一株无素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用的制作方法

1.本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株无素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用。

背景技术：

2.微生物胞外多糖是由微生物分泌的一种生物大分子。由于其单糖组成、糖苷键的多样性，胞外多糖展现出了诸如增稠性、乳化行、抗氧化性、抗肿瘤等多种多样的功能，使其在医药、食品、农业、工业等众多领域均体现出了较好的应用潜力。
3.泛菌多糖是近年来新发现、鉴定的一种由骆驼刺泛菌分泌的酸性杂多糖。泛菌多糖由葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成。目前，泛菌多糖已被证明在农业领域有较强的促进植物生长与增强植物抗逆的能力。然而，骆驼刺泛菌在发酵过程中还分泌大量的素，素与产物多糖极易通过静电螯合、离子键等作用形成复合体，这极大的提高了下游分离的难度。目前主流的方式是通过活性炭脱或乙醇脱洗的方案去除素。其中活性炭脱在工业生产中容易产生活性炭固废，增加了生产企业的环评、安评成本；乙醇脱需要使用大量的乙醇以及乙醇回收，也极大的增加了产品的终端成本。因此，受限于这一因素，使得骆驼刺泛菌胞外多糖在食品、日化、医疗等对产品品质要求较高的领域的应用推广受到了较大的阻碍。因此，如果能够通过基因工程手段，构建无素产生的泛菌多糖合成菌株，降低下游分离成本，对于其多领域的工业化应用至关重要。

技术实现要素：

4.发明目的：为解决骆驼刺泛菌胞外多糖脱纯化难的问题，本发明提供了一种无素产生的泛菌多糖合成菌株及其构建方法和其在高产无泛菌多糖中的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明公开了一株无素产生的骆驼刺泛菌，所述骆驼刺泛菌以骆驼刺泛菌pantoea alhagi xk-11作为出发菌株，通过敲除xk-11基因组中的八氢番茄红素合成酶基因crtb构建获得，命名为pantoea alhagi xk-11δcrtb，其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtb的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述工程菌xk-11δcrtb在表型上不再具有出发菌xk-11的黄素。
6.所述crtb基因利用crispr/cas9工具实现敲除的。
7.本发明进一步提出了上述骆驼刺泛菌的构建方法，包括如下步骤：
8.(1)以骆驼刺泛菌pantoea alhagi xk-11基因组为模版，pcr扩增crtb上下游同源片段，分别为crtb-up，crtb-dn；以ptarget质粒为模版，克隆带有crtb sgrna序列的片段crtb-sgrna，胶回收后，通过重叠pcr获得基因片段crtb-sgrna-up-dn；对质粒ptarget进行反向pcr，获得ptarget骨架片段，将获得的ptarget骨架片段和重叠片段crtb-sgrna-up-dn通过重组酶exnaseⅱ在37℃下进行in-fusion克隆，并转入e.coli dh5α，涂布至含有链霉素抗性的lb固体培养基中过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒ptarget-crtb；
9.(2)将pcas质粒通过电转化转化至骆驼刺泛菌xk-11感受态细胞中，获得带驼刺泛
菌xk-11(pcas)感受态细胞；
10.(3)将重组质粒ptarget-crtb通过电转化转化至骆驼刺泛菌xk-11(pcas)感受态细胞中，涂布至含有kmr和strr双抗的lb固体培养基中，30℃，培养24h；
11.(4)挑取阳性克隆接种至含kmr和iptg的lb培养基中，30℃，200rpm过夜培养并连续传代，直至菌株无法在strr抗性平板中生长，证明ptarget-crtb重组质粒已经丢失，随后，将丢失ptarget-crtb重组质粒的菌株接种至lb培养基中，37℃，200rpm过夜培养，并连续传代，直至菌株无法在kmr抗性平板中生长，证明pcas质粒已丢失，得到的突变菌株命名为骆驼刺泛菌xk-11δcrtb。
12.其中，步骤(2)，电转化条件为：电场强度25kv/cm，电击时间4msec。
13.步骤(3)中，电转化条件为：电场强度25kv/cm，电击时间4msec。
14.本发明还提出了上述骆驼刺泛菌在发酵制备骆驼刺泛菌胞外多糖上的应用功能。
15.具体地，制备骆驼刺泛菌胞外多糖的步骤如下：
16.(1)种子液扩培：将保藏的菌种接种至lb培养基内进行扩大培养，获得发酵种子液；
17.(2)发酵：按照1％～10％的接种量，将种子液转接至发酵培养基进行胞外多糖发酵，所述发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，发酵条件为：温度为25～32℃，通气强度为0.1～0.8vvm，发酵周期为16～24h，ph为6.5～7.5；
18.(3)提纯：将步骤(2)制备的发酵液首先进行高温降粘，趁热以珍珠岩作为过滤介质通过板框过滤机过滤除菌，滤液冷却至室温后加入2～3倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得纯化胞外多糖。
19.其中，所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或组合；所述氮源为硫酸铵、玉米浆、豆粕粉，蛋白胨中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为nacl，k2hpo4、kh2po4、mgso4、mnso4、cacl2中的任意一种或几种的组合；所述氧载体为正己烷、正庚烷、正十六烷中的任意一种或几种的组合。
20.具体地，碳源浓度为30～50g/l，氮源浓度为2～8g/l，无机盐总浓度为0.5～2.5g/l，氧载体总浓度为0.5～10g/l。
21.其中，高温降粘的条件为115℃加热30min进行降粘。
22.有益效果：与现有技术相比，本技术具有如下优点：
23.(1)出发菌株xk-11在制备泛菌多糖的过程中，获得无素的泛菌多糖，需要反复醇沉，去除素。本发明构建了无素泛菌多糖发酵菌株，仅需通过单次醇沉即可获得无素的泛菌多糖，干燥后多糖颜为纯白，乙醇用量大大减少；
24.(2)与出发菌株相比，工程菌xk-11δcrtb因素合成被阻断，降低了细胞营养和能量流向副产物的损失，使得发酵胞外多糖产量达到30g/l以上，显著提高；
25.(3)制备的骆驼刺泛菌多糖由于干燥后呈白，当用于日化保湿、食品增稠、医用凝胶等产品的开发时，更易接受。
附图说明
26.图1菌株xk-11与δcrtb在平板上的菌落形态差异；
27.图2提取菌株xk-11与δcrtb发酵液所得泛菌多糖的表型差异。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。下述实施例中使用的试剂、菌株，除非另有说明，均为市售常见试剂。
29.实施例1分泌无素pantoea alhagi基因工程菌株的构建。
30.一、重组质粒ptarget-crtb构建
31.以骆驼刺泛菌pantoea alhagi xk-11为出发菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏编号为cgmcc no.15526，菌株详细信息披露于专利cn202010736899.9中。
32.crtb基因是合成素公认的基因。本发明以现有报导的crtb基因为靶标序列，以骆驼刺泛菌基因组为模板序列，通过blast确定了骆驼刺泛菌中的crtb基因。
33.骆驼刺泛菌中的crtb基因序列如下：
34.atgaacagtacgctgatggatcacgccactgaaaccatggcggtcggctcaaagagttttgccaccgcctcaaagctgttcgatgcccgcacgcgtcgtagcgcgctgatgctttatgcctggtgccgctattgcgatgacgtgattgatggtcaggtgctgggttttcatcatccggcagcgagcggcggcagcgcaacgcagcggctggagatgctgaaaaccgagacgcagcgcgcctttgccggtgcagagatgcaggagccggcctttgccgcctttcaggaggttgcgacccgtcacaccatcccgccgcagctggcctttgatcatcttgaaggctttgcgatggatgtgcgcgagacgcactatgagaccttcacagatacgctgcgttattgttatcacgtggcgggcgtggtggggctgatgatggcgcgggtgatgggcgtacgtgacgaatcggtgctggatcgcgcctgtgacttagggctggcgtttcagctaaccaatattgcccgcgatatcgttgaggatgtgcaggcggggcgctgttatctgccgcaggcgtggctggatgagaaagggatgcgttctgccgatattctcgatccggcccggcgcgaggatctggcgcacctggcgcagcggctggtcgcgcaggcagagccttattacgactcggcgcgggcaggactgagcggcttgccgctgcgatccgcctgggcgatcgcctcggcgcatggggtttaccgtgagattggcgttaaggtcagcgcggcgggcgctcgcgcctgggagacgcggcagggaaccagccgcacagagaagatcggtttgctgattaagggcgcggcgctggcgctcagctctcgcgttgcgaatccgccgccgcgttcttctgagctgtggcagcgcccgcgtcggaagagcggacacgcgaagctgtag。
35.以出发菌xk-11基因组为模版，分别用引物crtb-up-f/crtb-up-r，crtb-dn-f/crtb-dn-r进行pcr，扩增crtb上下游同源片段，分别为crtb-up，crtb-dn；同时，以ptarget质粒为模版，用引物crtb-sgrna-f/crtb-sgrna-r克隆带有crtb sgrna序列的片段crtb-sgrna，sgrna序列为：gagacgcagcgcgcctttgc，pcr体系为：kodaq 2
×
pcr mastermix with dye 25μl，primer f 2μl，primer r 2μl，基因组2μl，ddh2o 19μl。pcr条件为：95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，循环30次；72℃10min。胶回收后，通过重叠pcr获得基因片段crtb-sgrna-up-dn，其序列为：
36.cagtcctaggtataatactagtgagacgcagcgcgcctttgcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttcgctggcaccgcccggctgcggcagctactacgtgctggcgccggtgccgcatctgggcacggcaaatctcgactggacggtagaggggccgcgtctgcgcgatcgtatttttgcttatctggagcaacattatatgccgggcctgcgcgatcagctagtgacgcaccggatgtttacgccgtttgatttccgtgaccagttgggggcgcatcaggggtcggcgttctccattgaacccattctgcgccaaagtgcctggttccgtccgcataaccgcgacagccgcatccccaatctctatctggtgggcgcgggcacgcatccgggcgccgggatcccgggcgtgatcggctcggcgaaagccaccgcaggtctgatgctggaggcgctgagctgatgaacagta
cgctgatgtgccgctgcgatccgcctgggcgatcgcctcggcgcatggggtttaccgtgagattggcgttaaggtcagcgcggcgggcgctcgcgcctgggagacgcggcagggaaccagccgcacagagaagatcggtttgctgattaagggcgcggcgctggcgctcagctctcgcgttgcgaatccgccgccgcgttcttctgagctgtggcagcgcccgcgtcggaagagcggacacgcgaagctgtagttttctgcgcccgtggttttttaacgtttcgctcgcgcaggatggcctgtaatttttccaccggcggcgcatagaggaagccgaaagagacgcaatcctctttgccgcgtaccgcatggtgcaggcggtgcgccatatagagacgtttcagatagccacggcgt
37.用引物ptarget-f/ptarget-r对质粒ptarget进行反向pcr，获得ptarget质粒的骨架结构。将获得的ptarget骨架片段和重叠片段crtb-sgrna-up-dn通过重组酶exnaseⅱ(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国)在37℃下进行in-fusion克隆(30min)，并转入e.coli dh5α(通用生物系统(安徽)有限公司，滁州，中国)，涂布至含有链霉素(strr)抗性的lb固体培养基中过夜培养(37℃)，挑取阳性克隆，获得重组质粒ptarget-crtb。其中，所用引物如表1所示。
38.表1引物
[0039][0040][0041]
二、骆驼刺泛菌xk-11感受态细胞制备及电转化
[0042]
(1)骆驼刺泛菌xk-11感受态细胞制备：
[0043]
a.挑取xk-11至液体lb培养基中，于37℃，200rpm，过夜培养；
[0044]
b.按体积比1％的转接量转接至50ml的液体lb培养基中，于37℃，200rpm，培养至od
600
＝0.7左右(微微浑浊，呈现雾状)；
[0045]
c.将培养好的细胞迅速冰浴10min，分装成2管，随后4℃，4,000rpm，离心15min；
[0046]
d.收集菌体后，每管用25ml冰浴的去离子水重悬；
[0047]
e.重复c，d步骤，将收集的细胞用去离子水洗涤三次；
[0048]
f.将d中收集的菌体用5ml冰浴的10％(w/v)的甘油洗涤一次，然后用300μl的冰浴10％(w/v)甘油重悬，分装至3个1.5ml离心管中，每管100μl，即得到3管xk-11的感受态细
胞；
[0049]
(2)电击转化：
[0050]
a.将洗净的泡在75％乙醇中的电转杯(电极间距为0.1cm)倒置于超净台中，开启通风、紫外灯灭菌吹干15min，确保电击杯干燥；
[0051]
b.向制备好的xk-11感受态细胞中加入200ng的pcas质粒，轻轻混匀，置于冰上；
[0052]
c.将伯乐micropulser1652100型电穿孔仪调节参数至：电压2.5kv，电击时间4msec；
[0053]
d.将细胞与dna混合物转移至预冷的电转杯内，擦干电击槽外的冷凝水和雾气，将电击杯放进电击仪；
[0054]
e.电击后立即加入soc培养基(青岛海博生物技术有限公司，中国)1ml混匀，转入1.5ml ep管中，30℃摇床、200rpm孵育3h；
[0055]
f.孵育结束后，将e中的培养基涂布于含卡那霉素(kmr)抗性的平板上，30℃过夜培养，长出转化子，即xk-11(pcas)感受态细胞。
[0056]
三、crtb基因敲除。
[0057]
使用步骤二的方法制备xk-11(pcas)感受态细胞。制备完成后，将ptarget-crtb重组质粒电转入xk-11(pcas)感受态细胞(方法同步骤二，将伯乐micropulser1652100型电穿孔仪调节参数至：电压2.5kv，电击时间4msec；)，涂布至含有kmr和strr双抗的lb固体培养基中，30℃，培养24h。
[0058]
用引物crtb-out-f/crtb-out-r(表1)对转化子进行菌落pcr验证，使用nx-11作为对照，筛选敲除成功的阳性克隆。将阳性克隆接种至lb培养基(kmr，iptg)中，30℃，200rpm过夜培养，并连续传代，直至菌株无法在strr抗性平板中生长，证明ptarget-crtb重组质粒已经丢失。随后，将该丢失ptarget-crtb重组质粒的菌株接种至lb培养基中，37℃，200rpm过夜培养，并连续传代，直至菌株无法在kmr抗性平板中生长，证明pcas质粒已丢失。将该突变菌株命名为δcrtb。
[0059]
实施例2出发菌xk-11与突变株δcrtb的表型分析。
[0060]
分别挑取xk-11与δcrtb的单菌落至lb固体培养基和发酵固体培养基(质量体积比为：蔗糖4％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％)中，于30℃培养24h，观察其菌落形态。
[0061]
结果如图1所示，xk-11与δcrtb的单菌落在固体发酵培养基中均呈现出湿润的、有大量粘液的圆形菌落；不同的是，xk-11呈现出鲜黄，δcrtb则为乳白，这表明突变株δcrtb缺失了合成黄素的能力。
[0062]
实施例3出发菌xk-11与突变株δcrtb发酵胞外多糖对比。
[0063]
分别以出发菌xk-11与突变株δcrtb作为菌种，按下述操作发酵制备胞外多糖：
[0064]
(1)挑取保藏菌株的单菌落至lb液体培养基中，于37℃，200rpm培养12h，获得种子液。
[0065]
(2)以4％(v/v)的接种量将种子液转接至发酵培养基(蔗糖4％w/v，蛋白胨1％4w/v％，酵母粉0.5％4w/v％，氯化钠1％4w/v％，正己烷2.3g/l)中，于30℃，ph为7培养24h，期间通气量为0.5vvm，搅拌转速为600ppm。发酵结束后通过苯酚-硫酸法测定发酵液中的多糖含量。
[0066]
(3)将步骤(2)制备的发酵液于115℃加热30min进行降粘，趁热以珍珠岩作为过滤介质通过板框过滤机过滤除菌，滤液冷却至室温后加入2倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得纯化胞外多糖。
[0067]
表2出发菌xk-11与突变株δcrtb发酵胞外多糖产量对比
[0068][0069]
发酵结果如表2所示，敲除八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)基因crtb后，在同等发酵条件下，突变株δcrtb胞外多糖产量显著提升，这可能是由于减少了营养和能量流向副产物黄素导致的。如图2所示，发酵液经过滤除菌，采用一步醇沉制备胞外多糖，出发菌株xk-11发酵液得到的胞外多糖呈现泛黄，表明一次醇沉难以脱出发酵液中的素，需要活性炭脱或多次醇沉等进一步的处理；而突变株δcrtb发酵液经除菌后，一次醇沉即可获得颜纯白的多糖产品。因此，本发明提供的基因工程菌，能够显著提升骆驼刺泛菌多糖的产品品质，减少制备工艺环节，降低乙醇的用量，使生产成本下降。

技术特征：

1.一株无素产生的骆驼刺泛菌，其特征在于，所述骆驼刺泛菌以骆驼刺泛菌pantoea alhagi xk-11作为出发菌株，通过敲除xk-11基因组中的八氢番茄红素合成酶基因crtb构建获得，命名为pantoea alhagi xk-11δcrtb，其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtb的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的骆驼刺泛菌，其特征在于，所述crtb基因利用crispr/cas9工具实现敲除的。3.权利要求1所述的骆驼刺泛菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以骆驼刺泛菌pantoea alhagi xk-11基因组为模版，pcr扩增crtb上下游同源片段，分别为crtb-up，crtb-dn；以ptarget质粒为模版，克隆带有crtb sgrna序列的片段crtb-sgrna，胶回收后，通过重叠pcr获得基因片段crtb-sgrna-up-dn；对质粒ptarget进行反向pcr，获得ptarget骨架片段，将获得的ptarget骨架片段和重叠片段crtb-sgrna-up-dn通过重组酶 exnase
ꢀⅱ
在37℃下进行in-fusion克隆，并转入e. coli dh5α，涂布至含有链霉素抗性的lb固体培养基中过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒ptarget-crtb；（2）将pcas质粒通过电转化转化至骆驼刺泛菌xk-11感受态细胞中，获得带驼刺泛菌xk-11（pcas）感受态细胞；（3）将重组质粒ptarget-crtb通过电转化转化至骆驼刺泛菌xk-11（pcas）感受态细胞中，涂布至含有km
r
和str
r
双抗的lb固体培养基中，30℃，培养24 h；（4）挑取阳性克隆接种至含km
r
和iptg的lb培养基中，30℃，200 rpm过夜培养并连续传代，直至菌株无法在str
r
抗性平板中生长，得到ptarget-crtb重组质粒丢失的菌株，随后，将丢失ptarget-crtb重组质粒的菌株接种至lb培养基中，37℃，200 rpm过夜培养，并连续传代，直至菌株无法在km
r
抗性平板中生长，得到的突变菌株命名为骆驼刺泛菌xk-11δcrtb。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2），电转化条件为：电场强度25 kv/cm，电击时间4 msec。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，电转化条件为：电场强度25 kv/cm，电击时间4 msec。6.权利要求1所述的骆驼刺泛菌在发酵制备骆驼刺泛菌胞外多糖上的应用功能。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，制备骆驼刺泛菌胞外多糖的步骤如下：（1）种子液扩培：将保藏的菌种接种至lb培养基内进行扩大培养，获得发酵种子液；（2）发酵：按照1%~10%的接种量，将种子液转接至发酵培养基进行胞外多糖发酵，所述发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，发酵条件为：温度为25~32℃，通气强度为0.1~0.8 vvm，发酵周期为16~24 h，ph为6.5~7.5；（3）提纯：将步骤（2）制备的发酵液首先进行高温降粘，趁热以珍珠岩作为过滤介质通过板框过滤机过滤除菌，滤液冷却至室温后加入2~3倍体积的乙醇，收集絮状沉淀并干燥获得纯化胞外多糖。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或组合；所述氮源为硫酸铵、玉米浆、豆粕粉，蛋白胨中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为nacl，k2hpo4、kh2po4、mgso4、mnso4、cacl2中的任意一种或几种的组合；所述氧载体为正己烷、正庚烷、正十六烷中的任意一种或几种的组合。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，碳源浓度为30~50 g/l，氮源浓度为2~8 g/l，无机盐总浓度为0.5~2.5 g/l，氧载体总浓度为0.5~10 g/l。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，高温降粘的条件为115℃加热30 min进行降粘。

技术总结

本发明公开了一株无素产生的骆驼刺泛菌突变菌，其以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11作为出发菌株，通过敲除XK-11基因组中的八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase）基因crtB构建获得。本发明同时公开了该工程菌的应用，用于发酵制备骆驼刺泛菌胞外多糖。与出发菌株XK-11相比，本发明公开的工程菌XK-11ΔcrtB制备胞外多糖的提纯过程乙醇用量较少，干燥后多糖颜为纯白，显著降低了生产成本，胞外多糖品质提升，可用于日化保湿、食品增稠、医用凝胶等产品的开发。医用凝胶等产品的开发。医用凝胶等产品的开发。