磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法

磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其elisa检测方法
技术领域
1.本发明涉及免疫分析技术领域，特别涉及磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其elisa检测方法。

背景技术：

2.抗生素从生产到消费中的各个环节都有可能进入环境，环境中残留的抗生素会导致耐药基因的产生，改变微生物生态环境；同时由于食物链积累，抗生素也会对人体造成不可预计的危害。目前，抗生素对水体的污染日益严重，医疗卫生、畜牧养殖、水产养殖成为环境水体中抗生素的主要污染源。虽然各地污染程度大不相同，但是检出频率较高，在我国检出浓度较大的抗生素种类依次为：磺胺类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、氯霉素类。因此，构建快速高效的抗生素类物质的检测方法显得尤为重要。
3.目前国内外对水体中抗生素的检测方法主要是仪器分析法，此类方法对仪器条件要求高，前处理操作相对复杂、耗时。elisa利用抗原-抗体特异性反应，很好的弥补了仪器分析法的不足，由于不需要昂贵的仪器设备，且特异性强、灵敏度高、操作简便快捷，在现场筛选和大量样本的快速检测中显示了其独特的优势。
4.目前对于水体中抗生素的elisa检测方法已有研究，这些方法均采用一种载体蛋白偶联一种半抗原制备人工抗原，通过免疫动物制备特异性多克隆/单克隆抗体，进而开发出相应的elisa检测方法。但抗生素种类繁多，通过一种elisa检测方法只能测定一种抗生素的含量，如果需要了解样品中某类抗生素或者某几类抗生素的总量，就需要进行很多次的测定再将结果汇总，势必会增加工作量，延长检测时间。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明目的在于提供磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其elisa检测方法。本发明提供的人工复合抗原能够制备出可以同时检测多种抗生素类物质的广谱抗体，实现磺胺类和四环素类抗生素的同时检测。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种人工复合抗原，具有式i所示结构：
[0008][0009]
式i中，“n-protein-n”表示载体蛋白。
[0010]
优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
[0011]
本发明提供了上述人工复合抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物；
[0013][0014]
将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式i所示结构的人工复合抗原。
[0015]
优选的，所述第一偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h；
[0016]
所述第二偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h。
[0017]
本发明提供了上述人工复合抗原在制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体中的应用。
[0018]
本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，由上述人工复合抗原免疫宿主动物得到。
[0019]
本发明提供了上述检测磺胺类和/或四环素类抗生素的试剂盒，包括包被抗原，封闭剂，磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，酶标二抗，显剂，酶标板；
[0020]
所述包被抗原为上述人工复合抗原；
[0021]
所述包被抗原结构中的载体蛋白与制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白不同。
[0022]
优选的，所述包被抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗
生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白；
[0023]
或者，所述包被抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白。
[0024]
本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的elisa检测方法，包括以下步骤：
[0025]
将含有包被抗原的缓冲溶液加至酶标板中，进行第一孵育，得到包被有包被抗原的酶标板；
[0026]
将封闭剂加至所述包被有包被抗原的酶标板中，进行第二孵育，洗去未结合物，得到封闭酶标板；
[0027]
将待测液和磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体加至所述封闭酶标板中，进行第三孵育，洗去未结合物，得到竞争结合后的酶标板；
[0028]
将酶标二抗加至所述竞争结合后的酶标板中，进行第四孵育，洗去未结合物，之后加入显剂进行显反应，测定所得显反应液在492nm处的吸光度值；
[0029]
根据所述吸光度值计算抑制率；
[0030]
根据所述抑制率和标准曲线获得待测液中磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度；所述标准曲线为磺胺类抗生素和四环素类抗生素总浓度的自然对数值与抑制率的线性关系曲线。
[0031]
优选的，所述磺胺类抗生素为磺胺、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺噻唑中的一种或几种；
[0032]
所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素和环霉素中的一种或几种。
[0033]
本发明提供了一种人工复合抗原，具有式i所示结构。本发明构建磺胺类(sulfonamides,sas)和四环素类(tetracyclines,tcs)抗生素的人工复合抗原，在人工抗原内引入磺胺片段和四环素片段，通过戊二醛连接臂将磺胺片段、四环素片段与载体蛋白连接，得到磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原。此人工复合抗原经动物免疫后可以得到对sas和tcs具有特异性、效价高的广谱抗体，可以直接检测样品中sas和tcs总量。
[0034]
本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的elisa检测方法，此法对sas和tcs类抗生素线性良好。实施例结果表明，本发明提供的elisa 检测方法对于磺胺sa、磺胺吡啶sp、磺胺嘧啶sd、磺胺噻唑st、四环素 tc、金霉素ctc、土霉素otc、环霉素dc的ic
50
分别为：16.3、21.8、18.3、 20.5、17.3、22.3、17.9、20.2ng/ml，检测下限ic
10
分别为：0.46、0.54、0.48、 0.53、0.49、0.51、0.50、0.49ng/ml，具有高灵敏度和低检测限；对单加标水样中的sas和tcs抗生素的回收率范围为：97.12～98.87％，可有效检测水中以上各类抗生素。对混合标水样中的sas和tcs抗生素总量检测的回收率范围为：96.25～98.56％，可有效检测水中sas和tcs抗生素总量。
附图说明
[0035]
图1为本发明人工复合抗原的合成路线；
[0036]
图2为本发明所得人工复合抗原的紫外光谱扫描结果。
具体实施方式
[0037]
本发明提供一种人工复合抗原，具有式i所示结构：
[0038][0039]
在本发明中，“n-protein-n”表示载体蛋白，“n-protein-n”中的“n”表示载体蛋白通过“n”与戊二醛结构连接。
[0040]
在本发明中，所述载体蛋白优选为牛血清蛋白(bsa)或卵清蛋白 (ova)。
[0041]
在本发明中，当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述人工复合抗原记为 sa-bsa-tc；当所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述人工复合抗原记 sa-ova-tc。
[0042]
本发明提供了上述人工复合抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0043]
将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物；
[0044][0045]
将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式i所示结构的人工复合抗原。
[0046]
本发明将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物。在本发明中，所述醇溶剂优选为甲醇。在本发明中，所述缓冲溶液优选为pbs缓冲溶液。在本发明中，所述pbs缓冲溶液的ph值优选为7.2，浓度优选为0.01mol/l。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。
[0047]
在本发明中，所述甲醇和pbs的体积比优选为1:1。
[0048]
在本发明中，所述磺胺、戊二醛和载体蛋白的摩尔比优选为33：178： 1～1.4；在本
发明中，当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述磺胺、戊二醛和载体蛋白的摩尔比优选为33：178：1.4，当所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述磺胺、戊二醛和载体蛋白的摩尔比优选为33：178：1。
[0049]
在本发明中，所述第一偶联反应的温度优选为22～26℃，更优选为室温，时间优选为4～5h。
[0050]
本发明将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式i所示结构的人工复合抗原。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。
[0051]
在本发明中，所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛的摩尔比优选为1：1：5～5.5。
[0052]
在本发明中，所述第二偶联反应的温度优选为22～26℃，更优选为室温，时间优选为4～5h。
[0053]
得到所述第二偶联反应后，本发明优选对所得第二偶联反应液进行透析。在本发明中，所述透析优选在pbs缓冲溶液中进行，所述透析使用透析袋的截留分子量优选为8000～10000da；在本发明中，所述透析的时间优选为72h，温度优选为4℃；所述透析的过程中，每隔12小时进行换液。
[0054]
本发明提供了上述人工复合抗原在制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体中的应用。
[0055]
本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，由上述人工复合抗原免疫宿主动物得到。在本发明中，所述宿主动物优选为小鼠、家兔。本发明对所述免疫宿主动物的具体方法没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的免疫宿主动物的方法即可。
[0056]
作为本发明的一个具体实施例，当所述宿主动物为小鼠时，所述免疫宿主动物的方法优选包括以下步骤：
[0057]
分别在第0、3、28、49天将人工复合抗原和佐剂注入小鼠体内，免疫完成后从小鼠尾部取血，得到抗血清，所述抗血清中含有磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体。
[0058]
本发明提供了一种检测磺胺类和/或四环素类抗生素的试剂盒，包括包被抗原，封闭剂，上述磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，酶标二抗，显剂，酶标板；
[0059]
所述包被抗原为上述人工复合抗原；
[0060]
所述包被抗原结构中的载体蛋白与制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白不同。在本发明中，所述制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原即为免疫抗原。
[0061]
在本发明中，所述磺胺类抗生素优选为磺胺(sa)、磺胺吡啶(sp)、磺胺嘧啶(sd)、磺胺噻唑(st)中的一种或几种；
[0062]
所述四环素类抗生素为四环素(tc)、金霉素(ctc)、土霉素(otc)、环霉素(dc)的一种或几种。
[0063]
在本发明中，所述磺胺sa、磺胺吡啶sp、磺胺嘧啶sd、磺胺噻唑st、四环素tc、金霉素ctc、土霉素otc、环霉素dc的化学式如下所示：
[0064][0065]
在本发明中，所述包被抗原结构中的载体蛋白优选为卵清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白。即在本发明中，所述包被抗原为sa-ova-tc，免疫抗原为 sa-bsa-tc。
[0066]
或者，所述包被抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白。即在本发明中，所述包被抗原为sa-bsa-tc，免疫抗原为sa-bsa-tc。
[0067]
在本发明中，所述封闭剂优选为牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶和脱脂奶粉中的一种或几种。
[0068]
在本发明中，所述酶标二抗优选为hrp标记羊抗小鼠igg。
[0069]
在本发明中，所述显剂优选为邻苯二胺、na2hpo4、柠檬酸、h2o2与水的混合液。
[0070]
本领域对所述酶标板的种类没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的酶标板即可。
[0071]
本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的elisa检测方法，包括以下步骤：
[0072]
将含有包被抗原的缓冲溶液加至酶标板中，进行第一孵育，得到包被有包被抗原的酶标板；
[0073]
将封闭剂加至所述包被有包被抗原的酶标板中，进行第二孵育，洗去未结合物，得到封闭酶标板；
[0074]
将待测液和磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体加至所述封闭酶标板中，进行第三孵育，洗去未结合物，得到竞争结合后的酶标板；
[0075]
将酶标二抗加至所述竞争结合后的酶标板中，进行第四孵育，洗去未结合物，之后加入显剂进行显反应，测定所得显反应液在492nm处的吸光度值；
[0076]
根据所述吸光度值计算抗生素对抗体的抑制率；
[0077]
根据所述抑制率和标准曲线获得待测液中磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度；
[0078]
所述标准曲线为磺胺类抗生素和四环素类抗生素总浓度的自然对数值与抑制率的线性关系曲线。
[0079]
本发明将含有包被抗原的缓冲溶液加至酶标板中，进行第一孵育，得到包被有包被抗原的酶标板。在本发明中，所述含有包被抗原的缓冲溶液的浓度优选为0.125～2μg/ml，具体优选为2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml，最优选为0.5μg/ml。在本发明中，所述含有包被
抗原的缓冲溶液的加入量优选为100μl/孔。
[0080]
在本发明中，所述第一孵育的温度优选为4℃，时间优选为过夜。
[0081]
本发明将封闭剂加至所述包被有包被抗原的酶标板中，进行第二孵育，洗去未结合物，得到封闭酶标板。在本发明中，所述封闭剂优选为牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶和脱脂奶粉中的一种或几种，最优选为牛血清蛋白。在本发明中，所述封闭剂的浓度优选为1wt％，加入量优选为250μl/孔。
[0082]
在本发明中，所述第二孵育的温度优选为37℃，时间优选为1h。
[0083]
在本发明中，所述洗去未结合物的方式优选为缓冲溶液洗涤。
[0084]
本发明将待测液和磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体加至所述封闭酶标板中，进行第三孵育，洗去未结合物，得到竞争结合后的酶标板。在本发明中，所述待测液优选为水体、血清、脱脂牛奶。
[0085]
在本发明中，所述磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体的稀释比例优选为1:16000～1:512000，具体优选为1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、 1:256000、1:512000，最优选为1:128000。
[0086]
在本发明中，所述待测液的加入量优选为50μl/孔，所述磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体的加入量优选为50μl/孔。
[0087]
在本发明中，所述第三孵育的温度优选为4～40℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃。在本发明中，所述第三孵育的时间优选为1h。
[0088]
在本发明中，所述洗去未结合物的方式优选为缓冲溶液洗涤。
[0089]
本发明将酶标二抗加至所述竞争结合后的酶标板中，进行第四孵育，洗去未结合物，之后加入显剂进行显反应，测定所得显反应液在492nm 处的吸光度值。在本发明中，所述酶标二抗选为hrp标记羊抗小鼠igg。在本发明中，所述酶标二抗的稀释倍数优选为1:64000，加入量优选为50μl/ 孔。
[0090]
在本发明中，所述第四孵育的温度优选为37℃，时间优选为1h。
[0091]
在本发明中，所述洗去未结合物的方式优选为缓冲溶液洗涤。
[0092]
在本发明中，所述显剂的加入量优选为100μl/孔。在本发明中，所述显反应的温度优选为室温，时间优选为15min。在本发明中，所述显反应优选在避光的条件下进行。
[0093]
本发明根据所述吸光度值计算抑制率。在本发明中，所述抑制率的计算方法如下：
[0094]
抑制率(％)＝(a-ai)/(a-a0)
[0095]
a：阳性对照孔吸光值(50μl抗体稀释液+50μl2倍浓度的广谱抗体)
[0096]ai
：含有浓度i的抗生素孔的吸光值
[0097]
a0：空白对照孔的吸光值(100μl抗体稀释液)。
[0098]
本发明根据所述抑制率和标准曲线获得待测液中磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度；所述标准曲线为磺胺类抗生素和四环素类抗生素总浓度的自然对数值与抑制率的线性关系曲线。
[0099]
在本发明中，所述标准曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
[0100]
提供梯度已知浓度的磺胺类和/或四环素类抗生素标准溶液，当所述标准溶液包括磺胺类抗生素和四环素类抗生素时，所述标准溶液的浓度为磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度。在本发明中，所述梯度已知浓度的磺胺类和/或四环素类抗生素标准溶液的
浓度优选为1、2.5、5、10、25、50、100 ng/ml。
[0101]
使用所述梯度已知浓度的磺胺类和/或四环素类抗生素标准溶液作为待测液，按照上述方法获得梯度已知浓度的磺胺类和/或四环素类抗生素标准溶液对应的抑制率，以抑制率为纵坐标，抗生素浓度的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。
[0102]
下面结合实施例对本发明提供的磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其elisa检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0103]
实施例1人工复合抗原的合成
[0104]
按体积比1:1制备甲醇/pbs(ph＝7.2,0.01mol/l)的混合溶液，取80mgsa 加入20ml甲醇/pbs混合溶液中，混合均匀；将1.4gbsa或0.6gova加入 50mlpbs溶液中，混合均匀；加入1ml25％的ga，室温下搅拌反应4h，制备人工抗原sa-bsa/sa-ova；随后加入200mgtc，混合均匀后，再次加入 1ml25％的ga，室温下搅拌反应4h，制备复合人工抗原 sa-bsa-tc/sa-ova-tc；将溶液置于透析袋中，4℃下pbs(ph＝7.2, 0.01mol/l)透析72h，每隔12小时进行换液，透析完成后，测定透析产物的蛋白质含量，并于-20℃下储存备用。
[0105]
本发明人工复合抗原的合成路线如图1所示。
[0106]
将复合人工抗原稀释至1mg/ml(按蛋白质浓度)后，进行紫外光谱扫描，所得结果如图2所示。由图2可以看出，sa-bsa-tc、sa-ova-tc具有 bsa、ova、tc、sa的光吸收特性，同时最大吸收峰又出现了一定的移动，体现出了自身的特性，说明sa和tc与bsa、ova偶联成功。
[0107]
实施例2广谱检测抗体的制备
[0108]
使用表1所示的免疫方案对balb/c雌性小鼠进行免疫，每只小鼠分别在第0、3、28、49天进行4次免疫；每次免疫分别使用100μg、50μg、50μg、 50μg的人工复合抗原，分别与等体积fca、fca、fica混合制备免疫剂用于免疫；对小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫。
[0109]
表1免疫方案
[0110][0111]
从小鼠尾部取血，得到抗血清，对抗血清对sas和tcs抗生素的效价采用间接elisa(indirectnoncompetitiveelisa,inelisa)方法测定，对sas 和tcs抗生素的灵敏度采用间接竞争elisa方法测定(indirectcompetitiveelisa,icelisa)，来检测复合抗体对sas和tcs类抗生素的特异性。检测抗体igg采用饱和硫酸铵沉淀法进行分离。
[0112]
抗血清效价测定具体步骤如下(inelisa)：
[0113]
①
包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释到1μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜；
[0114]
②
封闭：倒出酶标板孔内的液体，拍干。每孔加入250μl封闭液，37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。每孔加入洗涤缓冲液200μl，轻轻晃动90 s，倒出孔内液体，拍干。重复洗3次。
[0115]
③
加待测血清：用抗体稀释液将抗血清从1:4000开始2倍梯度稀释到1: 256000，100μl/孔。37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0116]
④
加酶标二抗：用抗体稀释液将hrp标记羊抗小鼠igg1:10000稀释， 100μl/孔。37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0117]
⑤
显：每孔加100μl新鲜配置的底物显液，室温避光反应15min。
[0118]
⑥
终止：每孔加50μl终止液。
[0119]
⑦
结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。
[0120]
抗血清的效价以中点效价计，即吸光值最接近1.0时的血清稀释度，并以该稀释度作为抗体的工作浓度，测定其灵敏度。
[0121]
抗血清灵敏度测定具体步骤如下(icelisa)：
[0122]
①
包被：同上。
[0123]
②
封闭：同上。
[0124]
③
竞争：用抗体稀释液将各种抗生素标准溶液从4000μg/l开始2倍梯度稀释到7.812μg/l，加入到96孔板中，50μl/孔，然后向每孔加入2倍工作浓度的抗血清50μl，充分混匀，另设一个阳性对照孔(50μl纯水+50μl 2倍工作浓度的抗血清)，37℃孵育1h。倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0125]
④
后续加酶标二抗、显、终止及结果测定同上
[0126]
以抑制率为纵坐标，抗生素浓度的自然对数值为横坐标，进行回归分析，计算产生50％抑制的抗生素浓度ic
50
。ic
50
值越低，灵敏度越高。
[0127]
小鼠抗血清的效价及灵敏度如表2所示。
[0128]
表2小鼠抗血清的效价及灵敏度
[0129][0130]
由表2可知，以sa-bsa-tc为免疫原，sa-ova-tc为包被原时，所得广谱检测抗体的特异性好、灵敏度高。
[0131]
实施例3elisa检测方法的建立及特异性检测
[0132]
(1)包被原浓度和抗体稀释比确定
[0133]
稀释包被原(sa-ova-tc)至浓度2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml，酶标板4℃包被过夜；将广谱抗体按1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、 1:256000、1:512000稀释，进行方阵滴定；取od
450
值为1左右的组合进行 icelisa测定，最佳组合为各组合中ic
50
值最小的组合。
[0134]
方正滴定法的具体步骤：
[0135]
将半抗原进行包被，包被浓度设置为2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml，4℃包被过夜，将广谱抗体按1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、 1:512000稀释，进行方阵滴定。
[0136]
①
包被：同上。
[0137]
②
封闭：同上。
[0138]
③
加广谱抗体：加入不同稀释比的广谱抗体，100μl/孔，，37℃孵育1h。倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0139]
④
加酶标二抗：用抗体稀释液将hrp标记羊抗小鼠igg1:10000稀释，100 μl/孔。37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0140]
⑥
显：同上。
[0141]
⑦
终止：同上。
[0142]
⑧
结果测定：同上。
[0143]
选择吸光值接近1.0的包被半抗原浓度和单抗稀释度的组合，进行半抗原包被的间接竞争elisa，所得结果如表3所示。
[0144]
表3包被原浓度与抗体稀释倍数筛选
[0145][0146]
由表4可知，包被原浓度为0.5μg/ml，抗体稀释比为128000时，对大部分sas和tcs类抗生素的ic
50
均最小，灵敏度最高，因此选择包被原浓度为0.5μg/ml，抗体稀释比为128000为最适组合。
[0147]
(2)elisa竞争反应体系反应温度的确定
[0148]
在包被原浓度为0.5μg/ml，抗体稀释比为128000条件下，采用3(1)中同样的icelisa方法，设定不同的反应温度(4、25、30、35、40℃)测定ic
50
，选择ic
50
最小时的温度，确定为最佳反应温度，所得结果如表4所示。
[0149]
表4最适反应温度筛选
[0150][0151]
由表4可知，反应温度为30℃时，对大部分sas和tcs类抗生素的ic
50
均最小，灵敏度最高，因此选择30℃为竞争反应最适反应温度。
[0152]
(3)elisa竞争反应体系反应ph的确定
[0153]
在包被原浓度为0.5μg/ml，抗体稀释比为128000，竞争反应温度为30℃条件下，采用实施例3步骤(1)中同样的icelisa方法，设定不同的反应ph (6.4、7.4、8.4、9.4)测定ic
50
，选择ic50最小时的ph，确定为最佳反应ph，所得结果如表5所示。
[0154]
表5最适反应ph筛选
[0155][0156]
由表5可知，反应ph为7.4时，对大部分sas和tcs类抗生素的ic50均最小，灵敏度最高，因此选择ph7.4为竞争反应最适ph。
[0157]
(4)elisa竞争反应体系封闭剂的确定
[0158]
在包被原浓度为0.5μg/ml，抗体稀释比为128000，竞争反应温度为30℃，ph＝7.4的条件下，采用3(1)中同样的icelisa方法，选择不同的封闭剂(1％ bsa、1％ova、1％明胶、3％脱脂奶粉)测定ic
50
，选择ic
50
最小时的ph，确定为最佳反应封闭剂，所得结果如表6所示。
[0159]
表6最适反应封闭剂筛选
[0160][0161]
由表3～6可以看出，优化得到的基于磺胺类和四环素类抗生素广谱抗体的elisa检测方法为：以0.5μg/mlsa-ova-tc为包被原，广谱抗体稀释比为1:128000，竞争反应体系温度为30℃，ph7.4，以1％bsa作为封闭剂。
[0162]
(5)标准曲线的建立
[0163]
利用已构建的elisa检测方法，采用不同浓度的sas、tcs抗生素标准溶液(0.5、1、2.5、5、10、25、50ng/ml)与广谱抗体进行竞争反应，以抑制率为纵坐标、lg(10
×c标准品
)(c
标准品
：标准品浓度)为横坐标建立标准曲线，计算ic
50
及检测下限ic
10
。
[0164]
标准曲线的建立具体步骤(icelisa)：
[0165]
①
包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释到0.5μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
[0166]
②
封闭：倒出酶标板孔内的液体，拍干。每孔加入250μl1％bsa，37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。每孔加入洗涤缓冲液200μl，轻轻晃动90 s，倒出孔内液体，拍干。重复洗3次。
[0167]
③
竞争：将sas、tcs抗生素标准溶液及sas、tcs随机混合样品梯度稀释到1、2.5、5、
10、25、50、100ng/ml，加入到96孔板中，50μl/孔，然后向每孔加入1:64000稀释的复合抗体50μl，充分混匀，使得抗生素标准溶液的浓度最终为：1、2.5、5、10、25、50、100ng/ml，复合抗体最终的稀释比为：1:128000；另设一个阳性对照孔(50μl纯水+50μl1:64000稀释的复合抗体)，37℃孵育1h。倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0168]
④
加酶标二抗：用抗体稀释液将hrp标记羊抗小鼠igg1:10000稀释， 100μl/孔。37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0169]
⑤
显：每孔加100μl新鲜配置的底物显液，室温避光反应15min。
[0170]
⑥
终止：每孔加50μl终止液。
[0171]
⑦
结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。
[0172]
以抑制率为纵坐标，抗生素浓度的自然对数值为横坐标，进行回归分析，计算产生50％抑制的抗生素浓度ic
50
。ic
50
值越低，灵敏度越高，检测下限以ic
10
计。
[0173]
标准曲线及ic
50
、ic
10
值如表7所示。
[0174]
表7标准曲线、ic
50
、ic
10
[0175]
[0176][0177]
由表7可知，所构建的elisa检测方法，对sas和tcs类抗生素线性良好。对于sa、sp、sd、st、tc、ctc、otc、dc及总量的ic
50
分别为： 16.3、21.8、18.3、20.5、17.3、22.3、17.9、20.2、17.6ng/ml，检测下限ic
10
分别为：0.46、0.54、0.48、0.53、0.49、0.51、0.50、0.49、0.50ng/ml。
[0178]
实施例4加标回收实验
[0179]
(1)水中单加标回收实验
[0180]
利用sas和tcs类抗生素标准品配制浓度为100ng/ml的加标水样，利用构建的elisa检测方法进行加标水样中sas和tcs的量。
[0181]
水中加标回收实验具体步骤：
[0182]
①
包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释到0.5μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
[0183]
②
封闭：倒出酶标板孔内的液体，拍干。每孔加入250μl1％bsa，37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。每孔加入洗涤缓冲液200μl，轻轻晃动90 s，倒出孔内液体，拍干。重复洗3次。
[0184]
③
竞争：将各种抗生素标准溶液梯度稀释到1、2.5、5、10、25、50、 100ng/ml，加入
到96孔板中，50μl/孔，然后向每孔加入1:64000稀释的复合抗体50μl，充分混匀，使得抗生素标准溶液的浓度最终为：1、2.5、5、 10、25、50、100ng/ml，复合抗体最终的稀释比为：1:128000(以上各孔制作标准曲线)；设一个阳性对照孔(50μl纯水+50μl1:64000稀释的复合抗体)；待检测孔(50μl加标水样+50μl1:64000稀释的复合抗体)37℃孵育1h。倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0185]
④
加酶标二抗：用抗体稀释液将hrp标记羊抗小鼠igg1:10000稀释， 100μl/孔。37℃孵育1h，倒出孔内液体，拍干。洗3次。
[0186]
⑤
显：每孔加100μl新鲜配置的底物显液，室温避光反应15min。
[0187]
⑥
终止：每孔加50μl终止液。
[0188]
⑦
结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。
[0189]
以抑制率为纵坐标，抗生素浓度的自然对数值为横坐标，进行回归分析，制作标准曲线，计算待检测加标水样中抗生素的浓度。
[0190]
水中单加标回收率测定结果见表8。
[0191]
表8水中单加标回收率测定结果
[0192][0193]
由表8可知，所构建的elisa检测方法，对单加标水样中的sas和tcs抗生素的回收率范围为：97.12％～98.87％，可有效检测水中以上各类抗生素。
[0194]
(2)水中混合加标回收实验
[0195]
利用sas和tcs各种抗生素，随机混合制备sas和tcs类抗生素混合样品，利用混合样品配制浓度为100ng/ml的加标水样，利用构建的elisa检测方法 (方法同上)，以进行加标水样中sas和tcs抗生素的总量，所得结果见表9。
[0196]
表9水中混合加标回收率测定结果
[0197][0198]
由表9可知，所构建的elisa检测方法，对混合标水样中的sas和tcs抗生素总量检测的回收率范围为：96.25～98.56％，可有效检测水中sas和tcs 抗生素总量。
[0199]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种人工复合抗原，具有式i所示结构：式i中，“n-protein-n”表示载体蛋白。2.根据权利要求1所述的人工复合抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。3.权利要求1或2所述的人工复合抗原的制备方法，包括以下步骤：将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物；将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式i所示结构的人工复合抗原。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h；所述第二偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h。5.权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制备得到的人工复合抗原在制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体中的应用。6.一种磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，由权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制备得到的人工复合抗原免疫宿主动物得到。7.一种检测磺胺类和/或四环素类抗生素的试剂盒，包括包被抗原，封闭剂，权利要求6所述的磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，酶标二抗，显剂，酶标板；所述包被抗原为权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制
备得到的人工复合抗原；所述包被抗原结构中的载体蛋白与制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白不同。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白；或者，所述包被抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白。9.一种磺胺类和四环素类抗生素总量的elisa检测方法，包括以下步骤：将含有包被抗原的缓冲溶液加至酶标板中，进行第一孵育，得到包被有包被抗原的酶标板；将封闭剂加至所述包被有包被抗原的酶标板中，进行第二孵育，洗去未结合物，得到封闭酶标板；将待测液和磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体加至所述封闭酶标板中，进行第三孵育，洗去未结合物，得到竞争结合后的酶标板；将酶标二抗加至所述竞争结合后的酶标板中，进行第四孵育，洗去未结合物，之后加入显剂进行显反应，测定所得显反应液在492nm处的吸光度值；根据所述吸光度值计算抗生素对抗体的抑制率；根据所述抑制率和标准曲线获得待测液中磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度；所述标准曲线为磺胺类抗生素和四环素类抗生素总浓度的自然对数值与抑制率的线性关系曲线。10.根据权利要求9所述的elisa检测方法，其特征在于，所述磺胺类抗生素为磺胺、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺噻唑中的一种或几种；所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素和环霉素中的一种或几种。

技术总结

本发明提供了磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明构建磺胺类(sulfonamides,SAs)和四环素类(tetracyclines,TCs)抗生素的人工复合抗原，在人工抗原内引入磺胺片段和四环素片段，通过戊二醛连接臂将磺胺片段、四环素片段与载体蛋白连接，得到磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原。此人工复合抗原经动物免疫后可以得到对SAs和TCs具有特异性、效价高的广谱抗体，可以直接检测样品中SAs和TCs总量。本发明提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的ELISA检测方法，此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。