一种粘质沙雷氏菌及其降酸应用的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种粘质沙雷氏菌及其降酸应用。

背景技术：

2.柑橘是世界上产量最高的水果，栽培柑橘的国家和地区达146个，主要集中在中国、美国、巴西和地中海沿岸，全世界的年产量超1亿吨。我国早在四千多年前就开始将柑橘作为果树进行种植，是柑橘的起源地之一。柑橘主要用于直接食用和加工业生产，其中最主要的加工方式为榨汁和制作橘瓣罐头，而柑渣是柑橘加工业的副产物，占柑橘鲜果重量的50％以上，主要包括柑橘皮(60-65％)、种子(0-10％)、残余果肉和橘络(30-35％)。此外，由于陈皮产业的扩张，大量以柑橘皮为目的的柑橘产业不断发展，使得柑汁也逐渐成为陈皮副产物。这些柑汁中含有大量以柠檬酸为主的有机酸，如不加以妥善处置，会对环境造成极大的污染。肆意地排入河道会抑制水中的微生物生长，严重威胁水体的自净化体系；不加处理就弃置在农田中会引起土壤酸化，并导致土壤中的金属离子活力增加，影响农作物发育的同时还带来一系列环境问题。
3.柑汁以及植物类其它酸性汁液中含有大量有机质、氮、磷、钾等植物生长所必须的营养元素，能通过处理后应用于饲料或肥料生产，改良土壤，是极具潜在价值的生物质资源。目前，采用微生物发酵的手段将柑汁等资源化处理是本领域常见的一种模式，通过微生物的代谢作用将其转化为发酵饮品或者原料，再进一步加工制作为成品。然而，柑汁等含有大量以柠檬酸为主的有机酸类化合物，这些有机酸会抑制发酵微生物的活性，从而阻碍发酵过程中生物质的转化，导致发酵产品质量下降或发酵失败，并会产生难闻恶臭味，造成环境污染和资源浪费。因此，如何在发酵过程将柑汁中的有机酸转化消除成为柑汁资源化亟待解决的技术问题。
4.目前解决这一问题的策略大多是采用外加碱性物质的方法，如生石灰、碳酸钙等。这在一定程度上虽然可以缓解有机酸导致的发酵失败问题，但是对于大规模发酵而言，额外添加的化学试剂需要的成本大，并且这些化学试剂容易对环境造成二次污染，也破环有机质的营养，不利于资源利用，用于制备有机肥时容易引起土地盐碱化。因此，迫切需要到一种高效且环境友好型的酸性有机物降酸方法。

技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种粘质沙雷氏菌。
6.本发明的另一目的在于提供所述粘质沙雷氏菌的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种粘质沙雷氏菌，名称为粘质沙雷氏菌(serratia sp.)js-043，保藏编号为gdmcc no：62046，该菌株于2021年11月9日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
9.所述的粘质沙雷氏菌的活力大于或等于1
×
10
10
cfu/g。
10.所述的粘质沙雷氏菌在降解酸性有机物和/或有机酸类化合物中的应用。
11.所述的酸性有机物为植物类酸性物质；优选为果汁和/或果渣；进一步优选为柑汁和/或柑渣；再进一步优选为柑汁。
12.所述的柑汁为陈皮加工生产所产生的柑汁，主要包括柑橘果肉榨汁后得到的液体。
13.所述的有机酸类化合物包括柠檬酸、苹果酸和乙酸中的至少一种；优选为柠檬酸。
14.一种降解酸性有机物和/或有机酸类化合物的生物菌剂，其活性成分为上述粘质沙雷氏菌。
15.一种降解酸性有机物和/或有机酸类化合物的方法，包括如下步骤：
16.(1)将花生麸和糖蜜加入到酸性有机物和/或有机酸类化合物中，将其配制成发酵培养基；
17.(2)将活化的粘质沙雷氏菌接种到发酵培养基中，通气发酵，以降解酸性有机物中的有机酸类化合物。
18.步骤(1)中所述的酸性有机物为植物类酸性物质；优选为果汁和/或果渣；进一步优选为柑汁和/或柑渣；再进一步优选为柑汁。
19.所述的花生麸的添加量为按每100ml柑汁配比5～30g花生麸计算；优选为按每100ml柑汁配比18.75g花生麸计算。
20.所述的糖蜜的添加量为按每100ml柑汁配比1～10g糖蜜计算；优选为按每100ml柑汁配比6.25g糖蜜计算。
21.步骤(1)中所述的有机酸类化合物包括柠檬酸、苹果酸和乙酸中的至少一种；优选为柠檬酸。
22.所述的发酵培养基中有机酸类化合物的浓度为0～100g/l；优选为10～60g/l。
23.步骤(1)中所述的发酵培养基的配方优选为：70～90ml柑汁，5～25g花生麸，5g糖蜜；更优选为：80ml柑汁，15g花生麸，5g糖蜜。
24.所述的柑汁主要有机酸成分为90％以上的柠檬酸，初始ph约为3.0。
25.步骤(2)中所述的活化的粘质沙雷氏菌优选为处于对数生长期或稳定期的粘质沙雷氏菌；优选通过如下步骤制备得到：将上述粘质沙雷氏菌接种于活化培养基(平板培养基)上活化，再接种于种子培养基中振荡培养，得到处于对数生长期或稳定期的粘质沙雷氏菌种子培养液。
26.所述的活化培养基(平板培养基)优选为mrs琼脂培养基。
27.所述的活化的温度为28～34℃；优选为30℃。
28.所述的活化的时间为20～30h；优选为24h。
29.所述的种子培养基为mrs琼脂培养基或mrs肉汤培养基。
30.所述的震荡培养的转速为150～210rpm；优选为180rpm。
31.所述的震荡培养的温度为28～34℃；优选为30℃。
32.所述的震荡培养的时间为18～30h；优选为24h。
33.步骤(2)中所述的粘质沙雷氏菌的接种量为体积百分比5％～12％；优选为体积百分比10％。
34.步骤(2)中所述的发酵的通气量为0.01～3l/l
·
min；优选为1l/l
·
min。
6.5，溶于1l蒸馏水中；
53.复筛培养基：柠檬酸三钠10g，硫酸亚铁0.1g，硫酸铵0.5g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，ph 4.0，溶于1l蒸馏水中。
54.2、菌株形态学鉴定
55.将上述筛选得到的菌株接种至mrs固体培养基中30℃活化24h，然后挑取少许菌落进行革兰氏染：
56.1)涂片固定。
57.2)草酸铵结晶紫染1分钟。
58.3)蒸馏水冲洗。
59.4)加碘液覆盖涂面染约1分钟。
60.5)水洗，用吸水纸吸去水分。
61.6)加95％(v/v)酒精数滴，并轻轻摇动进行脱，20秒后水洗，吸去水分。
62.7)番红染液(稀)染1分钟后，蒸馏水冲洗。
63.8)干燥，显微镜下观察。
64.菌株形态及染结果如图1所示。
65.3、分子生物学鉴定
66.将菌株在mrs培养基中培养至生长对数期，然后使用细菌基因组dna提取试剂盒(上海生工生物)提取供试菌株dna，利用细菌通用引物27f(5
’‑
aga gtttgatcatggctcag-3’)和1492r(5
’‑
tagggttaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。其中，
67.pcr反应体系：细菌基因组dna 0.5μl，携有mg
2+
的10
×
buffer 2.5μl，dntp 1μl，dna聚合酶0.2μl，10μmol/l的上下游引物各0.5μl，然后加双蒸水至25μl。
68.pcr反应条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，总共30个循环；72℃修复延伸10min，4℃下终止反应。
69.将pcr扩增产物送至美吉生物医药科技有限公司(上海)进行测序(seq id no.1)，测序结果在ncbi上进行比对，然后使用软件mega 6上的neighbor-joining法构建菌株的系统发育树。结果如图2所示。
70.根据菌株的菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株命名为沙雷氏菌serratia sp.js-043，该菌株于2021年11月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为gdmcc no：62046。
71.4、菌株对不同碳源的广谱适应能力以及对柑汁的降酸处理能力
72.(1)将活化好的菌株serratia sp.js-043接种至含有10g/l不同碳源(碳源为：半乳糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、丁二酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸)的培养基中，180rpm震荡培养24h，设置三次重复，考察该菌株对不同碳源的适应能力。
73.结果如图3所示：从图3中可以看到，该菌株能够以柠檬酸、苹果酸、乙酸等常见的有机酸作为唯一碳源。因此，该菌株在降解酸性有机物领域中可能具有较好的应用前景。
74.(2)将新会小青柑去皮，然后榨汁获得柑汁(主要有机酸成分为90％以上的柠檬酸，初始ph约为3.0)，然后将柑汁、花生麸(市售)和糖蜜分别按照80％、15％和5％(w/v)的比例加入5l的塑料瓶中，混匀后加入10％(v/v)已活化好(od
600
≥1.0)的菌株serratia sp.js-043，然后，在通气(1l/l
·
min)的条件下30℃恒温发酵，72h后取出检测体系的ph值
和柠檬酸含量，并计算柠檬酸去除率，三次重复。
75.结果表明，发酵初始的ph为4.21，其柠檬酸含量为1.84g/l，经过72h的生物降酸后，其ph上升到5.30，柠檬酸含量下降至0.2g/l。说明本方法对酸性有机物，尤其是对富含柠檬酸的酸性有机物具有较好的降酸效果。
76.(3)将活化好的菌株serratia sp.js-043接种至含有不同浓度(5、10、20、30、40、60、80和100g/l)柠檬酸的复筛培养基(在上述步骤1中的复筛培养基中补充或减少柠檬酸至目标浓度，并使用1％(v/v)硫酸或者40％(w/v)氢氧化钠调整ph)中，180rpm震荡培养156h，前期每6h取样一次，中后期每12h取样一次，当连续两次ph大于8时结束取样，检测体系的ph值和柠檬酸含量，并计算柠檬酸去除率，设置三次重复。
77.结果如图4所示：从图4a中可以看到，该菌株serratia sp.js-043在柠檬酸浓度高达100g/l时仍然能够良好生长，说明其具有非常优秀的耐受高浓度柠檬酸的能力。图4b和图4c的检测结果显示，在40g/l的柠檬酸浓度下，该菌株仍然可以降解超过80％的柠檬酸，并且使整个体系中的ph达到8以上，表现出非常优秀的耐受和降解能力。
78.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种粘质沙雷氏菌，其特征在于：名称为粘质沙雷氏菌(serratia sp.)js-043，保藏编号为gdmcc no：62046，该菌株于2021年11月9日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌在降解酸性有机物和/或有机酸类化合物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的酸性有机物为植物类酸性物质；所述的有机酸类化合物包括柠檬酸、苹果酸和乙酸中的至少一种。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的酸性有机物为果汁和/或果渣；进一步为柑汁和/或柑渣；所述的有机酸类化合物为柠檬酸。5.一种降解酸性有机物和/或有机酸类化合物的生物菌剂，其特征在于：其活性成分为权利要求1所述的粘质沙雷氏菌。6.一种降解酸性有机物和/或有机酸类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将花生麸和糖蜜加入到酸性有机物和/或有机酸类化合物中，将其配制成发酵培养基；(2)将活化的权利要求1所述的粘质沙雷氏菌接种到发酵培养基中，通气发酵，以降解酸性有机物中的有机酸类化合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酸性有机物为植物类酸性物质；进一步为果汁和/或果渣；再进一步为柑汁和/或柑渣；步骤(1)中所述的有机酸类化合物为柠檬酸、苹果酸和乙酸中的至少一种。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的花生麸的添加量为按每100ml柑汁配比5～30g花生麸计算；所述的糖蜜的添加量为按每100ml柑汁配比1～10g糖蜜计算；所述的发酵培养基中有机酸类化合物的浓度为0～100g/l。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的粘质沙雷氏菌的接种量为体积百分比5％～12％；步骤(2)中所述的发酵的通气量为0.01～3l/l
·
min；步骤(2)中所述的发酵的温度为28～34℃；步骤(2)中所述的发酵的时间为60～84h。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的活化的粘质沙雷氏菌通过如下步骤制备得到：将粘质沙雷氏菌接种于活化培养基上活化，再接种于种子培养基中振荡培养，得到处于对数生长期或稳定期的粘质沙雷氏菌种子培养液；所述的活化培养基为mrs琼脂培养基；所述的活化的温度为28～34℃；所述的活化的时间为20～30h；所述的种子培养基为mrs琼脂培养基或mrs肉汤培养基；所述的震荡培养的转速为150～210rpm；
所述的震荡培养的温度为28～34℃；所述的震荡培养的时间为18～30h。

技术总结

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其降酸应用。该菌株名称为粘质沙雷氏菌(Serratia sp.)JS-043，保藏编号为GDMCC NO：62046，该菌株于2021年11月9日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明中的Serratia sp.JS-043菌株具有优秀的耐受高浓度柠檬酸的能力，可以通过生物转化植物类酸性物质如柑汁、柑渣中的有机酸类化合物，提高其pH值，减少或解除低pH条件对发酵微生物的活性抑制作用，并有效提高了柑汁等酸性有机物的利用效率。性有机物的利用效率。性有机物的利用效率。