一种碱基编辑工具的制作方法

一种碱基编辑工具
1.本发明是申请日为2021年8月10日、申请号为2021109115458、发明名称为一种碱基编辑工具及其构建方法的分案申请。
技术领域
2.本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种碱基编辑工具。

背景技术：

3.基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。人工核酸酶主要包含锌指核酸酶(zinc finger nuclease，zfn)、talen核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)以及crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein 9)。利用这些技术，人们可以根据自身研究的需求对感兴趣的基因进行敲除或过表达等操作，进而研究基因的功能和调控机制。
4.crispr/cas9系统是存在于细菌和古细菌中的一种免疫防御机制，用来抵抗噬菌体以及外源dna的入侵，基于crispr系统开发而来的基因编辑系统已经被广泛运用于动物、植物和人细胞的基因编辑。crispr/cas9基因编辑系统的核心是一个rna蛋白复合物，由能与基因组中靶dna序列互补结合的sgrna和cas9核酸酶两部分组成。当该复合物与靶位点结合之后，会激活cas9的核酸酶活性，从而切割靶dna，产生双链断裂(dsb)的dna损伤。dsb进一步激活细胞内的dna损伤修复机制，主要包括易错的非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)以及高保真的同源重组修复(homologous recombination，hdr)。
5.非同源末端连接的修复方式会在靶位点处产生dna片段的插入或缺失(indels)，导致移码突变，从而造成靶基因的功能丧失，成为无效等位基因(null allele)。当通过同源重组的方式进行修复时，需要内源的同源序列或者外源导入的同源序列作为修复模板，在靶位点处敲入外源片段或引入点突变。但是，在细胞中，同源重组的效率远远低于非同源末端连接，导致靶位点处修复结果不可控，并倾向于产生核苷酸的插入和缺失。
6.为了提高定点突变的效率，将crispr/cas9和其他酶产物进行结合的单碱基编辑系统被相继报道。例如：哈佛大学生物化学家david liu组开发了base editor系统。base editor单碱基编辑系统主要由sgrna和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而中科院上海营养与健康研究院常兴课题组开发的融合蛋白仅包含cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgrna通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的胞嘧啶c经脱氨基作用转变为尿嘧啶u，而dna复制进一步使得u被t代替，而互补链上原来与c的互补碱基鸟嘌呤g将会变成腺嘌呤a，而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制u的切除，最终实现非互补链上的c替换为t和互补链上g替换为a的精确编辑。根据融合蛋白中cas9蛋白突变体的不同，可以将该系统分为两类，一类选用了无核酸内切酶活性的dcas9，进行编辑时不会造成切割靶dna；另一类选用了有单链dna切口酶活性的cas9n，进行
编辑时会在靶基因位点的一条dna单链产生切口，再以互补链为模板进行合成修复。由于cas9n和dcas9仍保持与sgrna结合的能力，但均不会引起双链dna的断裂，从而抑制了由nhej介导的dna片段的插入或缺失。单碱基编辑系统只能将在胞嘧啶核苷脱氨酶活性位点附近的c脱氨基，这个区域称为活性窗口。通常胞嘧啶脱氨酶的活性窗口有5个核苷酸，为距离pam最远端数起的第4～8位核苷酸，这样就会使活性窗口中非靶向的碱基也会发生替换作用。后来的研究者试图通过三种方式来缩短活性窗口，提高基因编辑的精准性，但是效果仍然不十分理想。
7.接着，david liu开发的一种新的基因编辑方法——引导编辑(prime editor，pe)，这种方法可以在不引入双链断裂(dsb)和供体dna模板的前提下，实现靶标位点的插入、缺失和所有12种类型点突变(目前abe和cbe系统仅能实现c
→
t，g
→
a，a
→
g，t
→
c四种突变类型)，扩展了碱基编辑的范围，提高了精准编辑的效率。引导编辑(prime editing)是一种基于“搜索和替换“(search-and-replace)的基因组编辑方式。引导编辑的搜索功能是基于改造的向导rna(the engineered guide rna，the pegrna)，pegrna中包含我们熟知的single guide rnas(sgrnas)，不同的是，在其3’端还有一段引物结合序列(primer binding site，pbs)和转录模板序列(rt template)。prime editor蛋白由cas9切口酶(cas9 nickase，仅有切割单链的功能，h840a)和逆转录酶(m-mlv rt)融合而成。这样，cas9切口酶在pegrna上的sgrna序列指引下，切割dna单链，pegrna 3’端的pbs(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶(m-mlv rt)以pegrna上pbs序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的dna链上。在pam识别链上进行单链切割后，会在这条单链dna上形成3’末端(3’flaps)和5’末端(5’flaps)两段序列，而5’末端会被具有5’核酸内切酶和5’核酸外切酶活性fen1和具有5’核酸外切酶活性的exo1蛋白切割。而3’末端通过反转录酶合成的编辑序列，就可以更大概率的保留在修复后的序列中。通过这套系统，可以在无需引入双链断裂和外源dna模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换或颠换、插入和缺失等变异。并在pe的基础上，进一步优化和提高了逆转录酶的效率，推出了比pe编辑效率更高的pe2版本。由于pe2编辑后的dna双链为杂合链，即一条为编辑链，一条为非编辑链。而杂合双链错配修复的模板是随机的，为了解决因错配修复造成的编辑效率降低，他们团队进一步开发出了pe3版本编辑系统，这一版本在非编辑链上距离pegrna造成的切口处50bp的位置引入了一个新的切口(避免产生双链断裂)，从而让细胞尽量多的以编辑链为模板进行dna修复，以达到精准编辑的目的。
8.然而，不同的pe碱基编辑系统对同一位点进行编辑时，编辑效率不尽相同。pegrna中pbs序列长度，反转录模板长度以及切口sgrna的位置都会或多或少影响最终的基因编辑效率，但如何影响的并没有明显的规律，进行插入和缺失编辑时，随着插入或缺失片段的增长，其编辑效率是逐渐降低的。因此提高精准编辑的效率十分必要。

技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种能够实现进一步提高碱基编辑的准确性、增强碱基编辑精准度的新的碱基编辑工具，为基因编辑提供更多的选择。
10.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
11.本发明第一方面提供一种碱基编辑工具，所述的碱基编辑工具包括suntag系统和
pe2系统。
12.具体地，将所述的suntag系统和所述的pe2系统相结合形成suntag-pe2系统。
13.具体地，所述的suntag系统包括gcn4多肽，所述的gcn4多肽能够被单链可变片段抗体识别。
14.suntag是一个信号扩增系统。是多拷贝的、含有一个单链抗体(scfv)识别的19个氨基酸gcn4多肽。小可溶性标签gb1是g链球菌g蛋白的结合域，融合到scfv的c端以蛋白聚集。suntag系统是一个合成的支架，最多能招募蛋白质的24个拷贝。最初，是用于与gfp蛋白结合以放大荧光标记效应，用于实现活细胞内单分子的追踪，而不会影响蛋白质的功能。suntag系统已成功应用于荧光成像和特定dna位点的靶向去甲基化，并且有报道利用suntag系统和be系统结合，和be3相比，进一步拓宽编辑窗口和提高编辑精准度，原始的be3的编辑窗口在pam上游的4-8bp，suntag系统和be系统结合的be-plus系统扩展pam上游的9-16bp的编辑窗口。但是目前的be3系统为c》g、a》t两种突变方向，而pe2系统将基因组编辑提升到了一个新的水平，这种方法允许引入所有突变类型，包括插入、缺失和12种碱基-碱基转换，并且通过设计pegrna的序列，可以实现pam上游3-29bp的编辑窗口。目前pe2系统的关键在于提高编辑效率，主要通过优化不同的rts和pegrna设计来实现，却未见将suntag系统和pe2系统相结合的报道，主要是因为suntag系统和pe2系统的结合并非简单的将be系统替换为pe2系统，suntag系统和pe2系统结合的难点包括两种系统结合时的空间位阻的影响，两者的结合方式对结合后的系统的编辑效率密切相关，如果结合方式没有选择好，甚至会出现编辑效率比原始pe2系统差的结果。
15.具体地，所述的pe2系统包括pegrna、仅有单链dna切口酶活性的cas9切口酶、以及逆转录酶，所述的pegrna的序列包括sgrna序列、引物结合序列、以及转录模板序列。
16.pe系统可以在无需引入双链断裂和外源dna模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换或颠换、插入和缺失等变异。
17.本发明利用suntag系统和pe2系统结果，采用suntag系统和编辑效率更高的pe2版本，构建suntag-pe2系统，经优化后，可以进一步提高碱基编辑的准确性、增强碱基编辑精准度。
18.优选地，将多个所述的gcn4多肽与所述的cas9切口酶的c端和/或n端相连。
19.进一步优选地，所述的gcn4多肽的数量为1～20。
20.根据一种具体实施方式，gcn4多肽的氨基酸序列为eellsknyhlenevarlkk(seq idno.14)。
21.再进一步优选地，所述的cas9切口酶的c端和n端分别连接1～5个所述的gcn4多肽。
22.优选地，用于连接所述cas9切口酶和所述gcn4多肽的接头序列为flexible linker。
23.根据一种具体实施方式，用于连接所述cas9切口酶和所述gcn4多肽的flexible linker的氨基酸序列为sggssggssgsetpgtsesattpessggssggss(seq id no.15)。
24.优选地，将所述的逆转录酶和所述的单链可变片段连接形成融合蛋白，将所述的融合蛋白与所述的pegrna相连。
25.再进一步优选地，用于连接所述的逆转录酶和所述的单链可变片段的接头序列为
flexible linker或gs linker。
26.根据一种具体实施方式，所述的flexible linker的氨基酸序列为
27.sggssggssgsetpgtsesattpessggssggss(seq id no.15)。
28.具体地，所述的gs linker的氨基酸序列为(gggs)ng，n为大于等于1的整数。
29.进一步地，n为2～10之间的整数。
30.根据一种具体实施方式，所述的gs linker的氨基酸序列为gggsgggsgggsgggsg(seq idno.16)。
31.本发明第二方面提供一种所述的碱基编辑工具的构建方法，包括：
32.将逆转录酶、单链可变片段、以及pegrna相连并插到pu6上，构建
33.pu6-pegrna-scfv-linker-rt质粒；
34.将n个gcn4多肽与cas9蛋白酶的c端和/或n端相连，然后插入到pcmv上，构建pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒，
35.其中，1≤n≤20。
36.根据一种具体地实施方式，所述的碱基编辑工具或所述的构建方法构建的碱基编辑工具，能够将如seq id no.1所示的目标序列编辑为如seq id no.2所示序列，采用的pegrna序列如seq id no.3所示。
37.优选地，所述的cas9切口酶的c端和n端分别连接1个所述的gcn4多肽。
38.优选地，用于连接所述的逆转录酶和所述的单链可变片段的接头序列为gs linker。
39.优选地，所述的cas9切口酶为h840a。
40.本发明第三方面还提供一种所述的碱基编辑工具在生命科学研究、农业生产和生物医药中的应用。
41.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
42.本发明首次利用suntag系统和pe系统结果，采用suntag系统和编辑效率更高的pe2版本，构建suntag-pe2系统，经优化后，在293t细胞上和原始的pe2系统进行比较，能够进一步提高pe2系统编辑的准确性，增强编辑精准度，为基因编辑提供更多的选择，该技术将推动我国及全世界在生命科学研究、农业生产和生物医药等领域的快速发展，具有重要的应用价值。
附图说明
43.图1为pe系统的示意图。引导编辑的搜索功能是基于改造的向导rna(the engineered guide rna，the pegrna)，pegrna中包含我们熟知的single guide rnas(sgrnas)，不同的是，在其3’端还有一段引物结合序列(primer binding site，pbs)和转录模板序列(rt template)。prime editor蛋白由cas9切口酶(cas9 nickase，仅有切割单链的功能，h840a)和逆转录酶(m-mlv rt)融合而成；
44.图2为pe系统编辑目标dna的流程示意图。cas9切口酶在pegrna上的sgrna序列指引下，切割dna单链，pegrna 3’端的pbs(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶(m-mlv rt)以pegrna上pbs序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的dna链上；
45.图3为suntag-pe2系统的示意图。将suntag系统和pe2系统结合，n个gcn4与ncas9的c端连接，构成pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒，其中n代表不同的gcn4的数量；逆转录酶(m-mlv rt)通过flexible linker与scfv连接形成融合蛋白，pegrna序列连在含有rt的质粒上，构成pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒，其中+1代表目标突变的位置位于hek3的sgrna引导的靶序列被cas9切割的断点后第一个碱基位置，cttins代表目标突变为ctt这3个碱基插入。当这两个质粒共转染时，dcas9-gcn4被sgrna引导到结合位点，scfv-rt是围绕结合位点招募来诱导ctt这3个碱基插入的；
46.图4为suntag-pe2系统的示意图以及和原始的pe2系统的效果比较图。在ncas9的c端连接不同数量的gcn4，从而分别构建质粒：pcmv-pe2-1
×
gcn4，pcmv-pe2-2
×
gcn4，pcmv-pe2-3
×
gcn4，pcmv-pe2-5
×
gcn4，pcmv-pe2-10
×
gcn4，与
47.pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染，和原始的pe2系统比较目标突变的效果；
48.图5为suntag-pe2系统的优化方式1的编辑效果。在ncas9的n端同时连接不同数量的gcn4，并且分别和c端同时连接不同数量的gcn4进行组合，从而分别构建质粒：
[0049]1×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，1
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0050]1×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，1
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0051]2×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，2
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0052]2×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，2
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0053]3×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，3
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0054]3×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，3
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0055]5×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，5
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0056]5×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，5
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0057]
与pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染，和原始的pe2系统比较目标突变的效果；
[0058]
图6为suntag-pe2系统的优化方式2示意图以及编辑效果。将flexible linker替换成gs linker，构建质粒pegrna-scfv-gs-linker-rt-hek3(+1-cttins)。
具体实施方式
[0059]
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0060]
实施例中使用的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；pcr试剂采用北京全式金生物科技有限公司的pcr supermix(货号：as111-02)。
[0061]
为了详细说明本发明的suntag-pe2系统，以下实施例针对文献中编辑效果较为稳定的pu6-hek3_pegrna_cttins，本领域技术人员可根据以下实施例设计针对其他基因的目标位点的碱基编辑的suntag-pe2系统。
[0062]
以下实施例将目标序列：
[0063]
catttgtaggcttgatgctttttttctgcttctccagccctggcctgggtcaatccttggggcccagactgagcacgtga tggcagaggaaaggaagccctgcttcctcc(seq id no.1)
[0064]
精准编辑为：
dna transfection reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的空载体(1μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％co2培养箱中培养。
[0085]
(3)基因组dna的提取
[0086]
转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用dmem完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟,弃除培养基，pbs洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除pbs，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：ee101-01)提取细胞基因组dna，测量dna浓度。
[0087]
(4)扩增子建库引物的设计
[0088]
分别根据hek3的sgrna靶向的基因序列(seq id no.11)设计引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选150～200bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别不大)，以扩增出目的片段。本实施例中与hek3的sgrna相对应的引物序列为：
[0089]
hek3-ngs-f：acactctttccctacacgacgctcttccgatctctggcctgggtcaatccttg。
[0090]
hek3-ngs-r：gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgctgcacatactagcccctg。
[0091]
(5)扩增子建库的pcr反应：
[0092]
以上述提取的基因组dna为模版，用上述引物进行pcr反应。本实验使用的高保真kapa聚合酶为kapa hifi hotstart readymix(货号：kk2602)。
[0093]
第一轮pcr:
[0094][0095][0096]
pcr反应体系：
[0097]
98℃ for 3min；25cycles of(98℃ for 20s,65℃ for 15s,72℃ for 15s),72℃ for 1min,4℃ for∞。
[0098]
第二轮pcr:
[0099]
名称体积kapahifihotstartreadymix12.5μl第一轮的pcr产物1μli7primer(10μm)2i5primer(10μm)2补无菌去离子水to25μl总共25μl
[0100]
i7 primer和i5 primer采用商业的illumina测序接头引物：hieff ngs384 dual index primer kit forset1(货号12613es02)。
[0101]
pcr反应体系：
[0102]
98℃ for 3min；11cycles of(98℃ for 20s,65℃ for 15s,72℃ for 15s),72℃ for 1min,4℃ for∞。
[0103]
pcr反应完成后，取pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段大小257bp的扩增子文库进行高通量测序分析目标突变效率，结果见图4，pcmv-pe2-1
×
gcn4及pcmv-pe2-3
×
gcn4与pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染的效果最好，约为8％，和原始的pe2系统效果接近。
[0104]
实施例2
[0105]
对实施例1的suntag-pe2系统的优化方式1：
[0106]
在ncas9的n端同时连接不同数量的gcn4，并且分别和c端同时连接不同数量的gcn4进行组合，从而分别构建以下pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒：
[0107]1×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，1
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0108]1×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，1
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0109]2×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，2
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0110]2×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，2
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0111]3×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，3
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0112]3×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，3
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0113]5×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4，5
×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4，
[0114]5×
gcn4-pcmv-pe2-3
×
gcn4，5
×
gcn4-pcmv-pe2-5
×
gcn4，
[0115]1×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4质粒序列：完整序列如seq id no.12所示。
[0116]1×
gcn4-pcmv-pe2-2
×
gcn4质粒序列：在gcn(1x)-pcmv-pe2-gcn(1x)质粒的ncas9的n端将1
×
gcn4(seq id no.6)替换成2
×
gcn4(seq id no.7)，其余14个pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒以此类推，构建而得。
[0117]
将上述16个pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒分别与pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染，和原始的pe2系统比较目标突变的效果，方法同实施例1，结果见图5，柱状图结果显示1
×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4与
[0118]
pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染的效果最好，约为16％，明显优于原始的pe2系统效果。
[0119]
实施例3
[0120]
对实施例2的suntag-pe2系统的优化方式2：
[0121]
将pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒中的flexible linker替换成gs linker，构建pegrna-scfv-gs-linker-rt-hek(+1-cttins)质粒：逆转录酶(m-mlv rt)通过gs linker与scfv连接形成融合蛋白，pegrna序列连在含有rt的质粒上，构成pegrna-scfv-gs-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒。构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
[0122]
pegrna-scfv-gs-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒完整序列如seq id no.13所示。
[0123]
将实施例2中的16个pcmv-pe2-n
×
gcn4质粒分别与
[0124]
pegrna-scfv-flexible-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染，和原始的pe2系统比较目标突变的效果，方法同实施例1，结果见图6，柱状图结果显示，将flexible linker替换成gs linker后编辑效率进一步提升，并且1
×
gcn4-pcmv-pe2-1
×
gcn4质粒与pegrna-scfv-gs-linker-rt-hek3(+1-cttins)质粒共转染的效果最好，约为18％，明显优于原始的pe2系统效果。
[0125]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种碱基编辑工具，其特征在于：所述的碱基编辑工具采用suntag系统和pe2系统相结合形成，所述的suntag系统包括能够被单链可变片段scfv识别的gcn4多肽，所述的pe2系统包括pegrna、仅有单链dna切口酶活性的cas9切口酶、逆转录酶以及与所述的逆转录酶连接形成融合蛋白的单链可变片段scfv，所述的pegrna的序列包括sgrna序列、引物结合序列、以及转录模板序列；其中，所述的suntag系统中有1～5个gcn4多肽与所述的pe2系统的cas9切口酶的n端连接；和/或，所述的suntag系统中有1～5个gcn4多肽与所述的pe2系统的cas9切口酶的c端连接。2.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的pe2系统的cas9切口酶的n端、c端中只有n端连接有所述gcn4多肽。3.根据权利要求1或2所述的碱基编辑工具，其特征在于：与所述的cas9切口酶的n端连接的gcn4多肽的个数是1～3个。4.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：连接在所述的cas9切口酶的c端的gcn4多肽的个数是1～3个。5.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的融合蛋白与所述的pegrna相连，然后与载体形成用于递送所述的pegrna、逆转录酶和单链可变片段scfv的质粒；所述的cas9切口酶和所述的gcn4多肽相连，然后与载体形成用于递送所述的cas9切口酶和gcn4多肽的质粒。6.根据权利要求5所述的碱基编辑工具，其特征在于：用于递送所述的pegrna、逆转录酶和单链可变片段scfv的质粒所使用的载体为pu6；和/或，用于递送所述的cas9切口酶和gcn4多肽的质粒所使用的载体为pcmv。7.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：用于连接所述cas9切口酶和所述gcn4多肽的接头序列为flexible linker，和/或，用于连接所述的逆转录酶和所述的单链可变片段scfv的接头序列为flexible linker或gs linker。8.根据权利要求7所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述flexiblelinker的氨基酸序列如seq id no.15所示，所述gs linker的氨基酸序列(gggs)ng，n为2～10之间的整数。9.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的gcn4多肽的氨基酸序列如seq id no.14所示。10.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的碱基编辑工具能够将如seq id no.1所示的目标序列编辑为如seq id no.2所示序列，采用的pegrna序列如seq idno.3所示。

技术总结

本发明涉及一种碱基编辑工具。为了提高现有PE2系统目标碱基编辑效率和精准度，本发明提供一种新的碱基编辑工具，所述的碱基编辑工具包括SunTag系统和PE2系统。本发明首次利用SunTag系统和PE系统结果，采用SunTag系统和编辑效率更高的PE2版本，构建SunTag-PE2系统，经优化后，在HEK293T细胞上和原始的PE2系统进行比较，所述的碱基编辑工具能够进一步提高PE2系统编辑的准确性，增强编辑精准度，为基因编辑提供更多的选择，该技术将推动我国及全世界在生命科学研究、农业生产和生物医药等领域的快速发展，具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。