α(TNFα)(R&D Systems， Minneapolis，MN)、10ng/mL IL-1β(R&D Systems，Minneapolis， MN)或100μg/mL脂多糖(LPS)(Sigma)一起培养。在24和48 小时时采集上清液并检测其细胞因子、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落 -刺激因素)、IL-1b、IL-6、IL-8、MCP-1(巨噬细胞趋化蛋白-1)和 TNFα。将来自BioSource International(Camarillo，CA)的 Multiplex Antibody Bead试剂盒用于测量样品中的细胞因子。在 Luminex-100仪(Luminex，Austin，TX)读取检测并用MasterPlex 软件(MiraiBio，Alameda，CA)分析数据。测量24-小时中每种细胞 系的细胞因子产生(pg/mL)。
B.对与人IL-31一起培养的正常人上皮细胞系的细胞因子产生的 抑制。
将细胞以每孔1x105个细胞的密度接种于24孔平板中，并与检 测试剂：1000ng/mL、100ng/mL和10ng/mL的IL-31(用和不用抗 体刺激)、10ng/mL TNFα、10ng/mL OSM、10ng/mL IFNα、10ng/mL TGFb或10ng/mL淋巴细胞趋化因子一起培养。在24小时和48小时 时采集上清液并检测其细胞因子：IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1a、RANTES 和嗜酸细胞活化趋化因子。细胞因子如先前描述的检测。测量48-小 时中每种细胞系的细胞因子产生(pg/mL)。
C.对与人IL-31和IFNγ共培养的人疾病-状态的上皮细胞系的 细胞因子产生的抑制
将细胞以每孔2x105个细胞的密度接种于24孔平板中，并与10 ng/mL IFNγ+/-100ng/mL、10ng/mL或1ng/mL的IL-31共培养。 在24和48小时时采集上清液并检测f(用和不用抗体刺激)或IL-8 及MCP-1。测量24-小时的样品中每种细胞系的细胞因子产量(pg/mL)。
实施例6
IL-31对粘附至转化的骨髓上皮细胞(TRBMEC)单层的U937单核 细胞的影响的抑制
研究已显示，IL-31可起增效剂作用，可影响U937细胞基底粘附 至上皮细胞单层。特别是，IL-31与TNFα起增效作用并进一步增强 U937的粘附。参见公开的美国专利申请(见公开号20030224487， Sprecher，Cindy等，2003)。因此，通过在此描述的抗-IL-31抗体 对IL-31的抑制可用下列测定法测量。
将转化的骨髓上皮细胞(TRBMEC)以25000/孔的密度接种于96 孔组织集(Falcon)中的、补充有微血管生长添加剂(MVGS)(Cascade Biologics)的培养基M131(Cascade Biologics)中。在汇合时(24 小时后)，将该细胞转到补充有1％胎牛血清(Hyclone)的M199 (Gibco-Life Technologies)中。加入经和未经抗体刺激的不同浓度 (0.4至10ng/mL)的人重组IL-31(试验试剂)，用以检测该蛋白 质对导致粘附的免疫细胞-上皮细胞相互作用的影响。除了IL-31，让 一些孔接受0.3ng/ml的肿瘤坏死因子(TNFα R&D Systems，一种 已知的致炎细胞因子)，用以检测蛋白质在炎性条件下对上皮细胞的 影响。将单独的0.3ng/ml的TNFα用作阳性对照，并且该使用浓度 代表约70％的在该系统中最大TNFα效果，即它不会诱导U937细胞(人 单核细胞类细胞系)最大粘附至上皮细胞。为此，这种设计能检测TNF α作用的上调和下调两者。将有和无TNFα的粘附的基础水平用作评 估试验试剂的影响的基线。
在上皮细胞与试验试剂、用5μM Calcein-AM荧光标记(分子探 针)染的U937细胞过夜孵育后，将细胞悬浮于补充有1％FBS的 RPMI 1640(无酚红)中，并以100,000细胞/孔接种于经冲洗的TRBMEC 单层上。在30分钟后，在用温的RPMI 1640(无酚红)冲洗孔3次以 除去未粘附的U937之前和之后，测量激发/发射波长为485/538nm (Molecular Devices micro-plate reader，Cyto Fluor application)时的荧光水平。将冲洗前(总的)和冲洗后(粘附特异 性的)的荧光水平用于测定粘附百分比(净粘附值/净总值x100＝％ 粘附)。
实施例7
IL-31的生物鉴定方法
让用hzCYTOR17(IL-31RA)、hOSMRB和KZ134转染的BAF3细胞 生长达到5x105和1x106个细胞/mL。将该细胞用检测培养基(RPMI 1640、10％FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和青霉素/链霉素(都来自 Gibco))洗涤并以3x105细胞/mL再悬浮于检测培养基中。在96孔不 透明平板中，将通过1∶2连续稀释的在检测培养基中的600pg/mL至 9.38pg/mL的hIL-31标准样品，以100μL/孔进行滴定，一式两份。 将质量对照标准样品(Quality control standard)以100μL 350 pg/mL和35pg/mL加入该平板中，一式两份。试验样品通常以1∶2或 1∶4稀释并一式两份加入样品孔中。加入100μL经洗涤的BAF3细胞 进每个孔中，终浓度为3x104细胞/孔。将平板在+37℃下于5％CO2培 养箱中孵育16-24小时。将平板以1200RPM离心5分钟，除去培养基 并加入25μL/孔的溶解缓冲液(Promega)进每个孔中。10分钟后， 在光度计(Berthold)上读取平板。光度计添加40μL/孔的荧光素 酶底物混合物(Promega)并积分4秒时间内的荧光值。将荧光值导出 至电子表格，在那里对它们进行分析并换成每mL体积每106个细胞的 IL-31皮克值。
实施例8
IL-31参与体内起始和维持接触性过敏反应
方法I
采用吸管操纵器，用溶解于丙酮∶橄榄油(4∶1)溶液中的25μ L 0.5％的DNFB(2，4，二硝基-氟-苯，Sigma，St.Louis MO)涂于 BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。载体对照组只接受25μL的丙酮∶ 橄榄油。5天后，将小鼠在吸入室中用异氟烷(isofluorane)麻醉， 并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照动物两侧耳廓以获 得基线测量值。然后，通过施用丙酮∶橄榄油(4∶1)中10μL 0.25 ％的DNFB至所有小鼠每只耳朵的两侧来攻击小鼠。在24小时和48小 时后测量接触性过敏反应作为右耳(受刺激)和左耳(未受刺激)之 间的不同。所有的测量用工程测微计完成。通过首次接受试验的小鼠 的受攻击和未受攻击的耳之间的耳肿胀的不同来测定背景值。
用于FACS和/或ELISA分析的全部血液和血清在处死小鼠之前采 集并且采集耳用于组织学。
方法II(诱导Th2应答)
在第1天第二天和第8天，用吸管操纵器将1∶1丙酮/酞酸丁酯 (MSDS可获得)溶液中的100μL 0.5％的FITC(异硫氰酸荧光素) 涂于BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。在第13天，将小鼠在吸入室 中用异氟烷麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照 动物的两个耳廓以获得基线测量值。通过施用25μL 0.5％的FITC (在1∶1的丙酮/酞酸二丁酯中)至每只耳朵的背侧来攻击小鼠。在 24小时和48小时后测量接触性过敏反应作为右耳(受刺激)和左耳 (未受刺激)之间的不同。所有的测量用工程测微计完成。通过首次 接受试验的小鼠的受刺激和未受刺激的耳之间的耳肿胀的不同来测定 背景值。用于FACS和/或ELISA分析的全部血液和血清在处死小鼠之 前采集并且采集耳用于组织学。
方法III(诱发Th1应答)
用吸管操纵器将25μL 2％的oxazalone(在4∶1的丙酮/橄榄 油中)涂于BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。在第7天，将小鼠在吸 入室中用异氟烷麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和 对照动物的两边耳廓以获得基线测量值。通过施用8μL oxazalone 至每只耳朵的背侧来攻击小鼠。在24小时和48小时后测量接触性过 敏反应作为右耳(受刺激)和左耳(未受刺激)之间的不同。所有的 测量用工程测微计完成。通过首次接受试验的小鼠的受攻击和未受攻 击的耳之间的耳肿胀的不同来测定背景值。用于FACS和/或ELISA分 析的全部血液和血清在处死小鼠之前采集并且采集耳用于组织学。
在实验的致敏阶段和攻击阶段，用在此描述的对抗IL-31的抗体 检测了起始和永存化接触性过敏反应中IL-31的参与。
实施例9
体内特应性皮炎中IL-31的参与
方法I(NC/Nga小鼠的致敏)
从日本CRL购买雄性NC/Nga小鼠。小鼠在到达时为4周大，并在 SPF检疫条件下圈养4周以适应新环境。在抗原致敏开始时小鼠约 10-11周大。将小鼠用异氟烷麻醉并用电动剪给背部剃毛。在5至6 周内，每周3次在颈部背面皮内注射约10μg的屋尘螨(Dp)(Indoor Biotechnologies，特别订购)提取物直到小鼠发生了皮肤病患。对照 动物每周接受10μL PBS皮内注入3次。所述Dp提取物根据Matsuoka 及其同事(Matsuoka H.，等，Allergy：58，139(2003))的方法制 备。简而言之，将595mg低压冻干的Dp耗尽培养提取物(pent culture extract)溶解于12mL的无菌PBS(Gibco)中。将Dp在振荡器上的 50mL Falcon试管中混合30分钟。将该提取物以2000rpm离心10 分钟，收集上清液并等分进1mL的冷冻管中并在-20℃下保存。
方法II(DO11.10小鼠的致敏)
DO11.10转基因小鼠由室内体繁殖并在抗原致敏开始时为9.5 至14周大。在表皮致敏前24小时，将小鼠用异氟烷麻醉并用电动剪 给小鼠的整个躯干(背部和腹部)剃毛。然后用Elastin外科带 (Johnson和Johnson)在小鼠的背部进行胶带剥脱。将1cm2无菌纱 布片用500μg卵清蛋白(Calbiochem 32467)或无菌PBS(Gibco) 弄湿，并用DuoDerm Extra Thin敷料(ConvaTec 187932)将其粘贴 在小鼠的背部左侧。然后，让布片和敷料覆盖于Elastin外科带的躯 体包裹中以便小鼠不会移动或破坏该布片。让布片粘贴7天并除去。 让小鼠在进行另一轮表皮致敏之前休息2周。小鼠受到总共为三次一 周的致敏。
结果
免疫组织化学分析粉尘螨致敏的NC/Nga和OVA致敏的DO11.10 动物的病患皮肤和非-病患皮肤中IL-31RA表达显示，IL-31RA由小鼠 中的表皮角质细胞表达，然而在抗原致敏的动物与PBS致敏的动物之 间未发现表达水平的显著不同。
实施例10
通过施用大鼠抗-小鼠IL-31抗体对搔痒的抑制
在另一个NC/Nga小鼠试验中，将4周大的雄性NC/Nga小鼠(SLC， Tokyo)暴露于已显示出轻微至中度皮炎的NC/Nga小鼠。在7周时间 内，将小鼠分为3组并接受下列处理。在7周中每第5天，给予一组 中的小鼠10mg/kg的IL-31大鼠-抗-小鼠注射剂；一组小鼠提供给血 清白蛋白注射剂；而第三组不接受任何处理。对小鼠进行每周两次的 临床评估，评估皮肤病患的严重性。特别是，涉及的皮肤(0＝未涉及、 1＝涉及背部、2＝背部和面部、3＝背部、面部和耳部)以及病患的严重 性(0＝正常皮肤、1＝鳞状且干燥的、2＝结节性病患、3＝血性病患)。 此外，还评估搔抓行为。小鼠用它们的后趾的搔抓行为用MicroAct (Neuroscience，Tokyo，Japan)自动检测并客观地评估。在 Ketalar/Xylazine麻醉下，将小的包被特氟隆的磁体皮下植入小鼠两 只后爪的背面。将具有磁体的小鼠置于圆形线圈环绕的观察室中。放 大并记录通过磁体移动在线圈中诱导的电流。分析程序使用下列设置 来记录骚抓事件：阈值(V)0.1，事件间隔(秒)0.2，最大Freg(HZ) 20.0，最小Freg(Hz)2.0；以及最小持续时间(秒)1.5。注意：在 NC/Nga小鼠模型中，长时间持续(＞1.5秒)，而不是短时间持续的搔 抓行为(0.3-1.5秒)与小鼠中皮炎-特异性搔痒感觉相关。测量的总 体基础终点(primary endopoint)是搔抓行为、皮炎和体重。
结果：
在整个阶段，用大鼠-抗-小鼠IL-31抗体的处理不符合基础终点。 然而，另外的分析显示，通过抗IL-31抗体处理，在22-43天的时段 内搔抓行为显著减少。在该时间段内，就整个阶段而论，用抗-I1-31 抗体处理不会影响特应性皮炎样病患的发展，并且不会使患病动物的 重量增加正常化，可能是由于临床表现的延缓发生或由于在处理结束 时中和了自身抗体。在该试验中，搔抓行为，但不是皮炎，在开始用 抗体处理时已在大多数动物中增加。
实施例11
IL-31在体内DTH中的参与
方法：
为了产生DTH反应，在第0天，通过用弗氏完全佐剂(CFA，50-100 μL总容积)中的100μg卵清蛋白(OVA)在小鼠尾的基部进行皮下 免疫接种，来使小鼠对抗原致敏。一周后，将小鼠在吸入室中用异氟 烷麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照动物的两 个耳廓以获得基线测量值。用总体积10μL的PBS中的10μg OVA 通过皮内攻击小鼠，该溶液进入左侧耳廓，刚好在皮肤下面而不碰到 任何静脉。作为对照，小鼠还在右侧耳廓接受10μL PBS注射。在一 些情形中，将在耳部给予皮内注射OVA的单独的对照组也用局部用皮 质甾类处理来作为抑制该反应的阳性对照。在刺激后24和48小时时， 将小鼠麻醉并测量耳朵的厚度。结果表示为：特异性耳肿胀＝试验耳 朵的(24小时时的测量值-0小时时的测量值)-阴性对照耳朵的(24 小时测量值-0小时测量值)。硬结(DTH的标志)在注射致敏抗原18 小时时可检测到，并且在24-48小时为最大值。可触及的硬结的发作 滞后是称该反应为“迟发型”的原因。
结果
对IL-31转基因小鼠的DTH进行了试验，然而，由于未受攻击的 IL-31转基因动物的耳朵厚度增加，在IL-31Tg动物与野生型对照之 间不能确定DTH在统计上有显著差别。也在DTH反应中试验了IL-31 受体敲除了的动物，并且在受体敲除的动物和野生型动物之间未能观 察到DTH反应的显著不同。
实施例12
IL-31参与搔痒反应的诱导
方法I(辣椒碱IL-31处理的小鼠)
将10周大的BALB/c动物(CRL)麻醉，并在皮下注入盐水中10％ 乙醇+10％吐温-80中的0.25ml 4mg/ml的辣椒碱溶液进颈背之前， 皮下注入0.1mg/kg的长效止痛剂盐酸。让动物在神经毒素 之后保持麻醉至少30分钟。48小时后，皮下植入14天渗透泵用 于持续递送20μg/天的IL-31，递送14天。采用下列标准：0＝无搔 抓行为，动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为； 2＝不严重的脱毛(一小部分)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行 为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为，每天监控小鼠的脱毛和搔 痒，监控6天。
结果表明，不用辣椒碱的小鼠在递送IL-313天后显示出 2.625的平均的搔抓/脱发打分，而辣椒碱的小鼠显示出显著低的 打分1。因此，在IL-31递送之前用辣椒碱处理的小鼠在实验6天中 既显示出搔抓行为和脱毛发生的延迟，又显示出较低的搔抓行为和脱 毛的强度的打分。这些数据表明，IL-31的确诱导了有助于IL-31诱 发的脱毛和搔痒的一些神经元成分。因此，IL-31的中和可以减少患 有涉及搔痒的皮肤障碍的患者中搔痒的发生和强度，并从而减少皮炎 的发生和强度。
方法II
Tac 1基因纯合无效的小鼠不表达可检测的P物质或神经激肽A。 这些小鼠显著减小了对中度至剧烈刺激的伤害性疼痛反应，并因此是 用于研究速激肽对疼痛/搔痒处理和炎性疾病状态的作用的有用工具。 将12周大的，Tac 1敲除的小鼠植入递送1μg/天的IL-31蛋白质的 14-天渗透泵，并采用下列标准每天观察脱毛和搔痒：0＝无搔痒行为， 动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重 的脱毛(小块)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严 重脱毛，过度的搔抓行为。
该研究结果显示，与野生型对照小鼠比较，Tac1缺陷小鼠不易受 IL-31诱发的搔抓/脱毛的影响。100％(10/10)的野生型小鼠在IL-31 处理6天后已发生搔抓和脱毛迹象，而只有33.3％(2/6)的Tac1缺 陷小鼠在相同的时间点表现出搔抓和脱毛现象。这些数据显示，IL-31 诱导了有助于IL-31-处理的小鼠中搔抓/脱毛表现型的神经元成分， 并且IL-31的中和可减少有关皮炎中的搔抓行为的发生和强度。
方法III(IL-31中和抗体的施用)
将约8-12周大的正常雌性BALB/c小鼠(CRL)皮下植入递送1 g/天的mIL-31的14-天渗透泵(Alzet，#2002)。从IL-31递送前1 周开始，小鼠组每周两次接受腹膜内(i.p.)注射10mg/kg(200 g/小鼠)的大鼠抗-小鼠IL-31单克隆抗体。小鼠对照组以相同给药方 案，接受i.p.注射的载体(PBS/0.1％BSA)。采用下列标准每天给小 鼠的脱毛和搔痒打分：0＝无搔痒行为，动物表现正常；1＝小范围内 毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(小块)，搔抓行为； 3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为。
在所有试验中，用大鼠抗-mIL-31mAb处理的小鼠的症状发作延 迟了约5至7天，并具有较低的脱毛和搔痒的总体打分。通过13天的 试验，所有mAb处理的小鼠组(不考虑给药频率或浓度)发生了与对 照小鼠类似的脱毛和搔痒。这些数据表明，IL-31的中和可延缓由 IL-31诱导的搔抓/脱毛反应的发作。
实施例13
小鼠-抗-人IL-31单克隆抗体的鉴定
将一组21个产生(重组)人白细胞介素31(IL31)特异性单克 隆抗体(mAb)的无性系杂交瘤分离。将10种产生强中和性mAb的杂 交瘤分离。将这些杂交瘤基于竞争性结合试验分配给两个亚-类 (sub-bin)。将11种产生弱中和性mAb的杂交瘤分离。将这些杂交 瘤基于竞争性结合试验分配给4个另外的类。一种mAb适用于蛋白质 印迹，并且它同样适用于免疫组织化学。确定了三种适合用作竞争性 拮抗剂的mAb。还确定了适合用于夹心免疫测定法的单克隆抗体。
A.通过Biacore进行表位分类法
材料：捕获抗体是山羊-抗-小鼠IgG-Fcγ特异性的(Jackson #115-005-071)；封闭抗体是多克隆IgG Fc片段(Jackson Labs.)； 抗原：在BHK中产生的具有CEE亲和标签的rIL31；Biacore 1000； Biacore CM5 NHS-激化的芯片(Biacore，PN BR-1000-14)。
方法：该试验在Biacore1000TM系统中进行。BIAlogue v.1.2用 于程序控制运行方法。将山羊-抗-小鼠Fc抗体通过赖氨酸残基共价地 固定在Biacore CM5芯片上以形成用于试验的活性结合表面。首先将 21种小鼠抗-huIL31 mAb克隆条件培养基上清液的每种注射至山羊- 抗-小鼠Fc表面上，以便将要检测的第一种mAb能以有利方向结合至 抗-小鼠抗体表面。然后，将剩余的结合位点通过注射无关的多克隆 IgG Fc片段封闭。随后注入抗原(rIL31)并捕获于所述的第一种抗 体表面。在这之后，另外注入21种小鼠抗-huIL31 mAb克隆条件培 养基上清液的其中一种来检测第二种的结合。如果第一种和第二种 mAb竞争抗原上相同的结合位点，则第二种mAb不会结合，如果两种 mAb不竞争抗原上的相同结合位点，则第二种mAb会结合。
将每种上清液作为作为第一种mAb与整组的mAb组合来检测。实 施对照循环来说明在没有第一种mAb或抗原时缺少第二种mAb反应。 将每种mAb相对于自身进行检测用作阴性对照来确定本底信号水平。 采用BioEvaluation 3.2RCI软件编辑数据，然后下载至ExcelTM用于 数据处理。在检测单克隆抗体对的每次循环之间，山羊-抗-小鼠Fc 表面用50mM HCl进行2x30秒的洗涤来再生。
将强中和性mAb(10种)和弱中和性mAb(11种)在两个分离的 组中研究，除了在研究弱中和性mAb时，将来自杂交瘤292.64.6的 mAb包括在内作为强中和性mAb的代表。另外，在评价了开始的两个 分类法组的关于表位类的相对亲合力测量值和中和数据后，将第三板 分类法在包括强和弱中和性mAb的8种“选择的”mAb上实施。
结果：完成检测单克隆抗体配对的三个组用于分析强中和性和弱 中和性mAb。第一组相对于彼此地检测所有强中和性mAb，而第二组相 对于彼此地检测所有弱中和性mAb(以及来自杂交瘤292.64.6的代表 性的强中和性mAb)。完成第三组用以明确评估选择用于进一步评估 的一亚组强和弱中和性mAb的配对。
除了测量到的不同mAb对的绝对反应(RU)差异，当对的次序 (orientation)改变时(即抗体对的一种mAb用作第一种mAb而另一 种用作第二种mAb)，多种mAb对表现不同。这种行为经常观察到， 并且一般归因于涉及的mAb具有重叠的表位。
从对最初的两个完整组的分析获得了总共4个不同的类。对于第 一组，所有强中和性抗体分组在一起而确定了单个类(类1：292.12.3、 292.39.5、292.51.5、292.63.5、292.64.6、292.72.3、292.84.1、 292.105.4、292.109.4、292.118.6)。在第二组中，弱中和性抗体 分组成3个不同于类#1的单个代表(292.64.6)的另外的主要类(类 2：294.35.2、294.146.5、292.152.4、292.152.4、294.154.5；类 3：294.35.3、291.78.4、294.158.5、294.155.6、294.163.2；类4： 294.144.3)。另外，在组2中评价的许多的mAb配对表明，反应的明 显不对称取决于其中检测mAb的次序，表明了结合位点的一些重叠。 来自类3的两种mAb，294.35.3和291.78.4在作为第二种mAb检测时， 显示出与类2中的mAb明显竞争。同样在组2中，强中和性抗体 292.64.6(类1)在作为第一种抗体检测时显示与类3中的mAb竞争。
在完成最初的两个分类法平板后，选择一组最强中和性mAb和最 高亲合力的弱中和性mAb用于进一步评估，并在组3中相对于彼此进 行检测。第三组的结果与先前的试验完全一致，显示强中和性抗体在 相同的类内，而弱中和性抗体分进已确定的多个类内。另外，第三组 表明，来自类2的两种mAb(294.35.2和292.154.4)与属于类1的 一亚组mAb(292.12.3、292.72.3、292.84)的结合部分重叠。这导 致在类1中分为亚-类1A和1B。在组3中，来自杂交瘤292.163.2(类 3)和292.144.3(类4)的mAb单独地成类(binned)。
B.微量滴定板(无标记的竞争性ELISA)表位分类法
材料：捕获抗体是山羊-抗-小鼠IgG(Fcγ特异性的)Jackson #115-005-071；封闭抗体是小鼠IgG1(ZymoGenetics)；杂交瘤的条 件培养基上清液用于该试验；抗原是采用Sulfo-NHS-Biotin试剂盒 (Pierce，Rockford，IL)生物素化的具有CEE亲和标签的、在BHK 中产生的rIL31；Nunc Maxisorp 96孔平板(Nalge Nunc，Rochester， NY)；ELISA B(PBS、0.1％吐温20、1％BSA)；抗生蛋白链菌素 -HRP(Pierce，Rockford，IL)；TMB底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)。
方法：该方法类似于由Nagata等(2004)描述的无标记的竞争性 ELISA(LFC-ELISA)。用于表位类并的该方法利用生物素化的rIL31。 将微量滴定板用在ELISA B(PBS、0.1％吐温20、1％BSA)中稀释的 1μg/mL山羊抗-小鼠IgG Fc-γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch #115-005-071)以100μg/孔包被。在环境温度下结合这种包被抗体 3小时后，将含有每种mAb的条件培养基在ELISA B中稀释以获得约 0.5μg/mL的mAb浓度，并让其在4℃下结合至山羊抗-小鼠IgG包 被的平板过夜(mAb#1)。平行地，将第二组条件培养基(mAb#2)在 聚苯乙烯试管中稀释达到在ELISA B中约0.5μg/mL，将其与50 ng/mL生物素化的rIL31抗原混合，并在4℃下孵育过夜。在将mAb#1 与包被抗体孵育后，用无关的抗体封闭该平板用以饱和平板上空着的 结合位点。将mAb#2-生物素-rIL31混合物加入平板并让其结合。作为 该检测中的对照(无竞争)，将50ng/mL生物素化的rIL31直接加入 (没有与mAb#2预孵育)至含有固定化的mAb#1的孔中。在与生物素 化IL31-mAb#2复合物孵育后，将抗生蛋白链菌素-HRP(Pierce， Rockford，IL)以0.5μg/mL加入平板中。将平板用TMB底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)显影，并用酶标仪(Molecular Devices SpectraMax 340，Sunnyvale，CA)测量450nm时单个孔的 吸光度。如果mAb#1识别与mAb#2不同的表位，则生物素-rIL31-mAb#2 复合物结合至平板导致高的吸光度读数。如果mAb#1识别与mAb#2相 同的表位，则生物素-rIL31-mAb#2复合物不会结合至平板导致低的吸 光度读数。
结果：将整组的21种mAb在一系列的6个96孔微量滴定板中相 对于它们自己同时检测。记录每种组合和次序在450nm时的吸光度值 (A450nm)并将其编辑。在所有情形中，获得自身-自身组合的低吸 光度值。除了自身-自身对照，将50ng/mL rIL31-生物素(没有竞争 性的mAb#2)的阳性对照用每个平板上的每种第一种mAb检测。获得 了每种第一种mAb的两种阳性对照样品，并且成对的样品的值相似。 从阳性对照孔(无mAb#2)获得的11种弱中和性mAb中的9种(来自 类2、3或4)的吸光度值比测量得到的剩余mAb的对照样品的吸光度 值低。据推测这是由于那些mAb较低的亲合力(更高的EC50)所致。 为了有助于理解结果，将吸光度值标准化以便将测量的一整排的mAb 的任意组合(捕获mAb(mAb#1)保持不变)的最大吸光度赋予值100％。 标准化的值分成两个截然不同的组：属于值32％以下的一大簇值对应 竞争，而属于32％以上的第二大簇值对应缺少竞争。32％的阈值用于 将mAb的每种组合及次序归属于两种独立类型(无竞争和竞争)中一 种。利用分类的数据，基于系统聚类算法自动完成了分类法。如在采 用Biacore的分类法实验过程中观察到的，取决于哪种mAb用作第一 种mAb，一些mAb对可不同地分类。高水平的严格性(两种次序中都 需要竞争)用于将mAb分配给一级类。随后将较低的严格标准(只有 一种次序中需要竞争)用来帮助将mAb基于行为的微小不同归类为亚- 类。将标准化数据根据基于高严格标准的5个一级类分配进行分组。 另外，mAb的组合和次序是用颜编码的(白为竞争而黑为非竞 争)，用以帮助肉眼观察导致mAb归属于亚-类的相互作用。
通过竞争性ELISA进行的分类法的结果与基于采用Biacore的研 究结果的类分配一致。采用严格的分类法标准，确定了下列类：
类#1(含有所有强中和性mAb)：292.72.3、292.64.6、292.63.5、 292.51.5、292.39.5、292.12.3、292.118.6、292.109.4、292.105.4、 292.84.1
类#2：294.35.2、294.154.5、294.146.5、292.154.4、292.152.4
类#3：294.35.3、294.163.2、294.158.5、294.155.6
类#4：294.144.3
类#5：291.78.4
对于类#1，来自类#1中3种杂交瘤的mAb(292.72.3、292.12.3、 292.84.1)在用作第二种mAb(mAb#2)时表明与3种来自类#2的mAb 竞争。基于该行为，将类1分为两个亚-类，即#1A和#1B，类#1B含有 与类2mAb竞争结合的mAb。类#1A含有292.64.6、292.63.5、292.51.5、 292.39.5、292.118.6、292.109.4、292.105.4。类#1B含有292.72.3、 292.12.3和292.84.1。
对于类#2，用于将类#2分为3个亚-类的三种截然不同的相互作 用是显而易见的。类#2A含有来自杂交瘤294.146.5的mAb，其与类#1 和类#2两者的所有mAb竞争。类#2B含有来自杂交瘤294.35.2和 294.154.5的mAb，其与来自类#1的(第二种)mAb竞争。类#2C含有 来自杂交瘤292.154.4和292.152.4的mAb，其在用作第二种mAb时 与来自类#4的mAb竞争。
对于类#3、类#4和类#5：类#3中的mAb(来自杂交瘤294.35.3、 294.163.2.1和294.155.6)在它们用作第二种mAb时与来自类#4和 类#5的mAb竞争。类#4(来自杂交瘤294.144.3.5)和类#5中的mAb 主要通过它们与亚-类#2C的mAb相互作用(以及在蛋白质印迹上杂交 瘤294.144.3的mAb的特殊结合特性)区分。
当整组的21种mAb用LFC-ELISA方法同时检测时，类1和亚类#1A 和#1B可明显确定。在同时检测整组mAb时也可确了类#2和类#3的部 分重叠，并且将类#2分为3个亚-类。与基于Biacore数据的类分配 的一个主要偏差是，当LFC-ELISA数据采用严格标准时，来自杂交瘤 291.78.4和294.144.3的mAb被分配给两个截然不同的类。基于 Biacore研究，已经将来自杂交瘤291.78.4的mAb已分配给类#3。
C.基于平板的亲合力测量
材料：捕获多克隆抗体是山羊-抗-小鼠IgG(Fcγ特异性的) (Jackson ImmunoResearch West Grove，Pennsylvania #115-005-071)；封闭多克隆抗体是小鼠抗-人IgG(Jackson JmmunoResearch，#209-005-082)；杂交瘤的条件培养基上清液用于 该试验；抗原是用Sulfo-NHS-Biotin试剂盒(Pierce，Rockford，IL) 生物素化的、在BHK中产生的具有CEE亲和标签的rIL31；Nunc Maxisorp 96孔平板(Nalge Nunc，Rochester，NY)；ELISA B(PBS、 0.1％吐温20、1％BSA)；抗生蛋白链菌素-HRP(Pierce，Rockford， IL)；TMB底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)。
方法：该方法类似于van Heyningen(1986)描述的方法。将微量 滴定板用在ELISA B(PBS、0.1％吐温20、1％BSA)中稀释的1μ g/mL山羊抗-小鼠IgG Fc-γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch #115-005-071)100μL/孔包被。在环境温度下结合该包被抗体 3小时后，将每种纯化的单克隆抗体上清液在ELISA B中稀释以获得 约1μg/mL的mAb浓度，并让其在环境温度下结合至平板1小时。500 ng/mL至0ng/mL的生物素化的rIL31抗原的连续稀释物在ELISA B 中制备并加入孔中。在与生物素化抗原孵育后，将抗生蛋白链菌素- HRP(Pierce，Rockford，IL)以0.5μg/mL加入平板中。将平板用 TMB底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)显影，并用酶 标仪(Molecular Devices SpectraMax 340，Sunnyvale，CA)测量450 nm时单个孔的吸光度。将重复点的读数平均并用4-参数拟合分析数 据。将4参数拟合的“C”值报告为表观EC50(ng/mL)，其为在该检 测中产生半数最大反应的生物素-rIL31浓度。
结果：4-参数拟合从所有21种mAb的试验曲线获得。在该检测 中产生半数最大反应的生物素-rIL31的浓度(EC50)为3.3至236 ng/mL范围，所有10种强中和性mAb显示出低的且类似的EC50值 (3.3-4.4ng/mL)。
D.蛋白质印迹
材料：抗原是在BHK中产生的具有CEE亲合性标签的rIL31；4-12 ％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)；非还原性 样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)；分子量标准是SeeBlue (Invitrogen)；1x MES电泳缓冲液(Invitrogen)；Western A缓 冲液(50mM Tris pH 7.4、5mM EDTA、150mM NaCl、0.05％Igepal、 0.25％明胶)；0.2μm硝酸纤维素膜(Invitrogen)；绵羊抗-小鼠 IgG-HRP(Amersham，Piscataway，NJ)；亲和提纯的对rIL31特异 性的兔pAb(ZymoGenetics)；驴抗-兔Ig-HRP(Amersham)；Lumi-Light Plus化学发光制剂(Roche，Mannheim，Germany)；Lumi-Imager (Mannheim-Boehringer)。
方法：在该试验中检验mAb在蛋白质印迹上检测变性的和变性的 /还原的rIL31的能力。将rIL31抗原与还原性或非还原性的样品缓冲 液混合，在70℃下加热10分钟，然后以100ng/泳道上样至4-12％ NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。分子量标 准是SeeBlue(Invitrogen)，并且电泳在1X MES电泳缓冲液 (Invitrogen)中进行。将凝胶中的蛋白质带转移至0.2μm的硝酸 纤维素膜(Invitrogen)上，并在Western A缓冲液(50mM Tris pH 7.4、5mM EDTA、150mM NaCl、0.05％Igepal、0.25％明胶)中的 2.5％脱脂干乳粉中封闭过夜。硝酸纤维素膜用约0.1μg/mL mAb浓 度的每种单克隆抗体探测。随后将印迹用缀合至辣根过氧化物酶的二 抗(绵羊抗-小鼠IgG-HRP；Amersham，Piscataway，NJ)探测。作为 阳性对照，将分离的蛋白质印迹用0.1μg/mL IL-31特异性的兔多克 隆抗体(ZymoGenetics)，以及缀合至辣根过氧化物酶的二抗(驴抗- 兔Ig-HRP；Amersham)探测。将蛋白质印迹上的带用Lumi-Light Plus 试剂(Roche，Mannheim，Germany)检测，并在Lumi-Imager (Mannheim-Boehringer)上记录化学发光。
结果：抗IL31mAb的蛋白质印迹分析表明，21种杂交瘤中只有3 种的mAb检测到变性的rIL31抗原。最强的信号从杂交瘤294.144.3 产生的mAb获得。这种mAb还比未-还原的/变性的rIL31更强地检测 还原的/变性的rIL31。用该mAb观察到的信号强度与用多克隆抗体对 照获得的类似。值得注意的是，来自杂交瘤294.144.3的mAb属于与 评估的其它mAb分离的类。来自两种其它杂交瘤(292.84.1和 292.64.6)的单克隆抗体可非常弱地检测未-还原的/变性的rIL31， 但不能检测还原/变性的rIL31。这种弱信号没有在扫描的印迹中再 现。这些mAb都是来自类#1的中和抗体。
实施例14
大鼠抗-小鼠单克隆抗体对IL-31配体的相对结合亲和力
4种大鼠-抗Ms-IL-31-配体MAb对抗IL-31配体的相对结合亲和 力可如下测定。检测克隆271.26.6.6.1、克隆271.33.3.2.1、克隆 271.33.1.2.2和克隆271.39.4.6.5。将山羊-抗-大鼠IgG-Fcγ特异 性抗体(Jackson)固定在CM5 Biacore芯片上。在初步试验后，将该 测定进一步优化以使每个MAb结合至抗-大鼠捕获表面上，并随后将一 浓度系列的IL-31配体注射通过MAb来观察结合和解离。在每次运行 后，通过2次注入30mM HCl使表面再生回到固定的抗-大鼠抗体。产 生了每种MAb的数据并用评估软件确定相对动力学值。
通过评估MAb-抗原结合曲线产生的相对动力学数据在表4中显 示。
表4
实施例15
在AD小鼠模型中TARC和MDC响应抗IL-31抗体的减少
方法I
将6周大的雄性NC/Nga小鼠(CRL Japan)每周三次用50μg 粉尘螨提取物(D.pteronyssinus，Indoor Biotechnologies)在背 部通过皮内致敏，并对类似AD病患打分。在致敏5周后，对小鼠实施 安乐死，并且切离右耳并置于补充有RPMI+2％FBS(GIBCO Invitrogen) 的48孔培养皿(Corning)的单个孔中。将平板置于5％CO2的湿度 控制保温箱中。在24小时后收集上清液并在-20℃下冷冻直到进一步 分析。
方法II
将12周大的雌性NC/Nga小鼠(CRL Japan)每周3次用10μg SEB (Toxin Technology)在耳内和背上通过皮内致敏。对小鼠类似AD 的病患打分。在致敏5周后，让小鼠安乐死，并从每只小鼠接受注射 的耳朵取出6mm活检穿孔器提取物并置于补充有RPMI+2％FBS的48 孔培养皿的单个孔中。将平板置于5％CO2的湿度控制保温箱中。在24 小时后收集上清液并在-20℃下冷冻直到进一步分析。
将这两种研究中的小鼠组用10mg/kg的大鼠抗-小鼠IL-31单克 隆抗体或载体进行腹膜内处理，处理从致敏1至2周后开始，每周2 次。
24-小时上清液样品中的TARC和MDC浓度通过常规的ELISA(R&D Systems)测量。
在这两种研究中，与对照小鼠比较，TARC和MDC的浓度在来自抗 IL-31处理的小鼠的耳朵上清液中较低，然而，当通过ANOVA分析时 这些结果在统计上不显著，可能是由于小的样本量。当将来自两个试 验的数据合并并分析时，在受处理组之间存在统计上显著的差异。
实施例16
IL-31中和抗体的施用
将约8-12周大的正常雌性BALB/c小鼠(CRL)皮下植入递送1 g/天的mIL-31的14-天渗透泵(Alzet，#2002)。从IL-31递送前1 周开始，数组小鼠每周两次接受腹膜内(i.p.)注射10mg/kg(200 g/小鼠)的大鼠抗-小鼠IL-31单克隆抗体。小鼠对照组以相同给药方 案，接受i.p.注射的载体(PBS/0.1％BSA)。采用下列标准每天给 小鼠的脱毛和搔痒打分：0＝无搔痒行为，动物表现正常；1＝小范围内 毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(小块)，搔抓行为； 3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为。
在所有试验中，用大鼠抗-mIL-31mAb处理的小鼠的症状发作延 迟了约5至7天，并具有较低的脱毛和搔痒的总体打分。通过13天的 试验，所有mAb处理的小鼠组(不考虑给药频率或浓度)发生了与对 照小鼠类似的脱毛和搔痒。这些数据表明，IL-31的中和可延缓由 IL-31诱导的搔抓/脱毛反应的发作。
根据上文中描述的，应该理解，虽然为了说明目的已在此描述了 本发明的特殊实施方案，但可作出多种修改而不背离本发明的精神和 范围。因此，本发明仅受附带的权利要求书限制。
序列表
<110>Siadak，Anthony W.
Bilsborough，Janine
Florkiewicz，Elin
Haran，Aaron C.
<120>IL-31单克隆抗体及其使用方法
<130>05-11PC
<150>60/678,918
<151>2005-05-06
<150>60/696,251
<151>2005-07-01
<150>60/711,600
<151>2005-08 26
<160>7
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>904
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(28)...(519)
<400>1
ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr
1 5
tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102
Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His
10 15 20 25
acg ttg ccc gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150
Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile
30 35 40
gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag 198
Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu
45 50 55
gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246
Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu
60 65 70
agc cct gac gcc cag ccg cca aac aac atc cac agc cca gcc atc cgg 294
Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg
75 80 85
gca tat ctc aag aca atc aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat 342
Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp
90 95 100 105
gag atc ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gca cca gaa 390
Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu
110 115 120
aca aac att tct gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc atc 438
Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile
125 130 135
ctg act att tct caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gca cta aaa 486
Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys
140 145 150
tca ttg acc tct gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539
Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr
155 160
ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599
gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659
agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719
tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779
ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839
ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc 899
tcata 904
<210>2
<211>164
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
1 5 10 15
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
20 25 30
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
35 40 45
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
50 55 60
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro
65 70 75 80
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
85 90 95
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
100 105 110
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
115 120 125
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
130 135 140
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145 150 155 160
Gln Ala Thr Thr
<210>3
<211>755
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(489)
<400>3
atg atc ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
1 5 10 15
tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc agc ttg tcc ttc ggt gcc cca 96
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
20 25 30
ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
35 40 45
tct cag gat ctt tat aac aac tat agc ata aag cag gca tct ggg atg 192
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
50 55 60
tca gca gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc agc ctg gac cgg gaa 240
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65 70 75 80
gca tta acc aac atc tcg gtc atc ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa 288
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
85 90 95
gtg ttg agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta 336
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
100 105 110
aca aac atc agc tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct 384
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
115 120 125
gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
130 135 140
tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat 480
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145 150 155 160
act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529
Thr Thr Cys
gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589
cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649
tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709
catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755
<210>4
<211>163
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
1 5 10 15
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
20 25 30
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
35 40 45
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
50 55 60
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65 70 75 80
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
85 90 95
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
100 105 110
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
115 120 125
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
130 135 140
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145 150 155 160
Thr Thr Cys
<210>5
<211>662
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp
1 5 10 15
Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg
35 40 45
Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr
50 55 60
Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn
65 70 75 80
Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe
85 90 95
Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg
115 120 125
Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys
130 135 140
Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro
145 150 155 160
Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg
165 170 175
Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg
180 185 190
Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr
195 200 205
Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp
210 215 220
Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro
225 230 235 240
Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly
245 250 255
Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
260 265 270
Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn
275 280 285
Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu
290 295 300
His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu
325 330 335
Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp
340 345 350
Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp
355 360 365
Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser
370 375 380
Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys
385 390 395 400
Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His
405 410 415
Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
420 425 430
Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys
435 440 445
Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly
450 455 460
Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly
465 470 475 480
Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser
485 490 495
Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser
500 505 510
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe
515 520 525
Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu
530 535 540
Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn
545 550 555 560
Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser
565 570 575
Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu
580 585 590
Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro
595 600 605
Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn
610 615 620
Phe Gly Ash Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly
625 630 635 640
Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser
645 650 655
Ser Cys Pro Thr Ser Ile
660
<210>6
<211>979
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu
20 25 30
Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu
35 40 45
His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys
50 55 60
Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile
65 70 75 80
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His
85 90 95
Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val
100 105 110
Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe
115 120 125
Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr
130 135 140
Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu
145 150 155 160
Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn
165 170 175
Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp
180 185 190
Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn
195 200 205
Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu
210 215 220
Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro
225 230 235 240
Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr
245 250 255
Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser
260 265 270
Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys
275 280 285
Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu
290 295 300
Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser
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Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro
325 330 335
Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr
340 345 350
Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile
355 360 365
Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys
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Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
385 390 395 400
Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser
405 410 415
Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu
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Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr
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Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys
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Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser
465 470 475 480
Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val
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Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn
515 520 525
Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser
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Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp
545 550 555 560
Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn
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Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg
580 585 590
Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg
595 600 605
Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala
610 615 620
Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser
625 630 635 640
Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe
645 650 655
Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His
660 665 670
Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys
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Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu
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Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala
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Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu
725 730 735
His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val
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Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu
755 760 765
Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser
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Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser
785 790 795 800
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Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala
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His Tyr Cys
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Glu-Glu标签肽
<400>7
Glu Tyr Met Pro Met Glu
1 5
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