7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用

1.本发明属于医学生物技术领域，更具体地，涉及7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。

背景技术：

2.沙门菌是一种革兰氏阴性细菌，人或养殖动物食用了被沙门菌污染的食物后，会导致食源性疾病，可引起从局部胃肠炎到全身性疾病。沙门菌的耐药性问题已对全球公共卫生构成威胁，随着临床检测中沙门菌耐药率升高，以及新型抗生素的供应有限，多粘菌素已作为抗生素多重耐药沙门菌的最后一道防线。
3.从上世纪50年代开始，多粘菌素已被用作抗生素对抗人类和兽医环境中革兰氏阴性细菌导致的临床感染。然而，由于多粘菌素使用容易有临床毒性，使其在上世纪80年代使用率显著减少。但随着耐药菌的危害加剧，多粘菌素又重新被使用，并作为多重耐药菌的最后手段。从2016年，质粒介导的可移动多粘菌素抗性基因(mcr-1)被报道后，多粘菌素耐药性是世界范围内新出现的公共卫生威胁。多粘菌素已在我国兽医领域停用，并有效减少耐多粘菌素大肠杆菌的检出率。但是在临床，多粘菌素还是十分重要的抗生素药物。基于肠杆菌科细菌的多粘菌素耐药性问题相当重要和突出，因此筛选有效的多粘菌素增效剂来耐药多粘菌素的肠杆菌科感染成了当务之急。从天然化合物库中提取与多粘菌素具有协同作用的天然化合物，可以有效的恢复耐多粘菌素肠杆菌科细菌对多粘菌黏的敏感性，这也是有效挖掘抗生素替代方法和解决细菌耐药性问题的策略之一。

技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供7,8-二羟基黄酮作为沙门菌铁稳态扰动剂的应用。
5.本发明的第二个目的是提供7,8-二羟基黄酮在制备耐多粘菌素沙门菌的增效剂中的应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.7,8-二羟基黄酮作为沙门菌铁稳态扰动剂的应用。
8.本发明所述铁稳态扰动剂7,8-二羟基黄酮，cas登录号为38183-03-8，分子式为c
15h10
o4，分子质量254.24。
9.结构式：
10.11.7,8-二羟基黄酮是脑源性神经营养因子的模拟物，主要作为抗抑郁药、创伤性脑损伤恢复以及预防认知能力下降和神经退行性疾病。目前，国内外未见7,8-二羟基黄酮通过扰乱沙门菌胞内铁稳态来增强沙门菌对多粘菌素敏感性的报道。
12.本发明以沙门菌胞内铁稳态作为多粘菌素增效剂筛选的靶标，并筛选到7,8-二羟基黄酮可以通过扰动细菌胞内的铁稳态，减少胞内可用的铁元素的含量，并且显著降低铁元素的转运蛋白的表达量。
13.因此，优选的，上述应用中，7,8-二羟基黄酮用于减少沙门菌细胞内铁元素的含量。
14.体外试验表明，在有效浓度范围内7,8-二羟基黄酮不具有抑菌能力，经7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合可以显著增强耐多粘菌素沙门菌对多粘菌素敏感性。
15.因此，本发明还提供了7,8-二羟基黄酮在制备耐多粘菌素沙门氏菌的增效剂中的应用。
16.优选的，上述应用中，所述7,8-二羟基黄酮的浓度为25mg/l，所述沙门氏菌的浓度为1
×
106cfu/ml，多粘菌素的浓度为16-32mg/l。
17.体内试验中，通过构建小鼠沙门菌肠道感染模型，7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素腹腔注射，可以减少肝和脾的沙门菌菌量并显著提高动物的生存率。
18.因此，本发明还提供了7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用在制备抗沙门氏菌感染的药物中的应用。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明公开了7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。使用elisa试剂盒检测沙门菌胞内的铁含量，并通过rt-pcr验证与铁摄取相关的基因的表达量变化，证实7,8-二羟基黄酮通过抑制与铁摄取相关基因的表达进而扰乱沙门菌胞内的铁稳态。7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂联合多粘菌素对沙门菌在体外和体内实验都具有很好的协同作用。相比传统抗生素与抗生素联合直接杀死沙门菌的作用机制，植物提取物7,8-二羟基黄酮可直接抑制沙门菌对铁元素的利用，从而提高沙门菌对多粘菌素的敏感性，不容易诱导细菌耐药性的产生，具有来源广泛、价格低和效果好的特点。
附图说明
21.图1显示7,8-二羟基黄酮扰动细菌包内的铁稳态，并显著降低铁元素的相关转运蛋白的表达量；
22.图2显示7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素对沙门菌的棋盘法热图和体外杀菌曲线；
23.图3显示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用显著降低沙门菌感染小鼠的肝和脾的载菌量，并显著提高小鼠的生存率。
具体实施方式
24.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
25.下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使
用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。
26.实施例1沙门氏菌铁稳态扰动剂的筛选
27.以检测细菌胞内总铁含量的elisa试剂盒来检测受试化合物对沙门菌铁稳态的影响，通过天然化合物与沙门菌共孵育后检测沙门菌胞内的总铁含量进行铁稳态扰动剂的筛选，具体实验过程如下：
28.1、将经高压灭菌的ph值为5.8的lpm肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株atcc14028为实验室保存。
29.2、试验前的准备工作：
30.(1)配制实验室已有的植物提取物，溶剂为二甲基亚砜，使药物终浓度为5000mg/l，混匀后用滤膜过滤，备用。
31.(2)将沙门菌标准菌株atcc14028接种至lb琼脂培养板上，培养至合适大小。
32.3、植物提取物影响沙门菌胞内铁含量的检测
33.(1)受试沙门菌标准菌株atcc14028接到装有4ml lb肉汤试管中，放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期；
34.(2)使用ph值为5.8的lpm肉汤将孵育后的菌稀释到100倍后添加终浓度为25mg/l的植物提取物使总体积4ml，并设置空白对照组；
35.(3)将(2)中的菌液放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期后，调整使每一植物提取物处理组的od值达一致；
36.(4)吸取等体积的(3)中调整好的菌液，在低温环境下收集菌体，并使用低温去离子水进行3次洗脱细菌胞外的铁元素；
37.(5)加入1ml 低温去离子水重悬(4)洗脱后的菌体，并使用超声破碎仪低温完全破碎菌体；
38.(6)根据检测细菌胞内总铁含量的elisa试剂盒的说明书步骤，检测沙门菌胞内的总铁含量。
39.利用rt-pcr检测化合物对沙门菌铁转运相关基因的mrna表达水平试验的影响。具体实验过程如下：
40.1、将经高压灭菌的ph值为5.8的lpm肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株atcc14028为实验室保存。
41.2、试验前的准备工作：
42.(1)配制适量的7,8-二羟基黄酮，溶剂为二甲基亚砜，使药物终浓度为5000mg/l，混匀后用滤膜过滤，备用。
43.(2)将沙门菌标准菌株atcc14028接种至lb琼脂培养板上，培养至合适大小。
44.3、7,8-二羟基黄酮对沙门菌的铁转运相关基因mrna水平检测
45.(1)受试沙门菌标准菌株atcc14028接到装有4ml lb肉汤试管中，放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期；
46.(2)使用ph值为5.8的lpm肉汤将孵育后的菌稀释到100倍后添加终浓度为25mg/l的7,8-二羟基黄酮使总体积4ml，并设置空白对照组；
47.(3)将(2)中的菌液放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期后；收集菌体，并使用
rna提取试剂盒提取菌体总rna；再使用反转录试剂盒将提取的rna反转录成cdna，并放于-20℃冰箱备用；
48.(4)在ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上收集并设计沙门菌与铁转运相关基因的引物，并将引物合成；
49.(5)使用(3)中准备好的cdna和(4)中已合成的引物进行rt-pcr试验，检测沙门菌与铁转运相关基因的mrna表达水平。
50.结果：细菌胞内总铁含量的elisa试剂盒检测结果显示，与对照组相比，7,8-二羟基黄酮在浓度为25mg/l时可以显著减少沙门菌胞内总的铁含量；rt-pcr结果显示，经25mg/l的7,8-二羟基黄酮预处理后，沙门菌与铁转运相关的基因表达水平均出现不同程度的下降，该结果表明7,8-二羟基黄酮通过抑制沙门菌铁摄取相关的基因表达水平，从而扰乱沙门菌胞内的铁稳态(见图1)。
51.实施例2 7,8-二羟基黄酮增强体外沙门氏菌对多粘菌素的敏感性
52.1、将经高压灭菌的ph值为5.8的lpm肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株atcc14028，耐多粘菌素沙门菌(17es)均为实验室保存。
53.2、试验前的准备工作：
54.(1)配制适量的7,8-二羟基黄酮，溶剂为二甲基亚砜，使药物终浓度为5000mg/l，混匀后用滤膜过滤，备用。多粘菌素按照clsi配成浓度为5120mg/l的储备液备用。
55.(2)将沙门菌标准菌株atcc14028和耐多粘菌素沙门菌(17es)接种至lb琼脂培养板上，培养至合适大小。
56.3、7,8-二羟基黄酮与多粘菌素对沙门菌的mic和fici
57.(1)受试沙门菌标准菌株atcc14028和耐多粘菌素沙门菌(17es)接到装有4ml lb肉汤试管中，放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期；
58.(2)使用ph值为5.8的lpm肉汤将孵育后的菌稀释到100倍，约为106cfu/ml，备用；
59.(3)取无菌96孔板，第1孔加180μl lpm肉汤培养基，第2-11孔分别加入100μllpm肉汤培养基；
60.(4)在第1列加入20μl药，吹打均匀后，吸取100μl到第2孔，依次类推，第10孔吸取100μl弃去；
61.(5)第1到11孔加入稀释好的菌液100μl，第12孔加入200μl lpm肉汤培养基肉汤；
62.(6)重复步骤(3)到(5)，进行三次重复平行；
63.(7)将接种好的96孔板放入37℃培养箱中孵育16-18h后，读取结果；
64.(8)根据mic结果，再进行棋盘法。7,8-二羟基黄酮浓度范围为1-100mg/l，多粘菌素抗生素的作用浓度范围为16-32mg/l。
65.mic结果如表1，7,8-二羟基黄酮对沙门菌标准菌和耐多粘菌素沙门菌的mic值》100mg/l；当7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用时，能显著降低耐药菌和标准菌对多粘菌素的敏感性，棋盘法结果如图2所示，并且棋盘法结果显示fici均小于0.5，表明7,8-二羟基黄酮与多粘菌素在沙门菌时有很好的协同作用。
66.表1
[0067][0068][0069]
4、7,8-二羟基黄酮与多粘菌素对沙门菌的体外杀菌曲线
[0070]
(1)受试沙门菌标准菌株atcc14028和耐多粘菌素沙门菌(17es)接到装有4ml lb肉汤试管中，放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期；
[0071]
(2)使用ph值为5.8的lpm肉汤将孵育后的菌稀释到10倍，约为107cfu/ml，备用；
[0072]
(3)在ph值为5.8的lpm肉汤离心管中，添加25mg/l浓度的7,8-二羟基黄酮或有抑菌浓度的多粘菌素单独或联合使用，然后加入步骤(2)所稀释得到的稀释菌液各0.4ml，涡旋5s混匀。设立一个空白对照组作为质控，对照组除了不加入药之外，其余条件都与试验组保持一致。此时的菌液浓度约为1
×
106cfu/ml左右，放置于37℃摇床内180转培养，菌液体系为4ml；
[0073]
(4)分别取培养时间的0、3、6、9和24h时的菌液吸取100μl菌液加入装有900μl0.85％生理盐水的2ml离心管中进行10倍的梯度稀释，稀释后吸取25μl滴在mh琼脂培养基上，在37℃培养箱孵育18h，进行计数，实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。统计各时间点的菌落数，并绘制杀菌曲线图。
[0074]
结果：图2体外杀菌曲线显示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用24h后载菌量相较于单药下降超过100倍，展现7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合在体外具有优异的杀灭沙门菌的效果。
[0075]
实施例3 7,8-二羟基黄酮增强体内多粘菌素对沙门氏菌杀伤效果
[0076]
1、试验材料：广东省南方医科大学购买8周龄c57bl/6j雌鼠64只，小鼠灌胃针，无菌注射器。
[0077]
2、试验前的准备工作：配备5mg/kg多粘菌素、5mg/kg 7,8-二羟基黄酮储备液，链霉素100000mg/l。将沙门氏菌atcc14028菌株接种至lb琼脂培养板上，培养至合适大小。每组8只小鼠，一共4组(对照组，多粘菌素组，7,8-二羟基黄酮组，联合组)。
[0078]
3、沙门氏菌感染小鼠模型的建立
[0079]
(1)每只老鼠口服20mg的链霉素处理肠道菌，并在处理前提前4h进行断水断粮。
[0080]
(2)链霉素处理一天后，灌胃100μl的约为109的atcc14028菌液。受试atcc14028菌株接到装有4ml lb肉汤试管中，放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期取出离心管(约108菌量)，并集菌到109的菌量。
[0081]
4、小鼠感染后靶器官菌落定植数检测
[0082]
(1)小鼠感染1天后，7,8-二羟基黄酮(5mg/kg,腹腔注射，一天一次)与多粘菌素(5mg/kg,腹腔注射，一天一次)进行单药以及联合给药。
[0083]
(2)使用上述药物剂量持续3天后，以颈部关节脱位法处死组和质控组的小鼠，收集脾脏、肾脏，并进行菌落计数。
[0084]
结果：与最好的单药组相比，7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合后，小鼠靶器官(肝、脾)显著减少，菌量较单药处理下降超过100倍(见图3)。
[0085]
5、小鼠感染后生存率试验
[0086]
(1)小鼠感染1天后，7,8-二羟基黄酮(5mg/kg,腹腔注射，一天一次)与多粘菌素(5mg/kg,腹腔注射，一天一次)进行单药以及联合给药。
[0087]
(2)使用(1)药物剂量持续8天后，记录并绘制组和质控组的小鼠生存曲线。
[0088]
结论：第八天后，对照组存活率0％，7,8-二羟基黄酮组存活率12.5％，多粘菌素组存活率25％，7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素生存率为87.5％；7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素保护率显著高于多粘菌素组(见图3)。这表明7,8-二羟基黄酮和多粘菌素联合使用体内沙门菌感染也有很好的协同效果。
[0089]
综上所述，本研究以沙门菌的铁稳态为靶标，筛选出铁稳态扰动剂7,8-二羟基黄酮，并展示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合具有很好的体外杀伤沙门菌作用。最后通过口服感染沙门菌的方式成功建立沙门氏菌感染小鼠模型，进一步证实7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用可以减少肝脏、脾脏的菌落定殖，并降低沙门菌感染小鼠的死亡率，这些研究将为多粘菌素增效剂的新药研发提供思路和基础。
[0090]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：

1.7,8-二羟基黄酮作为沙门菌铁稳态扰动剂的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述7,8-二羟基黄酮用于减少沙门菌细胞内铁元素的含量。3.7,8-二羟基黄酮在制备耐多粘菌素沙门菌的增效剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述7,8-二羟基黄酮的浓度为25mg/l，所述沙门菌的浓度为1
×
106cfu/ml，多粘菌素的浓度为16-32mg/l。5.7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用在制备抗沙门菌感染的药物中的应用。

技术总结

本发明属于生物技术领域，公开了7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。使用ELISA试剂盒检测沙门菌胞内的铁含量，并通过RT-PCR验证与铁摄取相关基因的表达量变化，证实7,8-二羟基黄酮通过抑制与铁摄取相关基因的表达进而扰乱沙门菌胞内的铁稳态。7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂联合多粘菌素对沙门菌在体外和体内实验都具有很好的协同作用。相比传统抗生素与抗生素联合直接杀死沙门菌的作用机制，植物提取物7,8-二羟基黄酮可直接抑制沙门菌对铁元素的摄取与利用，从而提高沙门菌对多粘菌素的敏感性，不容易诱导细菌耐药性的产生，具有来源广泛、价格低和效果好的特点。低和效果好的特点。低和效果好的特点。