用于T细胞工程改造的组合物及方法与流程

用于t细胞工程改造的组合物及方法
1.背景
2.作为产生强大的抗肿瘤作用的合成生物学形式，通过基因修饰产生肿瘤特异性t淋巴细胞以表达嵌合抗原受体(car)正受到关注。由于特异性由抗体片段赋予，car-t细胞不受mhc限制，因此比基于需要mhc匹配的t细胞受体的方法更实用。
3.cs1(也称为cracc、slamf7或cd319)是slam(信号传导淋巴细胞活化分子)家族受体的成员。其可在nk细胞、cd8+t淋巴细胞、成熟树突状细胞和活化的b细胞上表达。cs1也在多发性骨髓瘤(mm)中过表达，这使其成为免疫，如car-t的有吸引力靶点。
4.cd137(也称为4-1bb或tnfrsf9)是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员。它可以在活化的t细胞上表达，在cd8+上表达的程度比在cd4+t细胞上更大。此外，cd137在炎症部位的树突状细胞、b细胞、滤泡树突细胞、天然杀伤细胞、粒细胞和血管壁细胞中表达。
5.目前大多数car-t的临床试验使用自体car-t细胞输注来预防移植物抗宿主病(gvhd)。然而，即使在car重定向后，一些患者的t细胞也没有足够的效果，从而促进了同种异体供体t细胞的修饰。
6.概述
7.本文认识到需要用于遗传修饰免疫细胞(例如t细胞)的组合物和方法以供细胞。本文还认识到需要用于cs1靶向car-t细胞和cd137靶向car-t细胞的组合物和方法，同时避免使用患者特异性t细胞。本公开内容解决了这些需求并提供了额外的优点。
8.在一方面，本文提供了包含嵌合抗原受体(car)的工程改造免疫细胞，其中所述car包括：(i)特异性结合cs1的第一抗原结合域，(ii)特异性结合cd7的第二抗原结合域，以及(iii)跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
9.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域或所述第二抗原结合(结构域)是scfv。
10.在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；或(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
11.在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
12.在一些实施方式中，car还包括第二跨膜结构域和第二胞内信号传导结构域。
13.在一些实施方式中，所述第一或第二跨膜结构域包含以下的至少一部分：tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、
cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其任何组合。
14.在一些实施方式中，所述第一或第二胞内信号传导结构域包含以下的至少一部分：cd3 zeta、fcrγ、fcr-β、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、或cd66d、或其任何组合。
15.在一些实施方式中，第一或第二胞内信号传导结构域还包括共刺激结构域。在一些实施方式中，所述共刺激结构域选自：cd127、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、myd88、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体。
16.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头是可切割接头。在一些实施方式中，所述接头是自切割肽。在一些实施方式中，所述可切割接头选自：p2a、t2a、e2a和f2a。
17.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是α-βt细胞或γ-δt细胞。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞衍生自干细胞。在一些实施方式中，所述干细胞是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞获自具有病症的受试者。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞获自健康供体。
18.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)失活。在一些实施方式中，编码所述内源性tcr亚基的基因失活，使得所述内源tcr失活。在一些实施方式中，所述亚基选自tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ和cd3ζ。
19.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞的内源性cs1失活。在一些实施方式中，编码所述工程改造的免疫细胞的内源性cs1的基因失活。
20.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子失活。在一些实施方式中，所述内源性mhc分子包括mhc i类分子和mhc ii类分子。在一些实施方式中，所述mhc i类分子包含hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的亚基失活，使得内源性mhc-分子失活。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。
21.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞还包含能够增强所述工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些实施方式中，将所述增强子部分配置成组成型增强所述工程改造的免疫细胞的所述一种或多种活性。在一些实施方式中，将所述增强子部分配置成组成型上调所述工程改造的免疫细胞的一种或多种胞内信号传导通路。在一些实施方式中，所述一种或多种胞内信号传导通路是一种或多种细胞因子信号传导通路。在一些实施方式中，所述增强子部分通过自寡聚而自激活。在一些实施方式中，所述增强子部分通过自二聚化而自激活。在一些实施方式中，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方式中，所述增强子部分选自：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方式中，所述增强子部分用作反式活化因子或顺式活化因子。
22.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞还包含诱导性细胞死亡部分，其能
够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触后实现所述工程改造的免疫细胞的死亡。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分选自：rapacasp9、icasp9、hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分是egfrt，所述细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，所述细胞死亡激活剂是gcv。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分为icasp9，所述细胞死亡激活剂为ap1903。在一些实施方式中，所述细胞死亡激活剂包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。在一些实施方式中，所述增强子部分与所述诱导性细胞死亡部分连接。
23.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞在有所述工程改造的免疫细胞异源的细胞存在下表现出活力增强。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞异源的细胞包括异源t细胞和异源nk细胞。
24.在另一方面，提供了编码上述car的分离多核苷酸。
25.在另一方面，提供了产生如上所述的工程改造的免疫细胞的方法，包括：(i)将如上所述编码car的多核苷酸递送到免疫细胞中；和(ii)在所述免疫细胞中表达car，从而产生所述工程改造的免疫细胞。
26.在另一方面，提供了递送同种异体细胞的方法，包括向有需要的受试者施用如上所述的工程改造的免疫细胞。在一些实施方式中，工程改造的免疫细胞的内源性tcr在功能上失活。在一些实施方式中，与具有功能上有活性的tcr的其它细胞相比，所述细胞降低了受试者的gvhd。
27.在另一方面，提供了造血恶性肿瘤的方法，包括向有需要的患者施用如上所述的工程改造的免疫细胞。在一些实施方式中，所述造血恶性肿瘤包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性粒细胞白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、单核细胞、单细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞)白血病、慢性粒细胞白血病、，慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛型和高级型)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
28.在另一方面，提供了包含如上所述的工程改造的免疫细胞或分离的多核苷酸的试剂盒。
29.在另一方面，提供了包含如上所述的工程改造的免疫细胞或分离的多核苷酸的药物组合物。
30.在另一方面，提供了工程改造的免疫细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含特异性结合cs1的第一抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，(ii)内源性的无活性t细胞受体(tcr)，(iii)内源性的无活性mhc分子，和
31.(iv)内源性的无活性cs1。
32.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中编码内源性cs1的基因失活。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中的内源性tcr的亚基失活，使得内源tcr失活。在一些实施方式中，所述亚基选自tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ和cd3ζ。
33.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中编码mhc分子的基因失活。在一些
实施方式中，所述mhc分子包括mhc i类分子和mhc ii类分子。在一些实施方式中，所述mhc i类分子包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的亚基失活，使得内源性mhc分子失活。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。
34.在一些实施方式中，car还包括第二跨膜结构域和第二胞内信号传导结构域。
35.在一些实施方式中，所述第一或第二跨膜结构域包含以下的至少一部分：tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其任何组合。
36.在一些实施方式中，所述第一或第二胞内信号传导结构域包含以下的至少一部分：cd3 zeta、fcrγ、fcr-β、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、或cd66d、或其任何组合。
37.在一些实施方式中，第一或第二胞内信号传导结构域还包括共刺激结构域。在一些实施方式中，所述共刺激结构域选自：cd127、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、myd88、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体。
38.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头是可切割接头。在一些实施方式中，所述接头是自切割肽。在一些实施方式中，所述可切割接头选自：p2a、t2a、e2a和f2a。
39.在一些实施方式中，所述car还包含第二抗原结合域。在一些实施方式中，所述第二抗原结构域结合选自以下的抗原：cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白(robol)、卷曲受体(frizzled)、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2和cd137。
40.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域或所述第二抗原结合域是scfv。
41.在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；或(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
42.在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)
vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
43.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头包含可切割接头。在一些实施方式中，所述接头包含自切割肽。在一些实施方式中，所述接头不包含自切割肽。
44.在一些实施方式中，所述car还包含第三抗原结合域。在一些实施方式中，所述第三抗原结构域结合选自以下的抗原：cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2和cd137。
45.在一些实施方式中，所述car还包括第二跨膜结构域和第二胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域通过接头连接。在一些实施方式中，所述接头是可切割接头。在一些实施方式中，所述接头是自切割肽。在一些实施方式中，所述可切割接头选自：p2a、t2a、e2a和f2a。
46.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是α-βt细胞或γ-δt细胞。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞衍生自干细胞。在一些实施方式中，所述干细胞是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞获自具有病症的受试者。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞获自健康供体。
47.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞还包含能够增强所述工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些实施方式中，将所述增强子部分配置成组成型增强所述工程改造的免疫细胞的所述一种或多种活性。在一些实施方式中，将所述增强子部分配置成组成型上调所述工程改造的免疫细胞的一种或多种胞内信号传导通路。在一些实施方式中，所述一种或多种胞内信号传导通路是一种或多种细胞因子信号传导通路。在一些实施方式中，所述增强子部分通过自寡聚而自激活。在一些实施方式中，所述增强子部分通过自二聚化而自激活。在一些实施方式中，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方式中，所述增强子部分选自：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方式中，所述增强子部分用作反式活化因子或顺式活化因子。
48.在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞还包含诱导性细胞死亡部分，其能
够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触后实现所述工程改造的免疫细胞的死亡。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分选自：rapacasp9、icasp9、hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分是egfrt，所述细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，所述细胞死亡激活剂是gcv。在一些实施方式中，所述诱导性细胞死亡部分为icasp9，所述细胞死亡激活剂为ap1903。在一些实施方式中，所述细胞死亡激活剂包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。在一些实施方式中，所述增强子部分与所述诱导性细胞死亡部分连接。
49.在一些实施方式中，在有与所述工程改造的免疫细胞异源的细胞存在下，所述工程改造的免疫细胞表现出活力增强。在一些实施方式中，与所述工程改造的免疫细胞异源的细胞包括异源t细胞和异源nk细胞。
50.在另一方面，提供了包含嵌合抗原受体(car)的工程改造的细胞，其中所述car包括：(i)特异性结合cs1的第一抗原结合域，其中第一抗原结构域包含单结构域抗体，(ii)第二抗原结合域，以及(iii)跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
51.在一些实施方式中，所述第二抗原结合域是scfv。在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vhh1-vh2-vl2；(ii)vhh1-vl2-vh2；(iii)vh2-vl2-vhh1；(iv)vl2-vh2-vhh1；(v)vh2-vhh1-vl2；和(vi)vl2-vhh1-vh2，其中vhh1表示第一抗原结合域的单结构域抗体，vh2表示所述第二抗原结合域的重链可变结构域，vl2表示所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
52.在一些实施方式中，所述第二抗原结合域包含单结构域抗体。在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vhh1-vhh2；和(ii)vhh2-vhh1，其中vhh1表示第一抗原结合域的单结构域抗体，vhh2表示所述第二抗原结合域的单结构域抗体。
53.在一些实施方式中，所述第二抗原结构域结合选自下组的抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2和cd137。
54.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头相连。在一些实施方式中，所述接头包含自切割肽。在一些实施方式中，所述接头不包含自切割肽。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。
55.在一些实施方式中，所述t细胞是α-βt细胞或γ-δt细胞。在一些实施方式中，所述工程改造的免疫细胞衍生自干细胞。
56.在另一方面，提供包含嵌合多肽的工程改造的细胞，其中所述嵌合多肽包含：(i)第一嵌合抗原受体(car)，其中所述第一car包含：(a)第一抗原结合域，(b)第二抗原结合域，和(c)第一跨膜结构域和第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二嵌合抗原受体(car)，其中所述第二car包含：(a)第三抗原结合域，和(b)第二跨膜结构域和第二胞内信号传导结构域；其中所述抗原结合域中至少一个特异性结合cs1。
57.在一些实施方式中，所述第一car和第二car经由所述嵌合多肽上的接头相连。在一些实施方式中，所述接头是可切割接头。在一些实施方式中，所述接头是自切割肽。在一些实施方式中，所述可切割接头选自：p2a、t2a、e2a和f2a。
58.在一些实施方式中，所述第一共刺激结构域和第二共刺激结构域是不同的。在一些实施方式中，所述第一共刺激结构域和第二共刺激结构域是相同的。
59.在一些实施方式中，所述第一或第二跨膜结构域包含tcr alpha、tcr beta、cd3 zeta、cd3 gamma、cd3 delta、cd3 epsilon、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154的至少一部分。在一些实施方式中，所述第一胞内信号传导结构域和第二胞内信号传导结构域是不同的。在一些实施方式中，所述第一胞内信号传导结构域和第二胞内信号传导结构域是相同的。
60.在一些实施方式中，所述第一或第二胞内信号传导结构域包含cd3 zeta、fcr gamma、fcr beta、cd3 gamma、cd3 delta、cd3 epsilon、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的至少一部分。
61.在一些实施方式中，所述第一或第二抗原结合域是scfv。在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；和(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1代表所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1代表所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2代表所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2代表所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
62.在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域按照以下模式之一排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2，其中vh1代表所述第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1代表所述第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2代表所述第二抗原结合域的重链可变结构域，并且vl2代表所述第二抗原结合域的轻链可变结构域。
63.在一些实施方式中，所述第三抗原结合域包含scfv或单结构域抗体。
64.在一些实施方式中，所述第一抗原结合域结合选自下组的抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、
tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。
65.在一些实施方式中，所述第二抗原结构域结合选自下组的抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。
66.在一些实施方式中，所述第三抗原结构域结合选自下组的抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。
67.在另一方面，提供了工程改造的免疫细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含特异性结合cd137的第一抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，和(ii)以下的任意两个或多个：内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cd137。
68.在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的cd137。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cd137。
69.在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的mhc分子。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cd137。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含靶向肿瘤抗原的第二抗原结合域。
70.在另一方面，提供了工程改造的免疫细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含特异性结合cs1的第一抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，和(ii)以下的任意两个或多个：内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cs1。
71.在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性
无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的mhc分子。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cs1分子。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含靶向肿瘤抗原的第二抗原结合域。
72.在另一方面，提供了工程改造的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含：(i)特异性结合cs1的第一抗原结合域，(ii)特异性结合cd137的第二抗原结合域，(iii)跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
73.在一些实施方式中，所述免疫细胞包含以下的任意两个或多个：内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子、内源性无活性的cd137和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的mhc分子。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的cd137。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性mhc分子和内源性无活性的cd137。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性mhc分子和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的cd137和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的mhc分子、内源性无活性的cd137和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的cd137和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cs1。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子和内源性无活性的cd137。在一些实施方式中，所述免疫细胞包含内源性无活性的t细胞受体(tcr)、内源性无活性的mhc分子、内源性无活性的cd137和内源性无活性的cs1。
74.从以下详述中，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，这些详述仅示出和描述了本公开的说明性实施例。应该认识到，本公开能够有其它和不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述在本质上被视为说明性的，而非限制性的。
75.通过引用纳入
76.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式纳入本文，如同每一个单独的出版物、专利或专利申请都被明确和单独地指示以引用方式纳入本文一样。如果通过引用纳入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
77.附图简述
78.本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。参考以下详述和附图(本文中也称为“图”)将更好地理解本发明的特征和优点，该详述阐述了利用了本发明原理的说明性实施方式，其中：
79.图1举例说明了本文所述的靶向cs1的car的示例性设计，其可以改变为本文所公开的任何抗原，其中car s1-1至car s1-6说明了cs1单个car的示例性设计；car s2-1至car s2-3、car s3-1至car-s3-3和car s4-1至cars4-3示出了并行、环路和串联结构中的cs1双
car的示例性设计；car s5-1至car s5-4和car s6-1至car s6-4示出了cs1三car的示例性设计。
80.图2a和2b说明了cd4+或cd8+t细胞中cs1的敲除效率。
81.图3说明了抗cs1 car在t细胞上的表达情况。
82.图4a和4b说明了抗cs1 car-t细胞与cs1抗原的结合能力。
83.图5a-5c说明了抗cs1 car-t细胞对不同靶细胞的细胞毒性。
84.图6a-6c说明了抗cs1 car-t细胞与rpmi8226-lucg2#靶细胞共孵育后的细胞因子释放情况。
85.图7说明了car-t微调信号传导分析的结果。
86.图8说明了本技术的抗cs1单car、双car和三car在t细胞上的表达情况。
87.图9a-9e说明了本技术的通用car-t细胞中trac、b2m、cd7和cs1的敲除效率。
88.图10a-10d说明了本技术的通用抗cs1单car、双car和三car对靶细胞的细胞毒性。
89.图11a和11b说明了本技术的通用抗cs1单car、双car和三car对同种异体ctl或nk细胞的杀伤作用。
90.详述
91.尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方式，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是这些实施例仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以发生许多改变、变化和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明实施方式的各种替代方案。
92.定义
93.本文使用的术语“约”是指在确定的特定值或成分的可接受公差范围内的值或成分，其部分取决于该值或成分是如何测量或测量的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的最高20％、最高10％、最高5％或最高1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以指某数值的数量级内，优选5倍内，更优选2倍内。除非另有说明，如果在申请和权利要求书中描述了特定值，应假设术语“约”表示特定值的可接受误差范围内。
94.本文使用的术语“给药”是指使用多种方法和递送系统中的任何一种将本公开的产品物理引入受试者体内，包括静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、脊髓内或其它肠外给药途径，例如通过注射或输注。
95.本文使用的术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可被选择性结合剂，如受体结合的配体。再例如，抗原可以是可被选择性结合剂，如免疫蛋白(例如抗体)结合的抗原分子。抗原也可以是指能够在动物中使用以产生能够结合该抗原的抗体的分子或其片段。在一些情况下，抗原可以结合到基质(例如，细胞膜)。或者，抗原可以不与底物(例如，分泌分子，如分泌的多肽)结合。
96.本文使用的术语“抗体(ab)”包括但不限于特异性结合抗原的免疫球蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其片段。各h链包括重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包括三个恒定结构域ch1、ch2和ch3。各轻链包括轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括恒定结构域cl。vh和vl区还可以细分为称为互补决定区(cdr)的高可变区，其中散布有称为框架区(fr)的更保守区。各
vh和vl包含三个cdr和四个fr，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。
97.本文使用的术语“核苷酸”通常指碱糖磷酸组合。核苷酸可以包括合成核苷酸。核苷酸可以包括合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna))。术语核苷酸可以包括三磷酸核苷三磷酸腺苷(atp)、三磷酸尿苷(utp)、三磷酸胞嘧啶(ctp)、三磷酸鸟苷(gtp)和脱氧核苷三磷酸，如datp、dctp、ditp、dutp、dgtp、dttp或其衍生物。此类衍生物可以包括，例如，[αs]datp、7-脱氮(deaza)-dgtp和7-脱氮-datp，以及赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文所用的术语核苷酸可指二脱氧核糖核苷三磷酸(ddntp)及其衍生物。二脱氧核糖核苷三磷酸的示范性实例可以包括但不限于ddatp、ddctp、ddgtp、dditp和ddttp。核苷酸可以是未标记的或通过已知技术进行可检测标记。也可以用量子点进行标记。可检测标记可以包括，例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(fam)、2
’7’‑
二甲氧基-4’5-二氯-6-羧基荧光素(joe)、罗丹明、6-羧基罗丹明(r6g)、n,n,n’,n
’‑
四甲基-6-羧基罗丹胺(tamra)、6-羧基-x-罗丹明(rox)、4-(4
’‑
二甲氨基苯偶氮)苯甲酸(dabcyl)、级联蓝、俄勒冈绿、德克萨斯红、氰胺和5-(2
’‑
氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)。荧光标记核苷酸的具体实例可以包括[r6g]dutp、[tamra]dutp、[r110]dctp、[r6g]dctp、[tamra]dctp、[joe]ddatp、[r6g]ddatp、[fam]ddctp、[r110]ddctp、[tamra]ddgtp、[rox]ddttp、[dr6g]ddatp、[dr110]ddctp、[dtamra]ddgtp和[drox]ddttp，购自珀金
·
埃尔默，福斯特市，加利福尼亚州；氟联(fluorolink)脱氧核苷酸、氟联cy3-dctp、氟联cy5-dctp、氟联氟x-dctp、氟联cy3-dutp和氟联cy5-dutp，购自阿默沙姆公司，阿灵顿高地，伊利诺伊州；荧光素-15-datp、荧光素-12-dutp、四甲基-罗丹明-6-dutp、ir770-9-datp、荧光素-12-ddutp、荧光素-12-utp和荧光素-15-2
’‑
datp，购自勃林格
·
曼海姆，印第安纳波利斯，印第安纳州；和染体标记的核苷酸、bodipy-fl-14-utp、bodipy-fl-4-utp、bodipy-tmr-14-utp、bodipy-tmr-14-dutp、bodipy-tr-14-utp、bodipy-tr-14-dutp、级联蓝(cascade blue)-7-utp、级联蓝-7-dutp、荧光素-12-utp、荧光素-12-dutp、俄勒冈绿488-5-dutp、罗丹明绿-5-utp、罗丹明绿-5-dutp、四甲基罗丹明-6-utp、四甲基罗丹明-6-dutp、德克萨斯红-5-utp、德克萨斯红-5-dutp和德克萨斯红-12-dutp，购自分子探针公司，尤金，俄勒冈州。核苷酸也可以通过化学修饰进行标记。化学修饰的单核苷酸可以是生物素dntp。生物素化dntp的一些非限制性实例可以包括生物素-datp(例如生物素-n6-ddatp、生物素-14-datp)、生物素-dctp(例如生物素-11-dctp、生物素-14-dctp)和生物素-dutp(例如生物素-11-dutp、生物素-16-dutp、生物素-20-dutp)。
[0098]
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地用于指单链、双链或多链形式的任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以是细胞的外源性或内源性。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是dna。多核苷酸可以是rna。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可以包括一种或多种类似物(例如改变的骨架、糖或核碱基)。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性例子包括：5-溴脲嘧啶、肽核酸、异种核酸(xeno nucleic acid)、吗啉、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-gtp、荧光团(例如与糖连接的罗
丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、cpg岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)和丫苷(wyosine)。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(位点)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna(trna)、核糖体rna(rrna)、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、任何序列的分离rna、包括无细胞dna(cfdna)和无细胞rna(cfrna)在内的无细胞多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸序列可以被非核苷酸成分打断。
[0099]
本文中使用的术语“基因”是指参与编码rna转录物的核酸(例如dna，如基因组dna和cdna)及其相应的核苷酸序列。本文中参考基因组dna使用的术语包括介入的非编码区以及调节区，并且可以包括5’和3’端。在某些使用中，该术语包括转录序列，包括5’和3’非翻译区(5'-utr和3'-utr)、外显子和内含子。在某些基因中，转录区包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些使用中，“基因”仅包括编码多肽所需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在某些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体rna基因(rrna)和转运rna(trna)基因。在某些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，包括上游和下游调控区、增强子和启动子。基因可以指生物体基因组中自然位置的“内源性基因”或天然基因。基因可以指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常在宿主生物体中不存在但通过基因转移引入宿主生物体的基因。非天然基因也可以指不在生物体基因组中自然位置的基因。非天然基因还可以指包括突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
[0100]
本文使用的术语“内源性”是指通常在细胞或组织中表达的核酸分子或多肽。
[0101]
本文使用的术语“外源性”是指在细胞中不是内源性存在的核酸分子或多肽，或者其存在水平足以实现过表达时获得的功能效果。因此，术语“外源”包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如，外来的、异源的和过表达的核酸分子和多肽。
[0102]
本文使用的术语“自体”是指源自同一生物的。例如，自体样本(例如，细胞)可以是指被移除、处理，然后在稍后时间返回给同一受试者(例如，患者)的样本。就一过程而言，自体过程可以与同种异体过程区分开来，在同种异体中，样品的供体(例如细胞)和样品的受体不是同一受试者。
[0103]
本文使用的术语“同种异体”是指来源于材料被引入的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不完全相同时，两个或多个人被认为是彼此同种异体的。在某些方面，同一物种的个体的同种异体材料可能在遗传上差异很大，可以进行抗原相互作用。
[0104]
本文使用的术语“异种”是指衍生自不同物种的动物的移植物。
[0105]
本文使用的术语“t细胞和nk细胞共有标志物”是指共同存在于t细胞和n细胞上的标志物，包括但不限于：cd2、cd7、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd69、cd100、cd122、cd132、cd161、cd159a、cd159c、cd314。
[0106]
本文使用的术语“t细胞和/或nk细胞的标志物”是指分别存在于t细胞或nk或t细胞和nk细胞中的标志物，包括但不限于：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd160、cd161 cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c
(nkg2c)、nkg2e、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、slamf7。
[0107]
本文使用的术语“功能性失活”或“功能失活”是指功能性基因或该基因的产物(如mrna或蛋白)被阻止或抑制。失活可通过基因或其启动子的缺失、添加或替换，从而不发生表达来实现，或通过基因编码序列的突变而使基因产物如mrna或蛋白质失活。功能失活可以是完全的或部分的。基因失活可以包括所有程度的失活，包括基因沉默、敲除、抑制和破坏。在一些实施方式中，通过crispr-cas9系统引入功能失活。
[0108]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地用于指脊椎动物，优选哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、农场动物、运动动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
[0109]
本文中使用的术语“方法”和“”是指获得有益或所需结果，包括但不限于益处和/或预防益处的方法。例如，可以包括施用本文公开的系统或细胞。益处是指中的一种或多种病症(例如疾病或症状)的任何相关改善或效果。对于预防益处，可将组合物施用于有产生特定病症风险的受试者，或施用于报告有疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便病症可能尚未表现。
[0110]
概述
[0111]
car可以包括细胞外抗原识别区，例如scfv(单链可变片段)或单域抗体(sdab，例如vhh抗体)、跨膜区和胞内共刺激信号区。car的胞外结构域可以识别特定抗原，然后通过胞内结构域转导信号，从而引起t细胞活化和增殖、细胞溶解毒性和细胞因子分泌，藉此消除靶细胞。患者的自体t细胞(或异源供体)可以首先被分离、活化并进行遗传学改造以产生car-t细胞，然后再注射到同一患者体内。如此可能会降低移植物抗宿主病的概率，并且t细胞可以以非mhc限制的方式识别抗原。此外，car-t可以表达该抗原的所有癌症。
[0112]
本公开提供了用于工程改造细胞(例如免疫细胞)的组合物和方法，使得其可以通过单价、双特异性或多价car靶向疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物，如cs1、bcma、cd19)和免疫细胞抗原(例如cs1、cd7、cd137)。例如，本公开提供了可靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原，如cs1的工程改造的免疫细胞。内源性tcr可以被失活(例如，被破坏、抑制、敲除或沉默)。靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原的本公开的car-t可以消除阳性肿瘤细胞并清除宿主免疫细胞抗原阳性t和nk细胞，从而避免宿主排斥(hvg)。在本公开中，任选地，内源性mhc分子可以被失活(例如，被破坏、抑制、敲除或沉默)以避免宿主排斥。可以失活(例如，破坏、抑制、敲除或沉默)工程改造的免疫细胞中免疫细胞抗原的内源性表达以避免自残。可以敲除工程改造的免疫细胞的内源性tcr并预防移植物抗宿主病(gvhd)，从而制备通用或通用型car-t(ucar-t)细胞。工程改造的免疫细胞可以来源于自体t细胞或同种异体t细胞。
[0113]
此外，工程改造的免疫细胞可包含细胞自杀元件(例如诱导性细胞死亡部分)，并且可在任何时间失活/清除car-t以减少副作用。在某些情况下，工程改造的免疫细胞还可以包含增强子部分。当向受试者施用工程改造的免疫细胞时，增强子部分可以调节工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。例如，增强子部分可以是细胞因子(例如il-5或il-7)或细胞因子受体(例如il-5r或il-7r)。增强子部分可以增强工程改造的免疫细胞内的信号传导通路，例如stat5信号传导通路。在一些实施方式中，工程改造的免疫细胞包含靶向cs1和cd7或cs1和cd137的双特异性car。本实例中所示的工程改造的免疫细胞可进一步包含可诱
导细胞死亡部分，例如截断的表皮生长因子受体(egfrt或tegfr，可在本文中互换使用；参见美国专利号9447194b2和pct公布号wo2018038945)。
[0114]
可诱导细胞死亡部分或增强子部分可通过单独的表达载体引入免疫细胞。在一些情况下，可诱导细胞死亡部分和增强子部分可通过包含编码这两部分的序列的表达载体引入免疫细胞。在某些情况下，可诱导细胞死亡部分和增强子部分连接并表达为嵌合多肽。
[0115]
本文提供的工程改造的免疫细胞在细胞中的应用可以患者的疾病(例如癌症)，将其预先大规模制备以避免gvhd和hvg，降低成本，必要时随时失活car-t，减少免疫的副作用，并确保产品安全。本文提供的工程改造的细胞可以称为通用car-t细胞(ucar-t细胞)。
[0116]
嵌合抗原受体(car)
[0117]
本文提供的细胞(例如免疫细胞或工程改造的免疫细胞)可以包括一个或多个car。car可以包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。胞外结构域可以包括靶特异性结合元件(也称为抗原结合域)。胞内结构域可以包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区是指car的一部分，包含共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，可能是淋巴细胞对抗原的有效反应所需。在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car胞质结构域和膜间结构域之间可以掺有间隔子结构域。本文所用的术语“间隔子结构域”通常指功能是将跨膜结构域连接到多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的任何寡核苷酸或多肽。间隔子结构域可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。
[0118]
关于跨膜结构域，可以将car设计为包括融合于car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用与car中结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大程度降低与受体复合物的其它成员的相互作用。
[0119]
跨膜结构域可以是天然或合成来源的。如果是天然来源的，则该结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在本公开中特别使用的跨膜区可以衍生自(例如，至少包括以下的跨膜区)t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154，或衍生自免疫球蛋白，如igg4。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选在合成跨膜结构域的各端都有苯丙氨酸、氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡核苷酸或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)，可以形成car的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双链体提供了一种特别合适的接头。
[0120]
本公开的car的胞质结构域或其它胞内信号传导结构域可负责激活其中放置了car的免疫细胞的至少一种正常效应器功能。术语“效应器功能”是指细胞的一种特殊功能。例如，t细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应器功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白部分。虽然通常可以使用完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。对于利用胞内信号传导结构域的截短部分，只要其转导效应器功能信号，这种截短部分可以代替完整的链。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应器功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0121]
用于本公开的car的胞内信号传导结构域的实例包括tcr和共受体的胞质序列，所述共受体协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能的任何合成序列。
[0122]
仅通过tcr产生的信号可能不足以完全激活t细胞，可能包括次级或共刺激信号。因此，t细胞激活可以说是由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。
[0123]
初级胞质信号传导序列可以刺激或抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可能包含信号传导基序，其被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或itam。在本公开中特别使用的含itam的初级胞质信号传导序列的实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcr-β、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。特别优选的是，本公开的car中的胞质信号传导分子包含源自cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0124]
在一些实施方式中，可以将car的胞质结构域设计为本身包含cd3-ζ信号传导结构域，或者与本公开的car中有用的任何其它期望的胞质结构域组合。例如，car的胞质结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指car的一部分，其包含共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其可能是淋巴细胞对抗原的有效反应所需。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3以及与cd83特异性结合的配体等。因此，尽管在某些情况下，本公开以4-1bb作为共刺激信号元件进行了示例，但其它共刺激元件也在本公开的范围内。
[0125]
本公开的car的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以随机或以指定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双链体提供了一种特别合适的接头。
[0126]
在一些实施方式中，将胞质结构域设计为包括cd3-ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构。在另一实施方式中，将胞质结构域设计为包含cd3-zeta的信号传导结构域和4-1bb的信号传导结构域。在另一实施方式中，将胞质结构域设计为包含cd3ζ的信号传导结构域和cd28和4-1bb的信号传导结构域。
[0127]
本文提供的car可以包含一个或多个抗原结合域。在一些情况下，本文提供的car包含可以同时靶向免疫细胞抗原(例如，抑制t细胞或nk细胞的杀伤活性)和疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原)的抗原结合域。例如，同时靶向免疫细胞抗原和癌症抗原的抗原结合域包括但不限于，cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd69、cd100、cd122、cd132、cd137、cd161、cd159a、cd159c、cd279、cd314、cd319(cs1)和tcr。
[0128]
在一些情况下，本文提供的car包含单个抗原结合域。在一些实施方式中，单个抗原结合域是scfv或sdab。例如，car可以包含vhh-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ所示结构。cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。vhh可以是能够靶向抗原的sdab。
[0129]
在一些情况下，所述抗原可以是选自下组的任一种：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、
cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2。在一些实施方式中，所述sdab靶向cs1，如图1中car s1-1到car s1-4所示。在一些实施方式中，所述所述sdab靶向cd137。
[0130]
在一些实施方式中，car可以包含单个抗原结合域，并且单个抗原结合域包含多个抗原结合单元。在一些实施方式中，所述抗原结合单元是sdab。例如，car就包含(vhh)
n-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ所示结构，cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。vhh可以抗原结合单元，例如sdab，n是大于1的整数。在一些实施方式中，n可以是2-20的任何整数。在一些实施方式中，n可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方式中，n是2。在
[0131]
在一些情况下，抗原可以是选自下组的任一种：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2。在一些实施方式中，sdab靶向cs1，如图1中的car s1-5-car s1-6所示。在一些实施方式中，sdab靶向cd137。
[0132]
在一些情况下，本文提供的car包括两个抗原结合域，使得一个单独的car是靶向两种不同抗原的双特异性car。在一些情况下，抗原结合域可以选自本文公开的任何抗原结合域。在一些情况下，抗原结合域之一可以是scfv，而其他抗原结合域可以是单域抗体(sdab)。在一些情况下，两个抗原结合域都是scfv。在一些情况下，两个抗原结合域都是sdab。
[0133]
在一些情况下，所述双特异性car的第一抗原结合域靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、
h3-tm3-c3-cd3ζ(iv)；l3-scfv2-r-vhh1-h3-tm3-c3-cd3ζ(iii’)，其中各
“‑”
独立为接头肽或肽键；l3是任选的信号肽序列；vhh1是靶向cs1的抗原结合域；r是刚性或柔性接头；scfv2是靶向cd7、cd137或bcma抗原结合域(例如，抗体单链可变区序列)；h3任选地是铰链区；tm3是跨膜结构域；c3是共刺激结构域；cd3ζ是来源于cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0140]
在一些情况下，所述car具有式iv或iv’所示结构：l-vl-scfv-vh-h-tm-c-cd3ζ(iv)，l-vh-scfv-vl-h-tm-c-cd3ζ(iv’)，其中各
“‑”
独立为接头肽或肽键；元件l、h、tm、c和cd3ζ如上所述；scfv是靶向cs1的抗原结合域；vh是抗-cd7抗体重链可变区，vl是抗-cd7抗体轻链可变区；或者scfv是靶向cd7的抗原结合域；vh是cs1抗体重链可变区，vl是cs1抗体轻链可变区。在一些情况下，scfv是靶向cs1的抗原结合域；vh是抗-cd137抗体重链可变区，vl是抗-cd137抗体轻链可变区；或者scfv是靶向cd137的抗原结合域；vh是cs1抗体重链可变区，vl是cs1抗体轻链可变区。
[0141]
在一些情况下，car可包含本文所述的安全开关。在一些情况下，car可具有egfrt-cd7 scfv-cs1 scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ所示结构，其中egfrt是截短的egfr，作为安全开关(例如，诱导性细胞死亡部分)、cd7 scfv是通过gs接头连接的单克隆抗体的重链和轻链可变区的scfv片段，和cs1单克隆抗体的重链和轻链可变区的cs1 scfv片段。car的结构还可包含绞链、跨膜区、cd28或41bb的共刺激信号传导区，和/或cd3ζ胞内结构域。在本公开中，egfrt-cd7 scfv-cs1scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ的核酸构建体可以插入载体(例如慢病毒载体)中。载体可以在293t细胞中包装。可以将t细胞从pbmc中分选出来，激活后，可以通过crispr/cas技术敲除tcr和pd-1基因。然后用载体感染t细胞以表达car。制备的car-t细胞可用于通过流式细胞术检测car的感染效率和基因编辑效率。
[0142]
在一些情况下，car可以包括egfrt-cd137 scfv-cs1 scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ所示结构，其中egfrt是截短的egfr，作为安全开关(例如诱导性细胞死亡部分)，cd137 scfv是由gs接头连接的单克隆抗体的重链和轻链可变区的scfv片段，和cs1-scfv片段是cs1单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的scfv片段。car的结构还可以包括铰链、跨膜区、cd28或41bb的共刺激信号传导区和/或cd3ζ胞内结构域。在本公开中，可以将egfrt-cd137 scfv-cs1 scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ的核酸构建体插入载体(例如慢病毒载体)中。载体可以在293t细胞中包装。可以将t细胞从pbmc中分选出来，激活后，可以通过crispr/cas技术敲除tcr和pd-1基因。然后用载体感染t细胞以表达car。制备的car-t细胞可用于通过流式细胞术检测car的感染效率和基因编辑效率。
[0143]
在一些情况下，car包含以串联形式排列的两个抗原结合域，如图1中的car s4-1至car s4-3所示。
[0144]
在一些实施方式中，第一抗原结合域或第二抗原结合域是scfv。在一些实施方式中，从氨基末端到羧基末端，第一抗原结合域和第二抗原结合域以以下任一模式排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2，其中vh1是第一抗原结合结构结构域的重链可变结构域，vl1是第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是第二抗原结合域的重链变结构域，vl2是第二抗原结合域的轻链变结构域。例如，car可具有下式v或v’所示结构：l3-scfv1-r-scfv2-h3-tm3-c3-cd3ζ(v)；l3-scfv2-r-scfv1-h3-tm3-c3-cd3ζ(v’)，其中各
“‑”
独立地是连接肽或肽键；l3是任选的
信号肽序列；scfv1是靶向cs1的抗原结合域；r是刚性或柔性接头；scfv2是靶向cd7、cd137或bcma的抗原结合域(例如，抗体单链可变区序列)；h3是可选的铰链区；tm3是跨膜结构域；c3是共刺激结构域；cd3ζ是源于cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0145]
在一些实施方式中，第一抗原结合域或第二抗原结合域是sdab。car可具有下式vi或vi’所示结构：l3-vhh1-r-vhh2-h3-tm3-c3-cd3ζ(vi)；l3-vhh2-r-vhh1-h3-tm3-c3-cd3ζ(vi’)；其中各
“‑”
独立地是连接肽或肽键；l3是任选的信号肽序列；vhh1是靶向cs1的抗原结合域；r是刚性或柔性接头；vhh2是靶向cd7或cd137或bcma的抗原结合域(例如，单域抗体)；h3是可选的铰链区；tm3是跨膜结构域；c3是共刺激结构域；cd3ζ是来源于cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0146]
在一些情况下，car包含环状排列的两个抗原结合域，如图1中的car s3-1至car s3-3所示。在一些情况下，从氨基末端到羧基末端，第一抗原结合域和第二抗原结合域按以下任一模式排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；和(viii)vh1-vh2-vl2-vl1，其中vh1是第一抗原结合域的重链可变结构域，vl1是第一抗原结合域的轻链可变轻结构域，vh2是第二抗原结合域的重链可变结构域，vl2是第二抗原结合域的轻链可变结构域。例如，car可以具有下式vii、vii’、vii”或vii
”’
所示结构：l8-vl1-vh2-i-vl2-vh1-h8-tm8-c8-cd3ζ(vii)；l8-vh1-vl2-i-vh2-vl1-h8-tm8-c8-cd3ζ(vii’)；l8-vl2-vh1-i-vl1-vh2-h8-tm8-c8-cd3ζ(vii”)；l8-vh2-vl1-i-vh1-vl2-h8-tm8-c8-cd3ζ(vii
”’
)，其中各
“‑”
独立地是连接肽或肽键；l8是任选的信号肽序列；vh1是cs1抗体重链可变区，vl1是cs1抗体轻链可变区；vh2是cd7、cd137或bcma抗体重链可变区；vl2是抗cd7、cd137或bcma抗体轻链可变区；i是柔性接头；h8是任选的铰链；tm8是跨膜结构域；c8是共刺激结构域；cd3ζ是源于cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0147]
在一些情况下，包含两个抗原结合域的car以平行形式排列，如图1中的car s2-1至car s2-3所示。平行形式可以包括具有第一抗原结合域的第一car的全构建体和具有第二抗原结合域的第二car的完整构建体，二者相连。
[0148]
在一些实施方式中，第一抗原结合域或第二抗原结合域是scfv。平行形式的示例可以是tegfr-cs1 scfv-cd28-cd3ζ-cd7 scfv-41bb-cd3ζ。本文所示的tegfr的功能可以是作为安全开关，可以用本公开所述的其它安全开关替代。本文所述的cs1 scfv和cd7 scfv是抗原结合域的两个实例，其可被本公开所述的各种抗原结合域替代。cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。在一些情况下，接头用于连接第一car和第二car。接头可以是可切割接头。可切割接头可以是自切割肽，如2a自切割肽。
[0149]
平行形式的另一示例可以是tegfr-cs1 scfv-cd28-cd3ζ-cd137 scfv-41bb-cd3ζ。本文所示的tegfr的功能可以是作为安全开关，可以用本公开所述的其它安全开关替代。本文所述的cs1 scfv和cd137 scfv是抗原结合域的两个实例，其可被本公开所述的各种抗原结合域替代。cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。在一些情况下，接头用于连接第一car和第二car。接头可以是可切割接头。可切割接头可以是自切割肽，如2a自切割肽。
[0150]
在一些实施方式中，第一抗原结合域或第二抗原结合域是sdab。平行形式的一个示例可以是tegfr-cs1 sdab-cd28-cd3ζ-cd7 sdab-41bb-cd3ζ。本文所示的tegfr的功能可以是作为安全开关，可以用本公开所述的其它安全开关替代。本文所述的cs1 sdab和cd7 sdab是抗原结合域的两个实例，其可被本公开所述的各种抗原结合域替代，例如cd137靶向的sdab。cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。在一些情况下，接头用于连接第一car和第二car。接头可以是可切割接头。可切割接头可以是自切割肽，如2a自切割肽。
[0151]
平行形式的另一示例可以是tegfr-cs1 sdab-cd28-cd3ζ-cd137 sdab-41bb-cd3ζ。本文所示的tegfr的功能可以是作为安全开关，可以用本公开所述的其它安全开关替代。本文所述的cs1 sdab和cd137 sdab是抗原结合域的两个实例，其可被本公开所述的各种抗原结合域替代，例如cd137靶向的sdab。cd28可以是跨膜结构域的实例，并且可以用本文所述的其它跨膜结构域代替。41bb可以是共刺激结构域的示例，并且可以用本文描述的其它共刺激结构域代替。在一些情况下，接头用于连接第一car和第二car。接头可以是可切割接头。可切割接头可以是自切割肽，如2a自切割肽。
[0152]
在一些情况下，本文提供的car是多价car，如图1中car s5-1至s5-4和car s6-1至s6-4所示的包含三个抗原结合域的三特异性car(tri-car)。
[0153]
在一些情况下，三特异性car的第一抗原结合域靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，第一抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0154]
在一些情况下，三特异性car的第二抗原结合域靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，第二抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
scfv-41bb-cd3ζ；(v)cs1 scfv-cd7 scfv-cd28-cd3ζ-c+bcma scfv-41bb-cd3ζ；(vi)cs1 scfv-cd137 scfv-cd28-cd3ζ-c+bcma scfv-41bb-cd3ζ；(vii)cs1 scfv-bcma scfv-cd28-cd3ζ-c+cd19 scfv-41bb-cd3ζ；和(viii)bcma scfv-cd19 scfv-cd28-cd3ζ-c+cs1 scfv-41bb-cd3ζ，如图1中car s5-1至s5-4和car s6-1至s6-4所示。本公开还考虑了编码单个car、双特异性car或三特异性car的核酸分子。
[0159]
在一些实施方式中，核酸可以包括编码一个或多个嵌合抗原受体(car)的第一序列，其中car可以包括单价或多价(例如二价)抗原结合域，并且其中一个或多个car中的各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0160]
所述抗原结合域可靶向选自以下的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。在一些实施方式中，所述抗原结合域靶向cs1。在一些实施方式中，所述抗原结合域靶向cd137。
[0161]
在一些实施方式中，核酸可以包括编码一个或多个嵌合抗原受体(car)的第一序列，其中car可以包括(i)第一抗原结合域，其连接到(ii)第二抗原结合域，其中一个或更多个car中的各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0162]
所述第一抗原结合域可靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述第一抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0163]
在一些情况下，所述第二抗原结合域可靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、
kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述第二抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0164]
在一些实施方式中，核酸可以包括编码一个或多个嵌合抗原受体(car)的第一序列，其中car可以包括(i)第一抗原结合域，其连接到(ii)第二抗原结合域，(iii)第三抗原结合域，其中一个或更多个car中的各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0165]
所述第一抗原结合域可靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述第一抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0166]
在一些情况下，所述第二抗原结合域可靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述第二抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0167]
在一些情况下，所述第三抗原结合域可靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、
tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，所述第三抗原结合域靶向cs1、cd7、cd137、bcma或cd19。
[0168]
核酸分子可以进一步包含编码增强子部分的第二序列，当在细胞中表达时，该增强子部分可以增强car的一种或多种活性。该增强子部分可以选自下组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。核酸分子可进一步包含编码诱导性细胞死亡部分的第二序列，当在细胞中表达时，所述诱导性细胞死亡部分可在将所述诱导性细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时导致细胞死亡。诱导性细胞死亡部分可选自rapacasp9、icasp9，hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd 19、rqr8和egfrt。
[0169]
核酸分子还可以包括侧接第一序列和第二序列的第三序列，其中第三序列可以编码可切割接头。所述可切割接头可以是自切割肽。
[0170]
核酸分子还可以包括调节第一序列和/或第二序列表达的调节序列。
[0171]
本公开中还考虑了包含本文所述的核酸分子的试剂盒。
[0172]
在一些情况下，可以将编码本文描述的car的核酸递送到免疫细胞中，用于表达car以产生工程改造的细胞。
[0173]
来源细胞
[0174]
本公开提供了工程改造的细胞，例如工程改造的免疫细胞。工程改造的免疫细胞可以从获自受试者的样品中分离的细胞(例如免疫细胞)制备。工程改造的免疫细胞可以由细胞系细胞制备。用于制备工程改造的免疫细胞的免疫细胞可以是t细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞或巨噬细胞。用于制备工程改造的免疫细胞的免疫细胞可以是先天淋巴细胞(ilc)。
[0175]
用于制备工程改造的免疫细胞的免疫细胞可以是干细胞。干细胞可以是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。
[0176]
免疫细胞可包括t细胞受体(tcr)。tcr可以是免疫细胞的内源性tcr。在一些情况下，可以失活内源性tcr。例如，可以失活编码tcr亚基的基因。例如，免疫细胞可以是tcr受损的α-βt细胞，从而免疫细胞可以避免gvhd。再例如，可以利用抑制剂抑制内源性tcr的功能，例如tcr衍生肽、融合氨基酸序列衍生的肽和各种病毒的其他蛋白区域、抗体和小分子抑制剂。可从中衍生tcr抑制肽的病毒包括但不限于严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、赛米里疱疹病毒(hvs)、人疱疹病毒6(hhv-6)、拉萨病毒(lasv)、淋巴细胞性脉络膜炎病毒(lcmv)、莫佩亚病毒(mopv)、塔卡里布病毒(tacv)、弗云德鼠白血病病毒(mlv)；人嗜t淋巴细胞病毒1型(htlv-1)；蜘蛛猴疱疹病毒(hva)；马尔堡病毒(marv)；苏丹埃博拉病毒(sebov)；和扎伊尔埃博拉病毒(zebov)。
[0177]
在一些情况下，免疫细胞可以是含有可能不会引起gvhd反应的tcr的t细胞。例如，免疫细胞可以是具有tcr的α-βt细胞，所述tcr可以识别特定抗原，例如病毒特异性抗原、肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。再例如，免疫细胞可以是γ-δt细胞或天然杀伤t(nkt)细胞。再例如，免疫细胞可以是由抗原特异性t细胞(例如抗原特异性细胞毒性t细
胞)产生的诱导多能干细胞。免疫细胞可以是脐血t细胞。
[0178]
免疫细胞可包括细胞表面标志物。细胞表面标志物可以是免疫细胞抗原。可以失活用于制备工程改造的免疫细胞的免疫细胞的编码免疫细胞抗原的基因。免疫细胞抗原的例子包括但不限于：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ和slamf7。例如，在一些情况下，编码免疫细胞的cd7的基因失活。在一些情况下，编码免疫细胞的cd3的基因失活。在一些情况下，编码免疫细胞的cd137的基因失活。
[0179]
可以从受试者的样品中分离免疫细胞。受试者可以是健康的捐献者。受试者可能患有某种疾病(例如癌症等疾病)。样品可以是体液或组织，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些情况下，样品包括nk细胞、nkt细胞、t细胞或t细胞祖细胞。例如，在一些情况下，样品是脐带血样品、外周血样品(例如，单核细胞部分)或来自受试者的包括多能干细胞的样品。在一些方面，可以培养来自受试者的样品以产生诱导多能干(ips)细胞，这些细胞用于产生nk细胞、nkt细胞或t细胞。细胞样品可以从受试者直接培养，也可以先冻存再使用。在一些方面，获得细胞样品包括收集细胞样品。在其它方面，样品由第三方获得。在进一步的方面，可以处理来自受试者的样品以纯化或富集样品中的t细胞或t细胞祖细胞。例如，可以对样品进行梯度纯化、细胞培养选择和/或细胞分选(例如，通过荧光激活细胞分选(facs))。
[0180]
免疫细胞可以是nk细胞。nk细胞可从外周血、脐血或本文所述的其他来源获得。nk细胞可以来源于诱导多能干细胞。
[0181]
在一些实施方式中，可以在本文提供的方法中使用的细胞对于给定因子可以是正的或负的。在一些实施方式中，在本文提供的方法中使用的细胞可以是cd3+细胞、cd3-细胞、cd5+细胞、cd5-细胞、cd7+细胞、cd7-细胞、cd14+细胞、cd14-细胞、cd8+细胞、cd8-细胞、cd103+细胞、cd103-细胞、cd11b+细胞、cd11b-细胞、bdca1+细胞、bdca1-细胞、an l-selectin+细胞、an l-selectin-细胞、cd25+,cd25-细胞、cd27+,cd27-细胞、cd28+细胞、cd28-细胞、cd44+细胞、cd44-细胞、cd56+细胞、cd56-细胞、cd57+细胞、cd57-细胞、cd62l+细胞、cd62l-细胞、cd69+细胞、cd69-细胞、cd45ro+细胞、cd45ro-细胞、cd127+细胞、cd127-细胞、cd132+细胞、cd132-细胞、il-7+细胞、il-7-细胞、il-15+细胞、il-15-细胞、凝集素样受体g1阳性细胞、凝集素受体g1阴性细胞或其分化或去分化细胞。由细胞表达的因子的示例并非旨在限制，本领域技术人员将理解，细胞对于本领域已知的任何因子可以是阳性或阴性的。在一些实施方式中，细胞对于两个或多个因子可以是阳性的。例如，细胞可以是cd4+和cd8+。在一些实施方式中，细胞对于两个或多个因子可以是阴性的。例如，细胞可以是cd25-、cd44-和cd69-。在一些实施方式中，细胞可以对一个或多个因子是阳性的，而对一个或者多个因子则是阴性的。例如，细胞可以是cd4+和cd8-。在一些方面，本文提供的细胞标志物可用于选择、富集或消耗细胞。在一些方面，富集包括选择单核细胞部分。在一些方面，富集包括从单核细胞部分中分选免疫细胞。在一些实施方式中，可以选择具有或不具有一个或多个给定因子的细胞(例如，可以基于一个或多个因子的存在或不存在来分离细胞)。在一些实施方式中，所选细胞也可以在体外转导和/或扩增。所选择的细胞可以先在体
外扩增再输注。在一些实施方式中，可以用本文提供的载体转导选择的细胞。应当理解，在本公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任意细胞的混合物(例如，两种或多种不同的细胞)。例如，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是cd4+细胞和cd8+细胞的混合物。在另一示例中，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是cd4+细胞和幼稚细胞的混合物。在一些情况下，细胞可以是由cd45ro(-)、ccr7(+)、cd45ra(+)，cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+和il-7rα+组成的干记忆tscm细胞，干记忆细胞还可以表达cd95、il-2rβ、cxcr3和lfa-1，并显示出干记忆细胞特有的多种功能属性。本文提供的细胞还可以是包含l-选择素和ccr7的中央记忆tcm细胞，其中中央记忆细胞可以分泌，例如il-2，但不能分泌ifnγ或il-4。细胞也可以是包含l-选择素或ccr7的效应记忆tem细胞，并产生例如ifnγ和il-4等效应细胞因子。在一些情况下，可以将细胞引入受试者。例如，细胞可以是t细胞和nk细胞的组合。在其他情况下，体可以是幼稚细胞和效应细胞的组合。细胞可以是til。
[0182]
来源免疫细胞可以是t细胞。t细胞可以是α-βt细胞或γ-δt细胞。t细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施方式中，可以使用各种t细胞系。在本公开的某些实施方式中，可以采用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如ficolltm分离，从从受试者收集的单位血液中获得t细胞。在一些实施方式中，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方式中，可洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本公开的一些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在另一实施方式中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或者可能缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在没有钙存在下的初始活化步骤可能导致活化放大。根据制造商的说明，洗涤步骤可以通过诸如使用半自动“流通”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate或haemonetics cell saver 5)等方法来完成。洗涤后，可将细胞重悬在各种生物相容性缓冲液中，例如无ca2+、无mg2+的pbs、plasmalyte a或其它含或不含缓冲液的盐水溶液中。或者，可以去除单采样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬在培养基中。
[0183]
在另一实施方式中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如通过percolltm梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离t细胞。可通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的t细胞亚，如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t细胞。例如，在一个实施方式中，通过与抗-cd3/抗-cd28(即3
×
28)缀合的珠(例如cd3/cd28t)孵育足以阳性选择所需t细胞的时间来分离t细胞。在一个实施方式中，时间为约30分钟。在另一实施方式中，时间的范围从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一实施方式中，时间为至少1、2、3、4、5或6小时。在又一优选实施方式中，时间为10至24小时。在一些实施方式中，孵育时间为24小时。为了从白血病患者中分离t细胞，采用更长的培养时间，如24小时，可以提高细胞产量。与其他细胞类型相比，在t细胞较少的任何情况下，可以采用更长的培养时间来分离t细胞。此外，采用更长的孵育时间可以提高捕获cd8+t细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长t细胞与cd3/cd28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与t细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或过程中的其他时间点优先选择t细胞亚。此外，通过增加或减少珠或其他表面上的抗-cd3和/或抗-cd28抗
体的比例，可以在培养开始时或在其他期望的时间点优先选择t细胞亚。在一些情况下，也可以采用多轮选择。在某些实施方式中，执行选择过程并在激活和扩增过程中使用“未选择”细胞可能是有用的。“未选择”的细胞也可以作进一步的选择。
[0184]
通过负选择富集t细胞可以用针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。一种示例性方法可以是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些实施方式中，可能需要富集或正选择通常表达cd4+、cd25+、cd62lhi、gitr+和foxp3+的调节性t细胞。或者，在某些实施方式中，t调节细胞被抗c25缀合珠或其他类似的选择方法耗尽。
[0185]
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞，细胞和表面(例如，颗粒如珠)的浓度可以变化。在某些实施方式中，可能需要显著减少珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在另一实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方式中，使用75、80、85、90、95或1亿细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增提高。此外，使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达感兴趣靶抗原的细胞，例如cd28阴性t细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血、肿瘤组织等)中捕获细胞。这样的细胞可能具有价值，并且是期望获得的。例如，利用高浓度的细胞可以更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+t细胞。
[0186]
在相关实施方式中，可以使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面(例如，颗粒如珠)的混合物，最大程度降低颗粒和细胞之间的相互作用。这种方法可以选择要与颗粒结合的表达大量所需抗原的细胞。例如，cd4+t细胞表达更高水平的cd28，并且相比于稀释浓度的cd8+t细胞更有效地被捕获。在一些实施方式中，使用的细胞浓度为5
×
106/ml。在其它实施方式中，使用的浓度可以为约1
×
105/ml至1
×
106/ml，以及其间的任何整数值。在其它实施方式中，细胞可以在2-10℃或室温下，在旋转器上以不同速度孵育不同时间长度。
[0187]
用于刺激的t细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除细胞中的粒细胞和一定程度上的单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在文本中是有用的，但一种方法涉及使用含有20％二甲基亚砜和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基，或31.25％血浆溶解剂-a、31.25％葡萄糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40与5％葡萄糖、10％人血清白蛋白、和7.5％dmso的培养基或含有例如hespan和血浆溶解剂a的其他合适的细胞冷冻介质，然后将细胞冷冻至-80℃，速度为1
°
/min，储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它受控冻结方法以及在-20℃或液氮中的不受控冷冻。
[0188]
在一些实施方式中，冻存的细胞如本文所述解冻和洗涤，并在采用本公开的方法活化之前在室温下静置一小时。
[0189]
在一些实施方式中，在任何数量的相关模式之前，从受试者的血液样本或单
采液中分离细胞，所述模式包括但不限于药物，例如那他珠单抗、依法单抗、抗病毒药物、化疗、放疗、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506、抗体或其它免疫消融剂，如campath、抗-cd3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢素、fk505、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228和放疗。这些药物或抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢素和fk506)，或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liu等.,cell66:807-815,1991；henderson等.,immun.73:316-321,1991；bierer等.,curr.opin.immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，为患者分离细胞并冷冻以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外照射(xrt)、环磷酰胺或抗体如okt3或campath的t细胞消融结合(例如，之前、同时或之后)使用。在另一实施方式中，在b细胞消融(例如与cd20反应的试剂，如利妥昔单抗)之后，先分离细胞再冷冻以便后续用于。
[0190]
工程改造的免疫细胞
[0191]
本文提供的工程改造的免疫细胞可表现出针对肿瘤细胞的活性增强，但副作用，例如gvhd，和/或移植物宿主排异(hvg)降低。工程改造的免疫细胞可以靶向疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物)，同时抑制宿主免疫细胞。可以失活工程改造的免疫细胞的一个或多个内源性基因(例如，编码tcr亚基的基因、编码mhc分子亚基的基因或编码细胞表面标志物的基因)。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包括单个car。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包含第一car和第二car，各car靶向不同的抗原。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包含具有第一抗原结合域和第二抗原结合域的car。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包含第一car、第二car和第三car，各靶向不同的抗原。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包含具有第一抗原结合域、第二抗原结合域和第三抗原结合域的car。
[0192]
工程改造的免疫细胞可包含一种或多种包含结合部分的嵌合抗原受体(car)。
[0193]
在一些情况下，结合部分可以包含抗原结合域，其可以靶向免疫细胞抗原和疾病相关抗原。car还可以包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些情况下，抗原结合域靶向cs1。在一些情况下，抗原结合域靶向cd137。工程改造的免疫细胞还可以包含能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。
[0194]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性抗原可以在工程改造的免疫细胞中失活。在一些情况下，编码内源性抗原的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。在一些情况下，编码内源性cs1的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。在一些情况下，编码内源性cd137的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。
[0195]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。在一些情况下，编码工程改造的免疫细胞内源性tcr亚基基因可以失活，从而失活内源性tcr。编码亚基的基因可以是tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ或cd3ζ。
[0196]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子可以失活。在一些情况下，内源性mhc分子包含mhc i类分子和mhc ii类分子。在一些情况下，编码mhc i分子的基因可以失活。编码mhc i分子的基因包括但不限于hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。在一些实施方式中，可以敲除或部分敲除工程改造的免疫细胞的一个或多个内源性hla基因的表达。例如，可敲除或部分敲除工程改造的免疫细胞的hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f
和hla-g中的任一种或多种。在一些情况下，可敲除或部分敲除内源性hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g，以降低t细胞杀伤活性。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g中的任一种或多种可以保持完整。在一些情况下，可以失活所述工程改造的免疫细胞中的内源性mhc分子的亚基，使得内源性mhc分子失活。在一些情况下，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。在一些情况下，敲除或部分敲除所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基。
[0197]
在一些情况下，可过表达工程改造的免疫细胞的杀伤/吞噬细胞抑制剂。在其它一些情况下，可以通过共同表达杀伤/吞噬细胞抑制剂来敲除内源性hla。例如，可以通过共同表达杀伤/吞噬细胞抑制剂来敲除b2m。杀伤/吞噬细胞抑制剂可抑制对工程改造的免疫细胞的免疫反应。杀伤/吞噬细胞抑制剂包括但不限于cd47、cd24、fasl、pdl1或其功能域。
[0198]
在一些情况下，可以失活工程改造的免疫细胞的内源性抗原、内源性tcr和内源性mhc分子中的任意两种或多种。在一些情况下，可以失活工程改造的免疫细胞的内源性抗原和内源性tcr。在一些情况下，可以失活工程改造的免疫细胞的内源性tcr和内源性mhc分子。在一些情况下，可以失活工程改造的免疫细胞的内源性抗原和内源性mhc分子。在一些情况下，抗原结合域靶向cs1，并且工程改造的免疫细胞的内源性cs1和内源性tcr可以被激活，工程改造的免疫细胞中的内源tcr和内源性b2m可以失活，或者工程改造的免疫细胞内的内源性cs 1和内源性b2m可以失活。在一些情况下，抗原结合域靶向cd137，并且工程改造的免疫细胞的内源性cd137和内源性tcr可以被激活，工程改造的免疫细胞的内源性tcc和内源性b2m可以失活，或者工程改造的免疫细胞的内源性cd137和内源性b2m可以失活。
[0199]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性抗原、内源性tcr和内源性mhc分子可以失活。在一些情况下，抗原结合域靶向cs1，工程改造的免疫细胞的内源性抗原cs1、内源性tcr和内源性b2m可以全部失活。在一些情况下，抗原结合域靶向cd137，并且工程改造的免疫细胞的内源性抗原cd137、内源性tcr和内源性b2m可以全部失活。当本文公开的car靶向免疫细胞的两种或多种内源性抗原时，每种内源性抗原可被单独失活。在一些情况下，内源性抗原都在本文公开的工程改造的免疫细胞上被激活。
[0200]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞可以表现出(i)在有与工程改造的免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源t细胞、异源nk细胞以及异源t细胞和异源nk细胞的混合物)存在下，体外保持存活的程度增加，(ii)扩增程度增加，或(iii)与不灭活tcr、mhc分子和/或免疫细胞抗原的包含一种或多种car的其它工程改造的免疫细胞相比，对包含抗原的靶细胞的细胞毒性增强。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的特征可以表现为以下的两种或多种：(i)在有与工程改造的免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源t细胞、异源nk细胞以及异源t细胞和异源nk细胞的混合物)存在下，体外保持存活的程度增加，(ii)扩增程度增加，和(iii)细胞毒性增强。
[0201]
结合部分可以包括能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。一个或多个car中各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。工程改造的免疫细胞还可以包括能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子可以失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免
疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子中的任意两种或多种可以失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子可以全部失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞可以表现出(i)在有与工程改造的免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源t细胞、异源nk细胞以及异源t细胞和异源nk细胞的混合物)存在下，体外保持存活的程度增加，(ii)扩增程度增加，或(iii)与不灭活tcr、mhc分子和/或免疫细胞抗原的包含一种或多种car的其它工程改造的免疫细胞相比，对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞的细胞毒性增强。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的特征可以表现为以下的两种或多种：(i)在有与工程改造的免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源t细胞、异源nk细胞以及异源t细胞和异源nk细胞的混合物)存在下，体外保持存活的程度增加，(ii)扩增程度增加，和(iii)细胞毒性增强。
[0202]
工程改造的免疫细胞可包含多特异性car。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包括靶向免疫细胞抗原和疾病相关抗原的双特异性car。双特异性car的两个抗原结合域可以按本公开中描述的任何形式排列，例如平行形式、环状形式和串联形式。例如，本文所述的工程改造的免疫细胞可包含单个嵌合抗原受体(car)，其包含(i)特异性结合cd7的第一抗原结合域和(ii)能够结合cs1的第二抗原结合域。在另一实例中，本文所述的工程改造的免疫细胞可包含单个嵌合抗原受体(car)，其包含(i)特异性结合cd137的第一抗原结合域和(ii)能够结合cs1的第二抗原结合域。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子可以失活。在一些情况下，编码内源性cd7和/或cd137的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子中的任意两种或多种可以失活。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子可以全部失活。
[0203]
第一抗原结合域或第二抗原结合域可以是抗体或其片段，例如scfv或单域抗体。本文描述的疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。肿瘤相关抗原的例子包括但不限于：bcma、vegfr2、cd19、cd20、cd30、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd52、cd56、cd80、cd86、cd81、cd123、cd171、cd276、b7h4、cd133、egfr、gpc3、pmsa、cd 3、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2、erbb3 her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、cd44v6、cea、ca125、cd151、ctla-4、gitr、btla、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、hvem、mage-a、间皮素、ny-eso-1、psma、rank、ror1、tnfrsf4、cd40、cd137、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、tcra、tcrp、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、robl、卷曲受体、ox40、cd79b、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和notch-1-4。在一些情况下，肿瘤相关抗原包含cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、
ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、cs1、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r或trop-2。
[0204]
免疫细胞抗原选自下组：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ和slamf7。在一些情况下，免疫细胞抗原是cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd69、cd100、cd122、cd132、cd137、cd161、cd159a、cd159c、cd279、cd314、cd319(cs1)、tcrα或tcrβ。在一些情况下，免疫细胞抗原是cd2、cd3、cd5、cd7或cd137。在一些情况下，免疫细胞抗原是cd7。在一些情况下，免疫细胞抗原是cs1。在一些情况下，免疫细胞抗原是cd137。可以将增强子部分配置为组成型增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。可以将增强子部分配置为组成型上调工程改造的免疫细胞的一个或多个胞内信号传导通路。所述一个或多个胞内信号传导通路可以是一个或多个细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡而自我激活。增强子部分可以通过自二聚而自我激活。
[0205]
增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自下组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
[0206]
工程改造的免疫细胞可进一步包含诱导性细胞死亡部分，该诱导性细胞死亡部分可在与细胞死亡激活剂接触时实现工程改造的免疫细胞的自杀。诱导性细胞死亡部分可选自以下组：rapacasp9、icasp9、hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8和egfrt。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是egfrt，细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，细胞死亡激活剂是gcv。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是icasp9，细胞死亡激活剂是ap1903。细胞死亡激活剂可以包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
[0207]
本文提供的工程改造的免疫细胞可包含嵌合多肽，其包含(i)能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)诱导性细胞死亡部分，其能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程改造的免疫细胞死亡，其中所述增强子部分与所述诱导性细胞死亡部分连接。在一些情况下，增强子部分和诱导性部分可以通过接头连接。接头可以是可切割接头，例如自切割肽。工程改造的免疫细胞可进一步包含一种或多种包含结合部分的嵌合多肽受体(cpr)，其中所述结合部分包括(i)第一抗原结合域，所述第一抗原结合域在施用到受试者体内时抑制或减少受试者对所述工程改造的免疫细胞的免疫反应，以及(ii)能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。一个或多个cpr中的单个cpr可以包括(i)第一抗原结合域、(ii)第二抗原结合域，或(iii)第一抗原结合域和第二抗原结合域两者。一个或多个cpr的cpr可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些情况下，工程改造的免疫细胞中的一个或多个cpr是一个或多个嵌合抗原受体(car)或工程改造的t细胞受体(tcr)。在一些情况下，工程改造的免疫细胞包括car和工程改造的
tcr二者。工程改造的tcr可以是tcr融合蛋白。例如，tcr融合蛋白可以包括融合到tcr复合物的一个或多个亚基的异源抗原结合域。在一些情况下，tcr融合蛋白可以包括tcr亚基，其包含tcr胞外结构域和tcr胞内结构域的至少一部分；以及包含抗原结合域的抗体结构域，其中tcr亚基和抗体结构域相连。当在t细胞中表达时，tcr融合蛋白可以掺入tcr复合物中。在一些情况下，tcr融合蛋白可以进一步包含tcr跨膜结构域。tcr胞外结构域、tcr胞内结构域或tcr跨膜结构域可衍生自tcrα链、tcrβ链、tcr-γ链、tcr-δ链、cd3ε、cd3γ、cd3δ或cd3ζ。在一些情况下，包含工程改造的tcr的工程改造免疫细胞的内源性tcr失活。在一些情况下，包含失活内源性tcr的工程改造免疫细胞可能不会引起gvhd。例如，编码内源性tcr亚基的基因可以失活。再例如，编码内源性tcr亚基的基因可能发生突变，从而可能不形成内源性tcr。
[0208]
本文提供的工程改造的免疫细胞可包含嵌合多肽，其包含(i)能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)能够在嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现工程改造的免疫细胞死亡的诱导性细胞死亡部分。在一些情况下，增强子部分与诱导性细胞死亡部分相连。一个或多个嵌合抗原受体(car)可包含结合部分。所述结合部分可以包括(i)第一抗原结合域，当施用到受试者体内时，所述第一抗原结合域抑制或减少受试者对工程改造的免疫细胞的免疫反应，以及(ii)能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。在一些情况下，一个或多个car中的单个car包括(i)第一抗原结合域或(ii)第二抗原结合域。在一些情况下，一个或多个car的单个car包括第一抗原结合域和第二抗原结合域二者。在一些情况下，一个或多个car的每个car还包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0209]
工程改造的免疫细胞的第一抗原结合域可以结合免疫细胞抗原。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原可以失活。在一些情况下，编码内源性免疫细胞抗原的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。在一些情况下，编码内源性cs1或cd137的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活(例如沉默或敲除)。
[0210]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。在一些情况下，编码工程改造的免疫细胞的内源性tcr亚基的基因可以失活，从而内源性tcr失活。编码亚基的基因可以是tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ或cd3ζ。
[0211]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子可以失活。在一些情况下，内源性mhc分子包括mhc i类分子和mhc ii类分子。在一些情况下，编码mhc i分子的基因失活。编码mhc i分子的基因包括但不限于hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。在一些实施方式中，可以敲除或部分敲除工程改造的免疫细胞的一个或多个内源性hla基因的表达。例如，可敲除或部分敲除工程改造的免疫细胞的hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g中的任一或多种。在一些情况下，可敲除或部分敲除内源性hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g以降低t细胞杀伤活性。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g中的任一种或多种可以保持完整。
[0212]
在一些情况下，所述工程改造的免疫细胞中的内源性mhc分子的亚基可以失活，使得内源性mhc-分子无活性。在一些情况下，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。在一些情况下，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基被敲除或部分敲除。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的杀伤/吞噬细胞抑制剂可能过表达。
[0213]
在其他一些情况下，内源性hla可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达而被敲
除。例如，可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达而敲除b2m。杀伤/吞噬细胞抑制剂可抑制对工程改造的免疫细胞的免疫反应。杀伤/吞噬细胞抑制剂包括但不限于cd47、cd24、fasl、pdl1或其功能域。
[0214]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子中的任意两种或多种可以失活。在一些情况下，可激活工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原和内源性tcr，工程改造的免疫细胞中的内源性tcr和内源性mhc分子可失活，或工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原或内源性mhc分子可失活。
[0215]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性tcr和内源性mhc分子可以全部失活。
[0216]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)失活。可以采用各种方法失活内源性tcr。例如，编码内源性tcr亚基基因可以失活，使得内源性tcr失活。编码亚基的基因可以是tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ或cd3ζ。
[0217]
嵌合多肽可以包括或可以不包括侧接增强子部分和诱导性细胞死亡部分的任何自切割肽。可以将增强子部分配置为组成型增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。可以将增强子部分配置为组成型上调工程改造的免疫细胞的一个或多个胞内信号传导通路。所述一个或多个胞内信号传导通路可以是一个或多个细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡聚而自激活。增强子部分可以通过自二聚而自激活。
[0218]
本文描述的嵌合多肽可以是分泌蛋白。嵌合多肽可以是胞内蛋白。嵌合多肽可以是跨膜蛋白。增强子部分或诱导性细胞死亡部分可以包含在跨膜蛋白的胞外域中。增强子部分或诱导性细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞内域中。增强子部分可包含在跨膜蛋白的胞内域中，而诱导性细胞死亡部分可包含于跨膜蛋白质的胞外域中。增强子部分可以包含在跨膜蛋白的胞外域中，而诱导性细胞死亡部分可以包含于跨膜蛋白的胞内域中。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。例如，增强子部分可选自：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。诱导性细胞死亡部分可选自：rapacasp9、icasp9，hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd 19、rqr8和egfrt。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是egfrt，细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，细胞死亡激活剂是gcv。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是icasp9，细胞死亡激活剂是ap1903。细胞死亡激活剂可以包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
[0219]
工程改造的免疫细胞可以是car-t细胞。car-t细胞可表达靶向cs1或cd137的car。内源性cs1或cd 137基因的表达可在car-t中沉默。car可以是靶向cs1和cd7，或者靶向cs2和cd137的单个car。car可以包括靶向cs3的第一car和靶向cd7或cd137的第二car。car-t细胞可以具有以下一个或多个特征：(a)cs1、cd7和/或cd137基因的表达在car-t中沉默；(b)tcr基因的表达在car-t细胞中沉默；(c)car-t细胞表达外源性细胞自杀元件(例如诱导性细胞死亡部分)；d)mhc基因的表达在car-t细胞中沉默。
[0220]
工程改造的免疫细胞可表达car和/或外源性tcr，car和或外源性tcr靶向cs1、cd137、cs1和cd7或cs1和cd 137。工程改造的免疫细胞可以包括增强的细胞因子相关信号
传导通路。细胞因子相关的信号传导通路可以包括选自下组的细胞因子的相关信号传导通路：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21或其组合。增强细胞因子相关信号传导通路可以包括引入编码细胞因子和/或其受体的基因；上调编码细胞因子和/或其受体的基因；或外源性加入细胞因子、引入的细胞因子受体或其组合。工程改造的免疫细胞可以是car-t细胞，其具有选自下组的一种或多种特征：(a)表达内源性tcr的基因沉默；(b)表达细胞自杀元件；(c)内源性mhc分子正常表达；(d)表达内源性mhc的基因沉默或部分沉默；(e)cs1、cd7和/或cd137基因的表达在car-t细胞中沉默。
[0221]
工程改造的免疫细胞可以包括靶向肿瘤细胞标志物的car或外源性tcr。工程改造的免疫细胞可以包括靶向t细胞或nk细胞的物质。例如，工程改造的免疫细胞可以包括靶向t细胞和/或nk细胞的car。工程改造的免疫细胞可包括靶向(i)肿瘤细胞标志物和(ii)t细胞和/或nk细胞标志物两者的双特异性car。在一些情况下，这种物质是抗体。靶向t细胞和nk细胞二者的抗体可以是th-69、3a1e、3a1f、t3-3a1、rft2、sdz214-380(sdzchh380)、cd7-6b7、124-1d1、4h9、rpa-2.10、ts1/8、okt11、ab75、3e11、bh1、lo-cd2a、oti3b3、oti3e3 oti1f1、埃罗妥珠单抗、1b9、1g10、24.1、162.1、4b4-1、bbk-2、0.n.185、g-1、epr20238、oti5h5、oti7f9、abm3d3.2e8、abm2b2.1a5、5f8或jg1.6a。
[0222]
本文提供的car-t细胞可以是通用car-细胞。car-t细胞可表达靶向肿瘤细胞标志物的嵌合抗原受体car，t细胞受体与pd-1的结合受抑制。car-t细胞可靶向cs1。可以通过基因编辑技术敲除本文提供的car-t细胞中的内源性tcr表达。敲除car-t细胞的内源性tcr后，在异体输注过程中，正常细胞可能无法被car-t识别和杀伤。gvhd反应可能受抑制。此外，通过cs1靶向肿瘤细胞，同时通过cs1消除宿主t细胞和/或nk细胞，可以避免宿主对抗移植物(hvg)和/或nk杀伤，并提高受者中同种异体car-t细胞的存活和抗肿瘤效果。car-t还可以包括自杀基因开关(例如诱导性细胞死亡部分)。可以通过打开自杀基因开关(例如激活剂与诱导性细胞死亡部分的结合)来灭活或去除car-t细胞，以减少car-t的副作用。
[0223]
例如，本文提供的car可以具有cs1 scfv-cd7 scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ所示结构，其中cd7 scfv片段是单克隆3a1e抗体，重链可变区和轻链可变区通过gs接头连接，cs1 scfv片段是通过gs接头连接的抗cs1抗体的重链和轻链可变区。car还可以包括串联的铰链区和跨膜区、人cd28和/或41bb胞内共刺激元件以及人cd3细胞内结构域。在本公开的一些情况下，可以将car构建体cs1 scfv-cd7 scfv-绞链-tm-cd28/41bb-cd3ζ的基因片段插入慢病毒载体中，并且可以将重组载体在293t细胞中包装成病毒颗粒。为了制备通用的car-t细胞，可以从外周血单个核细胞中分离t细胞，激活后，可以通过基因编辑技术(例如crispr/cas技术)敲除一些内源性基因(例如cs1、tcr和pd-1基因)。随后，t细胞可以被含有本文描述的car构建体的病毒颗粒感染以表达car。制备的car-t细胞可用于通过流式细胞术检测car的感染效率和基因编辑效率。
[0224]
工程改造的免疫细胞可具有本文描述的一个或多个特征：(a)工程改造的免疫细胞的内源性cs1基因表达沉默；(b)工程改造的免疫细胞的pd-1基因表达沉默；(c)工程改造的免疫细胞的tcr基因表达沉默；(d)工程改造的免疫细胞表达细胞因子或细胞因子受体复合物，并且pstat5信号传导水平上调；(e)工程改造的免疫细胞表达外源性诱导性细胞死亡部分；(f)工程改造的免疫细胞中的第一car和/或第二car与诱导性细胞死亡部分共表达；(g)工程改造的免疫细胞的mhc基因表达沉默。
[0225]
工程改造的免疫细胞可包括两个不同的car，每个car具有靶向不同抗原的不同抗原结合域。工程改造的免疫细胞可包括单个car，其进一步包括靶向两种不同抗原的两个抗原结合域。在一些情况下，第一car和/或第二car通过自切割元件与诱导性细胞死亡部分和/或增强子部分连接。在一些情况下，增强子部分是细胞因子或细胞因子复合物。细胞因子或细胞因子复合物的实例包括il2、il7、il15、膜结合的il15(mbil15或mb15)和组成型激活细胞因子受体，如il7受体(c7r)。本文所用的“mbil”和“mb”可互换地用于指膜结合白介素因子，例如mbil7或mb7，以及mbil17或mb17。
[0226]
本文所述的工程改造的免疫细胞可具有以下特征：(a)工程改造的免疫细胞表达car和/或外源性tcr，并且所述car和和/或外源性tcr靶向肿瘤细胞标志物；和(b)细胞因子相关信号传导通路增强。工程改造的免疫细胞可以是(i)嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)；(ii)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)；或(iii)外源性t细胞受体(tcr)t细胞(tcr-t细胞)。工程改造的免疫细胞可以是car-t细胞，优选通用car-t(ucar-t细胞)。本文所用的“细胞因子相关信号传导通路”是指由细胞因子与相应受体结合启动的信号传导通路，将胞外信号转化为胞内信号，然后通过信号级联放大、分散和调节。可以产生一系列细胞反应。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括选自下组的细胞因子的相关信号传导通路：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、25或其组合。
[0227]
工程改造的免疫细胞可以包括双特异性car(或双car)。例如，双特异性car可以包括第一抗原结合域和第二抗原结合域二者。第一抗原结合域和第二抗原结合域可以通过接头连接。接头可以不包括自切割肽。第一抗原结合域或第二抗原结合域可以是scfv。
[0228]
从氨基末端到羧基末端，第一抗原结合域和第二抗原结合域可以按以下任何模式排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；和(iv)vh1-vl2-vh2-vl1，其中vh1是第一抗原结合域的重链可变域，vl1是第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是第二抗原结合域的重链可变域，和vl2是第二抗原结合域的轻链可变域。
[0229]
从氨基末端到羧基末端，第一抗原结合域和第二抗原结合域可以按以下任何模式排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；和(iv)vl1-vh1-vh2-vl1，其中vh1是第一抗原结合域的重链可变域，vl1是第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是第二抗原结合域的重链可变域，和vl2是第二抗原结合域的轻链可变域。第一抗原结合域和第二抗原结合域可以结合免疫细胞抗原和疾病相关抗原。
[0230]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞可能不包含双特异性car。例如，工程改造的免疫细胞的单个car可以仅包括第一抗原结合域，而工程改造的免疫细胞另外的单个cac可以仅包括第二抗原结合域。
[0231]
免疫细胞抗原可以是免疫细胞的表面蛋白或分泌蛋白。免疫细胞可以是nk细胞、t细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。免疫细胞抗原可以选自：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ和slamf7。
[0232]
疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是cs1或本文描述的其他
抗原。在一些情况下，第一抗原结合域可以结合选自下组的免疫细胞抗原：cd2、cd3、cd5、cs1、cd7和cd137，第二抗原结合域可结合cs1。在一些情况下，第一抗原结合域可以结合cd7，第二抗原结合域可结合cs1。在一些情况中，第一抗原结合域能够结合cd137，第二抗原结合域能够结合cs1。工程改造的免疫细胞的一个或多个内源性人白细胞抗原(hla)基因的表达可以保持完整。工程改造的免疫细胞的内源性hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g基因中一种或多种的表达可以保持完整。工程改造的免疫细胞中一种或多种内源性人白细胞抗原(hla)基因的表达可以失活。工程改造的免疫细胞的内源性hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g基因中一种或多种的表达可以失活。工程改造的免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(hla)基因的表达可下调。工程改造的免疫细胞的一种或多种内源性hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g基因的表达可下调。工程改造的免疫细胞的一种或多种内源性人类白细胞抗原(hla)基因的表达可以敲除或部分敲除。
[0233]
在各种实施方式中，工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。在一些情况下，工程改造的免疫细胞来源于干细胞。干细胞可以是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。
[0234]
本文提供的细胞(例如，工程改造的免疫细胞)可以包括一个或多个包含结合部分的嵌合抗原受体(car)，其中结合部分可以包括能够结合免疫细胞抗原的抗原结合域。一个或多个car中的每个car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。该细胞可进一步包含能够增强细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中细胞的内源性t细胞受体(tcr)可失活。
[0235]
增强子部分可以增强细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成型增强细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成型上调细胞的一个或多个胞内信号传导通路。例如，一个或多个胞内信号传导通路可以是一个或多个细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自下组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
[0236]
该细胞可进一步包含诱导性细胞死亡部分，该诱导性细胞死亡部分在与细胞死亡激活剂接触后可实现细胞的死亡。诱导性细胞死亡部分可选自以下组：rapacasp9、icasp9、hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。例如，诱导性细胞死亡部分可以是egfrt，细胞死亡激活剂可以是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。再例如，诱导性细胞死亡部分可以是hsv-tk，细胞死亡激活剂可以是gcv。再例如，诱导性细胞死亡部分可以是icasp9，细胞死亡激活剂可以是ap1903。
[0237]
编码细胞的内源性表面标志物的基因可以失活，其中内源性表面标志物在表达时能够与第一抗原结合域结合。内源性表面标志物可以是：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ或slamf7。
[0238]
抗原结合域
[0239]
工程改造的免疫细胞可包含单个抗原结合域。在一些情况下，抗原结合域是scfv或sdab。在一些情况下，抗原结合域是sdab。在一些实施方式中，抗原结合域是多价的，包括一个以上的抗原结合单元，如sdab。在一些实施方式中，抗原结合结构域是二价的，包括两个抗原结合单元，例如两个sdab。
[0240]
在一些情况下，抗原结合域靶向选自下组的任一抗原：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。在一些实施方式中，sdab靶向cs1。在一些实施方式中，sdab靶向cd137。在一些实施方式中，抗原结合域是二价的，包括两个靶向cs的sdab。在一些实施方式中，抗原结合域是二价的，包括两个靶向cd137的sdab。
[0241]
工程改造的免疫细胞可以包括第一抗原结合域和第二抗原结合域。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的单独或单个car包括第一抗原结合域和第二抗原结合域。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的两个car包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，各car仅包含一个抗原结合域。在一些情况下，两个工程改造的免疫细胞包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，各工程改造的免疫细胞仅包含一类抗原结合域。在一些情况下，第一抗原结合域可以靶向免疫细胞抗原，第二抗原结合域可靶向疾病相关抗原。抗原结合域可以是fab、f(ab’)2、单域抗体、单链fv(scfv)、森特灵(centyrin)、达尔平(darpin)或具有抗原结合特异性的其它多肽。
[0242]
抗原结合域可以靶向免疫细胞抗原。免疫细胞抗原的实例包括但不限于，cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ和slamf7。在一些情况下，免疫细胞抗原是在t细胞和nk细胞二者上表达的细胞标志物，包括但不限于cd2、cd7、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd69、cd100、cd122、cd132、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd178(icos)、cd161、cd159a、cd159c和cd314以及slamf7(cs1)。在一些实施方式中，免疫细胞抗原是cs1、cd7或cd137。
[0243]
抗原结合域可以靶向疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于，bcma、vegfr2、cd19、cd20、cd30、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd52、cd56、cd80、cd86、cd81、cd123、cd171、cd276、b7h4、cd133、egfr、gpc3；pmsa、cd 3、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2、erbb3 her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、cd44v6、cea、ca125、cd151、ctla-4、gitr、btla、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、hvem、mage-a、间皮
素、ny-eso-1、psma、rank、ror1、tnfrsf4、cd40、cd137、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、tcra、tcrp、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、robl、卷曲受体、ox40、cd79b、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和notch-1-4。在一些情况下，肿瘤相关抗原包括cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、cs1、mage3、密蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r或trop-2。在一些情况下，肿瘤相关抗原是cs1、cd19或bcma。
[0244]
在一些情况下，抗原结合域可以靶向cd7。cd7是一种跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员。cd7蛋白在成熟t细胞和nk细胞及其前体细胞表面表达。cd7可以与其配体k12/sectm1结合，并作为t细胞活化的共刺激效应器。在小鼠中，cd7敲除的t细胞前体可以发育成正常t细胞，但对t细胞效应器功能仅有轻微影响。90％以上的t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)可以表达cd7，因此cd7可以作为t-all的标志物。此外，cd7也可在nk淋巴瘤、t细胞淋巴瘤/白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病和富含淋巴细胞的胸腺瘤中表达。
[0245]
抗原结合域可以靶向cd137。cd137也称为4-1bb，是tnf受体超家族的成员。cd137蛋白可以是一种活化诱导的共刺激受体，可在活化的t细胞、nk细胞、树突状细胞、粒细胞和其它免疫细胞类型以及某些肿瘤细胞中广泛表达。在活化的t细胞和nk细胞上发现cd137表达，而在幼稚t细胞和失活的t细胞及nk细胞中几乎没有表达。在t细胞中，cd137可以通过traf2启动nf-κb通路，并参与t细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡。在临床应用中，cd137可以用作反应性t细胞的标志物。cd137天然配体或激动性抗体激活cd137信号传导通路可以增加细胞因子分泌和细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤活性。用特异性抑制性cd137抗体抑制反应性t细胞可减少移植物排斥中的自体排斥或减少由同种异体来源的自体反应性t淋巴细胞引起的gvhd反应。cd137的表达可以通过tcr信号传导和细胞因子il-2/il-15的下游信号传导调节。敲除cd137分子可能对处于非激活状态的成熟t细胞的功能没有影响。工程改造的免疫细胞的内源性cd137可以被敲除以避免自残。工程改造的免疫细胞的内源性tcr可以失活以预防gvhd。
[0246]
抗原结合域可以靶向cs1。cs1(cracc、slamf7或cd319)是slam(信号传导淋巴细胞激活分子)家族受体的成员。它可以在nk细胞、cd8+t淋巴细胞、成熟树突状细胞和活化的b细胞上表达。cs1是正常浆细胞和多发性骨髓瘤中恶性浆细胞的有力标志物。
[0247]
抗原结合域可以靶向cd19。cd19是b细胞表面的95kda糖蛋白，从b细胞早期发育开始表达，直到其分化为浆细胞。cd19是免疫球蛋白(ig)超家族的成员，并作为b细胞表面信号转导复合物的组成元件之一参与b细胞受体信号转导过程的调节。在cd19缺陷小鼠模型中，外周淋巴组织中的b细胞数量会显著减少，对疫苗和促分裂剂的反应也会减少，同时血清ig水平也会降低。通常可以认为，cd19的表达仅限于b细胞谱系，而不限于多能干细胞的
表面。cd19也可以在大多数b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、all、cll、毛细胞白血病和一些急性髓系白血病细胞的表面表达。cd19可作为白血病/淋巴瘤免疫的靶点。除b细胞外，cd19可能不在大多数正常细胞表面表达，包括多能干细胞。这一特征可以使cd19成为自身免疫性疾病的安全靶点，因为可以最大程度降低不可逆的骨髓毒性损害的风险。
[0248]
抗原结合域可以靶向bcma。b细胞成熟抗原(bcma或bcm)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(tnfrsf17)，是一种由tnfrsf7基因编码的蛋白。tnfrsf17是tnf受体超家族的一种细胞表面受体，它识别b细胞激活因子(baff)。bcma优先在成熟b淋巴细胞中表达。已显示其特异性结合肿瘤坏死因子(配体)超家族成员13b(tnfsf13b/tall-1/baff)，并导致nf-kappab和mapk8/jnk活化。它还可以结合多种traf家族成员，因此可以转导细胞存活和增殖的信号。
[0249]
本文提供的抗原结合域可以具有如v
h-v
l
或v
l-vh所示的结构，其中vh是抗体的重链可变区；v
l
是抗体的轻链可变区；
“‑”
是连接肽(或柔性接头)或肽键。在一些实施方式中，抗原结合域靶向肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，抗原结合域靶向免疫细胞抗原。在一些实施方式中，抗原结合域靶向cs1。在一些实施方式中，cs1的单克隆抗体选自oti3b3、oti3e3 oti1f1、埃罗妥珠单抗、1b9、1g10、24.1、162.1或其组合。在一些实施方式中，抗原结合域靶向cd137。在一些实施方式中，cd137的单克隆抗体选自4b4-1、bbk-2、0.n.185、g-1、epr20238、oti5h5、oti7f9、abm3d3.2e8、abm2b2.1a5、5f8或jg1.6a。在一些实施方式中，抗原结合域靶向cd19。在一些实施方式中，靶向cd19的抗原结合域包括单克隆fmc63抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方式中，接头肽或柔性接头的序列包括2-6个，优选3-4个连续的(ggggs)氨基酸序列。在一些实施方式中，免疫细胞抗原靶向cd7。在一些实施方式中，cd7的单克隆抗体选自th-69、3a1e、3a1f、t3-3a1、rft2、cd7-6b7、124-1d1、4h9、sdz214-380或其组合。
[0250]
增强子部分
[0251]
本文提供的工程改造的免疫细胞可包含增强子部分。增强子部分可以调节工程改造的免疫细胞的一种或多种活性，例如，增强或上调一种或多种信号传导通路，以增强或上调工程改造的免疫细胞的效应子功能。信号传导通路可以是细胞因子相关的信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子。增强子部分可以是细胞因子受体。
[0252]
细胞因子相关的信号传导通路可以包括细胞因子的相关信号传导通路。细胞因子的实例包括但不限于il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21和il25。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括两种或多种细胞因子的相关信号传导通路，其中细胞因子包括：il-2和il-7、il-2和il-15、il-7和il-15、il15和il21。细胞反应可包括下游基因表达的调节、胞内酶活性的变化、细胞骨结构的变化、dna合成的变化、基因转录的促进、免疫细胞分化、增殖的调节和对细胞死亡的抵抗。在一些情况下，细胞因子相关的信号传导途径被增强，包括：引入或上调编码细胞因子和/或其受体的基因，外源性添加细胞因子，引入细胞因子受体，或其组合。在一些情况下，上调编码细胞因子和/或其受体的基因包括上调编码基因的转录和/或翻译水平。在一些情况下，增强的细胞因子相关信号传导通路可以通过以下一种或多种方法实现：在免疫细胞中表达编码细胞因子和/或其受体的基因，增加免疫细胞中编码细胞因子及其受体的基因的拷贝数，工程改造编码基因的调节序列(例如启动子)以提高转录速度(例如转录起始率)，修饰
携带编码基因的信使rna的翻译调节区以增强翻译强度，修饰编码基因本身以增强mrna稳定性、蛋白质稳定性并解除蛋白反馈抑制。
[0253]
细胞因子相关信号传导通路可通过细胞因子及其受体的膜表达、细胞因子的分泌、细胞因子和/或其受体的转录调节的增强或其组合来增强。膜表达的细胞因子及其受体可以包括：il-15及其受体(例如mbil15融合蛋白)、il-7及其受体、il-17及其受体(如mbil17融合蛋白)，il-2及其受体(比如mbil2融合蛋白)、il-21及其受体(例如mbil21融合蛋白)、组成型活化的il-7受体(c7r)，或其组合。在一些情况下，工程改造的免疫细胞中的增强子部分是一种分泌性细胞因子。分泌性细胞因子可以通过多种机制发挥作用，例如，分泌性细胞素可以是反式激活因子或顺式激活因子。分泌性细胞因子可包括il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21或其组合。在一些情况下，增强子是膜结合蛋白，如mbil15、mbil7、mbil21和mbil2。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体下游信号传导蛋白，如stat5和stat3。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体，例如组成型活性il-7受体(c7r)或其衍生物。例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程改造的蛋白(例如，在本公开中称为“e3”)，其中c7r的胞外结构域被安全开关，例如egfrt或人表皮生长因子受体2的截短形式(her2t；参见美国专利申请公布号20170267742a1)或本公开中描述的其它肽取代。例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程改造的蛋白(例如，在本公开中称为“e4”)，其中c7r的胞外域被免疫细胞抑制剂(例如cd47、cd24或抑制杀伤或吞噬免疫细胞功能并保护细胞(例如，本文所述的工程改造的免疫细胞)的其他肽)替代。在一些情况下，细胞因子可以是趋化因子，如ccl21和ccl19。可以使用的趋化因子的其它非限制性例子包括ccl27、ccl28、ccl20、cxcl9、cxclio、cxcll l、cxcl16、cxcl13、cxcl5、cxcl6、cxcl8、cxcl12、ccl2、ccl8、ccl13、ccl25、ccl3、ccl4、ccl5、ccl7、ccl14、ccl15、ccl16、ccl23、cx3cl1、xcl1、xcl2、ccl1、ccl17、ccl22、ccl11、ccl24、ccl26、cxcll、cxcl2、cxcl3和cxcl7。在一些情况下，增强子部分是ccr7的配体，它可以增强t细胞、nk细胞或树突状细胞的浸润。ccr7配体包括但不限于ccl21和ccl19。在一些情况下，增强子部分包括趋化因子ccl21与ccl19的共表达，用于淋巴瘤或其它实体瘤。
[0254]
在一些情况下，工程改造的免疫细胞用作液体瘤的剂，在这种情况下，增强子部分可以包括本文所述的任何形式的任何细胞因子。在一些情况下，工程改造的免疫细胞用作实体瘤的剂，在这种情况下，增强子部分可以包括任何形式的任何细胞因子，并进一步包括一种或多种趋化因子。
[0255]
在一些情况下，可以使用两种细胞因子来增强工程改造的免疫细胞中的细胞因子相关信号传导通路，包括il-2和il-7、il-2和il-15、il-7和il 15以及il15和il21。细胞因子相关信号传导通路增强可包括选自下组多肽的表达：mbil融合蛋白、组成型活性il-7受体(c7r)、白介素或其组合。
[0256]
本文描述的增强子部分可以是白介素15(il-15)或il-15受体。il-15是由114个氨基酸组成的14-15kd糖蛋白，属于四螺旋束细胞因子家族。il-15在结构上与白介素2(il-2)同源。il-15受体包括高亲和力il-15受体α链、il2/15受体β链和共有γ链。因此，il-15可能具有一些类似于il-2的功能，如刺激t细胞活化和增殖、增强nk细胞杀伤活性和促进b细胞产生免疫球蛋白。最近的研究发现，il-15可能在nk细胞、nkt细胞和肠上皮细胞的分化、增
殖和活化中发挥作用。il-15和il-17可能在cd8+记忆t细胞的调节中发挥作用。研究还表明，il-15可以通过一种机制调节cd8+记忆t细胞的增殖和nk细胞的生存周期，其中表达il-15α链受体的细胞可以将il-15呈递给表达il-15β链和共有γ链的细胞。il-15也可能在非免疫系统中发挥作用，例如调节骨骼肌合成代谢。本文描述的增强子部分可以是白介素7(il-7)。il-7可以促进前b细胞、前b细胞，b细胞和t细胞的生长。它还可以促进b细胞和t细胞的生长和抗凋亡。il-7可在胸腺的早期分化和增殖以及树突状细胞的发育和分化中发挥作用。然而，il-7可能对抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的杀伤活性没有增强作用。它可以首先从胸腺转移到外周血，然后诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生淋巴因子，激活并增强lak细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞活性。cd8+亚可以是il-7的主要效应细胞，il-7也可以支持记忆性cd8+t细胞的扩增和存活。il-7可以促进骨髓组织的生成。il-7不仅能刺激髓系前体细胞和巨核细胞产生集落形成单位和血小板，还能使机体从环磷酰胺的免疫抑制中恢复。在较高浓度下，它还可以诱导增强巨噬细胞的细胞毒性，作为产生ctl细胞、nk细胞和活化单核细胞的协同因子，诱导单核细胞巨噬细胞分泌各种细胞因子，并促进炎症因子的表达，如巨噬细胞炎性蛋白α(mip-α)、mip-β、，il-8和单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)等。通过激活炎症细胞产生的大量炎性因子，il-7不仅可以调节炎症过程各成分之间的相互作用，还可以增强炎性细胞因子受体(ccr)，如ccr1、ccr2和ccr5。此外，il-7可以在诱导免疫反应中发挥作用。il-7可诱导i型免疫反应，增加ifn-γ和il-2的产生。il-7可与il-12协同诱导ifn-γ和t细胞增殖。il-7和转化生长因子β(tgfβ)可以发挥调节作用，并且可以是免疫调节机制的一部分。il-7不仅可以促进t细胞的免疫重建，而且可以诱导t细胞周期和bcl-2表达的上调，这拓宽了循环t细胞受体库的多样性和持久性，增加了cd4+和cd8+t细胞的数量。此外，对于hiv抗原，扩增的t细胞还可以分泌il2和ifn-γ，并具有良好的抗病毒功能。因此，il-7可以逆转hiv特异性t淋巴细胞在增殖、细胞因子分泌和细胞功能方面的缺陷。
[0257]
增强(子)部分可以调节(例如激活)信号转导子和转录激活子5(stat5)介导的信号通路。stat5可以广泛存在于细胞质中。当细胞因子(例如il2、il7、il15和il21)与细胞因子受体结合时，受体偶联的jak被激活，从而磷酸化stat5蛋白c末端的tyr残基。磷酸化的stat5可以通过其sh2区域形成同源或异源二聚体。同源或异源二聚体可以转移到细胞核并与靶基因结合，从而调节包括细胞调节因子和抗凋亡基因在内的靶基因的表达。stat5的激活可以在维持正常细胞功能和调节细胞增殖和分化方面发挥作用。因此，调节stat5信号通路的活性可以调节本文所述的car-t细胞的存活和持续性。
[0258]
通过将编码增强子部分的核酸分子递送到细胞中，可以将增强子成分引入细胞(例如免疫细胞或工程改造的免疫细胞)中。核酸分子可以是载体。增强子部分可以是融合构建体的一部分。融合蛋白或相应的核酸构建体可以具有选自下式的结构：s-2a-l1-scfv-h-tm-c-cd3ζ-2a-l2-il15-il15ra(a)；s-2a-l1-scfv-h-tm-c-cd3ζ-2a-l2-il15-il15ra-2a-l3-il7(b)；s-2a-l1-scfv-h-tm-c-cd3ζ-2a-l2-c7r(c)；s-2a-l1-scfv-h-tm-c-cd3ζ-2a-l2-il7-il7ra(d)；其中各
“‑”
独立地是接头肽或肽键；s是安全开关；2a是任选的自切割肽；l1、l2和l3各自独立地为空或信号肽序列；c7r如上所述；scfv是抗原结合域；h为空或铰链区；tm是跨膜结构域；c是共刺激信号传导分子；cd3ζ是来源于cd3ζ的胞质信号传导序列；il15是白介素15，il15ra是il-15受体a；il7是白介素7，il7ra是il-7受体a；c7r是组成型激
活的il-7受体。
[0259]
增强子部分可以是嵌合多肽的一部分。例如，增强子部分可以与诱导性细胞死亡部分连接。增强子部分可以通过接头与诱导性细胞死亡部分连接。接头可能未切割。接头可以不包括自切割肽。在一些其它情况下，增强子部分和诱导性细胞死亡部分可在细胞中从同一核酸分子表达，并可被切割形成两种多肽。
[0260]
诱导性细胞死亡部分
[0261]
本文所述的工程改造的免疫细胞可包含诱导性细胞死亡部分，也称为“自杀基因开关”、“自杀开关”、“安全开关”或“细胞自杀元件”。诱导性细胞死亡部分可用于在外源性因素(例如药物)的作用下在体内有效去除工程改造的免疫细胞(例如car-t细胞)。本文所述的诱导性细胞死亡部分可以是rapacasp9、icasp9和cd20(及其模拟表位)、rqr8、her2t、cd30、bcma、egfrt、hsv-tk、mtmpk等。icasp9、cd20(及其模拟表位)、rqr8和hsv-tk可能具有相同的清除t细胞的能力，但与hsv-tk相比，rapacasp9，icasp9，rqr8，和cd20(及它们的模拟图位)可能更快。
[0262]
在一些情况下，诱导性细胞死亡部分能够在所述诱导性细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触后实现所述细胞的死亡。诱导性细胞死亡部分可以是，例如，rapacasp9、icasp9，hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd 19、rqr8或egfrt。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是egfrt，所述细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，所述细胞死亡激活剂是gcv。在一些情况下，诱导性细胞死亡部分是icasp9，所述细胞死亡激活剂是ap1903。
[0263]
诱导性细胞死亡部分可以与增强子部分连接，并且可以如上所述作为嵌合多肽在细胞中共同表达。
[0264]
移植物抗宿主病(gvhd)
[0265]
为制备“现成”的异基因t细胞用于恶性和传染性疾病，可以设计通过输注t细胞的细胞来重建对病原体和恶性肿瘤的免疫力。在体外用足够数量的t细胞产生具有肿瘤靶向特性的t细胞所需的时间通常与患者的窗口不相容。此外，来自晚期疾病患者的自体t细胞可能功能受损，对所需抗原具有耐受性。
[0266]
为了解决这些问题，患者可以使用同种异体t细胞，但需要通过识别输注细胞上不同的主要或次要组织相容性抗原来防止宿主nk细胞和t细胞的免疫介导排斥反应。输注不表达tcrα和β链和/或mhc分子的t细胞可能不会引起gvhd和hvg。因此，用crispr/cas9编辑以删除tcrα链和/或mhc分子的t细胞可作为通用效应供体细胞的来源。
[0267]
敲除β-2-微球蛋白(b2m)可以防止供体car-t细胞受到宿主t细胞的攻击。供体car-t细胞可能受到宿主nk细胞的攻击，并影响car-t的存活。因此，本公开提供了靶向肿瘤细胞和宿主t细胞和/或nk细胞的工程改造免疫细胞。本文所述的工程改造的免疫细胞可以清除宿主t细胞和/或nk细胞，并增强car-t细胞的存活、持久性和扩增能力，从而更有效地对抗肿瘤细胞。
[0268]
基因编辑
[0269]
在本公开中可以使用各种基因编辑方法来制造工程改造的免疫细胞，包括crispr、rna干扰技术、talen(转录激活物样(tal)效应核酸酶)和锌指核酸酶(zfn)。
[0270]
在一些情况下，crispr/cas9系统用于编辑免疫细胞的基因。例如，crispr/cas9系
统可用于敲除免疫细胞的内源性tcr或细胞表面标志物(例如，cs1、cd7、cd137)，以产生用于t细胞的工程改造的免疫细胞。crispr/cas9(簇状规则间隔短回文重复序列)/cas(crispr相关)系统是原核生物特有的天然免疫系统，对病毒或外源质粒具有抗性。ii型crispr/cas系统作为直接基因组导向的基因组编辑工具已应用于许多真核生物和原核生物。crispr/cas9系统的开发彻底改变了人们编辑dna序列和调节靶基因表达水平的能力，为生物体的精确基因组编辑提供了强大的工具。简化的crispr/cas9系统可以包括cas9蛋白和grna。作用原理是grna通过其自身的cas9手柄与cas9蛋白形成cas9 grna复合物，cas9grna复合物中grna的碱基互补配对序列通过碱基互补对原理与靶基因的靶序列配对。cas9利用其自身的核酸内切酶活性来切割靶dna序列。与传统的基因组编辑技术相比，crispr/cas9系统具有几个明显的优势：易于使用、简单、低成本、可编程性以及同时编辑多个基因的能力。
[0271]
药物组合物
[0272]
本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文所述的工程改造的免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物是液体组合物。药物组合物可以通过，例如注射给药到受试者体内。制剂中工程改造的免疫细胞的浓度可为至少约102、103、104、105、106、107、108、109或更多细胞/ml。在一些情况下，制剂中工程改造的免疫细胞的浓度可以是1x10
3-1x108细胞/ml，或1x10
4-1x107细胞/ml。
[0273]
本公开的药物组合物可包含本文所述的工程改造的免疫细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可将本公开的组合物配制成用于静脉内给药。
[0274]
本公开的药物组合物可以以适合待(或预防)疾病的方式施用。给药的数量和频率将由患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，但适当的剂量可通过临床试验确定。
[0275]
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“量”时，医生可考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度的差异，以及患者(受试者)的情况。通常，包含本文所述的工程改造的免疫细胞(例如，car-t细胞)的药物组合物可以104至109细胞/kg体重的剂量施用，或者在一些情况下，105至106细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。t细胞组合物也可以在这些剂量下多次施用。可以采用输注技术来给予细胞。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整，不难确定特定患者的最佳剂量和方案。
[0276]
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。本文描述的组合物可通过皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内给药给患者。在一些实施方式中，通过皮内或皮下注射将本公开的t细胞组合物给予患者。在一些其它实施方式中，优选通过静脉内注射施用本公开的t细胞组合物。t细胞组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
[0277]

[0278]
本公开提供了用编码本文所述表达盒的慢病毒载体(lv)转导的工程改造免疫细胞(例如t细胞或nk细胞)的应用。转导的t细胞或nk细胞可以靶向肿瘤细胞标志物(如
cs1、cd19、bcma)和活化的t细胞和/或nk淋巴细胞共有标志物(例如cs1、cd7、cd137等)。工程改造的免疫细胞可用于同种异体肿瘤，并可大规模制备。
[0279]
因此，本公开还提供了刺激对受试者(例如哺乳动物)的靶细胞或组织的t细胞介导免疫应答的方法，包括向受试者施用本公开的工程改造的免疫细胞(例如car-t细胞)的步骤。
[0280]
在一些实施方式中，本公开提供了一类细胞，包括直接向有此需要的患者施用本公开的工程改造的通用car-t细胞。本公开的car-t细胞可通过基因编辑技术在细胞中敲除或沉默内源性tcr表达。内源性tcr和/或mhc(如b2m)的失活可防止在异体输注期间tcr杀伤正常细胞。可以防止gvhd反应。靶向肿瘤细胞标志物(如cs1、cd19、bcma)和活化的t细胞和/或nk细胞标志物(如cs2、cd7、cd137)的car-t细胞可以在清除肿瘤细胞的同时去除活化的t和/或nk细胞。此外，还可以防止宿主对移植物反应(hvg)。本文提供的细胞还可以改善受试者中同种异体car-t细胞的存活和抗肿瘤效果。
[0281]
在一些实施方式中，本文提供了一种或诊断受试者疾病的方法，包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。
[0282]
所述药物组合物中的工程改造的免疫细胞可以来源于同种异体免疫细胞。衍生自所述同种异体免疫细胞的工程改造免疫细胞可能不会在所述受试者中诱导移植物抗宿主病(gvhd)。所述药物组合物中的工程改造免疫细胞可以来源于自体免疫细胞。
[0283]
所述药物组合物中的所述工程改造的免疫细胞的内源性tcr和/或mhc(例如b2m)可以是功能上无活性的。与具有功能活性的tcr和/或mhc(如b2m)的其它免疫细胞相比，工程改造的免疫细胞可以减少所述受试者的gvhd。疾病可以是癌症。癌症可以是，例如淋巴瘤或白血病。
[0284]
本公开的car-t细胞可以经历稳健的体内细胞扩增，并且可以延长。car介导的免疫应答可以是过继免疫步骤的一部分，其中car修饰的t细胞可以诱导car中的抗原结合域特异性的免疫应答。例如，抗cs1 car-t细胞引发针对表达cs1的细胞的特异性免疫应答。
[0285]
本文提供的工程改造的免疫细胞可用于癌症。可以的癌症包括未血管化或尚未实质性血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液瘤，如白血病和淋巴瘤)或者可以包括实体瘤。用本公开的car的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。
[0286]
血液癌是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性粒细胞白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞)白血病、慢性粒细胞白血病、，和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛型和高级型)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
[0287]
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的，也可以是恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤，例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉
瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌，乳头状腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns肿瘤(如胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形胶质母细胞肿瘤)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、雪旺瘤、颅药瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤以及脑转移瘤)。
[0288]
在一些实施方式中，将本公开的car的抗原结合部分设计用于特定癌症。在一些实施方式中，设计为靶向cs1的car可用于癌症和病症，包括但不限于多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、t细胞淋巴瘤、轻链淀粉样变(al)、b细胞相关的自身免疫病症，如狼疮、hla供体特异性抗体(dsa)。在一些实施方式中，设计为靶向cd19的car可用于癌症和病症，包括但不限于前b all(儿科适应症)、成人all、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、挽救性异基因后骨髓移植等。在一些实施方式中，设计为靶向bcma的car可用于癌症和病症，包括但不限于多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小非分裂细胞淋巴瘤、地方性伯基特淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、结外粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴结单核细胞样b细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤，肺b细胞血管中心性淋巴瘤和小淋巴细胞淋巴瘤。本公开不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶点和疾病。相反，本公开应被解释为包括与car可用于疾病的疾病相关的任何抗原靶点。
[0289]
本文公开的细胞可以与一种或多种其他剂(例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素、疫苗和/或其他免疫疗法)联合配制和/或联合施用。在一些实施方式中，将工程改造的免疫细胞与其他模式，包括手术、放射、冷冻手术和/或热疗组合施用。这样的联合疗法可以有利地利用较低剂量的给药剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
[0290]
在某些实施方式案中，本文所述的方法和组合物与一种或多种抗体分子、化疗、其他抗癌(例如，靶向抗癌或溶瘤药物)、细胞毒性剂、基于免疫的(例如细胞因子)、外科手术和/或放射结合施用。可与之联合施用的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类、长春花生物碱、嵌入剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进凋亡的药剂、蛋白酶体抑制剂和放疗(局部或全身辐射)。
[0291]
在某些实施方案中，联合疗法与标准的癌症护理化疗剂联合使用，所述癌症护理化疗剂包括但不限于：阿那曲唑(anastrozole)(瑞宁得)、比卡鲁胺(bicalutamide)(康士得)、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)(布诺辛)、白消安(busulfan)(马利兰)、白消安注射剂(busulfan injection)(白舒非)、卡培他滨(capecitabine)(希罗达)、n4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷(n4-pentoxycarbonyl-5-deoxy-5-fluorocytidine)、卡铂(carboplatin)(铂尔定)、卡莫司汀(carmustine)(拜西恩佑)、苯
丁酸氮芥(chlorambucil)(瘤可宁)、顺铂(cisplatin)(普兰利诺)、克拉屈滨(cladribine)(艾博定)、环磷酰胺(cyclophosphamide)(癌得星或尼奥赛)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞甙(cytosine arabinoside)(赛德萨-u)、脂质体阿糖胞苷注射剂(cytarabine liposome injection)(迪泊赛)、达卡巴嗪(dacarbazine)(dtic多姆)、更生霉素(dactinomycin)(放线菌素d(actinomycin d)、寇斯霉根(cosmegan))、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)(西鲁比丁)、枸橼酸柔红霉素脂质体注射剂(daunorubicin citrate liposome injection)(多诺佐姆)、地塞米松(dexamethasone)、多西他赛(docetaxel)(泰索帝)、盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)(亚德里亚霉素卢布)、依托泊苷(etoposide)(凡毕士)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)(福达华)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(阿德鲁吉尔艾芙戴克)、氟他胺(flutamide)(欧莱辛)、替扎西汀(tezacitibine)、吉西他滨(gemcitabine)(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲(hydroxyurea)(海得里亚)、伊达柔比星(idarubicin)(伊达比星)、异环磷酰胺(ifosfamide)(艾弗伊克)、伊立替康(irinotecan)(坎普托萨)、l-天冬酰胺酶(l-asparaginase)(埃尔斯帕)、亚叶酸钙(leucovorin calcium)、美法仑(melphalan)(马法兰)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)(巯基嘌呤)、甲氨蝶呤(methotrexate)(佛雷科斯)、米托蒽醌(mitoxantrone)(诺安托)、麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇(paclitaxel)(泰克索)、蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)(艾博克散)、菲尼克斯(phoenix)(钇90/mx-dtpa(yttrium90/mx-dtpa))、喷司他丁(pentostatin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)和卡莫司汀植入物(carmustine implant)(格里德尔)、枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)(诺瓦得士)、替尼泊苷(teniposide)(卫萌)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、噻替帕(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)(替拉松)、注射用盐酸托泊替康(topotecan hydrochloride for injection)(海坎丁)、长春碱(vinblastine)(韦尔本)、长春新碱(vincristine)(安可平)，和长春瑞滨(vinorelbine)(诺维本)。
[0292]
烷基化剂的实例包括但不限于氮芥(nitrogen mustards)、亚乙基胺衍生物(ethylenimine derivatives)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonates)、亚(nitrosoureas)和三氮烯(triazenes))：尿嘧啶芥(aminouracil
uracil nitrogen)、氮芥(chlormethine)环磷酰胺(cyclophosphamide)(环磷酰胺(cyclophosphamide)(revimmune
tm
)、异环磷酰胺(ifosfamide)美法仑(melphalan)苯丁酸氮芥(chlorambucil)哌泊溴烷(pipobroman)三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)三亚乙基硫代磷胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺(temozolomide)噻替派(thiotepa)白消安(busulfan)卡莫司汀(carmustine)洛莫司汀(lomustine)链脲佐菌素(streptozocin)和达卡巴嗪(dacarbazine)其他示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂(oxaliplatin)替莫唑胺(temozolomide)替莫唑胺(temozolomide)更生霉素(dactinomycin)(也称为放线菌素d、)；美法仑(melphalan)(也称为l-pam、左旋苯丙氨酸氮芥(l-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥(phenylalanine mustard)，)；六甲嘧胺(altretamine)(也称为六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine,hmm)、)；卡莫司汀(carmustine)苯达莫司汀(bendamustine)白消安(busulfan)卡铂(carboplatin)洛莫司汀(lomustine)(也称为ccnu、)；顺铂(cisplatin)(也称为cddp、和platinol
tm-aq)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)环磷酰胺(cyclophosphamide)达卡巴嗪(dacarbazine)(也称为dtic、dic和咪唑羧酰胺(imidazole carboxamide)、dtic)；六甲嘧胺(altretamine)(也称为六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine,hmm)、)；异环磷酰胺(ifosfamide)普鲁莫司汀(prednumustine)；丙卡巴肼(procarbazine)甲氯乙胺(mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮介(mustine)和盐酸甲氯乙胺(mechloroethamine hydrochloride)、)；链脲佐菌素(streptozocin)噻替派(thiotepa)(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、tespa和tspa、)；环磷酰胺(cyclophosphamide)和盐酸苯达莫司汀(bendamustine hcl)
[0293]
蒽环霉素(anthracyclines)的实例包括，例如，阿霉素(doxorubicin)蒽环霉素(anthracyclines)的实例包括，例如，阿霉素(doxorubicin)博来霉素(bleomycin)柔红霉素(daunorubicin)(盐酸柔比星(dauorubicin hydrochloride)、多诺霉素(daunomycin)和柔红霉素盐酸盐(rubidomycin hydrochloride)、)；柔红霉素脂质体
(daunorubicin liposomal)(枸橼酸柔红霉素脂质体(daunorubicin citrate liposome)、)；米托蒽醌(mitoxantrone)(dhad、)；表柔比星(epirubicin)(ellence
tm
)；伊达比星(idarubicin)(idamycin)；丝裂霉素c(mitomycin c)格尔德霉素(geldanamycin)；除莠毒素(herbimycin)；灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。
[0294]
可与本文所述的细胞疗法联合使用的长春花生物碱(vinca alkaloids)的实例包括但不限于：酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)长春新碱(vincristine)和长春地辛(vindesine)长春碱(vinblastine)(也称为硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、长春花碱(vincaleukoblastine)和vlb、)；和长春瑞滨(vinorelbine)
[0295]
可与本文所述的细胞疗法联合使用的蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于：硼替佐米(bortezomib)卡菲偌米布(carfilzomib)(px-171-007、(s)-4-甲基-n-((s)-1-(((s)-4-甲基-1-((r)-2-甲基环氧丙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((s)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；马里佐米(marizomib)(npi-0052)；枸橼酸依沙唑米(ixazomib citrate)(mln-9708)；德兰佐米(delanzomib)(cep-18770)；0-甲基-n-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-l-丝氨酰-o-甲基-n-[(1s)-2-[(2r)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-l-丝氨酰胺(onx-0912)；丹诺瑞韦(danoprevir)(rg7227、cas 850876-88-9)；伊沙唑米(ixazomib)(mln2238、cas 1072833-77-2)；和(s)-n-[(苯基甲氧基)羰基]-l-亮氨酰-n-(1-甲酰基-3-甲基丁基)-l-亮氨酰胺(mg-132、cas 133407-82-6)。
[0296]
在一些实施方案中，所述细胞疗法可以与酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(rtk)抑制剂)联合使用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于：表皮生长因子(egf)通路抑制剂(例如，表皮生长因子受体(egfr)抑制剂)、血管内皮生长因子(vegf)通路抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(vegfr)抑制剂(例如，vegfr-1抑制剂、vegfr-2抑制剂、vegfr-3抑制剂))、血小板衍生生长因子(pdgf)通路抑制剂(例如，血小板衍生生长因子受体(pdgfr)抑制剂(例如，pdgfr-β抑制剂))、raf-1抑制剂、kit抑制剂和ret抑制剂。在一些实施方案中，与赫德霍格(hedgehog)抑制剂联合使用的抗癌剂选自下组：阿西替尼(axitinib)(ag013736)、博舒替尼(bosutinib)(ski-606)、西地尼布(cediranib)(re-centin、azd2171)、达沙替尼(dasatinib)(bms-354825)、厄洛替尼(erlotinib)吉非替尼(gefitinib)伊马替尼(imatinib)(cgp57148b、sti-571)、拉帕替尼(lapatinib)来他替尼(lestaurtinib)(cep-701)、来那替尼(neratinib)(hki-272)、尼罗替尼(nilotinib)塞马沙尼(semaxanib)(司马沙尼(semaxinib)、su5416)、舒尼替尼(sunitinib)(su11248)、托西尼布(toceranib)凡德他尼(vandetanib)(zd6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(ptk787、ptk/zk)、曲妥珠单抗(trastuzumab)贝伐单抗(bevacizumab)利妥昔单
抗(rituximab)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)雷珠单抗(ranibizumab)尼罗替尼(nilotinib)索拉非尼(sorafenib)阿仑单抗(alemtuzumab)单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)enmd-2076、pci-32765、ac220、多韦替尼乳酸盐(dovitinib lactate)(tki258、chir-258)、bibw 2992(tovok
tm
)、sgx523、pf-04217903、pf-02341066、pf-299804、bms-777607、abt-869、mp470、bibf 1120ap24534、jnj-26483327、mgcd265、dcc-2036、bms-690154、cep-11981、替沃扎尼(tivozanib)(av-951)、osi-930、mm-121、xl-184、xl-647、xl228、aee788、ag-490、ast-6、bms-599626、cudc-101、pd153035、培利替尼(pelitinib)(ekb-569)、凡德他尼(vandetanib)(扎克提马(zactima))、wz3146、wz4002、wz8040、abt-869(利尼伐尼(linifanib))、aee788、ap24534(普纳替尼(ponatinib))、av-951(替沃扎尼(tivozanib))、阿西替尼(axitinib)、bay 73-4506(瑞戈非尼(regorafenib))、丙氨酸布立尼布(brivanib alaninate)(bms-582664)、布立尼布(brivanib)(bms-540215)、西地尼布(cediranib)(azd2171)、chir-258(多韦替尼(dovitinib))、cp 673451、cyc116、e7080、ki8751、马赛替尼(masitinib)(ab1010)、mgcd-265、莫替沙尼二磷酸盐(motesanib diphosphate)(amg-706)、mp-470、osi-930、盐酸帕唑帕尼(pazopanib hydrochloride)、pd173074、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(bay 43-9006)、su 5402、tsu-68(su6668)、瓦他拉尼(vatalanib)、xl880(gsk1363089、exel-2880)。赫德霍格(hedgehog)抑制剂的其他实例包括但不限于：维莫德吉(vismodegib)(2-氯-n-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲基磺酰基)-苯甲酰胺、gdc-0449)；1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3-(4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-喹唑啉基)甲基)-脲(cas 330796-24-2)；n-[(2s,3r,3
′
r,3as,4
′
ar,6s,6
′
ar,6
′
bs,7ar,12
′
as,12
′
bs)-2
′
,3
′
,3a,4,4
′
,4
′
a,5,5
′
,6,6
′
,6
′
a,6
′
b,7,7
′
,7a,8
′
,10
′
,12
′
,12
′
a,12
′
b-二十烷氢-3,6,11
′
,12
′
b-四甲基螺[呋喃[3,2-b]吡啶-2(3h),9'(1'h)-萘基[2,1-a]奥苷菊环]-3'-基]-甲磺酰胺(ipi926、cas 1037210-93-7)；和4-氟代-n-甲基-n-[1-[4-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺(ly2940680、cas 1258861-20-9)；和索尼吉布(erismodegib)(lde225)。选定的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼(sunitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)，或索拉非尼厄洛替尼盐酸盐(sorafenib erlotinib hydrochloride)利尼伐尼(linifanib)(n-[4-(3-氨基-1h-吲唑-4-基)苯基]-n'-(2-氟代-5-甲基苯基)脲，也称为abt 869，可从基因泰克(genentech)获得)；苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)博舒替尼(bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，又称ski-606，描述于美国专利号6,780,996)；达沙替尼(dasatinib)帕唑帕尼(pazopanib)索拉非尼(sorafenib)扎克提马(zactima)(zd6474)；和伊马替尼(imatinib)或甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)
[0297]
在某些实施方案中，所述细胞疗法可以与血管内皮生长因子(vegf)受体抑制剂联
合使用，包括但不限于：贝伐单抗阿西替尼丙氨酸布立尼布(bms-582664、(s)-((r)-1-(4-(4-氟代-2-甲基-1h-吲哚-5-氧基)-5-甲基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-氧基)丙烷-2-基)2-氨基丙酸盐)；索拉非尼帕唑帕尼苹果酸舒尼替尼西地尼布(azd2171、cas 288383-20-1)；勃林格(vargatef)(bibf1120、cas 928326-83-4)；福瑞替尼(foretinib)(gsk1363089)；替拉替尼(telatinib)(bay57-9352、cas 332012-40-5)；阿帕替尼(apatinib)(yn968d1、cas 811803-05-1)；伊马替尼普纳替尼(ap24534、cas 943319-70-8)；替沃扎尼(av951、cas 475108-18-0)；瑞戈非尼(bay73-4506、cas 755037-03-7)；瓦他拉尼(vatalanib dihydrochloride)(ptk787、cas 212141-51-0)；布立尼布(bms-540215、cas 649735-46-6)；凡德他尼(或azd6474)；莫特沙尼二磷酸盐(amg706、cas 857876-30-3、n-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1h-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，在pct公开号wo 02/066470中描述)；多维替尼双乳酸(dovitinib dilactic acid)(tki258、cas 852433-84-2)；利尼伐尼(abt869、cas 796967-16-3)；卡博替尼(cabozantinib)(xl184、cas 849217-68-1)；来他替尼(cas 111358-88-4)；n-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-恶唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰胺(bms38703、cas 345627-80-7)；(3r,4r)-4-氨基-1((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)-3-醇(bms690514)；n-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(xl647、cas 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-n-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(bhg712、cas 940310-85-0)；和阿柏西普(aflibercept)
[0298]
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可以与pi3k抑制剂联合使用。pi3k抑制剂可以是pi3k的δ和γ同种型的抑制剂。pi3k抑制剂的实例包括但不限于：4-[2-(1h-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺；陶扎替(tozasertib)(vx680或mk-0457、cas 639089-54-6)；(5z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(gsk1059615、cas 958852-01-2)；(1e,4s,4ar,5r,6as,9ar)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊烷[5,6]萘基[1,2-c]吡喃-2,7,10(1h)-三酮(px866、cas 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-铬-4-酮(ly294002、cas 154447-36-6)；2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1h-吡唑-5-基)吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(sar 245409或xl 765)；1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2h-咪唑[4,5-c]喹啉-2-酮,(2z)-2-丁烯二酸(1:1)(bgt 226)；5-氟-3-苯基-2-[(1s)-1-(9h-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3h)-喹唑啉酮(cal101)；2-氨基-n-[3-[n-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯基]-2-甲基丙酰胺(sar 245408或xl 147)；和(s)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(byl719)。
[0299]
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可与mtor抑制剂联合使用，例如，选自以
下的一种或多种mtor抑制剂：雷帕霉素、西罗莫司azd8055、bez235、bgt226、xl765、pf-4691502、gdc0980、sf1126、osi-027、gsk1059615、ku-0063794、wye-354、palomid 529(p529)、pf-04691502或pki-587。雷帕霉素衍生物(ridaforolimus)(正式名称为deferolimus，(1r,2r,4s)-4-[(2r)-2[(1r,9s,12s,15r,16e,18r,19r,21r,23s,24e,26e,28z,30s,32s,35r)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六三十烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基膦酸盐，也称为ap23573和mk8669，并在pct公开号wo 03/064383中描述)；依维莫司(或rad001)；雷帕霉素(ay22989、)；simapi-mod(cas 164301-51-3)；埃西罗莫司，(5-{2,4-双[(3s)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(azd8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(pf04691502、cas 1013101-36-4)；和n2-[1,4-二氧-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4h-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-l-精氨酰甘氨酸-l-α-天冬氨酰l-丝氨酸-内盐(sf1126、cas 936487-67-1)、(1r,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1h-吲哚-2-基)咪唑并[1,5-f][1,2,4]三嗪-7-基)环己烷羧酸(osi-027)；和xl765。
[0300]
在一些实施方案中，所述细胞疗法可以与braf抑制剂联合使用，例如gsk2118436、rg7204、plx4032、gdc-0879、plx4720和甲苯磺酸索拉非尼(bay 43-9006)。在进一步的实施方案中，braf抑制剂包括但不限于：瑞戈非尼(bay73-4506、cas 755037-03-7)；图维扎尼(tuvizanib)(av951、cas 475108-18-0)；威罗非尼(vemurafenib)(plx-4032、cas 918504-65-1)；恩科拉非尼(encorafenib)(也称为lgx818)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1h-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-n-[4-(三氟甲基)苯基-1h-苯并咪唑-2-胺(raf265、cas 927880-90-8)；5-[1-(2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(gdc-0879、cas 905281-76-7)；5-[2-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1h-茚-1-酮肟(gsk2118436或sb590885)；(+/-)-甲基(5-(2-(5-氯-2-甲基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1h-异吲哚-1-基)-1h-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸酯(也称为xl-281和bms908662)和n-(3-(5-氯-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-碳1)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(也称为plx4720)。
[0301]
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可以与mek抑制剂联合使用。任何mek抑制剂都可以被联合使用，包括但不限于：司美替尼(selumetinib)(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-n-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1h-苯并咪唑-6-甲酰胺，也称为azd6244或arry 142886)；arry-142886曲美替尼二甲基亚砜(trametinib dimethyl sulfoxide)(gsk-1120212、cas 1204531-25-80)；g02442104(又称gsk1120212)、rdea436；n-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2r)-2,3-二羟丙基]-环丙磺酰胺(也称为rdea119或bay869766)；rdea119/bay 869766、as703026；g00039805(也称为azd-6244或司美替尼)，bix 02188；bix 02189；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-n-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺(也称为ci-1040或pd184352)；ci-1040(pd-184352)，n-[(2r)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称为pd0325901)；pd03259012'-氨基-3'-甲氧基黄酮(也称为pd98059，可从德国的biaffin gmbh&co.kg公司获得)；pd98059、2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为u0126)；u0126、xl-518(也称为
gdc-0973、目录号1029872-29-4，可从acc corp.公司获得)；gdc-0973(甲酮、[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-(25)-2-基-1-氮杂环丁烯基]-)、g-38963；和g02443714(也称为as703206)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。mek抑制剂的其他实例包括但不限于：贝尼替尼(benimetinib)(6-(4-溴-2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3h-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基乙氧基)-酰胺，也称为mek162、cas 1073666-70-2)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称为u0126并且描述于美国专利号2,779,780)；(3s,4r,5z,8s,9s,11e)-14-(乙胺基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1h-2-苯并异环十四烷-1,7(8h)-二酮](也称为e6201)；威罗非尼(plx-4032、cas 918504-65-1)；(r)-3-(2,3-二羟丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3h,8h)-二酮(tak-733、cas 1035555-63-5)；吡马塞替布(pimasertib)(as-703026、cas 1204531-26-9)；2-(2-氟代-4-碘苯基氨基)-n-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(azd 8330)；和3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-n-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]恶嗪-2-基)甲基]苯甲酰胺(ch4987655或ro 4987655)。
[0302]
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可以与jak2抑制剂联合使用，例如cep-701、incb18424、cp-690550(托法替尼(tasocitinib))。示例jak抑制剂包括但不限于：鲁索利替尼(ruxolitinib)托法替尼(tofacitinib)(cp690550)；阿西替尼(ag013736、cas 319460-85-0)；5-氯-n2-[(1s)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-n4-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(azd1480、cas 935666-88-9)；(9e)-15-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三氧-19,21,24-三氮杂四环[18.3.1.12,5.114,18]-六碳-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(sb-1578、cas 937273-04-6)；莫洛替尼(momelotinib)(cyt 387)；巴瑞克替尼(baricitinib)(incb-028050或ly-3009104)；帕克替尼(pacritinib)(sb1518)；(16e)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]七碳-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-癸烯(sb 1317)；甘多替尼(gandotinib)(ly 2784544)；和n,n-环丙基-4-[(1,5-二甲基-1h-吡唑-3-基)氨基]-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基-咪唑[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-甲酰胺(bms 911543)。
[0303]
在一些实施方式案中，本文公开的联合疗法包括紫杉醇或紫杉醇制剂，例如蛋白结合的紫杉醇(例如)。示例性紫杉醇制剂包括但不限于：纳米粒子白蛋白结合型紫杉醇(abrax-ane，由阿博利斯科学公司投入市场)、二十二碳六烯酸结合型紫杉醇(dha紫杉醇，泰索普新，由普罗泰卡公司投入市场)、聚谷氨酸结合型紫杉醇(pg紫杉醇、紫杉醇聚葡糖、ct-2103、xyotax，由细胞公司投入市场)、肿瘤激活的前药(tap)、ang105(与三种紫杉醇分子结合的angiopep-2，由免疫元公司投入市场)、紫杉醇ec-1(与erbb2识别肽ec-1结合的紫杉醇；参见li等，biopolymers(2007)87:225-230)和葡萄糖偶联的紫杉醇(例如，2
’‑
紫杉醇甲基-2-吡喃葡萄糖基琥珀酸盐)。
[0304]
方法
[0305]
本公开提供了用于产生工程改造的细胞的方法。在一些方面，该方法可以包括(a)将表达嵌合多肽的核酸分子递送到细胞中；和(b)在细胞中表达核酸分子，从而产生工程改造的细胞。嵌合多肽可以是本文所述的嵌合抗原受体。
[0306]
本公开还提供了本文所述的给予工程改造的细胞的方法。工程改造的细胞可以是工程改造的免疫细胞。工程改造的免疫细胞可以是t细胞。工程改造的免疫细胞可以来源于
自体t细胞。工程改造的免疫细胞可以来源于同种异体t细胞。
[0307]
在一些方面，本文提供了用于给予包含嵌合多肽的工程改造的免疫细胞的方法，所述嵌合多肽包含(i)能够增强所述工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)能够在将所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触后实现所述工程改造的免疫细胞死亡的诱导性细胞死亡部分。增强子部分可以与诱导性细胞死亡部分相连。工程改造的免疫细胞可进一步包含含有结合部分的一个或多个嵌合抗原受体(car)。结合部分可以包括第一抗原结合域，当给予受试者时，第一抗原结合域抑制或减少受试者对工程改造的免疫细胞的免疫反应。结合部分可以进一步包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。一个或多个car的单个car可以包括(i)第一抗原结合域、(ii)第二抗原结合域或(iii)第一抗原结合域和第二抗原结合域两者。一个或多个car中的各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0308]
在一些方面，本文提供了给予工程改造的免疫细胞的方法，所述工程改造的免疫细胞包含含有结合部分的一个或多个嵌合抗原受体(car)。结合部分可以包括能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。一个或多个car中各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。工程改造的免疫细胞可进一步包含能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些情况下，工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。工程改造的免疫细胞可表现出(i)当有与工程改造的免疫细胞异源的细胞(例如癌细胞、免疫细胞或两者)存在下，体外保持存活至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500天或更多天，(ii)在15天内扩增程度提高至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、200倍、250倍、300倍或更多，或(iii)与包含一个或多个car但不包含增强子部分的其它工程改造的免疫细胞相比,对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞的细胞毒性增强。在一些情况下，工程改造的免疫细胞可表现出在30天内扩增程度提高至少约50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、100-倍、110-倍、120-倍、130-倍、140-倍、150-倍、160-倍、170-倍、180-倍、190-倍、200-倍、210-倍、220-倍、230-倍、240-倍、250-倍、260-倍、270-倍、280-倍、290-倍、300-倍、350-倍、400-倍、450-倍、500-倍或更多。在一些情况下，工程改造的免疫细胞可表现出在60天内扩增程度提高至少约100-倍、200-倍、300-倍、400-倍、500-倍、600-倍、700-倍、800-倍、900-倍、1,000-倍、2,000-倍、3,000-倍、4,000-倍、5,000-倍、6,000-倍、7,000-倍、8,000-倍、9,000-倍、10,000-倍、20,000-倍、30,000-倍、40,000-倍、50,000-倍、60,000-倍、70,000-倍、80,000-倍、90,000-倍、100,000-倍、200,000-倍、300,000-倍、400,000-倍、500,000-倍、600,000-倍、700,000-倍、800,000-倍、900,000-倍、1,000,000-倍或更多。可以在有刺激(例如，由癌抗原或癌细胞刺激)存在下测量存活或扩增。可以在有多轮或重复刺激存在下测量存活或扩增。
[0309]
在一些方面，本文提供了给予细胞(例如，工程改造的免疫细胞)的方法，所述细胞包括功能上无活性的t细胞受体(tcr)。该细胞还可包含一个或多个嵌合抗原受体(car)。一个或多个car中各单独的car可以包含结合部分。所述结合部分可以包含(i)第一抗原结合域和(ii)结合疾病相关抗原的第二抗原结合域，所述第一抗原结合结构域在给予受试者时
抑制或减少受试者对工程改造的免疫细胞的免疫应答。一个或多个car中各car可以进一步包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
[0310]
在一些方面，本文提供了给予工程改造的免疫细胞的方法，所述工程改造的免疫细胞包含能够增强工程免疫细胞一种或多种活性的增强子部分。工程改造的细胞可进一步包含嵌合抗原受体(car)，其包含特异性结合cd7的抗原结合域。car可进一步包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。工程改造的免疫细胞中的内源性cd7可以失活。在一些实施方式中，工程改造的细胞可包含car，其包含特异性结合免疫细胞抗原的抗原结合域。免疫细胞抗原可以是本文所述的任何免疫细胞抗原，例如cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ和slamf7。抗原结合域结合的工程改造的细胞的内源性免疫细胞抗原可在工程改造的细胞中失活。
[0311]
在一些方面，本文提供了给予包含单个嵌合抗原受体(car)的工程改造免疫细胞的方法，所述单个car包含：(i)特异性结合cd7的第一抗原结合域和(ii)能够结合cs1的第二抗原结合域。所述car还可以包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。编码内源性cs1和/或cd7的基因可以在工程改造的免疫细胞中失活。
[0312]
在一些方面，本文提供给予包含单个嵌合抗原受体(car)的工程改造的免疫细胞的方法，所述单个car包含：(i)特异性结合cd137的第一抗原结合域和(ii)能够结合cs1的第二抗原结合域。所述car还可以包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。编码内源性cs1和/或cd137的基因可在工程改造的免疫细胞中失活。
[0313]
本公开还提供了或诊断受试者疾病的方法。在一些情况下，该方法包括给予受试者包含工程改造的免疫细胞的药物组合物。药物组合物中的工程改造的免疫细胞可以来源于同种异体免疫细胞。源自同种异体免疫细胞的工程改造免疫细胞可能不会在受试者中诱导移植物抗宿主病(gvhd)。药物组合物中工程改造的免疫细胞可以来源于自体免疫细胞。在一些情况下，药物组合物中工程改造的免疫细胞的内源性tcr在功能上无活性。与具有功能活性tcr的免疫细胞相比，工程改造的免疫细胞可以减少受试者的gvhd。在一些情况下，药物组合物中工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子(例如b2m)在功能上无活性。与具有功能活性mhc分子(如b2m)的免疫细胞相比，工程改造的免疫细胞可以减少受试者的gvhd。这种疾病可以是癌症。例如，癌症可以是淋巴瘤或白血病。
[0314]
本公开还提供了递送同种异体细胞的方法，包括给予有需要的受试者工程改造的免疫细胞。该的各工程改造的免疫细胞可包含含有结合部分的一个或多个嵌合抗原受体(car)。结合部分可以包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合域。结合部分可以进一步包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合域。当给予受试者时，第一抗原结合域可以抑制或减少受试者对工程改造的免疫细胞的免疫反应。工程改造的免疫细胞可进一步包含能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可以失活。例如，编码tcr亚基的基因可以失活。工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子可以失活。例如，编码mhc亚基(如b2m)的基因可以失活。本文描述的各种基因编辑方法可用于失活t细胞的内源性tcr。
[0315]
在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括激活细胞。在一些情况下，可以在制备工程改造的免疫细胞之前激活用于制备工程改造的免疫细胞的细胞。在一些情况下，工程改造的免疫细胞可以被激活。本文所用的激活可以指细胞从静止状态转变为活跃状态的过程。该过程可以包括对抗原的反应、迁移和/或表型或遗传改变到功能活性状态。在一些方面，激活可以指t细胞激活的逐步过程。在一些情况下，t细胞可能需要一个或多个信号，从而被激活。例如，t细胞可能需要至少两个信号才能完全激活。第一信号可以在tcr与抗原mhc复合物结合后发生，第二信号可以通过共刺激分子的结合而发生。抗-cd3抗体(或其功能变体)可以模拟第一信号，而抗-cd28抗体(或其功能变体)在体外可以模拟第二信号。
[0316]
在一些方面，本文提供的方法可以包括激活细胞。可通过使细胞与附着有可刺激cd3-tcr复合物相关信号的试剂和可刺激细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来进行活化。特别地，可以在体外刺激t细胞，例如通过与抗-cd3抗体或其抗原结合片段接触，或通过与固定在表面上的抗-cd2抗体接触，或有时与钙离子载体结合的蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑制素)接触。为共同刺激t细胞表面的辅助分子，可以利用结合辅助分子的配体。例如，可以在能够刺激t细胞增殖的条件下，使细胞与抗-cd3抗体和抗-cd28抗体接触。在一些情况下，可利用4-1bb刺激细胞。例如，可以利用4-1bb和il-21或另一细胞因子刺激细胞。对于cd4 t细胞或cd8 t细胞的活化，可以利用抗-cd3抗体和抗-cd28抗体。例如，提供信号的试剂可以在溶液中或与固相表面偶联。颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。在进一步的实施方式中，细胞(例如t细胞)可以与试剂包被的珠结合，其中细胞随后可以和珠分离，并任选培养。各珠可以包被有抗-cd3抗体或抗-cd28抗体，或者在一些情况下，两者的组合。在另一实施方式中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。可以通过将抗-cd3抗体和抗-cd28抗体可以附着的顺磁性珠(3x28珠)接触t细胞来偶联细胞表面蛋白。在一个实施方式中，将细胞和珠(例如，cd3/cd28 t顺磁性珠，比例为1:1)混合在缓冲液，例如磷酸缓冲盐水(pbs)(例如，不含钙和镁等二价阳离子)中。可以采用任何细胞浓度。该混合物可培养约数小时(例如约3小时)至或至约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施方式中，混合物可培养约21天或最多或最多约21天。适合t细胞培养的条件可以包括适当的培养基(例如，最低基本培养基或rpmi培养基1640或x-vivo 5(隆萨公司))，其可以含有增殖和存活所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-g、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-21、il-15、tgf-β和tnfα或用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、等离子酸盐和还原剂，如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi 1640、a1 m-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo 1和x-vivo20、optimizer，其中添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充了适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使t细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素，如青霉素和链霉素，只能包含在实验培养物中，可能不包含在要注入受试者的细胞培养物中。靶细胞可以维持在支持生长所需的条件下；例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％co2)。在一些情况下，暴露于不同刺激时间的t细胞可能表现出不同的特征。在一些情况下，可使用针对人cd3、cd28、cd2或其任何组合的可溶性单特异性四聚体抗体。在一些实施方式中，活化可利用活化部分、共刺激剂及其任何组合。在一些方面，活化部分结合：cd3/t细胞受体复合物和/或提供共刺激。
在一些方面，活化部分是抗-cd3抗体和/或抗-cd28抗体中的任一种。在一些方面，固相是珠、板和/或基材中的至少一种。在一些方面，固相是珠。作为替代或补充，活化部分可以不与基材偶联，例如活化部分可以在介质中自由浮动。
[0317]
在一些情况下，可以通过与组织或细胞共培养来激活或扩增细胞。细胞可以是抗原呈递细胞。人工抗原呈递细胞(aapc)可以表达t细胞受体的配体和共刺激分子，并可以激活和扩增t细胞进行转移，同时在一些情况下提高其效力和功能。aapc可以被工程改造以表达任何供t细胞活化的基因。aapc可以被工程改造以表达任何用于t细胞扩增的基因。aapc可以是珠、细胞、蛋白、抗体、细胞因子或任何组合。aapc可以向可能经历基因组移植的细胞传递信号。例如，aapc可以递送信号1、信号2、信号3或任何组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以是通过肽-mhc复合物结合tcr或结合针对cd3的激动性抗体，从而激活cd3信号转导复合物。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以是抗cd28、诱导性共刺激物(icos)、cd27和4-1bb(cd137)，它们分别与icos-l、cd70和4-1bbl结合。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。细胞因子可以是il-2、il-7、il-12、il-15、il-21或其任何组合。在一些情况下，人工抗原呈递细胞(aapc)可用于激活和/或扩增细胞。在一些情况下，人工物可能不会诱导异体特异性。在一些情况下，aapc可能不表达hla。aapc可经遗传修饰以稳定表达可用于激活和/或刺激的基因。在一些情况下，k562细胞可用于活化。k562细胞也可用于扩增。k562细胞可以是人红白血病细胞系。k562细胞可被工程改造以表达感兴趣的基因。k562细胞可能不内源性表达i、ii类hla或cd1d类分子，但可能表达icam-1(cd54)和lfa-3(cd58)。k562可以被工程改造为向t细胞递送信号1。例如，k562细胞可被工程改造以表达i类hla。在一些情况下，可将k561细胞设计成表达额外的分子，如b7、cd80、cd83、cd86、cd32、cd64、4-1bbl、抗-cd3、抗-cd3mab、抗-cd28、抗-cd28mab、cd1d、抗-cd2、膜结合的il-15、膜结合的il-17、膜结合的il-21、膜结合的il-2、截短的cd19或任何组合。在一些情况下，除了cd80和cd83外，工程改造的k562细胞还可以表达膜形式的抗-cd3mab、克隆okt3。在一些情况下，除cd80和cd83外，工程改造的k562细胞还可以表达膜形式的抗-cd3 mab、克隆okt3、膜形式的抗-cd28 mab。
[0318]
aapc可以是珠。球形聚苯乙烯珠可以包被有抗cd3和cd28的抗体，并用于t细胞活化。珠可以是任何尺寸。在一些情况下，珠可以是或可以是约3微米和6微米。珠的尺寸可以是或可以是约4.5微米。珠可以按照任何细胞与珠的比率使用。例如，每毫升100万个细胞时，可以使用3比1的珠细胞比。aapc还可以是刚性球形颗粒、聚苯乙烯胶乳微珠、磁性纳米或微粒、纳米尺寸量子点、4，聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)微球、非球形颗粒、5，碳纳米管束、6，椭球状plga微粒、7，纳米蠕虫、含流体脂质双层的系统、8，2d支撑的脂质双层(2d slb)、9，脂质体、10，raftsomes/微结构域脂质体、11，slb颗粒或其任何组合。在一些情况下，aapc可以扩增cd4 t细胞。例如，可以工程改造aapc以模拟ii类hla限制性cd4 t细胞的抗原处理和呈递途径。可以工程改造k562以表达hla-d、dpα、dpβ链、ii、dmα、dmβ、cd80、cd83或其任何组合。例如，工程改造的k562细胞可以用hla限制性肽作脉冲，以扩增hla限制的抗原特异性cd4 t细胞。在一些情况下，aapc的使用可以与外源性引入的细胞因子结合，用于t细胞活化、扩增或任何组合。细胞也可以在体内扩增，例如在给予受试者基因组移植的细胞后，在受试者的血液中扩增。
[0319]
在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括细胞的转导。在一些实施方式中，
方法包括引入编码细胞受体，如嵌合抗原受体和/或t细胞受体的多核苷酸。在一些情况下，可以进行细胞的转染。
[0320]
在一些实施方式中，产生包含编码细胞受体，如car和/或tcr的多核苷酸的病毒上清液。在一些实施方式中，病毒载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺相关病毒载体。包装细胞可用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞可包括293细胞(例如，用于包装腺病毒)和psi2细胞或pa317细胞(例如用于包装逆转录病毒)。可以通过生产将核酸载体包装成病毒颗粒的细胞系来产生病毒载体。载体可以包含包装和随后整合到宿主中所需的最小病毒序列。载体可包含被待表达多核苷酸的表达盒替代的其他病毒序列。缺失的病毒功能可以由包装细胞系反式提供。例如，aav载体可以包括来自aav基因组的itr序列，这些序列是包装和整合到宿主基因组中所必需的。病毒dna可以包装在细胞系中，该细胞系可以包含编码其它aav基因的辅助质粒，即rep和cap，但缺少itr序列。细胞系也可以用腺病毒感染作为辅助。辅助病毒可以促进aav载体的复制和来自辅助质粒的aav基因的表达。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒比aav更敏感。可以采用将核酸递送至细胞的其它方法，例如us20030087817中所述，其通过引用并入本文。
[0321]
在一些实施方式中，宿主细胞可以用本文描述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。细胞可以像它在受试者体内自然发生那样被转染。细胞可以取自或衍生自受试者并转染。细胞可以来源于取自受试者的细胞，例如细胞系。在一些实施方式中，用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一种或更多种载体衍生序列的新细胞系。用于真核宿主细胞的载体的非限制性实例包括但不限于：pbs、pqe-9(凯杰公司)、phagescript、psix174、pbluescript sk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(斯特拉塔基因公司)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr54o、prit5(法玛西亚公司)。真核生物：pwl-neo、psv2cat、pog44、pxt1、psg(斯特拉塔基因公司)psvk3、pbpv、pmsg、psvl(法玛西亚公司)。此外，可以使用任何其它质粒和载体，只要它们在选定的宿主中是可复制的和可存活的。任何载体和商业上可用的载体(及其变体或衍生物)都可以被工程改造，以包括一个或多个重组位点，从而用于方法中。此类载体可获自，例如载体实验室公司、英杰公司、普罗迈格公司、诺瓦金公司、neb、克隆技术公司、柏林格曼海姆公司、法玛西亚公司、埃匹中心公司、起源基因技术公司、斯特拉塔基因公司、珀金埃尔默公司、法玛金公司和研遗公司。其它感兴趣的载体包括真核表达载体，例如pfastbac、pfastbacht、pfastbacdual、psfv和ptet-splice(英杰公司)，peuk-c1、ppur、pmam、pmamneo、pbi101、pbi121、pdr2、pcmvebna和pyacneo(克隆技术公司)，psvk3、psvl、pmsg、pch110和pkk232-8(法玛西亚公司)，p3'ss、pxt1、psg5、ppbac、pmbac、pmclneo和pog44(斯特拉塔基因公司)，和pyes2、pac360、pblueba-chis a、b和c、pvl1392、pbluebac111、pcdm8、pcdna1、pzeosv、pcdna3 prep4、pcep4和pebvhis(英杰公司)和它们的变体或衍生物。其它载体包括puc18、puc19、pbluescript、psport、粘粒、噬菌粒、yac(酵母菌人工染体)、bac(细菌人工染体)、p1(大肠杆菌(escherichia coli)噬菌体)、pqe70、pqe60、pqe9(全安公司)、pbs载体、phagescript载体、bluescript载体、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(斯特拉塔基因公司)、pcdna3(英杰公司)、pgex、ptrsfus、ptrc99a、pet-5、pet-9、pkk223-3、pkk233-3、pdr540、prit5(法玛西亚公司)、psport1、psport2、pcmvsport2.0和psysport1(英杰公司)及其变体或衍生物。其它感兴趣的载体还包括ptrxfus、pthiohis、plex、ptrchis、ptrchis2、prset、pblueba-chis2、pcdna3.1/his、
pcdna3.1(-)/myc-his、psectag、pebvhis、ppic9k、ppic3.5k、pa081s、ppicz、ppicza、ppiczb、ppiczc、pgapza、pgapzb、pgapzc、pblue-bac4.5、pbluebachis2、pmelbac、psinrep5、psinhis、pind、pind(sp1)、pvgrxr、pcdna2.1、pyes2、pzer01.1、pzero-2.1、pcr-blunt、pse280、pse380、pse420、pvl1392、pvl1393、pcdm8、pcdna1.1、pcdna1.1/amp、pcdna3.1、pcdna3.1/zeo、pse、sv2、prc/cmv2、prc/rsv、prep4、prep7、prep8、prep9、prep 10、pcep4、pebvhis、pcr3.1、pcr2.1、pcr3.1-uni和pcrbac，来自英杰公司；x excell、x gt11、ptrc99a、pkk223-3、pgex-1x t、pgex-2t、pgex-2tk、pgex-4t-1、pgex-4t-2、pgex-4t-3、pgex-3x、pgex-5x-1、pgex-5x-2、pgex-5x-3、pezz18、prit2t、pmc1871、psvk3、psvl、pmsg、pch110、pkk232-8、psl1180、pneo和puc4k，来自法玛西亚公司；pscreen-lb(+)、pt7蓝(r)、pt7蓝-2、pcite-4-abc(+)、pocus-2、ptag、pet-32l1c、pet-30lic、pbac-2cp lic、pbacgus-2cp lic、pt7蓝-2lic、pt7蓝-2、x screen-1、x蓝星、pet-3abcd、pet-7abc、pet9abcd、pet11 abcd、pet12abc、pet-14b、pet-15b、pet-16b、pet-17b-pet-17xb、pet-19b、pet-20b(+)、pet-21abcd(+)、pet-22b(+)、pet-23abcd(+)、pet-24abcd(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28abc(+)、pet-29abc(+)、pet-30abc(+)、pet-31b(+)、pet-32abc(+)、pet-33b(+)、pbac-1、pbacgus-1、pbac4x-1、pbacgus4x-1、pbac-3cp、pbacgus-2cp、pbacsurf-1、plg、信号plg、pyx、selecta vecta-neo、selecta vecta-hyg和selecta vecta-gpt，来自诺瓦金公司；plexa、pb42ad、pgbt9、pas2-1、pgad424、pact2、pgad gl、pgad gh、pgad10、pgilda、pezm3、pegfp、pegfp-1、pegfpn、pegfp-c、pebfp、pgfpuv、pgfp、p6xhis-gfp、pseap2-基础、pseap2-对照、pseap2-启动子、pseap2-增强子、p i3gal-基础、pl3gal-对照、p i3gal-启动子、p i3gal-增强子、pcmv、ptet-off、ptet-on、ptk-hyg、pretro-off、pretro-on、pires1neo、pires1hyg、plxsn、plncx、plapsn、pmamneo、pmamneo-cat、pmamneo-luc、ppur、psv2neo、pyex4t-1/2/3、pyex-s1、pbacpak-his、pbacpak8/9、pacuw31、bacpak6、ptriplex、2xgt10、xgt11、pwe15和x triplex，来自克隆技术公司；lambda zap ii、pbk-cmv、pbk-rsv、pbluescript ii ks+/-、pbluescript ii sk+/-、pad-gal4、pbd-gal4 cam、psurfscript、lambda fix ii、lambda dash、lambda embl3、lambda embl4、supercos、pcr-scrigt amp、pcr-script cam、pcr-script direct、pbs+/-、pbc ks+/-、pbc sk+/-、phagescript、pcal-n-ek、pcal-n、pcal-c、pcal-kc、pet-3abcd、pet-llabcd、psputk、pesp-1、pcmvlaci、poprsvi/mcs、popi3 cat、pxt1、psg5、ppbac、pmbac、pmclneo、pmclneo poly a、pog44、p0g45、pfrti3gal、pne0i3gal、prs403、prs404、prs405、prs406、prs413、prs414、prs415和prs416，来自斯特拉塔基因公司；ppc86、pdbleu、pdbtrp、ppc97、p2.5、pgad1-3、pgad10、pact、pact2、pgadgl、pgadgh、pas2-1、pgad424、pgbt8、pgbt9、pgad-gal4、plexa、pbd-gal4、phisi、phisi-1、placzi、pb42ad、pdg202、pjk202、pjg4-5、pnlexa、pyestrp和它们的变体或衍生物。在一些实施方式中，载体可以是小环载体(minicircle vector)。本文提供的载体可用于递送编码car和/或tcr的多肽(多核苷酸)。
[0322]
转导和/或转染可以通过以下任一种方式进行：非病毒转染、生物列表法、化学转染、电穿孔、核转染、热休克转染、脂质转染、微注射或病毒转染。在一些实施方式中，所提供的方法包括病毒转导，并且所述病毒转导包括慢病毒。病毒颗粒可用于离体或体内将包含编码细胞受体的多肽序列的病毒载体递送到细胞中。在一些情况下，可以测量本文所公开的病毒载体的pfu(斑块形成单位)。在一些情况下，本公开的组合物和方法的重组病毒或表
达载体的pfu可以是约108–
约5
×
10
10
pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒是至少约1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
和5
×
10
10
pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒是至多约1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
和5
×
10
10
pfu。在一些方面，本公开的表达载体可以作为载体基因组来检测。在一些方面，本公开的重组病毒是1
×
10
10-3
×
10
12
个载体基因组、或1
×
10
9-3
×
10
13
个载体基因组、或1
×
10
8-3
×
10
14
个载体基因组、或至少约1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
和1
×
10
18
个载体基因组，或是1
×
10
8-3
×
10
14
个载体基因组，或是至多约1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
和1
×
10
18
个载体基因组。在一些情况下，本文提供的病毒载体可以利用感染复数(moi)来测量。在一些情况下，moi可以指载体或病毒基因组与递送核酸的细胞的比率或倍数。在一些情况下，moi可以是1
×
106。在一些情况下，moi可以是1
×
10
5-1
×
107。在一些情况下，moi可以是1
×
10
4-1
×
108。在一些情况下，本公开的重组病毒是至少约1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
和1
×
10
18
moi。在一些情况下，本公开的重组病毒是1
×
10
8-3
×
10
14
moi，或至多约1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
和1
×
10
18
moi。在一些情况下，将病毒载体以约1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x1064x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107或至多约9x109个基因组拷贝/病毒颗粒每细胞的感染复数(moi)引入。
[0323]
利用本文描述的任何核酸递送平台(例如转导)的细胞转染效率可以是或可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或高于99.9％。在一些实施方式中，方法可以包括将感染剂添加到包含细胞的组合物中。感染剂可以包括聚凝胺。在一些方面，感染剂可以提高病毒感染的效率。感染剂可将病毒感染力提高约100至1000倍。可以将约5ug至10ug/ml浓度的聚凝胺加入组合物。
[0324]
在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括将细胞受体引入细胞的非病毒方法。非病毒方法可以包括但不限于：crispr相关蛋白(cas蛋白，例如cas9)、锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、精氨酸核酸酶和巨核酸酶。核酸酶可以是天然存在的核酸酶、遗传修饰的核酸酶和/或重组核酸酶。也可以使用基于转座子的系统(例如piggybac、睡美人)进行非病毒方法。
[0325]
在一些实施方式中，本文提供的方法可以利用piggybac系统将外源多肽引入细胞。piggybac系统包括两个组分，一转座子和一转座酶。piggybac转座酶促进转座子在基因组中随机分布的“ttaa”位点处的整合。基因组中“ttaa”的预测频率约为dna序列的每256个碱基对中的1个。与其他转座子不同，pb转座酶还能够以完全无缝的方式切除转座子，不留下序列或突变。此外，piggybac的承载能力高(已证明超过200kb)，且没有已知的上限。pb性
能水平可以通过密码子优化策略、突变、缺失、添加、替换及其任何组合来提高。在一些情况下，pb可以具有更大的承载量(约9.1
–
14.3kb)、更高的转座活性，并且其无足迹特性可以使其作为基因编辑工具具有吸引力。在一些方面，pb可以包括几个特征：高效转座；承载量高；长期稳定表达；将转基因整合为单个拷贝；通过非侵入性标记而非pcr等传统方法在体内追踪靶基因；易于确定整合位点，和它们的组合。
[0326]
在一些方面，本文提供的方法可以利用睡美人(sb)系统将编码细胞受体的多肽引入细胞。sb是通过体外进化从鲑鱼基因组中发现的古代tc1/mariner转座子化石中改造而来的。sb-itr(230bp)包含长度为32bp的不完全直接重复序列(dr)，可作为转座酶的识别信号。itr内dr元件之间的结合亲和力和间距参与了转座活动。sb转座酶可以是39kda的蛋白质，具有dna结合多肽、核定位信号(nls)和催化结构域，其特征是保守氨基酸基序(dde)。对sb转座酶的主要氨基酸序列进行诱变的各种筛选获得了过度活跃的转座酶。在某些情况下，可以使用经修饰的sb。经修饰的sb可以在原始sb转座子的itr内包含突变、缺失和添加。经修饰的sb可包含：pt2、pt3、pt2b、pt4、sb100x和它们的组合。经修饰的sb的非限制性实例可选自：sb10、sb11(比sb10高3-倍)、sb12(比sb10高4-倍)、hsb1
–
hsb5(比sb10高最多10-倍)、hsb13
–
hsb17(hsb17比sb10高17-倍)、sb100x(比sb10高100-倍)、sb150x(比sb10高130-倍)和它们的任何组合。在一些情况下，与最初复活的转座酶(sb10)相比，sb100x是100倍的过度活性。在一些方面，sb转座切除在负载位点留下足迹(3bp)。整合到基因组的ta二核苷酸中，并导致宿主修复机制产生的靶位点重复。在一些情况下，sb似乎具有近乎无偏好、接近随机的整合曲线。在野生型系统中，转座子整合可以被人工靶向(约10％)预定的基因组位点，然而在本文提供的嵌合系统中，sb转座子整合可以以超过10％的效率被靶向预定的位点。
[0327]
在一些方面，可以采用非病毒方法将外源性多核苷酸引入细胞。在一些方面，可以在不使用病毒的情况下递送非病毒载体或核酸，并且可以根据核酸的量来测量。任何合适量的核酸通常都可以与本公开的组合物和方法联用。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可以是至多约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。
[0328]
在一些实施方式中，将car和/或tcr序列引入细胞的非病毒方法可以包括电穿孔。例如，可以使用转染系统(赛默飞世尔科技公司)或nucleofector(生物系统公司)进行电穿孔。可以调整电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞活力。电穿孔装置可以具有多种电波形脉冲设置，如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型都具有唯一的最佳场强(e)，这取决于所施加的脉冲参数(例如电压、电容和电阻)。应用最佳场强通过诱导跨膜电压引起电渗透，从而使得核酸通过细胞膜。在一些情况下，可以调节电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数、细胞密度和尖端类型以优化转染效率和/或
细胞活力。
[0329]
在一些实施方式中，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔电压可以小于约500伏。在一些情况下，电穿孔电压可以是至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲电压可能是细胞类型特异性的。例如，1900伏的电穿孔电压对于巨噬细胞细胞来说可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一例子中，约1350伏的电穿孔电压对于jurkat细胞或原代人细胞(如t细胞)可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔电压有一范围可能是最佳的。例如，在约1000伏和约1300伏之间的电穿孔电压对于人578t细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞可以是淋巴细胞。
[0330]
在一些实施方式中，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可以小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可以是至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力的电穿孔脉冲宽度可以是细胞类型特异性的。例如，30毫秒的电穿孔脉冲宽度对于巨噬细胞是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一例子中，约10毫秒的电穿孔宽度对于jurkat细胞可以是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度有一范围可能是最佳的。例如，在约20毫秒和约30毫秒之间的电穿孔宽度对于人578t细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
[0331]
在一些实施方式中，可以改变电穿孔脉冲的数量以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔可以包括单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可以包括多于一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可以包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或10个或更多个脉冲。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲数可能是细胞类型特异性的。例如，单脉冲电穿孔可能对巨噬细胞细胞是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一例子中，3个脉冲的电穿孔对于原代细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度有一范围可能是最佳的。例如，约1至约3个脉冲之间的电穿孔对于人类细胞
可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
[0332]
在一些情况下，可以改变电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以小于约1x105个细胞。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以至少约1x105个细胞、至少约2x105个细胞、至少约3x105个细胞、至少约4x105个细胞、至少约5x105个细胞、至少约6x105个细胞、至少约7x105个细胞、至少约8x105个细胞、至少约9x105个细胞、至少约1x106个细胞、至少约1.5x106个细胞、至少约2x106个细胞、至少约2.5x106个细胞、至少约3x106个细胞、至少约3.5x106个细胞、至少约4x106个细胞、至少约4.5x106个细胞、至少约5x106个细胞、至少约5.5x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约6.5x106个细胞、至少约7x106个细胞、至少约7.5x106个细胞、至少约8x106个细胞、至少约8.5x106个细胞、至少约9x106个细胞、至少约9.5x10个细胞、至少约1x107个细胞、至少约1.2x107个细胞、至少约1.4x107个细胞、至少约1.6x107个细胞、至少约1.8x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约2.2x107个细胞、至少约2.4x107个细胞、至少约2.6x107个细胞、至少约2.8x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约3.2x107个细胞、至少约3.4x107个细胞、至少约3.6x107个细胞、至少约3.8x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约4.2x107个细胞、至少约4.4x107个细胞、至少约4.6x107个细胞、至少约4.8x107个细胞、或至少约5x107个细胞。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔起始细胞密度可能是细胞类型特异性的。例如，1.5x106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于巨噬细胞细胞来说可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一示例中，5x106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔的起始细胞密度有一范围可能是最佳的。例如，在5.6x106和5x107个细胞之间的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞(例如t细胞)可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
[0333]
提供了淋巴恶性肿瘤的方法。该方法可包括向有需要的患者施用工程改造的免疫细胞。该的各工程改造的免疫细胞可以包括含有结合部分的一个或多个嵌合抗原受体(car)，其中结合部分可以包括能够结合免疫细胞抗原的抗原结合域，并且其中一个或多个car的各car可以进一步包括跨膜结构域和胞内信号传导结构域。该的各工程改造的免疫细胞可进一步包含能够增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)可失活。在一些情况下，在最后一次给予工程改造的免疫细胞后的一段时间(例如3周)内，患者的外周血中受影响的细胞数量或骨髓中受影响的细胞数量可减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些情况下，工程改造的免疫细胞最后一次给予后的时间可以是约1周、2周、3周、4周、5周或更长。患者外周血中的自体t细胞、粒细胞和nk细胞中的任一种或多种的数量可以在最后一次给予工程改造的免疫细胞后的一段时间内(例如，3周)开始增加。在一些情况下，工程改造的免疫细胞最后一次给予后的时间可以是约1周、2周、3周、4周、5周或更长。
[0334]
增强子部分可以增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。可以将增强子部分配置为组成型增强工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。可以将增强子部分配置为组成型上调工程改造的免疫细胞的一个或多个胞内信号传导通路。一个或多个胞内信号传导通路可以是一个或多个细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受
体。增强子部分可选自：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
[0335]
工程改造的免疫细胞可进一步包含诱导性细胞死亡部分，其能够在诱导性细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触后实现细胞死亡。诱导性细胞死亡部分可选自rapacasp9、icasp9，hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。例如，诱导性细胞死亡部分可以是egfrt，细胞死亡激活剂可以是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。例如，诱导性细胞死亡部分可以是hsv-tk，细胞死亡激活剂可以是gcv。例如，诱导性细胞死亡部分可以是icasp9，细胞死亡激活剂可以是ap1903。
[0336]
编码细胞的内源性表面标志物的基因可以失活。内源性表面标志物在表达时能够与第一抗原结合域结合。内源性表面标志物可以是cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd16a、cd16b、cd25、cd27、cd28、cd30、cd38、cd45、cd48、cd50、cd52、cd56、cd57、cd62l、cd69、cd94、cd100、cd102、cd122、cd127、cd132、cd137、cd160、cd161、cd178、cd218、cd226、cd244、cd159a(nkg2a)、cd159c(nkg2c)、nkg2e、cd279、cd314(nkg2d)、cd305、cd335(nkp46)、cd337、cd319(cs1)、tcrα、tcrβ或slamf7。
[0337]
患者外周血中自体t细胞、粒细胞和nk细胞中的任一种或多种的数量可以在外周血中受影响的细胞数量或骨髓中受影响的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之前开始增加。外周血中受影响的细胞数量或骨髓中受影响的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之后，外周血中自体t细胞、粒细胞和nk细胞中的任何一种或多种的数量可开始增加。
实施例
[0338]
尽管本发明的优选实施例已在本文中示出和描述，但对于本领域技术人员来说，这些实施例仅作为示例提供是显而易见的。本发明不受说明书中提供的具体示例的限制。虽然已经根据前述说明书描述了本发明，但本文中实施例的描述和图示并不意味着以限制性的意义进行解释。本领域技术人员将在不脱离本发明的情况下想到许多变种、变化和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文所述的取决于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明实施例的各种替代方案。因此，预期本发明还应涵盖任何此类替代、修饰、变种或等效物。以下权利要求意在限定本发明的范围，并且这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构意在由此被覆盖。
[0339]
实施例1表达cs1 car的car-t细胞的研究
[0340]
1.1靶向cs1的抗原结合域序列
[0341]
用cs1抗原和cs1阳性细胞免疫羊驼五轮，以获得滴度为≥1:128000的血浆抗体。使用外周血pbmc构建噬菌体文库后，通过富集和elisa筛选获得抗cs1纳米抗体。然后用富集的噬菌体作为模板扩增vhh区，并对扩增的序列进行下一代测序。根据序列频率(frequency)对获得的序列进行排序。前30个序列如表1所示。
[0342]
表1 cs1抗体序列
[0343]
[0344]
[0345][0346]
蛋白质筛选后，对阳性单克隆进行测序。测序结果如表2所示。
[0347]
表2按噬菌体-elisa亲和力排序的cs1阳性克隆
[0348]
[0349][0350]
1.2本技术的cs1单car、双car和三car的示例性设计
[0351]
设计了cs1单car、双car和三car，cs1单ca、双car和三car的示例结构如图1所示。
[0352]
实施例2 cs1 car-t细胞的制备
[0353]
2.1 cs1 car-t细胞的制备
[0354]
以2-8的moi用慢病毒载体转染原代t细胞，所述慢病毒载体包括下表3中列出的cs1 car，其中car-1至car-10是包括cs1 vhh抗体的cs1单car结构，car-r1至car-r3是包括cs1 scfv抗体的cs1单car结构。
[0355]
转染后，将细胞转移到烧瓶中，并在37℃、5％ co2下培养。转染后3天，使用抗gfp、抗信标(beacon)、cs1抗原检测细胞数量和car阳性细胞。如图3所示，t细胞中cs1 car的阳性率高于50％。
[0356]
表3用于制备cs1单car-t细胞的cs1 car的示例性序列
[0357]
[0358]
[0359][0360]
进一步验证了cs1 car-t细胞与cs1抗原的结合能力。简言之，用不同浓度的cs1抗原对cs1 car-t细胞进行染，然后通过流式细胞术分析阳性率。如图4a和4b所示，基于不同浓度cs1抗原下car-t细胞的阳性率计算t细胞上car与cs1的亲和力。
[0361]
2.2具有tcr ko的cs1 car-t细胞的制备
[0362]
用包括cs1 car的慢病毒载体转染原代t细胞。然后，通过crispr技术去除car-t细胞的trac基因。简言之，设计并合成了靶向trac的sgrna序列，sgrna的示例性序列包括：
[0363]
uucggaacccaaucacugacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuauc aacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。
[0364]
如图9a所示，使用抗cd3抗体通过facs分析grna的敲除效率。
[0365]
2.3具有cs1 ko的cs1 car-t细胞的制备
[0366]
设计并合成了靶向cs1的sgrna序列，sgrna的示例性序列如表4所示。
[0367]
表4t细胞中ko cs1的示例性sgrna序列
[0368][0369][0370]
在pcr管中以4:1的比例混合靶向cs1和cas9蛋白的sgrna，以获得rnp混合物。将混合物在37℃孵育15分钟以上，然后将其与从三个供体(#190023、#20005和#190036)获得的107个t细胞轻轻混合，随后通过电穿孔转染。转染后，将细胞在80μl预热培养基中孵育，并在培养箱中培养。转染的t细胞按cd4+或cd8+分类，并在抗原染后进行流式细胞术以检测cs1的表达。不同供体中cs1的敲除效率(％)如图2a和2b所示。
[0371]
2.4具有b2m ko的cs1 car-t细胞的制备
[0372]
用包括cs1 car的慢病毒载体转染原代t细胞。然后，通过crispr进一步去除car-t细胞的b2m基因。简言之，设计并合成了靶向trac的sgrna序列，sgrna的示例性序列包括：
[0373]
gaguagcgcgagcacagcuaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuauc aacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。
[0374]
如图9b所示，使用抗b2m抗体通过facs分析sgrna的敲除效率。
[0375]
实施例3 cs1 car-t细胞的效果
[0376]
3.1 cs1 car-t细胞的细胞毒性
[0377]
荧光素酶基因可以转染到靶细胞中。加入荧光素后，荧光素酶可以和荧光素反应产生荧光。通过检测荧光的强度，可以测量荧光素酶的活性，并且可以检测靶细胞的存活，从而评估cs1 car-t细胞的细胞毒性。特别是，将荧光素酶基因转入包括mm.1s-luc、nci-h929和rpmi8226细胞的靶细胞。然后，如图5a-5c所示，通过检测荧光强度分析具有cs1 ko的cs1 car-t细胞对靶细胞的细胞毒性。
[0378]
图5a显示，car-1至cdr-10 cs1 car-t细胞在不同的效：靶比(包括10:1、3:1和1:1)下显著增加了mm.1s-luc靶细胞的裂解百分比。图5b显示，car-1至cdr-10 cs1 car-t细胞在e:t比为10:1和3:1时显著增加了nci-h929靶细胞的裂解百分比。图5c显示，car-1至cdr-10 cs1 car-t细胞和car-r1至car-r3 cs1 car-t细胞在e:t比为10:1、3:1和1:1时显著增加了rpmi8226-luc细胞的细胞毒性。
[0379]
3.2细胞因子的释放
[0380]
通过使用e:t比为1:1的rpmi8226-lucg2细胞分析car-1至cdr-10 cs1 car-t细胞和car-r1至car-r3 cs1 car-t细胞对细胞因子释放的影响。
[0381]
如图6a-6c所示，在cs1 car-t细胞与rpmi8226-lucg2细胞以1:1的e:t比共孵育10小时后，使用legendplex试剂盒检测到细胞培养基上清液中的大量il-2、tnfα和ifnγ，表明了cs1 car-t对靶细胞的作用。
[0382]
3.3持续信号分析
[0383]
电转染后3天，使用抗信标(anti-beacon)抗体来区分cs1 car阳性细胞和cs1 car阴性细胞。同时，如图7所示，检测阳性和阴性细胞中cd25的表达水平，并计算cs1 car-阳性和cs1 car-阴性细胞中cd25阳性细胞的比例。
[0384]
实施例4通用cs1单car、双car或三car-t细胞的制备
[0385]
通过使用以下的sgrna对原代t细胞进行cs1、trac和b2m敲除。
[0386]
cs1 sgrna:
[0387]
cagccaaugagucccauaauguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(seq id no:47)
[0388]
trac sgrna:
[0389]
uucggaacccaaucacugacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(seq id no:65)
[0390]
b2m sgrna:
[0391]
gaguagcgcgagcacagcuaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(seq id no:66)
[0392]
电穿孔后，用慢病毒转染细胞。对于cs-1-1、cs-1-2、cs-1-5、cs-1-8、cs-1-9和cs-1-r1 car-t细胞，用包括表5所列的cs1 car构建体的慢病毒转染电穿孔t。对于cs1-bcma、cs1-cd19-bcma和cs1-cd7 car-t细胞，分别用包括cs1-1-1 car构建体的慢病毒和包括bcma、cd19-bcma或cd7 car构建物的慢病毒转染电穿孔t，car构建体如表5所列。
[0393]
表5 car构建体的示例性序列
[0394]
[0395][0396]
然后将转染的t转移到烧瓶中，并在37℃、5％co2下培养。转染后3天，通过流式细胞术检测细胞总数、car阳性细胞和敲除效率。trac、b2m、cd7或cs1的敲除效率如图9a-9e所示。如图8所示，cs1单car、双car和三car均在t细胞上成功表达。qko组是指trac、b2m、cd7或cs1被敲除但未被慢病毒转染的t细胞。t细胞组是指未经电穿孔或转染处理的t细胞。
[0397]
实施例5通用cs1单car、双car和三car-t细胞的效果
[0398]
5.1通用cs1单car、双car和三car-t细胞的细胞毒性
[0399]
荧光素酶基因可以转染到靶细胞中。加入荧光素后，荧光素酶可以和荧光素反应产生荧光。通过检测荧光的强度，可以测量荧光素酶的活性，并且可以检测靶细胞的存活，从而评估car-t细胞的细胞毒性。特别是，将荧光素酶基因转入包括mm.1s、rpmi-8226、ccrf-cem和nalm6细胞的靶细胞。然后，如图10a-10d所示，通过检测荧光强度分析通用cs1单car、双car和三car-t细胞对靶细胞的杀伤作用。如图10a所示，通用cs1单car、双car和三car-t细胞在不同的效：靶比(包括10:1、3:1和1:1)下显著增加了mm.1s-luc靶细胞的裂解百分比。图10b显示，通用cs1单car、双car和三car-t细胞在效：靶比为1:1时显著增加了rpmi8226-luc靶细胞的裂解百分比。图10c显示，通用cs1+cd7双car car-t细胞在不同的效：靶比(包括10:1、3:1和1:1)下显著增加了ccrf-cem-luc靶细胞的裂解百分比。图10d显示，通用cs1+cd19+bcma三car-t细胞在不同的效：靶比(包括10:1、3:1和1:1)下显著增加了nalm6-luc靶细胞的裂解百分比。
[0400]
5.2通用cs1单car、双car和三car-t细胞的杀伤作用
[0401]
cfse用于标记car-t细胞。将标记的细胞与同种异体原代扩增t细胞(ctl)或原代同种异体nk细胞以不同的e:t比混合，培养16小时，然后以300g离心5分钟。将颗粒中的细胞进一步用包括1:2000dapi的100μl facs缓冲液重悬。如图11a和11b所示，通过流式细胞术分析剩余的存活nk和ctl细胞的数量。如图11a和图11b所示，与通用cs1单car、双car和三car-t细胞孵育后，剩余的存活ctl和存活nk细胞减少。

技术特征：

1.一种包括嵌合抗原受体(car)的工程改造的细胞，其特征在于，所述car包括：(i)特异性结合cs1的第一抗原结合域，其中所述第一抗原结构域包括单域抗体，(ii)第二抗原结合域，和(iii)跨膜域和胞内信号域。2.如权利要求1所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第二抗原结合域是scfv。3.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vhh1-vh2-vl2；(ii)vhh1-vl2-vh2；(iii)vh2-vl2-vhh1；(iv)vl2-vh2-vhh1；(v)vh2-vhh1-vl2；和(vi)vl2-vhh1-vh2，其中vhh1表示所述第一抗原结合域的单域抗体，vh2表示所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2表示所述第二抗原结合域的轻链可变域。4.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第二抗原结合域包括单域抗体。5.如权利要求4所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vhh1-vhh2；和(ii)vhh2-vhh1，其中vhh1表示所述第一抗原结合域的单域抗体，vhh2表示所述第二抗原结合域的单域抗体。6.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第二抗原结合域与选自下组的抗原结合：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白18.2(claudin18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2和4-1bb。7.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头连接。8.如权利要求7所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头包括自剪切肽。9.如权利要求7所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头不包括自剪切肽。
10.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。11.如权利要求10所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述t细胞是αβt细胞或γδt细胞。12.如权利要求2所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞来源于干细胞。13.一种工程改造的免疫细胞，其特征在于，包括：(i)嵌合抗原受体(car)，其中所述car包括特异性结合cs1的第一抗原结合域、跨膜域和胞内信号域，(ii)内源性非活性t细胞受体(tcr)，(iii)内源性非活性mhc分子，和(iv)内源性非活性cs1。14.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中编码内源性cs1的基因失活。15.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中内源性tcr的亚基失活，使得内源性tcr失活。16.如权利要求15所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述亚基选自tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ和cd3ζ。17.如权利要求15所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中编码mhc分子的基因失活。18.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述mhc分子包括mhc i类分子和mhc ii类分子。19.如权利要求18所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述mhc i类分子包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。20.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的亚基失活，使得内源性mhc分子失活。21.如权利要求20所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。22.如权利要求20所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car进一步包括第二跨膜域和第二胞内信号域。23.如权利要求22所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二跨膜域包括tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的至少一部分，或其任何组合。24.如权利要求22所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二胞内信号域包括cd3ζ、fcrγ、fcr-β、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d的至少一部分，或其任何组合。25.如权利要求24所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二胞内信号域进一步包括共刺激域。26.如权利要求25所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述共刺激域选自下组：
cd127、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、myd88、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及与cd83特异性结合的配体。27.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头连接。28.如权利要求27所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是可裂解接头。29.如权利要求28所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是自剪切肽。30.如权利要求29所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述可裂解接头选自p2a、t2a、e2a和f2a。31.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car进一步包括第二抗原结合域。32.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第二抗原结构域与选自下组的抗原结合：cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白18.2(claudin 18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。33.如权利要求32所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域或所述第二抗原结合域是scfv。34.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组任一的模式排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；或(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变域。35.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；
(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2，其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变域。36.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头连接。37.如权利要求36所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头包括自剪切肽。38.如权利要求36所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头不包括自剪切肽。39.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car进一步包括第三抗原结合域。40.如权利要求39所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第三抗原结合域与选自下组的抗原结合：cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白18.2(claudin 18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r、trop-2和4-1bb。41.如权利要求39所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car进一步包括第二跨膜域和第二胞内信号域。42.如权利要求31所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头连接。43.如权利要求42所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是可裂解接头。44.如权利要求43所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是自剪切肽。45.如权利要求44所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述可裂解接头选自p2a、t2a、e2a和f2a。46.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。47.如权利要求46的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述t细胞是αβt细胞或γδt细胞。48.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞
来源于干细胞。49.如权利要求48所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述干细胞是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。50.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞是同种异体细胞。51.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞从患有疾病的受试者获得。52.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞从健康供体获得。53.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞进一步包括增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。54.如权利要求53所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分被配置为组成性增强所述工程改造的免疫细胞的所述一种或多种活性。55.如权利要求54所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分被配置为组成性上调所述工程改造的免疫细胞的一种或多种胞内信号通路。56.如权利要求55的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述一种或多种胞内信号通路是一种或多种细胞因子信号通路。57.如权利要求53所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分通过自寡聚体化而自激活。58.如权利要求57所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分通过自二聚体化而自激活。59.如权利要求53所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。60.如权利要求59所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分选自下组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其相应的受体、其功能片段、其功能变体，或其组合。61.如权利要求53所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分发挥反式激活因子或顺式激活因子的作用。62.如权利要求13所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞进一步包括诱导性细胞死亡部分，所述诱导性细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程改造的免疫细胞的死亡。63.如权利要求62所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分选自下组：rapacasp9、icasp9、hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。64.如权利要求63所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分是egfrt，并且所述细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。65.如权利要求63所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分
是hsv-tk，并且所述细胞死亡激活剂是gcv。66.如权利要求63所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分是icasp9，并且所述细胞死亡激活剂是ap1903。67.如权利要求62所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述细胞死亡激活剂包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体，或其任何组合。68.如权利要求62所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分与所述诱导性细胞死亡部分相连接。69.如权利要求62所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞在存在与所述工程改造的免疫细胞异源的细胞时，表现出增强的生存能力。70.如权利要求69所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的异源细胞包括异源t细胞和异源nk细胞。71.一种包括嵌合多肽的工程改造的细胞，其特征在于，所述嵌合多肽包括：(i)第一嵌合抗原受体(car)，其中所述第一car包括：(a)第一抗原结合域，(b)第二抗原结合域，和(c)第一跨膜域和第一胞内信号域，和(ii)第二嵌合抗原受体(car)，其中所述第二car包括：(a)第三抗原结合域，和(b)第二跨膜域和第二胞内信号域；其中至少一个抗原结合域特异性结合cs1。72.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一car和所述第二car通过所述嵌合多肽上的接头连接。73.如权利要求72所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是可裂解接头。74.如权利要求73所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是自剪切肽。75.如权利要求74所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述可裂解接头选自p2a、t2a、e2a和f2a。76.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一共刺激域和所述第二共刺激域不同。77.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一共刺激域和所述第二共刺激域相同。78.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二跨膜域包括tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154的至少一部分。79.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一胞内信号域和所述第二胞内信号域不同。80.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一胞内信号域和所述第二胞内信号域相同。81.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二胞内信号
域包括cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的至少一部分。82.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二抗原结合域是scfv。83.如权利要求82所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；和(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1表示所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1表示所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2表示所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2表示所述第二抗原结合域的轻链可变域。84.如权利要求82所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2，其中vh1表示所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1表示所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2表示所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2表示所述第二抗原结合域的轻链可变域。85.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第三抗原结合域包括scfv或单域抗体。86.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域与选自下组的抗原结合：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、
psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白(claudin 18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。87.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第二抗原结合域与选自下组的抗原结合：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、robol、frizzled、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白(claudin18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。88.如权利要求71所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第三抗原结合域与选自下组的抗原结合：cs1、cd19、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd79b、cd80、cd86、cd81、cd123、cd133、cd137、cd151、cd171、cd276、cll1、b7h4、bcma、vegfr-2、egfr、gpc3、pmsa、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2/her2、erbb3、her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-乙酰基gd2、o-乙酰基gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、flt3、cea、ca125、ctla-4、gitr、btla、tgfbr1、tgfbr2、tgfbr1、il6r、gp130、路易斯(lewis)、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2、psca、hvem、mage-a、msln、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、muc16、tcra、tcrb、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、罗波蛋白、卷曲受体、ox40、notch-1-4、april、mage3、封闭蛋白(claudin 18.2)、叶酸受体α、叶酸受体β、gpc2、cd70、baff-r和trop-2。89.一种包括嵌合抗原受体(car)的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car包括：(i)特异性结合cs1的第一抗原结合域，(ii)特异性结合cd7的第二抗原结合域，和(iii)跨膜域和胞内信号域。90.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域或所述第二抗原结合域是scfv。91.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vl2-vh1-vl1-vh2；(ii)vh2-vl1-vh1-vl2；(iii)vl1-vh2-vl2-vh1；(iv)vh1-vl2-vh2-vl1；(v)vl2-vl1-vh1-vh2；
(vi)vh2-vh1-vl1-vl2；(vii)vl1-vl2-vh2-vh1；或(viii)vh1-vh2-vl2-vl1；其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变域。92.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域从氨基末端到羧基末端以选自下组之一的模式排列：(i)vl2-vh2-vl1-vh1；(ii)vl2-vh2-vh1-vl1；(iii)vl1-vh1-vl2-vh2；(iv)vl1-vh1-vh2-vl2；(v)vh2-vl2-vl1-vh1；(vi)vh2-vl2-vh1-vl1；(vii)vh1-vl1-vl2-vh2；和(viii)vh1-vl1-vh2-vl2，其中vh1是所述第一抗原结合域的重链可变域，vl1是所述第一抗原结合域的轻链可变域，vh2是所述第二抗原结合域的重链可变域，vl2是所述第二抗原结合域的轻链可变域。93.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述car进一步包括第二跨膜域和第二胞内信号域。94.如权利要求93所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二跨膜域包括tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的至少一部分，或其任何组合。95.如权利要求93所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二胞内信号域包括cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的至少一部分，或其任何组合。96.如权利要求95所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一或第二胞内信号域进一步包括共刺激域。97.如权利要求96所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述共刺激域选自下组：cd127、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、myd88、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及与cd83特异性结合的配体。98.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述第一抗原结合域和所述第二抗原结合域通过接头连接。99.如权利要求98所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是可裂解接头。100.如权利要求99所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述接头是自剪切肽。101.如权利要求100所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述可裂解接头选自p2a、t2a、e2a和f2a。102.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞。103.如权利要求102所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述t细胞是αβt细胞或
γδt细胞。104.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞来源于干细胞。105.如权利要求104所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述干细胞是造血干细胞(hsc)或诱导多能干细胞(ipsc)。106.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。107.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞从患有疾病的受试者获得。108.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞从健康供体获得。109.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的内源性t细胞受体(tcr)失活。110.如权利要求109所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，编码所述内源性tcr亚基的基因失活，使得所述内源性tcr失活。111.如权利要求110所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述亚基选自tcrα、tcrβ、cd3ε、cd3δ、cd3γ和cd3ζ。112.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的内源性cs1失活。113.如权利要求112所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，编码所述工程改造的免疫细胞的内源性cs1的基因失活。114.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的内源性mhc分子失活。115.如权利要求114所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述内源性mhc分子包括mhc i类分子和mhc ii类分子。116.如权利要求115所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述mhc i类分子包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g。117.如权利要求116所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的亚基失活，使得内源性mhc分子失活。118.如权利要求117所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞中内源性mhc分子的b2m亚基失活。119.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞进一步包括增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程改造的免疫细胞的一种或多种活性。120.如权利要求119所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分被配置为组成性增强所述工程改造的免疫细胞的所述一种或多种活性。121.如权利要求120所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分被配置为组成性上调所述工程改造的免疫细胞的一种或多种胞内信号通路。122.如权利要求121所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述一种或多种胞内信
号通路是一种或多种细胞因子信号通路。123.如权利要求119所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分通过自寡聚体化而自激活。124.如权利要求123所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分通过自二聚体化而自激活。125.如权利要求119所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。126.如权利要求125所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分选自下组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-11、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、il-23、pd-1、pd-l1、cd122、csf1r、ctal-4、tim-3、ccl21、ccl19、tgfrβ、其相应的受体、其功能片段、其功能变体，或其组合。127.如权利要求119所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分发挥反式激活因子或顺式激活因子的作用。128.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞进一步包括诱导性细胞死亡部分，所述诱导性细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程改造的免疫细胞的死亡。129.如权利要求128所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分选自下组：rapacasp9、icasp9，hsv-tk、δcd20、mtmpk、δcd19、rqr8、her2t、cd30、bcma和egfrt。130.如权利要求129所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分是egfrt，并且所述细胞死亡激活剂是结合egfrt的抗体或其抗原结合片段。131.如权利要求129所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分是hsv-tk，并且所述细胞死亡激活剂是gcv。132.如权利要求129所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述诱导性细胞死亡部分是icasp9，并且所述细胞死亡激活剂是ap1903。133.如权利要求129所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述细胞死亡激活剂包括核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体，或其任何组合。134.如权利要求38所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述增强子部分与所述诱导性细胞死亡部分相连接。135.如权利要求89所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞在存在与所述工程改造的免疫细胞异源的细胞时，表现出增强的生存能力。136.如权利要求135所述的工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的异源细胞包括异源t细胞和异源nk细胞。137.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求89-136中任一所述的car。138.一种产生如权利要求89-136中任一所述的工程改造的免疫细胞的方法，其特征在于，包括：(i)将编码如权利要求89所述的car的多核苷酸递送到免疫细胞中；和
(ii)在所述免疫细胞中表达所述car，从而产生所述工程改造的免疫细胞。139.一种递送同种异体细胞的方法，其特征在于，包括向有需要的受试者施用如权利要求89-136中任一所述的工程改造的免疫细胞。140.如权利要求139所述的方法，其特征在于，所述工程改造的免疫细胞的内源性tcr在功能上失活。141.如权利要求140所述的方法，其特征在于，所述细胞与具有功能活性tcr的其他细胞相比，降低了所述受试者的gvhd。142.一种造血系统恶性肿瘤的方法，其特征在于，包括向有需要的患者施用如权利要求89-136中任一所述的工程改造的免疫细胞。143.如权利要求142所述的方法，其特征在于，所述造血系统恶性肿瘤包括白血病，所述白血病包括：急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia)和成髓细胞(myeloblastic)白血病、早幼粒细胞(promyelocytic)白血病、粒单核细胞(myelomonocytic)白血病、单核细胞(monocytic)白血病和红细胞白血病(erythroleukemia))、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(chronic myelocytic)(粒细胞性(granulocytic))白血病、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)，和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia))、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、淋巴瘤(lymphoma)、霍奇金病(hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)(惰性型和高级别型)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病(heavy chain disease)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)和脊髓发育不良(myelodysplasia)。144.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求89-136中任一所述的工程改造的免疫细胞或如权利要求137所述的分离的多核苷酸。145.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求89-136中任一所述的工程改造的免疫细胞或如权利要求137所述的分离的多核苷酸。

技术总结

本公开提供了工程改造的免疫细胞及其应用。所述工程改造的免疫细胞包含CAR或工程改造的TCR。当施用于受试者时，所述工程改造的免疫细胞能抑制宿主免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)并增强工程改造的免疫细胞的体内活力和持久性，藉此表现出更有效的肿瘤杀伤活性。藉此表现出更有效的肿瘤杀伤活性。藉此表现出更有效的肿瘤杀伤活性。

技术研发人员：

张华 沈连军 石欢 曹卫

受保护的技术使用者：

亘喜生物科技（上海）有限公司

技术研发日：

2021.05.06

技术公布日：

2023/3/10