一种细菌连续进化系统、正交易错DNA聚合酶及连续进化方法

一种细菌连续进化系统、正交易错dna聚合酶及连续进化方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细菌连续进化系统、正交易错dna聚合酶及连续进化方法。

背景技术：

2.定向进化技术通过文库构建与高通量筛选过程实现新的基因表达元件或高效酶的开发，其目前广泛应用于酶工程、代谢工程等领域。但是传统的定向进化方法需要首先构建体外文库，这个过程不仅通量较小，而且往往消耗大量的时间与成本。因此，目前已经开发了多种连续进化方法以克服这一困难。连续进化的关键在于可以实现体内目的dna序列的随机突变，这种方式不仅操作简便而且可极大提升文库的通量。但是目前在细菌中尚未开发出满足以下四种条件的连续进化方法，即包含所有突变类型、可实现长dna片段突变、连续性好和操作简便。先前在酵母中开发的正交dna复制系统可以满足4个关键特征，但是，在细菌中开发此类系统仍然是一个巨大的挑战。因此，为了酶工程、代谢工程等领域的发展打下基础，本发明实现了在细菌，即苏云金芽孢杆菌中实现基于正交线性基因表达载体的连续进化方法。

技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于细菌的正交线性基因表达载体的连续进化方法，是将正交dna复制系统与正交易错dna聚合酶结合后获得的能够满足4个关键特征的连续进化方法，即包含所有突变类型、可实现长dna片段突变、连续性好和操作简便，并将其应用于靶dna序列的进化。
4.本发明的第一个目的是提供一种细菌连续进化系统，所述细菌连续进化系统包括线性质粒和dna聚合酶突变体；其中，
5.所述线性质粒上包括dna复制与控制基因簇、启动子和目的基因，所述dna复制与控制基因簇的核苷酸序列如seq id no.6所示；
6.所述dna聚合酶突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的dna聚合酶突变得到；所述的突变为
7.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸(d18a/d70a)；或
8.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第442位的酪氨酸突变为天冬酰胺(d18a/d70a/y442n)；或
9.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第521位的亮氨酸突变为丝氨酸(d18a/d70a/l521s)；或
10.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第191位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(d18a/d70a/v191f)；或
11.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将
第199位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(d18a/d70a/v199f)；或
12.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第403位的亮氨酸突变为赖氨酸，将第404位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，同时将第405位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸(d18a/d70a/l403k/m404i/q405m)。
13.具体地，seq id no.1所示的dna聚合酶的序列如下：
14.msttnrkkrreiklftldtetrgldgdvfriglfdgkqyytgytfadvlpvfekykaydchvyihnldfdlskiiaelrdyaeptfnnslfingnivtftashiilhdsfrllpsslenlcrdfdlleggkmdivdymeennygiynvknrklnkrltkgnffttvdkddpvlceymeydcrslykileiviglskleveqfincpttaslaktvykeqykkdykvaistkqynhkqlgkgleafirkgyyggrtevftpriengyhydknslypyvmkmaempvgypnvldneeaelsfdlwkrrrygagfihakvhvpedmyipilpkkdytgklifpvgkiegvwtfpelalaeaegckiekiesgvvfektapvfrefisyfeeikntskgakrafsklmqnalygkfamqrerimyadiserdkleaeghtvseiiydmngirmefleydgyamaeyiqphisayitsiarillfkglkyahekgilaycdtdscatttkfpdkmvhdkeygkwklegyvieglyfqpkmyaekaintdgeyeevlrmkgvpkwvveeqldynsfrkwylqvkrgkaeipiykggervqkfltksknniemnelaemhktinfareqkrnidlnknitsplvrndygenkdekseyefdewyerleefnddmnaveelcmkfgkiqipekkqrklyglykeysskakamcfsneglpiqdwckktgwdmkellgelsfl。
15.进一步地，所述线性质粒上还包括由终止密码子提前终止的抗性基因，为线性质粒载体突变率的测定提供了一种方法。在本发明的一个实施例中，选用的是由终止密码子“taa”提前终止的编码红霉素抗性蛋白的表达框，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
16.进一步地，在本发明的一个实施例中，线性质粒上包括dna复制与控制基因簇和由终止密码子“taa”提前终止的编码红霉素抗性蛋白的表达框，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
17.进一步地，所述线性质粒上还包括位于两端的复制原点。各元件从5
′
端到3
′
端依次为左复制原点、dna复制与控制基因簇、启动子、目的基因和右复制原点，其中，左复制原点的核苷酸序列如seq id no.7所示，右复制原点的核苷酸序列如seq id no.8所示。
18.具体地，左复制原点的核苷酸序列如下：
19.attatgtacctctactagcctattaaaatatttacctattgacacgtaataacatttatgaaatatgatatac；
20.右复制原点的核苷酸序列如下：
21.tatatcgtgaaacatagatgtttatttgtgtcaatgggtaatattggtaaaagtgctagtagggatacataata。
22.进一步地，所述线性质粒以pbmb-esc为载体。
23.进一步地，所述线性质粒载体衍生于双链线性dna溶源噬菌体gil16的基因组。
24.进一步地，所述线性质粒载体改造采用同源重组法。
25.进一步地，所述线性质粒载体由gil16正交dna聚合酶(野生型聚合酶的氨基酸序列如seq id no.1所示)复制，其复制与基因组相互正交。所述的正交是指，复制线性质粒的dna聚合酶不能复制基因组，而宿主的dna聚合酶不能引发复制线性质粒。
26.进一步地，所述线性质粒上的启动子为适用于宿主细胞的任意启动子，如诱导型启动子。本发明的一个实施例中使用的是木糖诱导启动子，如p
xyla
。
27.进一步地，木糖诱导启动子p
xyla
的核苷酸序列如seq id no.9所示。
28.进一步地，所述dna聚合酶突变体由诱导型启动子控制表达，本发明的一个实施例中使用的是木糖诱导启动子，如p
xyla
。
29.进一步地，本发明的一个实施例中所述dna聚合酶突变体以pbmb为载体。
30.本发明的第二个目的是提供一种含有上述细菌连续进化系统的细胞。
31.进一步地，所述细菌为苏云金芽孢杆菌，包括但不限于苏云金芽孢杆菌hd-1(genbank号:cp001903)、苏云金芽孢杆菌jw-1(genbank号:cp045030)等。
32.本发明的第三个目的是提供一种正交易错的dna聚合酶突变体，所述dna聚合酶突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的dna聚合酶突变得到；所述的突变为
33.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸(d18a/d70a，m6)；或
34.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第442位的酪氨酸突变为天冬酰胺(d18a/d70a/y442n，m17)；或
35.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第521位的亮氨酸突变为丝氨酸(d18a/d70a/l521s，m18)；或
36.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第191位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(d18a/d70a/v191f，m19)；或
37.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第199位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(d18a/d70a/v199f，m20)；或
38.将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第403位的亮氨酸突变为赖氨酸，将第404位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，同时将第405位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸(d18a/d70a/l403k/m404i/q405m，m21)。
39.优选地，所述易错dna聚合酶包含d18a、d70a和y442n三个突变(氨基酸序列为seq id no.4)，其突变率为6.82x 10-7
每代每细胞每碱基，是基因组突变频率的6700倍。
40.进一步地，所述易错dna聚合酶由alphafold2结构预测与理性设计突变获得。
41.本发明的第四个目的是提供一种编码上述正交易错的dna聚合酶突变体的基因。
42.本发明的第五个目的是提供一种携带上述编码上述正交易错的dna聚合酶突变体的基因的表达载体。
43.本发明的第六个目的是提供一种表达上述正交易错的dna聚合酶突变体的细胞。所述细胞可为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等。
44.本发明的第七个目的是提供上述细菌连续进化系统、含有上述细菌连续进化系统的细胞、dna聚合酶突变体、编码dna聚合酶突变体的基因、携带编码dna聚合酶突变体的基因的表达载体、表达dna聚合酶突变体的细胞在食品、生物领域中的应用，尤其是在细菌连续进化、易错复制中的应用。
45.进一步地，所述应用是在细胞培养中，添加诱导剂实现靶dna序列的易错复制与随机突变。所述靶dna序列包括但不限于：启动子、核糖体结合位点与甲醇利用基因簇。
46.本发明的第八个目的是提供一种基于细菌正交易错dna聚合酶的连续进化方法，包括将上述线性质粒和上述dna聚合酶突变体导入细胞(细菌)中的步骤。dna聚合酶在细胞内通过正交易错复制线性质粒以实现目的蛋白(由目的基因编码)随机突变文库构建与高通量筛选的定向进化应用。
47.进一步地，所述dna聚合酶突变体由诱导型启动子调控表达，而后通过在培养条件中添加诱导剂诱导表达。本发明的进化方法中，通过诱导dna聚合酶突变体表达的开启与关闭，可实现线性质粒易错突变过程与高保真复制过程的切换，从而实现对连续进化过程的控制。
48.进一步地，诱导剂的浓度为0.01-100g/l。
49.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
50.本发明通过构建基于细菌正交线性基因表达载体的连续进化方法，实现了靶dna序列的高效连续进化，其优势包括：包含所有突变类型、可实现长dna片段突变(理论突变框长度大于噬菌体基因组长度，即15000bp)、连续性好和操作简便。其中，正交易错的dna聚合酶由alphafold2预测结构后通过理性设计并进行了突变率测试得到，最优突变体的突变率达到6.82x10-7
每代每细胞每碱基，是基因组突变频率的6700倍，且不引起基因组突变率的显著提升。
51.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
52.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
53.图1基于正交线性基因表达载体的连续进化方法概念图。
具体实施方式
54.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
55.下述实施例中所涉及的材料与方法如下：
56.苏云金芽孢杆菌：bacillus thuringiensis hd-1(genbank号:cp001903)。
57.绿荧光蛋白(gfp)的genbank登录号为af324408.1。
58.培养基为lb培养基：培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。
59.sg缓冲液：每l含蔗糖93.1g、甘油150ml。
60.0.1m pbs：每100ml含k2hpo
4 1.4g、kh2po
4 0.52g。
61.1m mgcl2：每100ml含mgcl2·
6h2o 20.33g。
62.ep缓冲液：每l含sg缓冲液1l、0.1m pbs 5ml、1.0m mgcl
2 500μl。
63.绿荧光蛋白表达量的测定方法：在96孔板中每孔加入200μl稀释后的发酵液，使用cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。
64.实施例1苏云金芽孢杆菌的电转化
65.感受态制备：首先挑取单菌落于5ml lb培养基中，30℃活化培养过夜。然后按1/100的接种量转接至新鲜的lb培养基中，30℃、220r/min培养至od600约等于1.0-1.3(约2h)后冰浴冷却10-30min，整个感受态制作及转化过程均应在低温条件进行。冷却结束后，将菌液以5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，弃上清。然后相同条件用预冷的ep缓冲液清洗菌
体2次，使用预冷的sg缓冲液清洗菌体1次，最后将菌体重悬于sg缓冲液中(约加入1.5ml)，使感受态od600约为50-70；将感受态50μl/管分装于离心管中，-80℃存放备用，或500μl/管分装于离心管中，现用现分装。
66.电转化过程：取1管感受态细胞放置冰上，加入3-5μl质粒dna(质粒浓度100ng/μl以上，必须使用大肠杆菌jm110作为克隆宿主，否则质粒会被限制性切割导致转化失败)，稍微震荡混匀，冰浴10-30min后加入到1mm预冷的电转杯中，1.25kv电击后迅速加入500μl 37℃预热的lb培养基；37℃，220r/min恢复培养2h后涂布抗性平板，37℃培养箱内培养过夜。
67.实施例2dna聚合酶突变率测定宿主构建
68.首先构建了辅助质粒pbmb-esc(序列为seq id no.5)以实现苏云金芽孢杆菌hd-1高效重组。具体来说，在此质粒上通过使用木糖诱导表达exo(双链dna5'-3'外切酶)、ecossb(大肠杆菌来源单链dna结合蛋白)和csprect(dna退火蛋白)以实现dna片段在胞内形成单链dna且高效退火。
69.线性质粒整合框的构建采用融合pcr的方式。首先设计同源臂长度为500-1000bp的重组框，以包含由终止密码子“taa”提前终止的编码红霉素抗性蛋白(核苷酸序列如seq id no.2)的表达框的线性质粒(核苷酸序列如seq id no.3)为例。具体操作为：使用引物hd-te-1f：acggacagttgtgcaacaactacg、hd-te-1r：gaaattgttatccgctccgtcacacgtgtgtcattttggac扩增左臂，使用引物hd-te-2f：cacgtgtgacggagcggataacaatttcacacaggaaacagc、hd-te-2r：gaacacgaactaacgccagggttttcccagtcacg扩增壮观霉素抗性蛋白表达框，使用引物hd-te-3f：ggaaaaccctggcgttagttcgtgttcgtgctgacttgc、hd-te-3r：gccagtttcgtcgtttaatgccctttacctgttccaatttcg扩增红霉素抗生素抗性蛋白表达框，使用引物hd-te-4f：ggtaaagggcattaaacgacgaaactggctaaaataagtaaac、hd-te-4r：gtagttatgcccagcgtgagtctagggacctctttagctccttgg扩增红霉素抗生素抗性蛋白表达框并引入taa终止密码子，使用引物hd-te-5f：cctagactcacgctgggcataactactttgtg、hd-te-5r：caattacggcttgtgcttcctctcg扩增右臂。
70.获得的dna片段纯化后相应的线性质粒/基因组整合操作为：首先制备含pbmb-esc质粒的菌株的感受态，当菌液od600约为0.5时加入终浓度3％的木糖，继续培养至od600约等于1.0-1.3。其余操作与电转化质粒相同。电转化时，dna片段需较为单一，加入5μl浓度200ng/μl以上的dna片段，后培养3h。其余操作与电转化质粒相同，最终dna整合框实现原噬菌体gil16基因组的重组编辑，构建获得包含由终止密码子“taa”提前终止的编码红霉素抗性蛋白的表达框的线性质粒。相同条件下，含有完整红霉素抗性基因的菌株可以在添加红霉素条件下生长，而含有由taa终止密码子提前终止的红霉素抗性基因的菌株再添加氯霉素条件下不生长。为了诱导表达dnap聚合酶，使用引物pdnap-1f：tgttaaaggaggaaggatccatgagtactactaatagaaaaaagcgtagagag、pdnap-1r：gcatccttcaatccttataagaaacttaattcgcctaatagttctttcatgtcc扩增gil16 dna聚合酶，使用引物pdnap-2f：gtttcttataaggattgaaggatgcttaggaagacgag、hd-te-2r：catggatccttcctcctttaacatttccccctttgatttttagatatcactagtttgg扩增带有木糖诱导性启动子的pbmb质粒载体，然后使用gibson组装，构建质粒质粒pbmb-odnap(seq id no.10)。
71.实施例3不同正交dna聚合酶突变体突变率测定
72.通过理性设计，初步获得24种dna聚合酶突变体(表1，gil16正交dna聚合酶氨基酸
序列如seq id no.1所示)。
73.表1不同dna聚合酶突变体突变率测定
[0074][0075][0076]
然后，将实施例2构建的重组苏云金芽孢杆菌，使用pbmb-odnap质粒分别额外诱导表达24种突变体，使用5％木糖添加量诱导，经过1/1000接种后，培养至饱和生物量，然后稀释涂布平板，计数抗性菌落所占总细胞比例。对于每种突变体，设置17个平行，将最终获得的结果使用falcor工具(https://lianglab.brocku.ca/falcor/)进行波动分析，计算最终突变率μ(s.p.b.)。突变率由公式μ(s.p.b.)＝f/(r
×
c)计算获得，其中f为falcor计算获得的结果，r是使红霉素抗性基因恢复的独特突变种类，c是质粒拷贝数。经过测序可知，当taa突变为aaa/caa/tta/tat/tac可使菌株获得红霉素抗性，因此r＝5/3。最终，24种突变体中m17(氨基酸序列如seq id no.4所示)具有最大的突变率，达6.82x10-7
每代每细胞每碱基。
[0077]
其中，野生型正交dna聚合酶突变率测定，包括以下步骤：使用5％木糖添加量在胞内额外诱导表达野生型dna聚合酶，经过1/1000接种后，培养至饱和生物量，然后稀释涂布平板，计数抗性菌落所占总细胞比例。经测定，野生型正交dna聚合酶突变频率为2.52x10-9
每代每细胞每碱基。
[0078]
实施例4添加不同浓度木糖后控制靶dna突变率与突变频率
[0079]
将实施例3构建的含m17突变体的重组苏云金芽孢杆菌在37℃、750rpm、700μl lb
培养基、96孔深孔板中培养10h，获得种子液，再将种子液以0.1％的接种量转入200μl含不同浓度木糖的lb培养基中，使不同孔中的木糖终浓度为0.00g/l～50g/l，每个浓度设置17个平行对照，于37℃、750rpm条件下培养24h。相同条件下，不添加木糖的对照组突变率为2.59x10-8
；而添加0.01，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，30，50g/l木糖之后，测得突变率与突变频率数据平均值分别见表2。
[0080]
表2添加不同浓度木糖后靶dna突变率与突变频率
[0081][0082]
对比例1菌株基因组突变率测定
[0083]
基因组突变率的测定方法与正交dna聚合酶突变率测定方法相同，但不需添加木糖，且所选择的突变基因为基因组rpob蛋白。当基因组rpob蛋白发生以下突变时会使菌株获得利福平抗性：v135f(gtt-ttt),q137r(cag-cgg),q468r(cag-cgg),q468k(cag-aag),q468l(cag-ctg),h481d(cac-gac),h481p(cac-ccc),h481y(cac-tac),h481r(cac-cgc),s486y(tct-tat),s486f(tct-ttt),and l488s(tta-tca)，因此，因此r＝12/3。将菌株种子液经过1/1000接种后，培养至饱和生物量，然后稀释涂布平板，计数抗性菌落所占总细胞比例。最终测得基因组突变频率为1.02x10-10
每代每细胞每碱基。因此计算可得，正交易错dna聚合酶突变率是基因组突变频率的6700倍。
[0084]
此外，采用相同方法测定了实施例3构建的含m17突变体的重组苏云金芽孢杆菌基因组突变率，结果为1.45x10-10
，显著性分析发现其不引起基因组突变率的显著提升。
[0085]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：

1.一种细菌连续进化系统，其特征在于：所述细菌连续进化系统包括线性质粒和dna聚合酶突变体；其中，所述线性质粒上包括dna复制与控制基因簇、启动子和目的基因，所述dna复制与控制基因簇的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述dna聚合酶突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的dna聚合酶突变得到；所述的突变为将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第442位的酪氨酸突变为天冬酰胺；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第521位的亮氨酸突变为丝氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第191位的缬氨酸突变为苯丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第199位的缬氨酸突变为苯丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第403位的亮氨酸突变为赖氨酸，将第404位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，同时将第405位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸。2.根据权利要求1所述的细菌连续进化系统，其特征在于：所述线性质粒上还包括由终止密码子提前终止的抗性基因。3.根据权利要求1所述的细菌连续进化系统，其特征在于：所述dna聚合酶突变体由诱导型启动子控制表达。4.含有权利要求1-3任一项所述的细菌连续进化系统的细胞。5.一种正交易错的dna聚合酶突变体，其特征在于：所述dna聚合酶突变体由氨基酸序列如seq id no.1所示的dna聚合酶突变得到；所述的突变为将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第442位的酪氨酸突变为天冬酰胺；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第521位的亮氨酸突变为丝氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第191位的缬氨酸突变为苯丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第199位的缬氨酸突变为苯丙氨酸；或将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸，将第403位的亮氨酸突变为赖氨酸，将第404位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，同时将第405位的谷氨酰胺突变为甲硫氨酸。6.编码权利要求5所述的正交易错的dna聚合酶突变体的基因。7.携带权利要求6所述的基因的表达载体。
8.表达权利要求5所述的正交易错的dna聚合酶突变体的细胞。9.权利要求1-3任一项所述的细菌连续进化系统、权利要求4所述的细胞、权利要求5所述的正交易错的dna聚合酶突变体、权利要求6所述的基因、权利要求7所述的表达载体或权利要求8所述的细胞在食品或生物领域中的应用。10.一种基于细菌正交易错dna聚合酶的连续进化方法，其特征在于，包括将权利要求1-3任一项所述的线性质粒和dna聚合酶突变体导入细胞中的步骤。

技术总结

本发明涉及一种细菌连续进化系统、正交易错DNA聚合酶及连续进化方法。本发明将正交DNA复制系统与正交易错DNA聚合酶结合后，获得了一种能够包含所有突变类型、可实现长DNA片段突变、连续性好和操作简便的连续进化方法。通过诱导DNA聚合酶表达的开启与关闭，实现线性质粒易错突变过程与高保真复制过程的切换，从而实现靶DNA序列的高效连续进化。而实现靶DNA序列的高效连续进化。而实现靶DNA序列的高效连续进化。