NOTCH3突变体及其应用的制作方法

notch3突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及notch3突变体及其应用。

背景技术：

2.胎儿淋巴水囊瘤(cystic hygroma,ch)是常见的先天性发育异常，主要临床特征是由于淋巴管发育异常导致淋巴管阻塞扩张所形成的水囊状淋巴管，其内充满异常积聚的淋巴液。多于早孕期发生，90％以上发生于颈部，尤其在颈后部。胎儿颈部淋巴水囊瘤在自然流产胎儿中发病率为1:750。在进行产前诊断的高危妊娠妇女中，其发病率达到6.8％。在临床实践中主要通过产前超声扫描进行诊断胎儿颈部淋巴水囊瘤，依据超声扫描特征，可以区分为分隔型和非分隔型两种亚型，其中非分隔型不容易与一般的胎儿颈后透明层增厚(nuchaltransluce ncy increased，nt)进行鉴别，因此，临床常规中胎儿颈部淋巴水囊瘤多数指分隔型，占85％以上。无分隔水囊瘤主要表现为单房囊性包块，多位于颈部两侧，显示颈部围绕一囊性肿物，体积较小，内透声好，易漏诊；无分隔水囊瘤不伴其它异常且染体核型正常者愈后较好，可行宫内或在新生儿期手术切除。有分隔水囊瘤预后极差，危害极大，最常合并的畸形依次是水肿胎、心血管系统畸形以及骨骼系统畸形等，妊娠结局差，多数孕妇选择终止妊娠，在为数不多的继续妊娠中，要么自然流产，要么胎死宫内，个别幸存的新生儿亦死于围手术期，或者留下精神运动发育迟缓的后遗症，完全健康的患儿病例极少见，仅占不到4％。如果各种原因引起淋巴管与颈静脉窦回流延迟或者胎儿静脉压增加，淋巴囊液无法汇入淋巴系统和颈内静脉，颈部淋巴液过多地积聚在颈部，胎儿颈项透明层(nt)就明显增厚了。当严重的淋巴循环障碍或者运输组织液至静脉系统的网状淋巴管先天畸形可发展为ch。胎儿nt增厚与ch的病理基础相似，只是程度不同。
3.目前，已知染体畸变是导致胎儿颈部淋巴水囊瘤的主要病因，大约占到40％～45％，最多见是turner综合征(特纳综合征，先天性卵巢发育不全)，其次是21三体、18三体和13三体，其他有5％的病例由染体微缺失、微重复导致，还有一些与遗传综合征有关，常见的有努南综合征、多发性翼状韶肉综合征及骨骼肌肉异常相关综合征等。临床实践中仍有60％胎儿病例的病因及分子改变至今未明。对引起胎儿颈部淋巴水囊瘤基因的发现与检测，可加强对该病的理解，为产前诊断提供指导。新近发展起来的下一代高通量测序技术(next generation sequencing,ngs)能够直接在全基因组30亿个碱基范围内精确检测基因的变异位点，为探索和发现遗传病的致病基因提供技术便利和可行性。其中全外显子组测序(whole exome sequencing,wes)以其经济、有效的优势已广泛应用于遗传病及复杂疾病的研究。随着wes的发展，将发现更多与胎儿颈部淋巴水囊瘤相关的基因，从而进一步深入了解该病的遗传原因。

技术实现要素：

4.本发明的第一方面的目的，在于提供一种蛋白。
5.本发明的第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的核酸。
6.本发明的第三方面的目的，在于提供检测本发明第一方面的蛋白的物质和/或检测本发明第二方面的物质在制备淋巴水囊瘤诊断或预后评估的产品中的应用。
7.本发明的第四方面的目的，在于提供一种生物模型的构建方法。
8.本发明的第五方面的目的，在于提供生物模型在筛选药物中的应用。
9.本发明的第六方面的目的，在于提供特异性改变本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸的物质在制备预防和/或淋巴水囊瘤的药物中的应用。
10.本发明的第七方面的目的，在于提供一种药物。
11.本发明的第八方面的目的，在于提供一种产品。
12.本发明的第九方面的目的，在于提供与本发明第二个方面的核酸相关的生物材料。
13.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
14.本发明的第一个方面，提供一种蛋白，所述蛋白与野生型notch3蛋白相比，存在以下突变：p.val1186met(p.v1186m)。
15.优选地，所述野生型notch3蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
16.本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面的蛋白的核酸。
17.优选地，所述核酸与野生型notch3基因相比，存在以下突变：c.3556g》a。
18.优选地，所述野生型notch3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
19.本发明的第三个方面，提供(e1)～(e3)中至少一种在制备淋巴水囊瘤诊断或预后评估的产品中的应用；
20.(e1)检测本发明第一方面的蛋白的物质；
21.(e2)检测本发明第二方面的核酸的物质；
22.(e3)检测野生型notch3的物质。
23.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质为定量检测本发明第一方面的蛋白的物质。
24.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质选自下组的一种或多种检测方法中的物质：免疫组织化学法、western印迹法、生物芯片法。
25.优选地，所述免疫组织化学法选自：免疫荧光法、免疫酶标法(elisa)和免疫胶体金法。
26.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质包含：对本发明第一方面的蛋白具有特异性的物质。
27.优选地，所述对本发明第一方面的蛋白具有特异性的物质为(a1)～(a3)中的任一种：
28.(a1)特异性结合本发明第一方面的蛋白的抗体；
29.(a2)特异性结合本发明第一方面的蛋白的配体蛋白或多肽；
30.(a3)特异性识别本发明第一方面的蛋白的非蛋白类化合物。
31.优选地，所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体中的至少一种。
32.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质为定量检测本发明第二方面的核酸的物质。
33.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：northern印迹法、pcr、生物芯片法。
34.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质包含本发明第二方面的核酸的探针、基因芯片、pcr引物等。
35.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质包含notch3引物。
36.优选地，所述notch3引物的序列如seq id no.3、seq id no.4所示。
37.优选地，所述检测野生型notch3的物质包含定量检测野生型notch3的物质。
38.优选地，所述检测野生型notch3的物质包含在基因水平和/或蛋白质水平上检测野生型notch3的物质。
39.优选地，所述物质包含用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法、western印迹法、northern印迹法、pcr、生物芯片法。
40.优选地，所述免疫组织化学法选自下组中的至少一种：免疫荧光分析、反向酶联免疫吸附和免疫胶体金法。
41.优选地，所述检测野生型notch3的物质选自下组中的至少一种：对野生型notch3具有特异性的物质，例如其抗体(优选单克隆抗体)；野生型notch3特异性的探针、基因芯片、pcr引物等。
42.优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、系统中的至少一种。
43.优选地，所述产品的受试样品选自血液、羊水、绒毛，脐血、组织、细胞样品中至少一种。
44.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
45.发明人发现，淋巴水囊瘤患者的外显子中存在前面所述的基因突变，且为杂合突变和/或纯合突变；和/或野生型notch3的表达量降低；和/或野生型notch3蛋白的活性降低。用于检测前面所述的核酸的物质和/或前面所述的蛋白的物质和/或检测野生型notch3的物质所制备的产品，可用于淋巴水囊瘤诊断或预后评估。
46.本发明的第四个方面，提供一种生物模型的构建方法，包括如下步骤：使生物模型携带(b1)～(b4)中至少一种：
47.(b1)本发明第一个方面的蛋白；
48.(b2)本发明第二个方面的核酸；
49.(b3)野生型notch3的表达量降低；
50.(b4)野生型notch3蛋白的活性降低。
51.优选地，(b3)中所述野生型notch3包含蛋白和核酸。
52.优选地，通过降解野生型notch3的物质和/或降低野生型notch3表达水平的物质降低野生型notch3的表达量。
53.优选地，通过降解野生型notch3蛋白的物质和/或抑制野生型notch3蛋白活性的物质降低野生型notch3蛋白的活性。
54.优选地，所述生物模型包含动物模型、细胞模型中的至少一种；进一步优选地，所述生物模型包含动物模型。
55.优选地，所述动物模型包含小鼠模型、大鼠模型中的至少一种。
56.优选地，所述生物模型为淋巴水囊瘤模型。
57.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
58.本发明的第五个方面，提供生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型携带(b1)～(b4)中至少一种：
59.(b1)本发明第一个方面的蛋白；
60.(b2)本发明第二个方面的核酸；
61.(b3)野生型notch3的表达量降低；
62.(b4)野生型notch3蛋白的活性降低。
63.优选地，(b3)中所述野生型notch3包含蛋白和核酸。
64.优选地，通过降解野生型notch3的物质和/或降低野生型notch3表达水平的物质降低野生型notch3的表达量。
65.优选地，通过降解野生型notch3蛋白的物质和/或抑制野生型notch3蛋白活性的物质降低野生型notch3蛋白的活性。
66.优选地，所述生物模型包含动物模型、细胞模型中的至少一种；进一步优选地，所述生物模型包含细胞模型。
67.优选地，所述动物模型包含小鼠模型、大鼠模型中的至少一种。
68.携带前面所述的核酸、蛋白、野生型notch3的表达量降低、野生型notch3蛋白的活性降低的模型可作为c.3556g》a相关疾病模型，进而该疾病模型可用于科学研究，如筛选c.3556g》a相关疾病的药物。
69.优选地，所述生物模型为淋巴水囊瘤模型。
70.优选地，所述药物用于预防和/或淋巴水囊瘤。
71.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
72.本发明的第六个方面，在于提供(f1)～(f3)中至少一种在制备预防和/或淋巴水囊瘤的药物中的应用；
73.(f1)提高野生型notch3表达量的物质；
74.(f2)提高野生型notch3蛋白的活性的物质；
75.(f3)特异性改变本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸的物质。
76.如前所述，淋巴水囊瘤患者携带前面所述的基因突变，且为杂合突变和/或纯合突变；和/或野生型notch3的表达量降低；和/或野生型notch3蛋白的活性降低，如果能够将前面所述的核酸、或蛋白恢复为野生型或非致病性、和/或野生型notch3的表达量提高、和/或野生型notch3蛋白的活性升高的药物，则具有和/或预防淋巴水囊瘤的潜能。
77.优选地，所述特异性改变为将本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸恢复为野生型。
78.优选地，所述特异性改变本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸的物质为基于包括单碱基基因编辑、锌指核酸酶(zfn)、转录激活样效应因子核酸酶(talen)、crispr/cas9(可同时联合ipsc和aav载体技术)等至少之一基因编辑方法的物质。
79.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少
一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
80.本发明的第七个方面，在于提供一种药物，包含：(f1)～(f3)中至少一种：
81.(f1)提高野生型notch3表达量的物质；
82.(f2)提高野生型notch3蛋白的活性的物质；
83.(f3)特异性改变本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸的物质。
84.优选地，所述特异性改变为将本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸恢复为野生型。
85.优选地，所述特异性改变本发明第一方面的蛋白和/或本发明第二方面的核酸的物质为基于包括单碱基基因编辑、锌指核酸酶(zfn)、转录激活样效应因子核酸酶(talen)、crispr/cas9(可同时联合ipsc和aav载体技术)等至少之一基因编辑方法的物质。
86.优选地，所述药物用于预防和/或淋巴水囊瘤。
87.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
88.本发明的第八个方面，在于提供一种产品，包含：(g1)～(g3)中至少一种：
89.(g1)检测本发明第一方面的蛋白的物质；
90.(g2)检测本发明第二方面的核酸的物质；
91.(g3)检测野生型notch3的物质。
92.优选地，所述产品包含(g1)或(g2)。
93.优选地，所述产品包含(g1)～(g3)中至少两种。
94.优选地，所述产品包含：检测本发明第一方面的蛋白的物质、检测本发明第二方面的核酸的物质中的至少一种和检测野生型notch3的物质。
95.优选地，所述检测野生型notch3的物质包含定量检测野生型notch3的物质。
96.优选地，所述检测野生型notch3的物质包含在基因水平和/或蛋白质水平上检测野生型notch3的物质。
97.优选地，所述物质包含用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法、western印迹法、northern印迹法、pcr、生物芯片法。
98.优选地，所述免疫组织化学法选自下组中的至少一种：免疫荧光分析、反向酶联免疫吸附和免疫胶体金法。
99.优选地，所述检测野生型notch3的物质选自下组中的至少一种：对野生型notch3具有特异性的物质，例如其抗体(优选单克隆抗体)；野生型notch3特异性的探针、基因芯片、pcr引物等。
100.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质为定量检测本发明第一方面的蛋白的物质。
101.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质选自下组的一种或多种检测方法中的物质：免疫组织化学法、western印迹法、生物芯片法。
102.优选地，所述免疫组织化学法选自：免疫荧光法、免疫酶标法(elisa)和免疫胶体金法。
103.优选地，所述检测本发明第一方面的蛋白的物质包含：对本发明第一方面的蛋白具有特异性的物质。
104.优选地，所述对本发明第一方面的蛋白具有特异性的物质为(a1)～(a3)中的任一种：
105.(a1)特异性结合本发明第一方面的蛋白的抗体；
106.(a2)特异性结合本发明第一方面的蛋白的配体蛋白或多肽；
107.(a3)特异性识别本发明第一方面的蛋白的非蛋白类化合物。
108.优选地，所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体中的至少一种。
109.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质为定量检测本发明第二方面的核酸的物质。
110.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：northern印迹法、pcr、生物芯片法。
111.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质包含本发明第二方面的核酸的探针、基因芯片、pcr引物等。
112.优选地，所述检测本发明第二方面的核酸的物质包含notch3引物。
113.优选地，所述notch3引物的序列如seq id no.3、seq id no.4所示。
114.优选地，所述产品用于淋巴水囊瘤诊断或预后评估。
115.优选地，所述产品包含试剂、试剂盒、试纸、芯片、系统中的至少一种。
116.优选地，所述产品的受试样品选自血液、羊水、绒毛、脐血、组织、细胞样品中至少一种。
117.优选地，所述产品还包含其他诊断淋巴水囊瘤的物质。
118.优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤、无分隔型淋巴水囊瘤中的至少一种；进一步优选地，所述淋巴水囊瘤包含分隔型淋巴水囊瘤。
119.本发明的第九个方面，提供一种与本发明第二个方面的核酸相关的生物材料，所述生物材料包含(c1)～(c7)中的至少一种：
120.(c1)包含本发明第二个方面的核酸的表达盒；
121.(c2)包含本发明第二个方面的核酸的载体；
122.(c3)包含(c1)所述表达盒的载体；
123.(c4)包含本发明第二个方面的核酸的转基因细胞系；
124.(c5)包含(c1)所述表达盒的转基因细胞系；
125.(c6)包含(c2)所述载体的转基因细胞系；
126.(c7)包含(c3)所述载体的转基因细胞系。
127.优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
128.本发明的有益效果是：
129.本发明首次公开了与野生型notch3蛋白相比，存在以下突变：p.val1186met(p.v1186m)的蛋白，以及编码该蛋白的核酸，该蛋白和/或编码该蛋白的核酸是淋巴水囊瘤的致病因子，通过检测该蛋白和/或编码该蛋白的核酸可对淋巴水囊瘤进行诊断或预后评估，通过特异性改变该蛋白和/或编码该蛋白的物质可以达到预防和/或淋巴水囊瘤的效果。
附图说明
130.图1是非综合征性分割型淋巴水囊瘤胎儿病理图：其中，a是胎儿镜下淋巴水囊瘤胎儿整体外观图(颈部明显水肿)；b是终止妊娠的淋巴水囊瘤胎儿大体病理图(颈部明显肿大)。
131.图2是蛋白质表达结果火山图：图中，蛋白表达无差异性变化用黑颜显示，上调表达用绿显示，下调表达用红颜显示，notch3蛋白位于右侧红颜区域，为显著下调表达。
132.图3是notch3基因突变c57bl/6小鼠模型f2代小鼠外观图。
133.图4是notch3基因突变c57bl/6小鼠模型f2代小鼠颈部局部解剖图。
具体实施方式
134.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
135.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
136.术语解释：
137.1.gnomad：https://gnomad.broadinstitute.org/，体数据库，目前已经收集了15,708个全基因组和125,748个外显子组的数据；
138.2.1000genomes：https://www.internationalgenome.org/，千人基因组，包含2,504个测序样本；
139.3.omim：https://www.omim.org/，人类孟德尔遗传在线数据库；
140.4.bwa：http://bio-bwa.sourceforge/，将原始测序数据比对到参考基因组上的软件；
141.5.gatk：https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us，genome analysis toolkit的缩写，是一款从高通量测序数据中分析变异信息的软件；
142.6.vep：variant effect predictor，对二代测试产生的不同类型变异进行注释，https://asia.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html；
143.7.sift，polyphen2_hdiv，revel，mutationtaster，metasvm：各种危害性预测软件，用于预测突变导致的危害性；
144.8.clinvar：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/，存储了人类变异位点和表型之间的关系，并提供了支持证据；
145.9.hgmd：http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php？，人类基因突变数据库(the human gene mutation database),收集引起人类遗传疾病相关的突变；
146.10.orphanet：https://www.orpha/consor/cgi-bin/index.php，人类罕见疾病数据库；
147.11.ddg2p：https://decipher.sanger.ac.uk/ddd/ddgenes，发育障碍疾病相关基因型与表型数据库；
148.12.pcr：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术；
149.13.crispr-cas9：是由细菌和古细菌等微生物中特有的获得性免疫系统发展起来
的基因组编辑技术；
150.14.c57bl/6：是一种常见的近交品系实验鼠，在遗传学试验中广泛用作转基因鼠以模拟人类的基因缺陷类疾病。
151.实施例1确定胎儿颈部淋巴水囊瘤致病基因
152.1.样本收集
153.发明人收集了52例不明原因的颈后淋巴水囊瘤胎儿病例及其家系成员进行全外显子测序(wes)。wes结果在7例胎儿病例中识别和筛选出notch3基因及其突变位点。同时在100例正常对照和103例淋巴水囊瘤的胎儿病例中对上述发现的notch3基因及位点应用sanger测序做扩展筛查。因此共有完整非综合征分隔型淋巴水囊瘤胎儿病例52+103例，所有个人(患者与正常人)，所有个人已抽取外周血样本，胎儿病例采集绒毛样本、羊水样本、脐带血样本，部分终止妊娠的引产病例同时取颈部组织。样本收集经广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，坚持1964年《赫尔辛基宣言》和其后修订内容中制定的标准。所有参与个体都由本人或他们的监护人签署了知情同意书。收集了包括年龄、性别和临床症状在内的临床信息。应用免疫荧光染技术对终止妊娠的非综合征性ch胎儿病例组织进行病理学研究，通过特异性淋巴管染和血管染的抗体(lyve1，prox1，cd31等)证实该类胎儿病例颈部淋巴水囊瘤的病理特征是淋巴管发育不良和毛细血管的基底平滑肌发育异常，并且上述异常跟胎儿发育的孕周没有相关性，如图1。应用全外显子组测序技术(wes)对其中52例不明原因的颈部淋巴水囊瘤胎儿及其核心家系成员进行全外显子组测序分析，分别从生物学意义、遗传学意义、以及临床特征(淋巴管发育与毛细血管发育相关)等不同层面进行深度分析。
154.2.全外显子测序
155.采用sureselect xt human all exon 50mb v5 kit(安捷伦)捕获芯片对所有的dna样本杂交获取目标区域序列，在illumina hiseq 2500测序仪上进行双末端150bp测序。测序后获得的原始数据使用fastp(v0.20)进行原始数据质控，去除含有接头或者低质量的reads，将质控后的clean data利用bwa(v0.7.17)比对到人类参考基因组grch37(hg19)，利用samtools(v1.9)以及picard软件对比对后的数据排序以及标记重复序列，最后使用gatk(v3.8)的haplotypecaller模块检测样本的变异信息；对得到的初始变异结果进行过滤留下高质量的信息，去掉条件满足以下之一的变异：突变总深度低于10，基因型质量值低于50以及比对质量值低于30。变异的注释使用vep(variant effect predictor)，同时注释疾病数据库，人频率数据库，危害性或保守型预测软件以及变异位点数据库等信息；体数据库包括千人基因组(1000genomics)、gnomad和实验室的本地频率数据库；危害性或保守型预测软件包括sift,polyphen2_hdiv,revel,mutationtaster以及metasvm等，变异位点数据库clinvar和hgmd以及疾病数据库omim,orphanet，medgen,ddg2p等。
156.通过对上述52例病人的的核心家系wes数据分析(图2)，发明人优先关注可能影响蛋白功能的编码区以及剪切区域，同时体数据频率小于0.05的变异。最后发明人在其中7例(7/52)胎儿病例中发现在notch3基因上的错义突变c.3556g》a(p.val亮氨酸1186met蛋氨酸)，同时额外在100例正常对照和103例淋巴水囊瘤的胎儿病例中对上述发现的notch3基因及位点做扩展筛查，sanger测序证实在另外4例(4/103)颈部淋巴水囊瘤胎儿病例中发现了相同的notch3基因突变。sanger实验与测序过程见下节。notch3基因包括33个外显子
exons，c.3556g》a突变位于exon 22，其中，野生型notch3基因的核酸序列为：atggggccgggggcccgtggccgccgccgccgccgtcgcccgatgtcgccgccaccgccaccgccacccgtgcgggcgctgcccctgctgctgctgctagcggggccgggggctgcagcccccccttgcctggacggaagcccgtgtgcaaatggaggtcgttgcacccagctgccctcccgggaggctgcctgcctgtgcccgcctggctgggtgggtgagcggtgtcagctggaggacccctgtcactcaggcccctgtgctggccgtggtgtctgccagagttcagtggtggctggcaccgcccgattctcatgccggtgcccccgtggcttccgaggccctgactgctccctgccagatccctgcctcagcagcccttgtgcccacggtgcccgctgctcagtggggcccgatggacgcttcctctgctcctgcccacctggctaccagggccgcagctgccgaagcgacgtggatgagtgccgggtgggtgagccctgccgccatggtggcacctgcctcaacacacctggctccttccgctgccagtgtccagctggctacacagggccactatgtgagaaccccgcggtgccctgtgcaccctcaccatgccgtaacgggggcacctgcaggcagagtggcgacctcacttacgactgtgcctgtcttcctgggtttgagggtcagaattgtgaagtgaacgtggacgactgtccaggacaccgatgtctcaatggggggacatgcgtggatggcgtcaacacctataactgccagtgccctcctgagtggacaggccagttctgcacggaggacgtggatgagtgtcagctgcagcccaacgcctgccacaatgggggtacctgcttcaacacgctgggtggccacagctgcgtgtgtgtcaatggctggacaggcgagagctgcagtcagaatatcgatgactgtgccacagccgtgtgcttccatggggccacctgccatgaccgcgtggcttctttctactgtgcctgccccatgggcaagactggcctcctgtgtcacctggatgacgcctgtgtcagcaacccctgccacgaggatgctatctgtgacacaaatccggtgaacggccgggccatttgcacctgtcctcccggcttcacgggtggggcatgtgaccaggatgtggacgagtgctctatcggcgccaacccctgcgagcacttgggcaggtgcgtgaacacgcagggctccttcctgtgccagtgcggtcgtggctacactggacctcgctgtgagaccgatgtcaacgagtgtctgtcggggccctgccgaaaccaggccacgtgcctcgaccgcataggccagttcacctgtatctgtatggcaggcttcacaggaacctattgcgaggtggacattgacgagtgtcagagtagcccctgtgtcaacggtggggtctgcaaggaccgagtcaatggcttcagctgcacctgcccctcgggcttcagcggctccacgtgtcagctggacgtggacgaatgcgccagcacgccctgcaggaatggcgccaaatgcgtggaccagcccgatggctacgagtgccgctgtgccgagggctttgagggcacgctgtgtgatcgcaacgtggacgactgctcccctgacccatgccaccatggtcgctgcgtggatggcatcgccagcttctcatgtgcctgtgctcctggctacacgggcacacgctgcgagagccaggtggacgaatgccgcagccagccctgccgccatggcggcaaatgcctagacctggtggacaagtacctctgccgctgcccttctgggaccacaggtgtgaactgcgaagtgaacattgacgactgtgccagcaacccctgcacctttggagtctgccgtgatggcatcaaccgctacgactgtgtctgccaacctggcttcacagggcccctttgtaacgtggagatcaatgagtgtgcttccagcccatgcggcgagggaggttcctgtgtggatggggaaaatggcttccgctgcctctgcccgcctggctccttgcccccactctgcctccccccgagccatccctgtgcccatgagccctgcagtcacggcatctgctatgatgcacctggcgggttccgctgtgtgtgtgagcctggctggagtggcccccgctgcagccagagcctggcccgagacgcctgtgagtcccagccgtgcagggccggtgggacatgcagcagcgatggaatgggtttccactgcacctgcccgcctggtgtccagggacgtcagtgtgaactcctctccccctgcaccccgaacccctgtgagcatgggggccgctgcgagtctgcccctggccagctgcctgtctgctcctgcccccagggctggcaaggcccacgatgccagcaggatgtggacgagtgtgctggccccgcaccctgtggccctcatggtatctgcaccaacctggcagggagtttcagctgcacctgccatggagggtacactggcccttcctgcgatcaggacatcaatgactgtgaccccaacccatgcctgaacggtggctcgtgccaagacggcgtgggctccttttcctgctcctgcctccctggtttcgccggcccacgatgcgcccgcgatgtggatgagtgcctgagcaacccctgcggcccgggcacctgtaccgaccacgtggcctccttcacctgcacctgcccgccaggctacggaggcttccactgcgaacaggacctgcccgactgcagccccagctcctgcttcaatggcgggacctgtgtggacggcgtgaactcgttcagctgcctgtgccgtcccggctacacaggagcccactgccaacatgaggcagacccctgcc
tctcgcggccctgcctacacgggggcgtctgcagcgccgcccaccctggcttccgctgcacctgcctcgagagcttcacgggcccgcagtgccagacgctggtggattggtgcagccgccagccttgtcaaaacgggggtcgctgcgtccagactggggcctattgcctttgtccccctggatggagcggacgcctctgtgacatccgaagcttgccctgcagggaggccgcagcccagatcggggtgcggctggagcagctgtgtcaggcgggtgggcagtgtgtggatgaagacagctcccactactgcgtgtgcccagagggccgtactggtagccactgtgagcaggaggtggacccctgcttggcccagccctgccagcatggggggacctgccgtggctatatggggggctacatgtgtgagtgtcttcctggctacaatggtgataactgtgaggacgacgtggacgagtgtgcctcccagccctgccagcacgggggttcatgcattgacctcgtggcccgctatctctgctcctgtcccccaggaacgctgggggtgctctgcgagattaatgaggatgactgcggcccaggcccaccgctggactcagggccccggtgcctacacaatggcacctgcgtggacctggtgggtggtttccgctgcacctgtcccccaggatacactggtttgcgctgcgaggcagacatcaatgagtgtcgctcaggtgcctgccacgcggcacacacccgggactgcctgcaggacccaggcggaggtttccgttgcctttgtcatgctggcttctcaggtcctcgctgtcagactgtcctgtctccctgcgagtcccagccatgccagcatggaggccagtgccgtcctagcccgggtcctgggggtgggctgaccttcacctgtcactgtgcccagccgttctggggtccgcgttgcgagcgggtggcgcgctcctgccgggagctgcagtgcccggtgggcgtcccatgccagcagacgccccgcgggccgcgctgcgcctgccccccagggttgtcgggaccctcctgccgcagcttcccggggtcgccgccgggggccagcaacgccagctgcgcggccgccccctgtctccacgggggctcctgccgccccgcgccgctcgcgcccttcttccgctgcgcttgcgcgcagggctggaccgggccgcgctgcgaggcgcccgccgcggcacccgaggtctcggaggagccgcggtgcccgcgcgccgcctgccaggccaagcgcggggaccagcgctgcgaccgcgagtgcaacagcccaggctgcggctgggacggcggcgactgctcgctgagcgtgggcgacccctggcggcaatgcgaggcgctgcagtgctggcgcctcttcaacaacagccgctgcgaccccgcctgcagctcgcccgcctgcctctacgacaacttcgactgccacgccggtggccgcgagcgcacttgcaacccggtgtacgagaagtactgcgccgaccactttgccgacggccgctgcgaccagggctgcaacacggaggagtgcggctgggatgggctggattgtgccagcgaggtgccggccctgctggcccgcggcgtgctggtgctcacagtgctgctgccgccagaggagctactgcgttccagcgccgactttctgcagcggctcagcgccatcctgcgcacctcgctgcgcttccgcctggacgcgcacggccaggccatggtcttcccttaccaccggcctagtcctggctccgaaccccgggcccgtcgggagctggcccccgaggtgatcggctcggtagtaatgctggagattgacaaccggctctgcctgcagtcgcctgagaatgatcactgcttccccgatgcccagagcgccgctgactacctgggagcgttgtcagcggtggagcgcctggacttcccgtacccactgcgggacgtgcggggggagccgctggagcctccagaacccagcgtcccgctgctgccactgctagtggcgggcgctgtcttgctgctggtcattctcgtcctgggtgtcatggtggcccggcgcaagcgcgagcacagcaccctctggttccctgagggcttctcactgcacaaggacgtggcctctggtcacaagggccggcgggaacccgtgggccaggacgcgctgggcatgaagaacatggccaagggtgagagcctgatgggggaggtggccacagactggatggacacagagtgcccagaggccaagcggctaaaggtagaggagccaggcatgggggctgaggaggctgtggattgccgtcagtggactcaacaccatctggttgctgctgacatccgcgtggcaccagccatggcactgacaccaccacagggcgacgcagatgctgatggcatggatgtcaatgtgcgtggcccagatggcttcaccccgctaatgctggcttccttctgtgggggggctctggagccaatgccaactgaagaggatgaggcagatgacacatcagctagcatcatctccgacctgatctgccagggggctcagcttggggcacggactgaccgtactggcgagactgctttgcacctggctgcccgttatgcccgtgctgatgcagccaagcggctgctggatgctggggcagacaccaatgcccaggaccactcaggccgcactcccctgcacacagctgtcacagccgatgcccagggtgtcttccagattctcatccgaaaccgctctacagacttggatgcccgcatggcagatggctcaacggcactgatcctggcggcccgcctggcagtagagggcatggtggaagagctcatcgccagccatgctgatgtcaatgctgtggatgagcttgggaaatcagccttacactgggctgcggctgtgaacaacgtggaagcca
ctttggccctgctcaaaaatggagccaataaggacatgcaggatagcaaggaggagacccccctattcctggccgcccgcgagggcagctatgaggctgccaagctgctgttggaccactttgccaaccgtgagatcaccgaccacctggacaggctgccgcgggacgtagcccaggagagactgcaccaggacatcgtgcgcttgctggatcaacccagtgggccccgcagcccccccggtccccacggcctggggcctctgctctgtcctccaggggccttcctccctggcctcaaagcggcacagtcggggtccaagaagagcaggaggccccccgggaaggcggggctggggccgcaggggccccgggggcggggcaagaagctgacgctggcctgcccgggccccctggctgacagctcggtcacgctgtcgcccgtggactcgctggactccccgcggcctttcggtgggccccctgcttcccctggtggcttcccccttgaggggccctatgcagctgccactgccactgcagtgtctctggcacagcttggtggcccaggccgggcgggtctagggcgccagccccctggaggatgtgtactcagcctgggcctgctgaaccctgtggctgtgcccctcgattgggcccggctgcccccacctgcccctccaggcccctcgttcctgctgccactggcgccgggaccccagctgctcaacccagggacccccgtctccccgcaggagcggcccccgccttacctggcagtcccaggacatggcgaggagtacccggcggctggggcacacagcagccccccaaaggcccgcttcctgcgggttcccagtgagcacccttacctgaccccatcccccgaatcccctgagcactgggccagcccctcacctccctccctctcagactggtccgaatccacgcctagcccagccactgccactggggccatggccaccaccactggggcactgcctgcccagccacttcccttgtctgttcccagctcccttgctcaggcccagacccagctggggccccagccggaagttacccccaagaggcaagtgttggcctga(seq id no.1)；野生型notch3蛋白的氨基酸序列为：mgpgargrrrrrrpmspppppppvralplllllagpgaaappcldgspcanggrctqlpsreaaclcppgwvgercqledpchsgpcagrgvcqssvvagtarfscrcprgfrgpdcslpdpclsspcahgarcsvgpdgrflcscppgyqgrscrsdvdecrvgepcrhggtclntpgsfrcqcpagytgplcenpavpcapspcrnggtcrqsgdltydcaclpgfegqncevnvddcpghrclnggtcvdgvntyncqcppewtgqfctedvdecqlqpnachnggtcfntlgghscvcvngwtgescsqniddcatavcfhgatchdrvasfycacpmgktgllchlddacvsnpchedaicdtnpvngraictcppgftggacdqdvdecsiganpcehlgrcvntqgsflcqcgrgytgprcetdvneclsgpcrnqatcldrigqftcicmagftgtycevdidecqsspcvnggvckdrvngfsctcpsgfsgstcqldvdecastpcrngakcvdqpdgyecrcaegfegtlcdrnvddcspdpchhgrcvdgiasfscacapgytgtrcesqvdecrsqpcrhggkcldlvdkylcrcpsgttgvncevniddcasnpctfgvcrdginrydcvcqpgftgplcnveinecasspcgeggscvdgengfrclcppgslpplclppshpcahepcshgicydapggfrcvcepgwsgprcsqslardacesqpcraggtcssdgmgfhctcppgvqgrqcellspctpnpcehggrcesapgqlpvcscpqgwqgprcqqdvdecagpapcgphgictnlagsfsctchggytgpscdqdindcdpnpclnggscqdgvgsfscsclpgfagprcardvdeclsnpcgpgtctdhvasftctcppgyggfhceqdlpdcspsscfnggtcvdgvnsfsclcrpgytgahcqheadpclsrpclhggvcsaahpgfrctclesftgpqcqtlvdwcsrqpcqnggrcvqtgayclcppgwsgrlcdirslpcreaaaqigvrleqlcqaggqcvdedsshycvcpegrtgshceqevdpclaqpcqhggtcrgymggymceclpgyngdnceddvdecasqpcqhggscidlvarylcscppgtlgvlceineddcgpgppldsgprclhngtcvdlvggfrctcppgytglrceadinecrsgachaahtrdclqdpgggfrclchagfsgprcqtvlspcesqpcqhggqcrpspgpgggltftchcaqpfwgprcervarscrelqcpvgvpcqqtprgprcacppglsgpscrsfpgsppgasnascaaapclhggscrpaplapffrcacaqgwtgprceapaaapevseeprcpraacqakrgdqrcdrecnspgcgwdggdcslsvgdpwrqcealqcwrlfnnsrcdpacsspaclydnfdchaggrertcnpvyekycadhfadgrcdqgcnteecgwdgldcasevpallargvlvltvllppeellrssadflqrlsailrtslrfrldahgqamvfpyhrpspgseprarrelapevigsvvmleidnrlclqspendhcfpdaqsaadylgalsaverldfpyplrdvrgepleppepsvpllpllvagavlllvilvlgvmvarrkrehstlwfpegfslhkdvasghkgrrepvgqdalgmknmakgeslmgevatdwmdtecpeakrlkveepgmgaeeavdcrqwtqhhlvaadirvapamaltppqgdadadgmdvnvrgpdgftplmlasfcggalepmpteedeaddts
asiisdlicqgaqlgartdrtgetalhlaaryaradaakrlldagadtnaqdhsgrtplhtavtadaqgvfqilirnrstdldarmadgstalilaarlavegmveeliashadvnavdelgksalhwaaavnnveatlallkngankdmqdskeetplflaaregsyeaakllldhfanreitdhldrlprdvaqerlhqdivrlldqpsgprsppgphglgpllcppgaflpglkaaqsgskksrrppgkaglgpqgprgrgkkltlacpgpladssvtlspvdsldsprpfggppaspggfplegpyaaatatavslaqlggpgraglgrqppggcvlslgllnpvavpldwarlpppappgpsfllplapgpqllnpgtpvspqerpppylavpghgeeypaagahssppkarflrvpsehpyltpspespehwaspsppslsdwsestpspatatgamatttgalpaqplplsvpsslaqaqtqlgpqpevtpkrqvla(seq id no.2)。该突变为罕见新发变异，体数据库gnomad中未见收录，生物信息预测软件显示该突变会破坏野生型蛋白质的结构/功能，因此，notch3基因的该突变可能是非综合征分隔型淋巴水囊瘤的致病位点。发明人进一步应用蛋白质表达分析方法证实上述非综合征分隔型淋巴水囊瘤胎儿病例中notch3野生型蛋白表达显著下调，进一步说明notch3基因的该突变可能是非综合征分隔型淋巴水囊瘤的致病位点。
157.实施例2sanger法测序验证
158.1.dna提取：所有样本dna的提取使用qiaamp dna blood mini kit试剂盒(方法参照说明书)。
159.2.引物设计及pcr反应
160.a)引物设计：参考人类基因组参考序列hg19/grch37，设计突变位点特异性引物，具体如表1所示。
161.表1 notch3_3556g》a的特异性引物
[0162][0163]
b)反应体系：具体如下：mgcl2(25mm)3μl、gc buffer i 15μl、dntp(2.5mm)3μl、上游引物/下游引物(10μmol/l)各2μl、promega taq dna聚合酶0.1μl、模板dna 1μl、ddh20 7μl。
[0164]
c)反应程序：具体如下：94℃3min；94℃30s、59℃30s、72℃100s，30个循环；72℃5min；10℃∞。
[0165]
3.sanger测序
[0166]
将步骤2中获得的上述52名患者家系、103名散发病人和100名正常成员的pcr扩增产物直接进行dna测序(abi 3730dna analyzer)，以便获得测序结果。然后基于测序结果，对上述样本进行notch3基因序列比对，结果如表2所示：7(来源于52名患者)+4名患者(来源于103名散发病人)的notch3基因上存在错义突变c.3556g》a，而100名正常成员的notch3基因上均不存在错义突变c.3556g》a。可见，notch3基因的错义突变c.3556g》a是分隔型淋巴水囊瘤的致病突变，可作为分隔型淋巴水囊瘤的诊断标志物。
[0167]
表2 11名患者和100名正常成员的notch3基因样本信息
[0168]
样本编号患病情况突变基因突变外显子cdna序列突变类型p1颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p2颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义
p3颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p4颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p5颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p6颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p7颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p8颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p9颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p10颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义p11颈部淋巴水囊瘤notch3exon 22c.3556g》a杂合错义100例正常对照正常notch3exon 22未突变未突变
[0169]
实施例3一种构建淋巴水囊瘤小鼠模型的方法
[0170]
一种构建淋巴水囊瘤小鼠模型的方法，通过crispr/cas9基因敲除技术直接对c57bl/6小鼠notch3基因进行错义突变c.3556g》a(p.val亮氨酸1186met蛋氨酸)，得到淋巴水囊瘤(notch3杂合突变)小鼠模型(f1代)。并观察f2代小鼠外观及颈部局部解剖，结果如图3、4所示：f2代notch3突变鼠发生明显的颈部淋巴肿大、心脏发育异常和卷尾。通过对小鼠模型的构建，探索notch3突变对淋巴管和毛细血管发育及对notch信号通路的分子作用机制，联合淋巴水囊瘤的临床胎儿样本和小鼠组织，取不同胚胎发育时期f2代notch3突变小鼠颈部组织，以野生型c57bl/6胚胎小鼠颈部组织作为对照，观察notch3在各胚胎发育时期的表达规律；同时作转录组rna测序分析，对转录组水平差异表达的基因进行go和kegg富集分析；应用rt-pcr、免疫组化、western blot等技术，观察notch信号通路中的配体jag1和d114蛋白和其他关键分子(lyve-1、prox-1、vegf-3、vegfa等)的表达水平、细胞内效应器分子(csl-dna结合蛋白)以及下游靶基因(hes、hey、herp)等变化，分析notch3突变引起的notch信号通路在胎儿淋巴水囊瘤中的作用机制。最后，利用人源脐静脉内皮细胞，构建notch3基因的干扰慢病毒载体，对脐静脉内皮细胞中not ch3基因进行沉默和过表达(实验分组：正常对照组、阴性质粒组、notch3基因干扰组、notch3基因过表达组)，应用western blot、免疫组化等技术检测各组细胞生长增殖相关蛋白(vegf等)、凋亡激活因子与抗凋亡因子(apaf-1、caspase-9、caspase-3、bcl-2及bcl-xl)、内皮源性血管生成因子(lyve-1、prox-1、vegf-3、vegfa等)，以及各组中notch信号通路关键因子jag1、d114、csl-dna结合蛋白、hes、hey、herp的表达，评价no tch3基因缺陷对淋巴管和毛细血管发育和分化的调节机制。最后在每组细胞中添加正常浓度的野生型notch3-mrna(正常情况下notch3的浓度是20pmol/l)，再观察上述指标的表达变化，摸索探讨应用正常野生型notch3-mrna修复由notch3基因缺陷引起的no tch3-notch信号通路异常活化，评价notch3基因缺陷对淋巴管和毛细血管发育和分化的调节机制。表明notch3蛋白与淋巴水囊瘤相关，notch3蛋白的突变或缺失会引起淋巴水囊瘤，通过检测notch3蛋白和/或编码notch3蛋白的核酸的表达量和/或发生上述点突变的notch3蛋白(p.v1186m)和/或notch3基因(c.3556g》a)可对淋巴水囊瘤进行诊断或预后评估，相应地，通过增加notch3蛋白和/或编码notch3蛋白的核酸的表达量、和/或将发生上述点突变的notch3蛋白(p.v1186m)和/或notch3基因(c.3556g》a)恢复为野生型可以达到预防和/或淋巴水囊瘤的效果。
[0171]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种蛋白，所述蛋白与野生型notch3蛋白相比，存在以下突变：p.v1186m。2.编码权利要求1所述的蛋白的核酸。3.(e1)～(e3)中至少一种在制备淋巴水囊瘤诊断或预后评估的产品中的应用；(e1)检测本发明第一方面的蛋白的物质；(e2)检测本发明第二方面的核酸的物质；(e3)检测野生型notch3的物质。4.一种生物模型的构建方法，包括如下步骤：使生物模型携带(b1)～(b4)中至少一种：(b1)权利要求1所述的蛋白；(b2)权利要求2所述的核酸；(b3)野生型notch3的表达量降低；(b4)野生型notch3蛋白的活性降低。5.生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型携带(b1)～(b4)中至少一种：(b1)权利要求1所述的蛋白；(b2)权利要求2所述的核酸；(b3)野生型notch3的表达量降低；(b4)野生型notch3蛋白的活性降低。6.(f1)～(f3)中至少一种在制备预防和/或淋巴水囊瘤的药物中的应用；(f1)提高野生型notch3表达量的物质；(f2)提高野生型notch3蛋白的活性的物质；(f3)特异性改变权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2所述的核酸的物质。7.一种药物，包含：(f1)～(f3)中至少一种：(f1)提高野生型notch3表达量的物质；(f2)提高野生型notch3蛋白的活性的物质；(f3)特异性改变权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2所述的核酸的物质。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述特异性改变为将权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2所述的核酸恢复为野生型；优选地，所述物质为基于包括选自单碱基基因编辑、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、crispr/cas9、crispr/cas9联合ipsc和aav载体技术的基因编辑方法的至少之一的物质。9.一种产品，包含：(g1)～(g3)中至少一种：(g1)检测权利要求1所述的蛋白的物质；(g2)检测权利要求2所述的核酸的物质；(g3)检测野生型notch3的物质。10.与权利要求2所述的核酸相关的生物材料，所述生物材料包含(c1)～(c7)中的至少一种：(c1)包含权利要求2所述的核酸的表达盒；(c2)包含权利要求2所述的核酸的载体；(c3)包含(c1)所述表达盒的载体；(c4)包含权利要求2所述的核酸的转基因细胞系；
(c5)包含(c1)所述表达盒的转基因细胞系；(c6)包含(c2)所述载体的转基因细胞系；(c7)包含(c3)所述载体的转基因细胞系。

技术总结

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NOTCH3突变体及其应用。本发明首次公开了与野生型NOTCH3蛋白相比，存在以下突变：p.Val1186Met(p.V1186M)的蛋白，以及编码该蛋白的核酸，该蛋白和/或编码该蛋白的核酸是淋巴水囊瘤的致病因子，通过检测该蛋白和/或编码该蛋白的核酸可对淋巴水囊瘤进行诊断或预后评估，通过特异性改变该蛋白和/或编码该蛋白的物质可以达到预防和/或淋巴水囊瘤的效果。效果。