一株多粘类芽孢杆菌及其悬浮液和应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌及其悬浮液和应用。

背景技术：

2.自然界存在很多有益微生物，能够依附于植株体上生存、繁殖，产生拮抗活性物质、激素类物质、噬铁素等，具有溶磷、解钾、固氮等功能，直接或间接参与植物生长发育，促进植物生长、增强植物抗逆能力、防治植物病害等作用。
3.多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)是一类广泛存在于自然界中的具有周生鞭毛，兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，遇到不良环境可以产生抗逆性很强的芽孢。其中具有促生防病能力的有益菌株能有效定殖在植物体，具有促生、防病、增产和提高品质等效果，研发应用于农业生产中，可降低农药化肥的使用量，减轻环境污染和农药残留，提高产量和品质，为绿农业可持续发展提供有利途径，应用前景十分广阔。
4.申请号为202111390742.6的发明专利申请揭示了一种使用多粘类芽孢杆菌af01促进蔬菜生长和抗病的方法，具体公开了一种对番茄黑斑病菌、番茄病菌、黄瓜靶斑病菌、黄瓜枯萎病菌均具有抑制作用的多粘类芽孢杆菌af01，且对苦瓜白粉病还具有良好的防效。但该多粘类芽孢杆菌仅记载了对平板实验下的抑菌效果，并没有公开其在农田生产中的应用和防治效果。申请号为201710623589.4的发明专利申请揭示了一种多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用，但没有公开该菌种还可以同时防治棒孢叶斑病。同时，现有的多粘类芽孢杆菌少有报道具有同时在大田中防治两种以上叶部真菌病害的功效。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供一株多粘类芽孢杆菌及其悬浮液和应用，以解决上述问题。
6.本发明提供一株多粘类芽孢杆菌，它为“多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa pp-hk11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“cgmcc no.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101。该多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选获得，而且还可以利用tsa培养基进行培养。
7.本发明还提供一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，它包括无菌缓冲溶液和均匀分散在该缓冲溶液中的上述多粘类芽孢杆菌的菌体。
8.基于上述，所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01ml～0.1ml、(nh4)2so
4 0.01g～0.1g、k2hpo
4 0.07g～0.1g、kh2po
4 0.02g～0.1g、mgso
4 0.001g～0.1g、蒸馏水1000ml。
9.基于上述，所述多粘类芽孢杆菌悬浮液中，所述多粘类芽孢杆菌菌体的浓度为(4～6)
×
108cfu/ml。
10.本发明还提供一种上述多粘类芽孢杆菌悬浮液的应用，该多粘类芽孢杆菌悬浮液
用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
11.本发明还提供一种上述多粘类芽孢杆菌悬浮液的施用方法，将多粘类芽孢杆菌悬浮液稀释10～50倍后进行叶面喷雾处理，以用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
12.其中，将多粘类芽孢杆菌悬浮液稀释10～50倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
13.本发明还提供一种生物制剂，包括均匀混合的上述多粘类芽孢杆菌悬浮液和预混料，该预混料由卵磷脂、葵花油、蒸馏水均匀混合组成。
14.基于上述，所述多粘类芽孢杆菌悬浮液与所述预混料的体积比为1:(5～15)；所述预混料中，卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为(3～10):(10～50):(30～100)。
15.具体地，所述预混料的配制方法为：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为(3～10):(10～50):(30～100)分别称取大豆卵磷脂、葵花油和蒸馏水并用破壁机混合3～5分钟。其中，利用破壁机进行混合处理的主要是因为大豆卵磷脂和葵花油在水中形成的油粒比较大，利用破壁机将油粒打碎形成小粒。
16.本发明还提供一种上述生物制剂的应用，该生物制剂用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
17.基于上述，所述生物制剂稀释100～200倍后，用作瓜类叶部病害的叶面喷雾剂。
18.其中，将上述生物制剂稀释100～200倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
19.本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株抑菌谱比较宽，能抑制黄瓜棒孢叶斑病菌、番茄叶霉病菌、灰霉病菌、芹菜早疫病菌、番茄早疫病菌、枯萎病菌、辣椒疫病菌、麦根腐平脐蠕孢等多种病原菌。特别是对棒孢霉菌的抑菌活性高，能强烈抑制棒孢叶斑病菌的菌丝生长和孢子萌发；且在黄瓜叶部具有稳定的定殖能力。同时，通过实验表明，该多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株的悬浮液对黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的防治效果均能够达到50％以上，可以在农业生产上进行实际应用。
20.因此，本发明提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液具有防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的作用。进一步的，通过实验证明，将主要由多粘类芽孢杆菌悬浮液和预混料均匀混合组成的生物制剂能够明显提高防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的效果，且应用时仅需要喷雾至叶部即可，施用方法简单、易于农业生产上进行实际应用，且还可以提高黄瓜的免疫能力，有利于提高产量和品质。
附图说明：
21.图1为本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌落形态。
22.图2为根据16sr dna测序结果构建的pp-hk11-9的系统发育树，分支上的数字代表置信度。
23.图3为本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的生物学特性图。
24.图4为本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9对植物病原菌的抑菌谱图。
25.图5为本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9悬浮液对黄瓜棒孢叶斑病菌分生
孢子萌发的抑制效果。
26.图6为离体接种条件下多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)和生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果图。
27.图7为活体接种条件下多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)和生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果图。
28.图8为多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)和生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理时在黄瓜叶部的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株的定殖密度。
具体实施方式
29.下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
30.实施例1
31.本发明提供一株多粘类芽孢杆菌，它为“多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa pp-hk11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“cgmcc no.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101。该多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选出来的。
32.菌株筛选：在河南省信阳鸡公山采集健康生长的金鸡菊根部带土剪取1～2g，用研钵研碎，在100ml的无菌水中混荡培养30分钟，然后在80℃恒温水浴锅处理20分钟，用无菌水稀释至1000～10000倍，将稀释好得到的混合液均匀地涂在1/10tsa培养基平板上，倒置放于30℃恒温培养箱中培养48～72h。待菌株长出后，用无菌牙签挑取大小、颜和形态不同的细菌菌落，在tsa培养基平板上划线分离纯化，纯化后的菌株与棒孢叶斑病菌进行对峙培养，筛选出对棒孢叶斑病菌具有拮抗活性的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9，并将多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株采用逐步提高诱导浓度的方法获得稳定抗利福平(100μl
·
ml-1
)的菌株，放-80℃超低温冰箱里保存。
33.菌株的鉴定：采用tsa培养基在28～32℃培养上述pp-hk11-9菌株，在tsa培养基上菌落呈乳白，边缘呈锯齿状，不透明，培养3～5天形成如图1所示的菌落。同时，鉴定多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的形态特征和生理生化特性，具体如表1所示。
34.表1多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的形态特征和生理生化特性
35.[0036][0037]
从表1中可以看出：pp-hk11-9菌体为直杆状，革兰氏染反应呈阳性，产生芽孢，具有运动性；生长温度范围为4～50℃，最适生长温度为30℃，最适ph为6.2～7.5，最高耐盐度为4％，可以利用蔗糖、葡萄糖、甘油、半乳糖、果糖、l-阿拉伯糖和山梨醇，亚硝酸还原、硝酸盐反应、淀粉水解和过氧化氢酶反应呈阳性，不产生硫化氢，明胶液化呈阴性。葡萄糖氧化发酵为发酵型。
[0038]
如图2所示，该菌16s rdna序列全长为1449bp，与paenibacillus polymyxa(多粘类芽孢杆菌)的16s rdna序列相似性达到99.72％，所以该菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa pp-hk11-9。
[0039]
菌株的生物学功能：采用平板对峙法研究多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9抑菌情况，结果如表2和图4所示。
[0040]
表2多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9对植物病原菌的抑菌能力
[0041][0042][0043]
从表2和图4可以看出：本发明提供的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9抑菌谱比较宽，能抑制黄瓜棒孢叶斑病菌(棒孢霉corynespora cassiicola)、番茄叶霉病菌(黄褐孢霉fulvia fulva)、番茄灰霉病菌(灰葡萄孢botrytis cineria)、芹菜早疫病菌(芹菜尾孢
cercospora apci)、番茄早疫病菌(茄链格孢alternaria solani)、枯萎病菌(尖孢镰孢fusarium oxysporum)、辣椒疫病菌(辣椒疫霉phytophthora capsici)、麦根腐平脐蠕孢(bipolaris sorokiniana)等多种病原菌。特别是对棒孢霉菌(黄瓜棒孢叶斑病菌)的抑菌活性高。
[0044]
另外，从图3中可以看出，多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株具有分解淀粉、分解纤维素、分解蛋白、产嗜铁素等功能，有利于其发挥防病促生作用。
[0045]
实施例2
[0046]
本实施例提供一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，它包括无菌缓冲溶液和均匀分散在该无菌缓冲溶液中的实施例1中的多粘类芽孢杆菌的菌体。其中，本实施例中，所述多粘类芽孢杆菌的浓度为6
×
108cfu/ml。
[0047]
所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01ml、(nh4)2so
4 0.01g、k2hpo40.07g、kh2po
4 0.02g、mgso
4 0.001g、蒸馏水1000ml。
[0048]
具体地，该多粘类芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其包括以下步骤：
[0049]
将实施例1提供的多粘类芽孢杆菌菌株经过tsa培养基培养得到的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种；将所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种接种到发酵培养基上，并在32℃发酵培养48h，得到该多粘类芽孢杆菌发酵液；
[0050]
其中，发酵培养基的配方包括蛋白胨20g、酵母膏5g、nacl 0.5g、0.25mol/l kcl 10ml、2mol/l mgcl
2 5ml、1mol/l葡萄糖20ml和蒸馏水1000ml，发酵培养基的ph值为7.0；
[0051]
对所述多粘类芽孢杆菌发酵液进行离心处理，得到多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体；采用无菌缓冲溶液稀释所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体，获得上述多粘类芽孢杆菌悬浮液。
[0052]
通过实验表明，该多粘类芽孢杆菌悬浮液对黄瓜棒孢叶斑病菌分生孢子萌发有抑制效果。具体试验方法如下：
[0053]
采用悬滴法分别测试“无菌水”和“pp-hk11-9悬浮液”中黄瓜棒孢叶斑病菌的分生孢子萌发情况，将等量的黄瓜棒孢叶斑病菌分生孢子悬浮液和pp-hk11-9悬浮液混合均匀，滴到凹玻片上置于28℃恒温培养箱中保湿培养，每隔2h在显微镜下观察孢子萌发情况，并计算孢子萌发率，每次共观察3个视野，每个视野大概100个分生孢子。结果如图5所示；其中，该图中的“无菌水”是黄瓜棒孢叶斑病菌分生孢子悬浮液和无菌水的混合液，“pp-hk11-9”是黄瓜棒孢叶斑病菌分生孢子悬浮液和pp-hk11-9悬浮液的混合液。其中，孢子萌发率(％)＝萌发孢子数/调查孢子总数
×
100。
[0054]
从图5中可以看出：黄瓜棒孢叶斑病菌分生孢子在无菌水中培养2h开始萌发，培养第6h时孢子萌发率达到100％，而在pp-hk11-9悬浮液中培养8h都完全没有萌发。因此，pp-hk11-9悬浮液能强烈抑制棒孢叶斑病菌的孢子萌发。
[0055]
本实施例还提供一种上述多粘类芽孢杆菌悬浮液用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。具体地，将多粘类芽孢杆菌悬浮液稀释10～50倍进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
[0056]
本实施例还提供一种使用上述多粘类芽孢杆菌悬浮液的生物制剂，该生物制剂由上述多粘类芽孢杆菌悬浮液与预混料均匀混合制成，其中，所述预混料由卵磷脂、葵花油、
蒸馏水均匀混合组成。
[0057]
本实施例中，预混料和该多粘类芽孢杆菌悬浮液的体积比为5:1；所述预混料中，卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为3:10:30。
[0058]
具体地，所述生物制剂应用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。在农业生产进行应用时，将生物制剂稀释100～200倍进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
[0059]
实施例3
[0060]
本实施例提供一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，它包括无菌缓冲溶液和均匀分散在该无菌缓冲溶液中的实施例1中的多粘类芽孢杆菌的菌体。其中，本实施例中，所述多粘类芽孢杆菌悬浮液的浓度为4
×
108cfu/ml。
[0061]
所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.1ml、(nh4)2so
4 0.1g、k2hpo40.1g、kh2po
4 0.1g、mgso
4 0.1g、蒸馏水1000ml。
[0062]
具体地，该多粘类芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其包括以下步骤：
[0063]
将实施例1提供的多粘类芽孢杆菌菌株经过tsa培养基培养得到的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种；将所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种接种到发酵培养基上，并在30℃发酵培养56h，得到多粘类芽孢杆菌发酵液；
[0064]
其中，发酵培养基的配方包括蛋白胨20g、酵母膏5g、nacl 0.5g、0.25mol/l kcl 10ml、2mol/l mgcl
2 5ml、1mol/l葡萄糖20ml和蒸馏水1000ml，发酵培养基的ph值为7.0；
[0065]
对所述多粘类芽孢杆菌发酵液进行离心处理，得到多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体；采用无菌缓冲溶液稀释所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体，获得上述多粘类芽孢杆菌悬浮液。
[0066]
本实施例还提供一种上述多粘类芽孢杆菌悬浮液用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
[0067]
本实施例还提供一种使用上述多粘类芽孢杆菌悬浮液的生物制剂，该生物制剂由上述多粘类芽孢杆菌悬浮液与预混料均匀混合制成，其中，所述预混料由卵磷脂、葵花油、蒸馏水均匀混合组成。所述生物制剂应用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。本实施例中，预混料和该多粘类芽孢杆菌悬浮液的体积比为15:1；所述预混料中，卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为1:5:10。
[0068]
实施例4
[0069]
本实施例提供一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，它包括无菌缓冲溶液和均匀分散在该无菌缓冲溶液中的实施例1中的多粘类芽孢杆菌的菌体。其中，本实施例中，所述多粘类芽孢杆菌悬浮液的浓度为5
×
108cfu/ml。
[0070]
所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.05ml、(nh4)2so
4 0.05g、k2hpo40.09g、kh2po
4 0.08g、mgso
4 0.01g、蒸馏水1000ml。
[0071]
本实施例还提供一种多粘类芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其包括以下步骤：
[0072]
将实施例1提供的多粘类芽孢杆菌菌株经过tsa培养基培养得到的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种；将所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌种接种到发酵培养基上，并在30℃发酵培养56h，得到多粘类芽孢杆菌发酵液；
[0073]
其中，发酵培养基的配方包括蛋白胨20g、酵母膏5g、nacl 0.5g、0.25mol/l kcl 10ml、2mol/l mgcl
2 5ml、1mol/l葡萄糖20ml和蒸馏水1000ml，发酵培养基的ph值为7.0；
[0074]
对所述多粘类芽孢杆菌发酵液进行离心处理，得到多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体；采用无菌缓冲溶液稀释所述多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9的菌体，获得上述多粘类芽孢杆菌悬浮液。
[0075]
本实施例还提供一种上述多粘类芽孢杆菌悬浮液用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
[0076]
本实施例还提供一种使用上述多粘类芽孢杆菌悬浮液的生物制剂，该生物制剂由上述多粘类芽孢杆菌悬浮液与预混料均匀混合制成，其中，所述预混料由卵磷脂、葵花油、蒸馏水均匀混合组成。所述生物制剂应用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。本实施例中，预混料和该多粘类芽孢杆菌悬浮液的体积比为10:1；所述预混料中，卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为5:20:73。
[0077]
效果试验：
[0078]
下面以实施例2提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液记为pp-hk11-9、生物制剂记为lso-pp-hk1-9为例，通过离体接种法、活体接种方法和田间试验验证对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果；通过盆栽人工活体接种方法和田间试验验证对白粉病和霜霉病的防治效果。
[0079]
试验样品分组：
[0080]
试验样品组一pp-hk11-9：实施例2提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液。
[0081]
试验样品组二lso-pp-hk11-9：实施例2中提供的由多粘类芽孢杆菌悬浮液与预混料组成的生物制剂。
[0082]
试验样品组三化学药剂：25％戊唑醇水乳剂3000倍液。
[0083]
试验样品组四对照：清水。
[0084]
1、棒孢叶斑病的离体接种试验
[0085]
黄瓜棒孢叶斑病菌离体接种：
[0086]
黄瓜2片真叶时，叶面分别喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后剪下叶片置于保湿托盘里，然后在叶片上采用针刺接种法接种棒孢叶斑病菌分生孢子悬浮液(108孢子/ml)，每孔5μl孢子悬浮液，然后用保鲜膜将托盘封好置于25℃培养箱中进行保湿培养，培养3～4d后调查黄瓜棒孢叶斑病发病情况，结果如表3和图6所示。
[0087]
其中，病情调查和防效计算方法如下：
[0088]
离体接种和活体接种条件下棒孢叶斑病病情调查根据病斑直径，其分级标准为：
[0089]
0级：病斑直径0cm；
[0090]
1级：病斑直径≤0.2cm；
[0091]
2级：病斑直径＞0.2cm，≤0.4cm；
[0092]
3级：病斑直径＞0.4cm，≤0.6cm；
[0093]
4级：病斑直径＞0.6cm。
[0094]
活体接种条件下白粉病和霜霉病病情调查根据病斑占面积，其分级标准：
[0095]
0级：无病斑；
[0096]
1级：病斑占整个叶片面积的≤5％；
[0097]
3级：病斑占整个叶片面积的＞5％，≤10％；
[0098]
5级：病斑占整个叶片面积的＞10％，≤25％；
[0099]
7级：病斑占整个叶片面积的＞25％，≤50％；
[0100]
9级：病斑占整个叶片面积的＞50％以上。
[0101]
病情指数和防治效果计算公式：
[0102]
病情指数＝〔σ(各级病叶数
×
各级代表值)/(调查总数
×
最高级代表值)〕
×
100；
[0103]
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100。
[0104]
表3在离体接种条件下对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果
[0105]
试验样品病情指数防治效果(％)pp-hk11-925.03
±
2.57b57.09lso-pp-hk11-919.75
±
1.89a66.14化学药剂26.21
±
3.12b55.07对照58.33
±
3.51c-[0106]
从表3和图6中可以看出，利用本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk11-9)、生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理的黄瓜棒孢叶斑病发病较轻，病情指数低于化学药剂和对照处理。
[0107]
2、黄瓜叶部常见病害的活体接种试验
[0108]
盆栽人工接种棒孢叶斑病病菌：
[0109]
黄瓜2片真叶时，叶面分别喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶片上采用针刺接种法接种棒孢叶斑病菌分生孢子悬浮液(108孢子/ml)，每孔5μl孢子悬浮液，接种叶片套袋保湿，置于25℃温室培养，两天后去掉套袋。培养5～7d时调查发病情况，结果如表4和图7所示。
[0110]
盆栽人工接种白粉病病菌：
[0111]
黄瓜2～3片真叶时，叶面喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶部喷雾接种黄瓜白粉病孢子悬浮液(10
5-6
孢子/ml)，接种后套袋保湿，25～28℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养5～7d调查发病情况，结果如表4所示。
[0112]
盆栽人工接种霜霉病病菌：
[0113]
黄瓜2～3片真叶时，叶面喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶部喷雾接种黄瓜霜霉病菌游动孢子囊悬浮液(10
4-5
孢子囊/ml)，接种后套袋保湿，25～28℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养4～5d调查发病情况，结果如表4所示。
[0114]
表4在活体接种条件下对黄瓜叶部常见病害的防治效果
[0115][0116]
从图7中可以看出，利用本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk11-9)、生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理的黄瓜棒孢叶斑病发病较轻，病情指数显著低于化学药剂和对照处理。
[0117]
从表4中可以看出，多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk11-9)防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的效果均能够达到50％以上，可以在农业生产上实际应用。因此可以证明本案提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液能够同时防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
[0118]
同时，从表4中还可以看出：生物制剂施用后，能够明显提高防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的效果。
[0119]
3、常见瓜类病害条件下的田间栽培试验
[0120]
黄瓜田间栽培试验：
[0121]
将黄瓜苗移栽定植，然后按常规方法进行水肥管理，在此期间，从黄瓜结果初期开始每隔7d叶面分别喷雾处理上述四组试验样品组，将黄瓜叶片正反面喷均匀。在此期间，调查黄瓜生长状况、发病情况、果实产量和品质及pp-hk11-9在黄瓜叶面的定殖密度，调查和测试结果如图8、表5和表6所示。
[0122]
具体地，黄瓜生长状况是在黄瓜花絮盛开期测定其株高、茎粗和叶片数；产量测定采用定点累积测产方法，推算亩产。
[0123]
品质测定黄瓜果实中蛋白质、可溶性糖和维生素c含量。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝g-250法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比法，维生素c含量测定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法。
[0124]
定殖密度测定采用稀释涂布平板法，取黄瓜叶片去掉主叶脉，用灭菌研钵研磨，然后用无菌水稀释成不同浓度的稀释液，将稀释液均匀涂布在添加利福平(50μg
·
ml-1
)的tsa培养基上，在28℃恒温培养箱中培养48～72h后，调查菌落数并推算定殖密度。
[0125]
(1)菌株定殖密度：
[0126]
从图8中所示的黄瓜叶部的定殖密度曲线可以看出：利用本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk11-9)、生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理时，pp-hk11-9菌株在黄瓜叶部稳定保持104cfu/g以上的定殖密度，提供其发挥防病作用的前提条件。
[0127]
(2)黄瓜产量和品质：
[0128]
表5黄瓜产量
[0129]
处理产量(kg/亩)pp-hk11-92894.7
±
59.7a
lso-pp-hk11-92921.5
±
71.6a化学药剂2733.7
±
43.6b对照2697.3
±
32.8b
[0130]
表6黄瓜果实品质相关指标
[0131][0132]
从表5、表6和图8中可以看出：生物制剂(lso-pp-hk11-9)和多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)处理与化学药剂和对照处理相比均显著提高产量，提高黄瓜果实蛋白质、可溶性糖和维生素c含量，生物制剂(lso-pp-hk11-9)和多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)两个处理之间在黄瓜产量、黄瓜中的蛋白质含量等方面没有显著差异。而图8中可以看出，生物制剂(lso-pp-hk11-9)处理时，在黄瓜叶部的多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9菌株的定殖密度显著高于多粘类芽孢杆菌悬浮液(pp-hk1-9)，有利于其发挥防治病害的作用。
[0133]
因此，本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌悬浮液、生物制剂均可以提高黄瓜的免疫能力，能抑制病菌的生长和萌发并防止病原菌侵入的作用，能够防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病，有利于提高产量和品质。
[0134]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

技术特征：

1.一株多粘类芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa），其特征在于，它为“多粘类芽孢杆菌pp-hk11-9”，保藏编号为“cgmcc no.24634”。2.一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，其特征在于，它是由权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的。3.根据权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌悬浮液，其特征在于，所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01 ml～0.1 ml、(nh4)2so
4 0.01 g～0.1g、k2hpo
4 0.07 g～0.1g、kh2po
4 0.02 g～0.1g、mgso
4 0.001 g～0.1g、蒸馏水1000 ml。4.根据权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌悬浮液，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌的浓度为（4～6）
×
10
8 cfu/ml。5.一种权利要求2或3或4所述的多粘类芽孢杆菌悬浮液的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌悬浮液用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。6.一种权利要求2或3或4所述的多粘类芽孢杆菌悬浮液的施用方法，其特征在于，将所述多粘类芽孢杆菌悬浮液稀释10～50倍后进行叶面喷雾处理。7.一种生物制剂，其特征在于：包括均匀混合的权利要求2或3或4所述的多粘类芽孢杆菌悬浮液和预混料，该预混料由卵磷脂、葵花油、蒸馏水均匀混合组成。8.根据权利要求7所述的生物制剂，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌悬浮液与所述预混料的体积比为1:（5～15）；所述预混料中，卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为（3～10）:（10～50）:（30～100）。9.一种权利要求7或8所述的生物制剂的应用，其特征在于：所述生物制剂用于防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。10.根据权利要求9所述的生物制剂的应用，其特征在于，所述生物制剂稀释100～200倍后，用作瓜类叶部病害的叶面喷雾剂。

技术总结

本发明提供一株多粘类芽孢杆菌，它为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为“CGMCC No.24634”。本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌悬浮液，它包括无菌缓冲溶液和均匀分散在该无菌缓冲溶液中的多粘类芽孢杆菌的菌体。本发明还提供了一种多粘类芽孢杆菌悬浮液的应用。该多粘类芽孢杆菌悬浮液能强烈抑制病原菌菌丝生长和分生孢子萌发，防止病原菌侵入，提高植物的免疫能力，能防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病，促进植株生长，有利于提高产量和品质。产量和品质。产量和品质。