一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法与流程

一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法。

背景技术：

2.鸭肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。在新疫区，本病的死亡率很高，可达90％以上。给养鸭户们带来了严重的经济损失。注射鸭肝炎血清抗体能产生鸭肝炎卵黄抗体，也是预防鸭肝炎一种非常有效的措施。
3.经过海量检索，发现现有技术：公开号为cn104726409b，公开了一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，该方法包括：(1)用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养该消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；(2)采用脂质体转染法，将编码htert和marker基因的真核表达质粒导入该原代培养的鸭胚肝细胞；(3)培养该转染的鸭胚肝细胞，用g418筛选该htert阳性克隆；(4)培养筛选的该htert阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。该永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。
4.综上所述，鸭肝炎病毒抗体的检测主要为中和试验方法，该方法费时费力，且检测结果不够稳定准确。同时，行业内的检测方法，主要针对鸭源抗体的检测，而随着鸡源卵黄抗体产品的持续发展，进一步开发方便、快捷、稳定性好的、专门用于卵黄抗体检测方法显得尤为必要。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，检测步骤如下：
7.s1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；
8.s2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；
9.s3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；
10.s4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；
11.s5：捕获elisa；
12.s6：elisa敏感性试验；
13.s7：elisa特异性试验；
14.s8：elisa重复性试验；
15.s9：elisa临床样品检测试验。
16.优选的，基于检测步骤的s1中：
17.取冻干种毒1-4e5，加1ml无菌pbs复溶，旋涡混匀10秒以上，倍比稀释1000倍稀释至10ml，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量，尿囊腔接种10日龄spf鸡胚90枚，收获24h后死亡鸡胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用；
18.取湿毒1-5e81支，融化后旋涡混匀，以无菌pbs梯度稀释至100倍稀释至10ml，充分混匀后，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量尿囊腔接种11日龄鸭胚，接种90枚，收获24h后死亡鸭胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用。
19.优选的，基于检测步骤的s2中：
20.将病毒液加入透析袋中封口，加入peg20000覆盖4℃过夜进行10倍浓缩。浓缩液进行病原测定，确定为单一病原；
21.基于检测步骤的s3中：
22.取一半病毒液加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.05％，加甲醛溶液后37℃密封灭活24小时，其间每隔4～6小时摇晃一次，灭活后，置于2～8℃保存备用，并取样用于无菌检测。
23.优选的，基于检测步骤的s4中：
24.在无菌条件下将蛋清倒出，将卵黄膜刺破，抽取约卵黄液，加入1倍灭菌pbs充分震荡摇匀后，复加入2倍体积的氯仿充分震荡摇匀，离心3000r/min，15min。
25.优选的，基于检测步骤的s5中：捕获步骤如下：
26.a：用包被液稀释抗体至工作浓度，每孔100ul加入到96孔酶标板中，4℃放置15h，弃去孔中包被液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
27.b：每孔加入封闭液200ul，37℃温育1h，弃去孔中封闭液，洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
28.c:每孔加入用pbs稀释至工作浓度的捕获抗原100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
29.d:每孔加入稀释的被检卵黄100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
30.e：每孔加入100ul稀释的羊抗鸡二抗，采用hrp标记，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
31.f：每孔加入tmb底物液100ul，室温避光10min，每孔加入终止液50ul终止反应，在酶标仪测od450值。
32.优选的，基于检测步骤的s6中：
33.将鸭肝炎阳性蛋黄分别进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000倍系列稀释，以各稀释度进行elisa检测，确定对鸭肝炎阳性样品的最低检出效价。
34.优选的，基于检测步骤的s7中：
35.分别选取已知的鸭肝炎阳性卵黄和阴性卵黄、小鹅瘟、鹅星状病毒、鸭圆环病毒阳性卵黄抗体，利用elisa方法依次进行检测，确定该检测方法的特异性。
36.优选的，基于检测步骤的s8中：
37.批内重复性试验：用同一批次包被的4块elisa板，分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批内重复性；
38.批间重复性试验：用不同批次制备的4批包被的elisa反应板，并分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批间重复性。
39.优选的，基于检测步骤的s9中：
40.分别用本试验所建立的elisa方法和中和试验对同一批蛋样进行检测所建立的elisa方法的临床适用性。
41.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用酶联免疫吸附试验，可对鸭肝炎病毒卵黄抗原抗体进行大通量、快速检测，可鸭肝炎卵黄抗体半成品、成品检测效率，有利于鸭肝炎卵黄抗体新的行业检测标准的形成。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
44.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
45.本发明提供的三种实施例：
46.实施例一：
47.一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，检测步骤如下：
48.s1：扩毒，取冻干种毒1-4e5，加1ml无菌pbs复溶，旋涡混匀10秒以上，倍比稀释1000倍稀释至10ml，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量，尿囊腔接种10日龄spf鸡胚90枚，收获24h后死亡鸡胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用；
49.取湿毒1-5e81支，融化后旋涡混匀，以无菌pbs梯度稀释至100倍稀释至10ml，充分混匀后，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量尿囊腔接种11日龄鸭胚，接种90枚，收获24h后死亡鸭胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用。
50.s2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋中封口，加入peg20000覆盖4℃过夜进行10倍浓缩。浓缩液进行病原测定，确定为单一病原。
51.s3：病毒液灭活，取一半病毒液加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.05％，加甲醛溶液后37℃密封灭活24小时，其间每隔4～6小时摇晃一次，灭活后，置于2～8℃保存备用，并取样用于无菌检测。
52.s4：卵黄液粗提取，在无菌条件下将蛋清倒出，将卵黄膜刺破，抽取约卵黄液，加入1倍灭菌pbs充分震荡摇匀后，复加入2倍体积的氯仿充分震荡摇匀，离心3000r/min，15min。
53.s5：捕获elisa；
54.s6：elisa敏感性试验；将鸭肝炎阳性蛋黄分别进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000倍系列稀释，以各稀释度进行elisa检测，确定对鸭肝炎阳性样品的最低检出效价。
55.s7：elisa特异性试验；分别选取已知的鸭肝炎阳性卵黄和阴性卵黄、小鹅瘟、鹅星状病毒、鸭圆环病毒阳性卵黄抗体，利用elisa方法依次进行检测，确定该检测方法的特异性。
56.s8：elisa重复性试验；批内重复性试验：用同一批次包被的4块elisa板，分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批内重复性；
57.批间重复性试验：用不同批次制备的4批包被的elisa反应板，并分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批间重复性。
58.s9：elisa临床样品检测试验；分别用本试验所建立的elisa方法和中和试验对同一批蛋样进行检测所建立的elisa方法的临床适用性。
59.实施例二：
60.捕获elisa步骤如下：
61.a：用包被液稀释抗体至工作浓度，每孔100ul加入到96孔酶标板中，4℃放置15h。弃去孔中包被液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
62.b：每孔加入封闭液200ul，37℃温育1h，弃去孔中封闭液，洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
63.c:每孔加入用pbs稀释至工作浓度的捕获抗原100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
64.d:每孔加入稀释的被检卵黄100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
65.e：每孔加入100ul稀释的羊抗鸡二抗，采用hrp标记，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
66.f：每孔加入tmb底物液100ul，室温避光10min，每孔加入终止液50ul终止反应，在酶标仪测od450值。
67.实施例三：
68.elisa捕获后，需要经过包被抗体最佳浓度与捕获抗原是否需要灭活以及最佳浓度的确定：将包被抗体与捕获抗原分别稀释为终浓度分别为2.5、5、10、15μg/ml，采用方阵
滴定法，根据阳性样品和阴性样品比值，p/n值越大越好，确定包被抗体最佳浓度与捕获抗原是否需要灭活和最佳浓度。
69.抗原最佳孵育时间确定：加入捕获抗原后，孵育时间分别为30、45、60、90min，根据阳性样品和阴性样品比值，确定捕获抗原最佳孵育时间
70.样品最佳稀释度与最佳作用时间的确定：将阳性蛋样样品分别进行1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，作用时间分别为30、45、60、90min，采用方阵滴定法，根据阳性和阴性比值，确定样品最佳稀释度与最佳作用时间。
71.二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定：将hrp标记羊抗鸡igg分别进行1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:5000、1:10000倍稀释，作用时间分别为30、45、60、90min，采用方阵滴定法，根据阳性样品和阴性样品比值，确定二抗最佳稀释度和最佳作用时间。
72.捕获elisa临界值的确定：选取已知的鸭肝炎阴性蛋黄样品40份，利用确定的最佳反应条件对其进行检测，计算od450平均值x和标准差sd，根据统计学原理，当待检血清样品od450≥x+3
×
sd判为阳性，od450≤x+2
×
sd判为阴性，介于两者之间判为可疑。
73.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

技术特征：

1.一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：检测步骤如下：s1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；s2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；s3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；s4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；s5：捕获elisa；s6：elisa敏感性试验；s7：elisa特异性试验；s8：elisa重复性试验；s9：elisa临床样品检测试验。2.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s1中：取冻干种毒1-4e5，加1ml无菌pbs复溶，旋涡混匀10秒以上，倍比稀释1000倍稀释至10ml，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量，尿囊腔接种10日龄spf鸡胚90枚，收获24h后死亡鸡胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用；取湿毒1-5e81支，融化后旋涡混匀，以无菌pbs梯度稀释至100倍稀释至10ml，充分混匀后，放置在冰盒上，按照0.1ml/枚剂量尿囊腔接种11日龄鸭胚，接种90枚，收获24h后死亡鸭胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000ui/ml双抗，充分混匀，500ml分装-80℃保存备用。3.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s2中：将病毒液加入透析袋中封口，加入peg20000覆盖4℃过夜进行10倍浓缩。浓缩液进行病原测定，确定为单一病原；基于检测步骤的s3中：取一半病毒液加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.05％，加甲醛溶液后37℃密封灭活24小时，其间每隔4～6小时摇晃一次，灭活后，置于2～8℃保存备用，并取样用于无菌检测。4.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s4中：在无菌条件下将蛋清倒出，将卵黄膜刺破，抽取约卵黄液，加入1倍灭菌pbs充分震荡摇匀后，复加入2倍体积的氯仿充分震荡摇匀，离心3000r/min，15min。5.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s5中：捕获步骤如下：a：用包被液稀释抗体至工作浓度，每孔100ul加入到96孔酶标板中，4℃放置15h，弃去孔中包被液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；b：每孔加入封闭液200ul，37℃温育1h，弃去孔中封闭液，洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；c:每孔加入用pbs稀释至工作浓度的捕获抗原100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
d:每孔加入稀释的被检卵黄100ul，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；e：每孔加入100ul稀释的羊抗鸡二抗，采用hrp标记，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；f：每孔加入tmb底物液100ul，室温避光10min，每孔加入终止液50ul终止反应，在酶标仪测od450值。6.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s6中：将鸭肝炎阳性蛋黄分别进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000倍系列稀释，以各稀释度进行elisa检测，确定对鸭肝炎阳性样品的最低检出效价。7.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s7中：分别选取已知的鸭肝炎阳性卵黄和阴性卵黄、小鹅瘟、鹅星状病毒、鸭圆环病毒阳性卵黄抗体，利用elisa方法依次进行检测，确定该检测方法的特异性。8.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s8中：批内重复性试验：用同一批次包被的4块elisa板，分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批内重复性；批间重复性试验：用不同批次制备的4批包被的elisa反应板，并分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该elisa方法的批间重复性。9.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体elisa检测方法，其特征在于：基于检测步骤的s9中：分别用本试验所建立的elisa方法和中和试验对同一批蛋样进行检测所建立的elisa方法的临床适用性。

技术总结

本发明公开了一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，检测步骤如下：S1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；S2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；S3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；S4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；S5：捕获ELISA；S6：ELISA敏感性试验；S7：ELISA特异性试验；S8：ELISA重复性试验；S9：ELISA临床样品检测试验。本发明采用酶联免疫吸附试验，可对鸭肝炎病毒卵黄抗原抗体进行大通量、快速检测，可鸭肝炎卵黄抗体半成品、成品检测效率，有利于鸭肝炎卵黄抗体新的行业检测标准的形成。卵黄抗体新的行业检测标准的形成。