野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法

1.本发明属于转基因技术领域，具体涉及野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法。

背景技术：

2.野大麦(hordeum brevisubulatium)是禾本科大麦属多年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北、内蒙古、新疆等地，是重要的禾本科生态修复草与牧草。野大麦分蘖株丛密，再生能力强，生产性能较好；适应性强，具有耐寒、耐旱、耐盐碱等特性，在-40℃仍能安全越冬，对土壤要求不严格野大麦耐湿耐涝性较强，在低湿并有临时性积水的草甸黑土上生长良好，是盐化和碱化草甸草原的建种。
3.近年来，利用crispr/cas9技术对目标基因进行编辑已成为热点，野大麦具有较强的抗寒性和耐盐碱能力，是挖掘抗逆基因的优良种质资源，要想利用该技术，必须建立一套成熟的遗传转化体系。由于野大麦缺乏完整的遗传转化体系，功能基因组的研究暂时集中于基因克隆和载体构建，并且只能通过异源表达进行验证；同时，进行品种选育时无法利用基因编辑的方法获得转基因植株，在功能基因组研究和分子育种方面均受到较大的限制。
4.鉴于遗传转化体系的重要性，较多牧草的遗传转化体系已建立成功，包括柳枝稷、羊草、黑麦草、高羊茅等，然而，野大麦目前只有组培快繁体系的相关报道，遗传转化体系尚未报道。

技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于提供一种野大麦组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染方法。利用本发明所述方法能够获得野大麦快繁系数和分化率较高的再生苗，并能获得农杆菌介导的愈伤侵染体系。
6.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
7.一种野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法，具体包括获得愈伤组织和农杆菌侵染
8.所述获得愈伤组织包括种子愈伤诱导和胚性愈伤系筛选；
9.所述种子愈伤诱导时的培养基为蔗糖30g
·
l-1
+ch 1g
·
l-1
+2,4-d5mg
·
l-1
+agar 7.6-7.8g，ph为5.8-6.0；
10.所述的胚性愈伤系筛选：获得的种子的愈伤组织后，将其放在ms+30g
·
l-1
蔗糖+1g
·
l-1
ch+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt的培养基上进行继代，23℃暗培养，继代3-5次后筛选出结构致密且呈颗粒状的淡黄胚性愈伤组织；
11.所述的农杆菌侵染为活化panic6b农杆菌，取野大麦愈伤组织，放到od＝0.3的侵染液中，侵染液配方为100μmol
·
l-1
乙酰丁香酮+0.45g/l ms粉+5mg
·
l-1 2,4-d+0.1g/l mes+30g
·
l-1
蔗糖，抽真空10分钟，超声10分钟，再抽真空10分钟后置于无菌的滤纸上晾干；在23℃暗培养箱中共培养5天，进行暗培养筛选，暗筛培养基为ms+2mg
·
l-1
2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+30g
·
l-1
蔗糖+7.8g
·
l-1
agar+1mg
·
l-1
特美汀+5mg
·
l-1
潮霉素，15天后将其置于含有15mg
·
l-1
潮霉素的暗筛培养基上，两个月转移到光分化培养基上进行分化，所述光分化
培养基为ms+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+50g
·
l-1
蔗糖+3.0g
·
l-1
植物凝胶+1mg
·
l-1
特美汀+5mg
·
l-1
潮霉素。
12.本发明与现有技术相比的有益效果：
13.本发明首先通过提高野大麦再生培养基中的蔗糖浓度，建立了高效的再生体系，再生率为70％，快繁系数为35，可为其他禾本科牧草再生体系的建立提供借鉴及宝贵经验；其次，通过农杆菌侵染和调整共培养时间，侵染效率达34％；之后又确定了暗培养筛选压为15h；光分化筛选压为5h，这是目前野大麦未有的研究，可以为后期野大麦功能基因和分子育种研究奠定基础。
附图说明：
14.图1不同2,4-d浓度对应的出愈率和愈伤组织状态图；其中a为2,4-d浓度2mg
·
l-1
；b为5mg
·
l-1
；c为7mg
·
l-1
。bars＝5mm
15.图2为野大麦种子胚性愈伤系的筛选图；a-e为不同愈伤系；f-j为a-e愈伤系对应的放大图。bars＝5mm
16.图3野大麦胚性愈伤系的分化、生根图；其中，a为光照培养15天；b为光照培养25天；c为光照培养40天；d生根；e移栽
17.图4为12种添加不同浓度蔗糖和植物凝胶的分化培养基分化率统计结果图；其中，1为蔗糖30g
·
l-1
、植物凝胶3g
·
l-1
；2为蔗糖30g
·
l-1
、植物凝胶3.5g
·
l-1
；3为蔗糖30g
·
l-1
、植物凝胶4g
·
l-1
；4为蔗糖40g
·
l-1
、植物凝胶3g
·
l-1
；5为蔗糖40g
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l-1
、植物凝胶3.5g
·
l-1
；6为蔗糖40g
·
l-1
、植物凝胶4g
·
l-1
；7为蔗糖50g
·
l-1
、植物凝胶3g
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l-1
；8为蔗糖50g
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l-1
、植物凝胶3.5g
·
l-1
；9为蔗糖50g
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l-1
、植物凝胶4g
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l-1
；10为蔗糖60g
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l-1
、植物凝胶3g
·
l-1
；11为蔗糖60g
·
l-1
、植物凝胶3.5g
·
l-1
；12为蔗糖60g
·
l-1
、植物凝胶4g
·
l-1
；不同小写字母表示各处理间的显著性差异(p《0.05)。
18.图5暗培养筛选压确定
19.图6光分化筛选压确定
20.图7农杆菌共培时间对侵染效率的影响
21.a-c为共培养3天、4天、5天的gus染情况；d-f为a、b和c中gus染阳性愈伤的对应放大图；g为侵染效率与共培养时间的关系图。不同小写字母表示不同处理间的差异显著(单因素方差分析，duncan’s检验，p《0.05)。bars＝100μm
具体实施方式
22.下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。本发明英文缩写的中文释义如下：
23.2,4-d：2,4-二氯苯氧乙酸
24.kt：萘乙酸
25.as：乙酰丁香酮
26.ch：水解酪蛋白
27.agar：琼脂
28.gus：β-葡萄糖苷酸酶
29.hph：潮霉素
30.timentin：特美汀
31.kan：卡那霉素
32.rif：利福平
33.mes：乙磺酸
34.实施例1、野大麦愈伤诱导的最适2,4-d浓度
35.在超净工作台中，将晾干的种子放在含有不同浓度2,4-d的愈伤诱导培养基上，2,4-d浓度设置3个梯度，分别为2mg
·
l-1
、5mg
·
l-1
和7mg
·
l-1
，愈伤诱导培养基的基础培养基为蔗糖30g
·
l-1
+ch 1g
·
l-1
+agar 7.6-7.8g，ph 5.8-6.0，高温高压121℃灭菌15分钟。1个月后统计诱导率、观察愈伤状态并确定2,4-d的最适浓度。实验结果表明，2,4-d浓度为2mg
·
l-1
时，诱导率为74.4％；2,4-d浓度为5mg
·
l-1
时诱导率次之为65.0％；2,4-d浓度为7mg
·
l-1
时诱导率最低为31.1％。3种浓度诱导的愈伤状态如图2所示，2,4-d浓度为2mg
·
l-1
时出芽较长，愈伤组织较松软较透明呈玻璃化状态；2,4-d浓度为5mg
·
l-1
时，芽长受到一定抑制，愈伤较为紧实，只有外层愈伤状态呈轻微水渍化状态；2,4-d浓度为7mg
·
l-1
时，芽较短，愈伤呈半透明、水渍化状态。随着2,4-d浓度的增加，芽长受到一定的抑制，愈伤状态有所改善，2,4-d为2mg
·
l-1
时种子诱导率最高，但状态不佳，综合考虑后将种子愈伤诱导的2,4-d浓度确定为5mg
·
l-1
，具体见表1。
36.表1为不同2,4-d浓度对种子诱导率的影响
[0037][0038]
实施例2、胚性愈伤系筛选
[0039]
出愈后将芽和种皮去除干净，只保留愈伤组织，将其放在ms+30g
·
l-1
蔗糖+1g
·
l-1
ch+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt的培养基上进行继代，23℃暗培养15-20天后再次继代，继代3-5次后筛选出结构致密且呈颗粒状的淡黄胚性愈伤组织，对其进行大量扩繁。经多次继代扩繁后得到abcde五个愈伤系，愈伤系a和c状态偏白，呈水渍状；愈伤系b状态松散，愈伤组织偏黄；愈伤系d在继代过程中容易长芽，上述几个愈伤系状态欠佳均为非胚性愈伤，在继代过程中只有愈伤系e表面出现部分淡黄颗粒，继代多次后有明显的颗粒感，具有胚性愈伤的特点，将其大量扩繁，作为后期分化和侵染的受体材料(图2)。
[0040]
实施例3、分化培养基筛选
[0041]
分化培养基均为ms+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt，在此基础上设置4个梯度蔗糖浓度，分别为30、40、50、60g
·
l-1
；植物凝胶设置3个梯度，分别为3.0、3.5、4.0g
·
l-1
，共12种培养基(图4)。将愈伤组织分成小块置于上述分化培养基上，每皿15-20块愈伤，每种培养基重复10皿，23℃光培养，定期进行观察，1个月后统计分化率、快繁系数并筛选出最佳的
分化培养基。生根培养基为1/2ms+15g
·
l-1
蔗糖+5g
·
l-1
agar。光照培养6天后，部分愈伤组织开始由淡黄变为淡绿，15天后在愈伤组织表面长出绿芽点(图3中的a)，25天后在显微镜下可看到部分愈伤长出绿的小芽(图3中的b)，40天后已形成肉眼可见的绿分化芽(图3中的c)，将其转移到生根培养基上进行生根，生根率达100％(图3中的d)，1个月后将其移栽到温室的花盆中(图3中的e)，最终该技术体系的快繁系数平均可达35，该研究初步具备商业化优良种苗繁育的应用潜力。对12种分化培养基的分化率统计结果如图4所示。结果表明，在蔗糖为50g/l、植物凝胶为3.0g
·
l-1
培养基上，分化率最高达70％，其余分化培养基的分化率维持在10％-20％之间，二者间存在显著差异，最终将ms+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+50g
·
l-1
蔗糖+3.0g
·
l-1
植物凝胶确定为最佳的分化培养基。
[0042]
实施例4、快繁系数统计
[0043]
光照25天后，取已分化的愈伤组织，放入3个盛有分化培养基的培养皿中、每个培养皿放入5块，共15块(避开快繁系数最高和最低的愈伤组织)，将其置于显微镜下，用镊子剥开统计每块愈伤组织绿分化芽数并取平均值，快繁系数为35，快繁系数较高有利于后期获得更多的阳性苗(图3中的b)。
[0044]
实施例5、暗筛及光分化培养基筛选压确定
[0045]
基础培养基为ms+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+30g
·
l-1
蔗糖+7.8g
·
l-1
agar+1mg
·
l-1
特美汀，在此基础上设置梯度浓度实验，潮霉素浓度分别为0mg
·
l-1
(ck)、5mg
·
l-1
、10mg
·
l-1
、15mg
·
l-1
；将野生型愈伤组织置于上述培养基上，暗培养1个月，统计各浓度对应的愈伤组织的存活率，0mg
·
l-1
时存活率为100％，5mg
·
l-1
时为87％，10mg
·
l-1
时为51％，15mg
·
l-1
时为25％。筛选压浓度不宜过高，过高会使愈伤组织全部死亡，过低会遗漏未转化成功的愈伤组织，从而造成野生型材料也能在培养基上正常生长，综合考虑后确定野大麦的暗培养筛选为15h(即潮霉素的浓度为15mg
·
l-1
，下同)(图5)。
[0046]
光分化基础培养基为ms+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+50g
·
l-1
蔗糖+3.0g
·
l-1
植物凝胶+1mg
·
l-1
特美汀，在此基础上设置潮霉素梯度浓度实验，分别为0mg
·
l-1
(ck)、1mg
·
l-1
、2mg
·
l-1
、3mg
·
l-1
、4mg
·
l-1
、5mg
·
l-1
，1个月后统计成活率，分别为100％、100％、88％、68％、48％、31％，同上考虑后将野大麦的光分化筛选压确定为5h(图6)即潮霉素的浓度为5mg
·
l-1
。
[0047]
实施例6、农杆菌侵染
[0048]
活化农杆菌：将panic6b农杆菌从-80℃冰箱里取出，划线在相应抗性的农杆菌固体培养基(ms基础培养基，16g
·
l-1
琼脂)上，在28℃的条件下进行暗培养。2天后，农杆菌固体培养基上长出了农杆菌单克隆。菌液检测呈阳性后，取200μl菌液加入同等抗生素浓度50ml lb培养液中，于28℃、200r
·
min-1
的摇床中摇至od
600
＝0.6-0.8时，3500r
·
min-1
离心15分钟收集菌体，然后加入含有乙酰丁香酮(as)的液体侵染液(0.45g/l ms粉+5mg
·
l-1 2,4-d+0.1g/l mes+30g
·
l-1
蔗糖)重悬菌体。继续摇2小时od
600
＝0.6时，用侵染液进行稀释，使终浓度od
600
＝0.3，乙酰丁香酮终浓度为100μmol
·
l-1
时开始侵染。
[0049]
实施例7、侵染愈伤组织并共培养：侵染愈伤组织为结构致密、带有颗粒感的胚性愈伤组织，将愈伤组织加到稀释好的菌液中，进行抽真空10分钟，超声5分钟，再抽真空10分钟，“抽-超-抽”结束后在超净台中倒掉多余菌液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液并晾干，23℃培养箱暗培养，分别统计第3-7天的侵染效率。
[0050]
实施例8、共培养条件确定：农杆菌侵染后部分愈伤组织gus染呈阳性，共培养3天侵染效率为22％左右，共培养4天侵染效率为27％左右，共培养5天后侵染效率为34％左右，共培养6天后侵染效率为36％-37％，共培养7天侵染效率与共培养6天持平，随着共培养时间的增加，侵染效率明显增加，但共培养第6天开始，侵染效率上升趋势减缓。将共培养4-7天的愈伤组织分别置于暗筛培养基上继代，结果发现共培养4天和5天的愈伤组织可正常进行继代，共培养6天和7天的愈伤组织农杆菌难以抑制，个别还长有霉菌，最终确定共培养最长时间为5天(图7)。
[0051]
本发明首先通过提高野大麦再生培养基中的蔗糖浓度，建立了高效的再生体系，再生率为70％，快繁系数为35，可为其他禾本科牧草再生体系的建立提供借鉴及宝贵经验；其次，通过农杆菌侵染和调整共培养时间，侵染效率达34％；之后又确定了暗培养筛选压为15h；光分化筛选压为5h，这是目前野大麦未有的研究，可以为后期野大麦功能基因和分子育种研究奠定基础。

技术特征：

1.一种野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法，其特征在于，所述方法包括获得愈伤组织和农杆菌侵染；所述获得愈伤组织包括种子愈伤诱导和胚性愈伤系筛选；所述种子愈伤诱导时的培养基为蔗糖30g
·
l-1
+ch 1g
·
l-1
+2,4-d5mg
·
l-1
+agar 7.6-7.8g，ph为5.8-6.0；所述的胚性愈伤系筛选：获得的种子的愈伤组织后，将其放在ms+30g
·
l-1
蔗糖+1g
·
l-1
ch+2mg
·
l-1 2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt的培养基上进行继代，23℃暗培养，继代3-5次后筛选出结构致密且呈颗粒状的淡黄胚性愈伤组织；所述的农杆菌侵染为活化panic6b农杆菌，取野大麦愈伤组织，放到panic6b农杆菌od＝0.3的侵染液中，抽真空10分钟，超声10分钟，再抽真空十分钟后置于无菌的滤纸上晾干；在23℃暗培养箱中共培养5天，进行暗培养筛选，暗筛培养基为ms+2mg
·
l-1
2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+30g
·
l-1
蔗糖+7.8g
·
l-1
agar+1mg
·
l-1
特美汀+5mg
·
l-1
潮霉素，15天后将其置于含有15mg
·
l-1
潮霉素的暗筛培养基上，2个月转移到光分化培养基上进行分化，所述光分化培养基为ms+2mg
·
l-1
2,4-d+0.05mg
·
l-1
kt+50g
·
l-1
蔗糖+3.0g
·
l-1
植物凝胶+1mg
·
l-1
特美汀+5mg
·
l-1
潮霉素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述侵染液为100μmol
·
l-1
乙酰丁香酮+0.45g/l ms粉+5mg
·
l-1
2,4-d+0.1g/l mes+30g
·
l-1
蔗糖，其中panic6b农杆菌的od值为0.3。

技术总结

本发明涉及一种野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法，属于转基因技术领域，所述方法包括获得愈伤组织和农杆菌侵染；所述获得愈伤组织包括种子愈伤诱导和胚性愈伤系筛选；所述的农杆菌侵染为活化农杆菌，取野大麦愈伤组织，放到侵染液中，抽真空10分钟，超声10分钟，再抽真空十分钟后置于无菌的滤纸上晾干；在23℃暗培养箱中共培养5天，进行暗培养筛选，15天后将其置于含有15mg