CD98HC基因人源化非人动物的构建方法及应用与流程

cd98hc基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种cd98hc基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术：

2.cd98hc属于溶质转运蛋白(slc3)家族，为ii型跨膜蛋白，是氨基酸转运体(hats)的重链组成部分，且是hats运输氨基酸的必需组分。hats在细胞中广泛表达并介导了几乎所有必需氨基酸的跨膜转运，保证细胞内氨基酸水平的稳定，对维持细胞正常的生物学功能具有重要作用。cd98hc具有调控氨基酸运转和整合素信号转导的功能，在多种快速增殖的细胞内广泛表达，参与调控多种重要的细胞活动，在细胞生长及胚胎发育过程中发挥重要作用。
3.研究发现，cd98hc在很多肿瘤细胞系、原位癌及转移癌中高表达，包括胃癌、骨肉瘤、肾细胞癌、胆道癌等，cd98hc可以满足肿瘤细胞对氨基酸的大量需求，维持肿瘤细胞的快速增殖能力，因而对肿瘤生长和转移等发生过程具有重要的调控作用，使其成为肿瘤的重要靶点。
4.cd98hc的人鼠同源度仅为73.10％。在药物开发过程中，利用实验动物进行人类药物，特别是抗体药物的发现和筛选，是非常重要的研究过程；同时，利用实验动物进行人类药物的药理药效等临床前研究更是不可缺少的开发步骤。但由于动物与人类在生理结构和代谢系统的差异，传统的动物模型并不能很好地反映药物在人体的真实状况，建立更接近人类生理特征的人源化动物模型是生物医药行业的迫切需求。而由于动物与人类生理病理的差异，以及基因的复杂性，构建“有效”的人源化动物用于新药开发依旧是存在巨大困难。
5.鉴于cd98hc在肿瘤疾病领域的巨大应用潜力，为进一步探索相关生物学特性，并提高cd98hc靶点相关药物临床前试验的有效性，降低临床研究风险，本领域急需开发cd98hc相关信号通路的非人动物模型。

技术实现要素：

6.本发明的第一方面，提供了一种cd98hc基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化cd98hc蛋白。
7.优选的，所述的非人动物的内源cd98hc蛋白表达降低或缺失。
8.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的全部或部分。
9.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
10.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更优选的，包含4号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含4号外显子的
部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子。
11.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含seq id no：7或10编码的氨基酸序列；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有seq id no：7或10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
12.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸，例如包含至少200、300、400、410、415、416、417、418、419、420、425个连续氨基酸；所述的人源化cd98hc蛋白胞外区包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
13.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白部分包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
14.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的部分，进一步优选为非人动物cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的全部或部分，优选的，包含seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
16.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
27.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
28.a)转录的mrna为seq id no：10所示核苷酸序列；
29.b)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
30.c)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
31.d)转录的mrna具有seq id no：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
32.优选的，所述的人源化cd98hc基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
33.优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物cd98hc基因座上。
34.优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
35.a)编码人或人源化cd98hc蛋白的核苷酸序列；
36.b)编码人或人源化cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人cd98hc蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分；进一步优选的，包含编码人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列
37.c)人或人源化cd98hc基因的核苷酸序列；或，
38.d)人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子；进一步优选的，所述的靶向载体包含seq id no：7所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少
99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
39.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为替换或插入。
40.优选的，所述的人或人源化cd98hc基因可操作连接到至少一条染体上内源cd98hc基因的内源调控元件。
41.所述的人或人源化cd98hc基因在非人动物中通过调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人cd98hc基因。
42.在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物cd98hc基因。
43.优选的，所述的导入的位置位于cd98hc基因的内源调控元件之后。
44.优选的，所述的导入为替换或插入，进一步优选的，所述的导入非人动物cd98hc基因座为替换非人动物相应区域，更优选的，非人动物cd98hc基因的2号至10号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分被替换。
45.优选的，编码seq id no：1的第147-565位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。
46.优选的，使用基因编辑技术进行cd98hc基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
47.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物cd98hc基因的编码框，将编码人或人源化cd98hc蛋白的核苷酸序列或者人源化cd98hc基因的核苷酸序列插入非人动物cd98hc基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物cd98hc基因的编码框可以采用敲除非人动物cd98hc基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物cd98hc蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物cd98hc基因的编码框可以为敲除非人动物cd98hc基因的2号外显子至10号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分。
48.优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
49.优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
50.a)编码人或人源化cd98hc蛋白的核苷酸序列；
51.b)编码人或人源化cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人cd98hc蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分；进一步优选的，包含编码人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列
52.c)人或人源化cd98hc基因的核苷酸序列；或，
53.d)人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进
一步优选的，包含人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子；进一步优选的，所述的靶向载体包含seq id no：7所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
54.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
55.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，其选自非人动物cd98hc基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如seq idno：3或5所示。
56.所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，其选自非人动物cd98hc基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如seq id no：4或6所示。
57.优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向cd98hc基因的sgrna与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物cd98hc基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd98hc基因上的靶序列上。
58.优选的，所述的sgrna靶位点位于cd98hc基因的2号外显子至10号外显子序列上。
59.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd98hc基因的2号外显子和/或10号外显子序列上。
60.优选的，所述的sgrna在cd98hc基因上的靶序列如seq id no：12和13所示。
61.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向cd98hc基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得cd98hc基因人源化的非人动物。
62.在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得cd98hc基因人源化的非人动物。
63.根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将cd98hc基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
64.优选的，所述的其他基因为pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28和cd38中的至少一种基因。
65.优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28和cd38蛋白中的至少一种。
66.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合的。
67.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为杂合的。
68.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
69.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
70.所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
71.本发明的第二方面，提供了一种cd98hc基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化cd98hc蛋白。
72.优选的，所述的非人动物的内源cd98hc蛋白表达降低或缺失。优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的全部或部分。
73.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
74.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更优选的，包含4号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子。
75.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含seq id no：7或10编码的氨基酸序列；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有seq id no：7或10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个
或多个氨基酸的氨基酸序列。
76.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸，例如包含至少200、300、400、410、415、416、417、418、419、420、425个连续氨基酸；所述的人源化cd98hc蛋白胞外区包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
77.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白部分包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
78.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的部分，进一步优选为非人动物cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
79.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的全部或部分，优选的，包含seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
80.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
81.a)seq id no：11所示氨基酸序列；
82.b)与seq id no：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
83.c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
84.d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
85.优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化cd98hc基因，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的部分。
86.优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选
的，包含4号至12号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，优选还包含4-5号内含子和/或11-12号内含子，更优选的包含4-12号外显子之间的任一内含子，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子。
87.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因包含seq id no：7所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
88.优选的，所述的人源化cd98hc基因包含编码人cd98hc蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的人源化cd98hc基因包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：2第215-630位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
89.优选的，所述的人源化cd98hc基因还包含非人动物cd98hc基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物cd98hc基因的1号至10号外显子的全部或部分，更优选包含非人动物cd98hc基因1号外显子的全部、2号外显子的部分和10号外显子的部分。
90.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因还包含编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
91.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
92.a)转录的mrna为seq id no：10所示核苷酸序列；
93.b)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
94.c)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2
或不超过1个核苷酸；或，
95.d)转录的mrna具有seq id no：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
96.优选的，所述人或人源化cd98hc基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染体中内源性cd98hc基因的内源调控元件。
97.优选的，所述的非人动物是本发明如上所述的构建方法构建的。
98.根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28和cd38中的至少一种。
99.根据本发明的一些实施例，所述人或人源化cd98hc基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合。
100.根据本发明的一些实施例，所述人或人源化cd98hc基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为杂合。
101.优选的，所述的人源化cd98hc基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
102.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
103.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
104.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
105.所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
106.本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
107.优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
108.a)编码人或人源化cd98hc蛋白的核苷酸序列；
109.b)编码人或人源化cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人cd98hc蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分；进一步优选的，包含编码人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列；
110.c)人或人源化cd98hc基因的核苷酸序列；或，
111.d)人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、
300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子；进一步优选的，所述的靶向载体包含seq id no：7所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
112.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
113.所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的dna片段，其选自非人动物cd98hc基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如seq idno：3或5所示。
114.所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，其选自非人动物cd98hc基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如seq id no：4或6所示。
115.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd98hc基因的2号和/或10号外显子上。
116.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
117.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
118.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
119.优选的，所述的靶向载体还包含seq id no：8和/或9。
120.本发明的第四方面，提供了一种sgrna，所述的sgrna靶向非人动物cd98hc基因，其靶位点位于cd98hc基因的2号外显子至10号外显子序列上。
121.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd98hc基因的2号外显子和/或10号外显子序列上。
122.优选的，所述的sgrna在cd98hc基因上的靶序列如seq id no：12和13所示。
123.本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgrna的dna分子。优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
124.本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgrna的载体。
125.本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgrna、上述编码sgrna的dna分子和/或上述载体的细胞。
126.本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgrna、上述编码sgrna的dna分子、上述载体和/或上述细胞在cd98hc基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
127.本发明的第九方面，提供了一种人源化cd98hc蛋白，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的全部或部分。
128.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
129.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更优选的，包含4号至12号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子。
130.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含seq id no：7或10编码的氨基酸序列；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7或10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有seq id no：7或10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
131.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸，例如包含至少200、300、400、410、415、416、417、418、419、420、425个连续氨基酸；所述的人源化cd98hc蛋白胞外区包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
132.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白部分包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不
超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
133.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的部分，进一步优选为非人动物cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
134.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的全部或部分，优选的，包含seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
135.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
136.a)seq id no：11所示氨基酸序列；
137.b)与seq id no：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
138.c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
139.d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
140.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
141.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
142.所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
143.本发明的第十方面，提供了一种人源化cd98hc基因，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的部分。
144.优选的，所述的人源化cd98hc基因编码上述的人源化cd98hc蛋白。
145.优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，包含4号至12号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，优选还包含4-5号内含子和/或11-12号内含子，更优选的包含4-12号外显子之间的任一内含子，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、81、82、83、84、
85、90、100、150、200、300、400、420、429bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从编码胞外区n端第1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸开始至4号外显子最后一个核苷酸，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、250、300、350、360、361、362、363、364、365、370、400、500、530bp的核苷酸序列；优选的，12号外显子的部分包含12号外显子中第一个核苷酸开始至终止密码子。
146.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因包含seq id no：7所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
147.优选的，所述的人源化cd98hc基因包含编码人cd98hc蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的人源化cd98hc基因包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：2第215-630位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
148.优选的，所述的人源化cd98hc基因还包含非人动物cd98hc基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物cd98hc基因的1号至10号外显子的全部或部分，更优选包含非人动物cd98hc基因1号外显子的全部、2号外显子的部分和10号外显子的部分。
149.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因还包含编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：1第1-146位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码seq id no：1第1-146位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
150.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd98hc基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
151.a)转录的mrna为seq id no：10所示核苷酸序列；
152.b)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
153.c)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
154.d)转录的mrna具有seq id no：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
155.优选的，所述的人源化cd98hc基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，
所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
156.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
157.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
158.所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
159.本发明的第十一方面，提供了一种cd98hc基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源cd98hc基因的2号外显子至10号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分。
160.本发明的第十二方面，提供了一种cd98hc基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgrna进行非人动物的制备。
161.本发明的第十三方面，提供了一种cd98hc基因缺失的细胞，所述的细胞缺失cd98hc基因的2号外显子至10号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分。
162.本发明的第十四方面，提供了一种cd98hc基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgrna进行cd98hc基因缺失的细胞的构建。
163.本发明的第十五方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，包括如下步骤：
164.i)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
165.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
166.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28和cd38修饰的非人动物。
167.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
168.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源基因座的替换可以是纯合的。
169.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源基因座的替换可以是杂合的。
170.本发明的第十六方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化cd98hc蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化cd98hc基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法
获得的非人动物。
171.本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化cd98hc蛋白。或者，所述荷瘤后的瘤组织的基因组中包含上述的人源化cd98hc基因。或者，所述荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
172.本发明的第十八方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
173.本发明的第十九方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
174.本发明的第二十方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
175.本发明的第二十一方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
176.本发明的第二十二方面，提供了一种cd98hc基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化cd98hc蛋白。
177.优选的，所述的细胞表达上述的人源化cd98hc蛋白。
178.优选的，所述的细胞的基因组中包含人cd98hc基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化cd98hc基因。
179.本发明的第二十三方面，提供了一种包含上述的人源化cd98hc基因的构建体或者表达上述的人源化cd98hc蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。
180.本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
181.本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
182.本发明的第二十六方面，提供了一种cd98hc基因人源化非人动物的基因组。
183.优选的，所述的基因组中包含人或人源化cd98hc基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化cd98hc蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
184.优选的，所述的人源化cd98hc基因为上述的人源化cd98hc基因。
185.优选的，所述的人源化cd98hc蛋白为上述的人源化cd98hc蛋白。
186.优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源cd98hc基因座处用人cd98hc基因的基因组片段(优选编码人cd98hc的胞外区的全部或部分序列)，和/或，非人动物cd98hc基因的基因组片段，导入非人动物cd98hc基因的基因组片段以形成经修饰的cd98hc基因。
187.优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源cd98hc基因座处用人源化cd98hc基因导入非人动物cd98hc基因的基因组片段以形成经修饰的cd98hc基因。
188.所述的经修饰的cd98hc基因编码人源化cd98hc蛋白。
189.优选的，所述的导入为插入或替换。
190.优选的，所述的导入非人动物cd98hc基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物cd98hc基因的2号至10号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物cd98hc基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分被替换。
191.优选的，所述的经修饰的cd98hc基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
192.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何
可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
193.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
194.本发明的第二十七方面，提供了包含上述cd98hc基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
195.优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
196.本发明的第二十八方面，提供了一种上述的人源化cd98hc蛋白、上述的人源化cd98hc基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：
197.a)涉及人类细胞的与cd98hc相关的免疫过程的产品开发中的应用；
198.b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与cd98hc相关的模型系统中的应用；
199.c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与cd98hc相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发策略中的应用；
200.d)在体内研究人cd98hc信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
201.e)研究cd98hc基因功能，研究针对人cd98hc靶位点的药物、药效，研究与cd98hc相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
202.优选的，所述应用包括疾病的和/或诊断方法，或，非疾病的和/或诊断方法。
203.本发明的第二十九方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人cd98hc特异性调节剂的筛选。
204.本发明的第三十方面，提供了一种人cd98hc特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。
205.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗cd98hc抗体。
206.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
207.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
208.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
209.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
210.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
211.优选的，所述筛选方法包括和非方法。
212.在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有效果，即效果不是必然的，只是一种可能性。
213.本发明的第三十一方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
214.优选的，所述药物筛选或评价的方法包括和非方法。
215.在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即效果不是必然的，只是一种可能性。
216.优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
217.优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
218.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
219.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
220.优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
221.优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
222.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
223.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
224.本发明所述“(treating)”(或“(treat)”或“(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的干
预。
225.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“cd98hc基因座”表示cd98hc基因1号至10号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的cd98hc基因座可以是cd98hc基因1号至10号外显子上的任选一段的dna片段。
226.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
227.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
228.本发明所述的“人源化cd98hc蛋白”，包含来源于人cd98hc蛋白的部分。其中，所述的“人cd98hc蛋白”同“人cd98hc蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人cd98hc蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd98hc蛋白的部分”，为连续或间隔的5-630个(优选为10-416个)氨基酸序列与人cd98hc蛋白的氨基酸序列一致或与人cd98hc蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
229.本发明所述的“人源化cd98hc基因”，包含来源于人cd98hc基因的部分和非人cd98hc基因的部分。其中，所述的“人cd98hc基因”同“人cd98hc基因的全部”，即其核苷酸序列与人cd98hc基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人cd98hc基因的部分”为连续或间隔的20-32752bp(优选为20-7331bp、20-2221bp或20-1251bp)个核苷酸序列与人cd98hc核苷酸序列一致或与人cd98hc核苷酸序列具有70％以上同源性。
230.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“4号至5号外显子”包含4号外显子、4-5号内含子、5号外显子的全部核苷酸序列。
231.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“4-5号内含子”表示4号外显子与5号外显子之间的内含子。
232.本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人cd98hc基因的12号外显子的部分，包含连续或间隔的5-530bp个，优选10-363bp个核苷酸序列与人cd98hc基因的12号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化cd98hc基因”中包含的“12号外显子的部分”至少包括12号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。
233.本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、b细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期b细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本技术所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
234.本发明所述的“cd98hc蛋白”，例如“人cd98hc蛋白”、“非人动物cd98hc蛋白”或“人源化cd98hc蛋白”，均包含胞外区、胞内区和/或跨膜区。
235.本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所
述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
236.本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
237.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
238.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.-in-chief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
239.基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
240.此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明
在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
241.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
242.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
243.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
244.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
245.图1：小鼠cd98hc基因座和人cd98hc基因座对比示意图(非按比例)；
246.图2：小鼠cd98hc基因人源化改造示意图(非按比例)；
247.图3：cd98hc基因打靶策略及靶向载体v1设计示意图(非按比例)；
248.图4：cd98hc基因打靶策略及靶向载体v2设计示意图(非按比例)；
249.图5：f0代小鼠基因型鉴定结果，其中wt为野生型对照，h2o为水对照；
250.图6：f1代小鼠基因型鉴定结果，其中wt为野生型对照，h2o为水对照；
251.图7：southern blot检测结果，其中wt为野生型对照；
252.图8：rt-pcr检测结果，其中+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为cd98hc基因人源化纯合子小鼠，h2o为水对照，gapdh为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；
253.图9：c57bl/6野生型小鼠脑部蛋白表达结果，其中dapi为鼠脑部细胞核染，merge为合并结果，箭头指示检测到的细胞；
254.图10：cd98hc基因人源化纯合子小鼠脑部蛋白表达结果，其中dapi为鼠脑部细胞核染，merge为合并结果，箭头指示检测到的细胞。
具体实施方式
255.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
256.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
257.bbsi、ecori、bamhi、bglii、sspi酶购自neb，货号分别为r0539l、r0101m、r0136m、r0144l、r0132m；
258.c57bl/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
259.ambion体外转录试剂盒购自ambion，货号am1354；
260.cas9mrna来源sigma，货号cas9mrna-1ea；
261.uca试剂盒来源百奥赛图公司，货号bcg-dx-001；
262.brilliant violet 510
tm
anti-mouse cd45 antibody(mcd45)购自biolegend，货号103138；
263.percp/cy5.5 anti-mouse tcrβchain(mtcrβ)购自biolegend，货号109228；
264.brilliant violet 605
tm
anti-mouse cd19 antibody(mcd19)购自biolegend，货号115540；
265.apc anti-mouse cd98(4f2)antibody(mcd98hc)购自biolegend，货号128211；
266.fitc anti-human cd98 antibody(hcd98hc)购自biolegend，货号315603；
267.apc rat igg2a,κisotype ctrl antibody(鼠同型对照抗体)购自biolegend，货号400512；
268.fitc mouse igg1,κisotype ctrl(fc)antibody(人同型对照抗体)购自biolegend，货号400110；
269.zombie nir
tm
fixable viability kit购自biolegend，货号：423106；
270.purified anti-mouse cd16/32购自biolegend，货号：101302；
271.4f2hc/cd98(d3f9d)rabbit mab购自cell signaling technology，货号：47213；
272.重组anti-cd31抗体[epr17259]购自abcam，货号：ab182981。
[0273]
实施例1 cd98hc基因人源化小鼠
[0274]
小鼠cd98hc基因(ncbi gene id：17254，primary source：mgi：96955，uniprotid：p10852-2，位于19号染体nc_000085.7的第8684246至8700733位，基于转录本nm_001161413.1及其编码蛋白np_001154885.1(seq id no：1))和人cd98hc基因(ncbi gene id：6520，primary source：hgnc：11026，uniprot id：p08195，位于11号染体nc_000011.10的第62856109至62888860位，基于转录本nm_002394.6及其编码蛋白np_002385.3(seq id no：2))对比示意图如图1所示。
[0275]
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源cd98hc基因座引入编码人cd98hc蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化cd98hc蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠cd98hc基因调节元件的控制下，用编码人cd98hc蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化cd98hc基因座示意图如图2所示，实现对小鼠cd98hc基因的人源化改造。
[0276]
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体v1上含有小鼠cd98hc基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人cd98hc蛋白的核苷酸序列的a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：3)与ncbi登录号为nc_000085.7的第8690791-8694207位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：4)与ncbi登录号为nc_000085.7的第8678908-8683721位核苷酸序列相同；a片段上包含的人cd98hc序列(seq id no：7)与ncbi登录号为nc_000011.10的第62881363至62888693位核苷酸序列相同。
[0277]
靶向载体v1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为端与小鼠基因的连接设计为端与小鼠基因的连接设计为(seq id no：8)，其中序列“gtgca”中的“a”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为
(seq id no：9)，其中序列中的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列中的“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠cd98hc的mrna序列如seq id no：10所示，表达的蛋白序列如seq id no：11所示。
[0278]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到cd98hc基因人源化纯合子小鼠。
[0279]
此外，还可引入crispr/cas9系统进行基因编辑，设计如图4所示的打靶策略，图中显示了靶向载体v2上含有小鼠cd98hc基因上游和下游的同源臂序列，以及人cd98hc核苷酸序列。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000085.7的第8690791至8691758位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：6)与ncbi登录号为nc_000085.7的第8683723至8685086位核苷酸序列相同，人cd98hc核苷酸序列如seq id no：7所示。
[0280]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
[0281]
靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgrna序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgrna进行后续实验。sgrna在cd98hc基因上的示例性靶序列如下所示：
[0282]
sgrna1靶位点(seq id no：12)：5
’‑
tttgtaggccgggatgcgggagg-3’[0283]
sgrna2靶位点(seq id no：13)：5
’‑
actaagcaaaagtttagcgctgg-3’[0284]
在sgrna的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列，退火后将退火产物连接至pt7-sgrna质粒(质粒先用bbsi线性化)，获得表达载体pt7-cd98hc-1和pt7-cd98hc-2。pt7-sgrna载体由质粒合成公司合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna(seq id no：14)并依次通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体(来源takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0285]
取小鼠的原核期受精卵，例如c57bl/6小鼠，利用显微注射仪将pt7-cd98hc-1和pt7-cd98hc-2质粒的体外转录产物(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与cas9 mrna预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯
·
纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发
育，将获得的小鼠(f0代)通过杂交和自交，扩大种数量，建立稳定的cd98hc基因人源化小鼠品系。
[0286]
可通过常规检测方法(如pcr分析)鉴定f0代小鼠体细胞的基因型，部分f0代小鼠的示例性鉴定结果见图5。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果，经测序进一步验证图5中编号为f0-01、f0-02、f0-03的小鼠为阳性小鼠。pcr引物如表1所示。
[0287]
表1f0代基因型pcr检测引物序列及重组片段大小
[0288][0289]
其中，引物l-gt-f位置位于5’同源臂左侧，r-gt-r位于3’同源臂右侧，l-gt-r和r-gt-f均位于人cd98hc序列上。
[0290]
将f0鉴定为阳性的cd98hc基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到f1代小鼠。可使用同样的pcr方法(引物序列如表1所示)对f1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图6，显示编号为f1-01、f1-02、f1-03的3只小鼠为阳性小鼠。
[0291]
对f1代pcr鉴定为阳性的小鼠进行southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组dna，选用bglii酶或sspi酶消化基因组，转膜，杂交。5’探针和a探针分别位于5’同源臂及人源片段，具体探针及目的片段的长度见表2。示例性检测结果见图7，综合a探针和5’探针的结果表明，编号为f1-01、f1-02、f1-03的3只阳性小鼠均无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的cd98hc基因人源化小鼠。
[0292]
表2具体探针及目的片段的长度
[0293]
限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小bglii5’probe14.5kb5.5kbsspia probe
‑‑
7.1kb
[0294]
探针合成引物如下：
[0295]5’
probe-f(seq id no：19)：5
’‑
acatctggttggtttgatccatcttgt-3’；
[0296]5’
probe-r(seq id no：20)：5
’‑
ggccagaacagtagagaggaaggga-3’；
[0297]
a probe-f(seq id no：21)：5
’‑
cactgcacccggccatcagcat-3’；
[0298]
a probe-r(seq id no：22)：5
’‑
ctcacacatacactgttgcccctcag-3’；
[0299]
将f1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得f2代cd98hc基因人源化纯合子小鼠。
[0300]
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化cd98hc mrna的表达情况，例如使用rt-pcr等。具体来说，分别选取7周龄雌性野生型c57bl/6小鼠(+/+)和本实施制备的cd98hc基因人源化纯合子(h/h)各1只，脱颈安乐死后取肾脏组织，采用如表3所示的引物序列进行rt-pcr检测，示例性检测结果如图8所示。从图中可以看出，在野生型c57bl/6小鼠体内仅检测到鼠cd98hc mrna，未检测到人cd98hc mrna；在cd98hc基因人源化纯合子小鼠体内仅检测到人cd98hc mrna，未检测到鼠cd98hc mrna。
[0301]
表3rt-pcr引物序列及目的片段大小
[0302][0303][0304]
可通过流式细胞术确认阳性小鼠体内人源化cd98hc蛋白的表达情况。具体来说，分别选取7周龄雌性野生型c57bl/6小鼠(wt)和本实施例制备的cd98hc基因人源化纯合子(h/h)小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏，制备单细胞悬液后，使用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm
anti-mouse cd45antibody(mcd45)、抗鼠cd98抗体apc anti-mouse cd98 antibody(mcd98)、抗人cd98抗体fitc anti-human cd98 antibody(hcd98)、抗鼠tcrβ抗体percp/cy5.5 anti-mouse tcrβchain antibody(mtcrβ)、抗鼠cd19抗体brilliant violet 605
tm
anti-mouse cd19 antibody(mcd19)、zombie nir
tm
fixable viability kit以及purified anti-mouse cd16/32识别染后进行流式检测，分析t细胞、b细胞中人源化cd98hc(hcd98hc)阳性细胞或鼠cd98hc(mcd98hc)阳性细胞的百分比。对照选用鼠同型对照抗体(apc rat igg2a,κisotype ctrl antibody)和人同型对照抗体(fitc mouse igg1,κisotype ctrl(fc)antibody)。其中，t细胞的特征为mcd45+mtcrβ+；b细胞的特征为mcd45+mcd19+。
[0305]
表4t细胞和b细胞上cd98hc蛋白流式检测结果
[0306][0307]
结果如表4所示，在cd98hc基因人源化纯合子小鼠的t细胞和b细胞中人源化cd98hc蛋白阳性细胞比例分别为27.6％和27.1％，表明本实施例构建的cd98hc人源化小鼠可以成功表达人源化cd98hc蛋白。
[0308]
进一步地，采用if染检测小鼠脑部人源化cd98hc蛋白的表达情况。具体来说，选取8周龄雌性c57bl/6野生型小鼠(+/+)和本实施制备的cd98hc基因人源化纯合子小鼠(h/h)各3只，脱颈安乐死后取脑部组织，制成石蜡切片并用特异性抗人cd98hc抗体4f2hc/cd98(d3f9d)rabbit mab和抗鼠cd31抗体anti-cd31抗体[epr17259]联合染，检测小鼠脑部mcd31和hcd98蛋白表达情况。示例性if结果如图9和图10所示，图9为c57bl/6野生型小鼠脑部蛋白表达结果，图10为cd98hc基因人源化纯合子小鼠脑部蛋白表达结果，其中dapi为小鼠脑部细胞染，merge为合并结果。
[0309]
结果显示，在c57bl/6小鼠中可检测到mcd31+脑微血管内皮细胞(箭头所示)，未见hcd98hc+脑微血管内皮细胞；在cd98hc纯合子小鼠可检测到mcd31+脑微血管内皮细胞和hcd98hc+脑微血管内皮细胞(箭头所示)，表明cd98hc基因人源化纯合子小鼠脑部中可以成
功表达人源化cd98hc蛋白。
[0310]
实施例2双重人源化或多重人源化小鼠的制备
[0311]
利用本方法或制得的cd98hc基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28、cd38等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化cd98hc小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得cd98hc与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的cd98hc小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化cd98hc与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人cd98hc和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0312]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0313]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0314]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：

1.一种cd98hc基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化cd98hc蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化cd98hc基因。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的部分，优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分，更优选的，包含人cd98hc蛋白的胞外区至少200个连续氨基酸，更进一步优选的，所述的人cd98hc蛋白部分包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的部分，优选为非人动物cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：a)seq id no：11所示氨基酸序列；b)与seq id no：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的部分，优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的人cd98hc基因包含seq id no：7所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷
酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，优选的，所述的人源化cd98hc基因还包含非人动物cd98hc基因的部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含非人动物cd98hc基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和10号外显子的部分。6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化cd98hc基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：a)转录的mrna为seq id no：10所示核苷酸序列；b)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，d)转录的mrna具有seq id no：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物cd98hc基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：a)编码人或人源化cd98hc蛋白的核苷酸序列；b)编码人或人源化cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人cd98hc蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人cd98hc蛋白胞外区至少200个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码seq id no：2第215-630位氨基酸的核苷酸序列；c)人或人源化cd98hc基因的核苷酸序列；或，d)人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包括人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，进一步优选的，包括人cd98hc基因的4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，12号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，优选的，包含seq id no：7所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，优选的，所述的导入非人动物cd98hc基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物cd98hc基因的2号至10号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分被替换。9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将cd98hc基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自pd-1、pd-l1、lag3、4-1bb、cd40、ctla4、cd147、il6r、il17、cd3、cd28和cd38中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化cd98hc基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合的，优选的，所述人或人源化cd98hc基因可操作连接到至少一条染体上内源cd98hc基因的内源调控元件。11.一种人源化cd98hc蛋白，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的全部或部分。12.根据权利要求11所述的人源化cd98hc蛋白，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化cd98hc蛋白包含人cd98hc蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人cd98hc蛋白的胞外区至少200个连续氨基酸，更优选的，所述的人cd98hc蛋白部分包含seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq idno：2第215-630位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第215-630位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，所述的人源化cd98hc蛋白还包含非人动物cd98hc蛋白的部分，进一步优选为非人动物cd98hc蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，更优选的，包含seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-146位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。13.根据权利要求11-12任一所述的人源化cd98hc蛋白，其特征在于，所述的人源化cd98hc蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：a)seq id no：11所示氨基酸序列；b)与seq id no：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。14.一种人源化cd98hc基因，其特征在于，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的部分，优选的，所述的人源化cd98hc基因编码权利要求11-13任一所述的人源化cd98hc蛋白。15.根据权利要求14所述的人源化cd98hc基因，其特征在于，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号至12号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含人cd98hc基因的4号外显子的部分、5号至11号外显子的全部和12号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，12号外显子的部分至少包含200bp的
核苷酸序列，更优选的，所述的人cd98hc基因包含seq id no：7所示的核苷酸序列；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，优选的，所述的人源化cd98hc基因还包含非人动物cd98hc基因的部分，进一步优选的，所述的人源化cd98hc基因包含非人动物cd98hc基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和10号外显子的部分。16.根据权利要求14-15任一所述的人源化cd98hc基因，其特征在于，所述的人源化cd98hc基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：a)转录的mrna为seq id no：10所示核苷酸序列；b)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)转录的mrna与seq id no：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，d)转录的mrna具有seq id no：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。17.根据权利要求11-13任一所述的人源化cd98hc蛋白、权利要求14-16任一所述的人源化cd98hc基因、权利要求1-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。18.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求14-16任一所述的人源化cd98hc基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达权利要求11-13任一所述的人源化cd98hc蛋白，或者，权利要求1-10任一所述的构建方法获得的非人动物，优选的，所述的组织包括荷瘤后的瘤组织。19.一种权利要求11-13任一所述的人源化cd98hc蛋白、权利要求14-16任一所述的人源化cd98hc基因、权利要求1-10任一所述的构建方法获得的非人动物或权利要求18所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包含：a)涉及人类细胞的与cd98hc相关的免疫过程的产品开发中的应用；b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与cd98hc相关的模型系统中的应用；c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与cd98hc相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发策略中的应用；d)在体内研究人cd98hc信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，e)研究cd98hc基因功能，研究针对人cd98hc靶位点的药物、药效，研究与cd98hc相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

技术总结

本发明提供了一种CD98HC基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化CD98HC蛋白、一种人源化CD98HC基因和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CD98HC蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CD98HC蛋白，可以作为人CD98HC信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。发具有重要的应用价值。发具有重要的应用价值。