一种褐藻胶寡糖衍生物的应用

1.本发明涉及预防和光老化皮肤疾病领域，具体涉及一种褐藻胶寡糖衍生物的应用。

背景技术：

2.皮肤是人体中最大的器官，它具有许多功能，如保持体温、防止水分流失，是保护身体免受破坏病原体、污染和紫外线(uv)辐射的屏障。随着人口日益老龄化及其对保持皮肤年轻的需求，皮肤抗衰老剂的发展已引起制药和化妆品等领域的关注热点之一。皮肤老化分为内在老化和外在老化，通过各种外部刺激，主要是紫外线辐射刺激引起的老化称为光老化。光老化的主要特征为肤素沉着，皮肤粗糙、干燥、发黄、深皱纹、严重萎缩、黑素瘤等。黑素细胞产生的黑素作为皮肤自我光保护的一部分，具有自由基清除的活性。但是，紫外线照射可以直接或间接的激发皮肤细胞中发团发生化学反应产生大量的活性氧(ros)自由基，超出了黑素的清除能力。这些活性氧进一步导致皮肤细胞中的转录因子激活蛋白-1(ap-1)和核因子κb(nf-b)的活化。ap-1可以诱导上调基质金属蛋白酶(mmps)，如胶原酶-1(mmp-1)、基质溶素-1(mmp-3)和明胶酶a(mmp-2)的活性，mpps可以特异性降解结缔组织，如胶原蛋白和弹性蛋白，并间接抑制皮肤中的胶原蛋白合成，从而导致皮肤的松弛、衰老。因此，需要额外提供足够的光保护以防止光老化和其他皮肤疾病。
3.目前，一些合成的活性物质用于抗光老化的产品，但是，因为其不稳定性和潜在的生物毒性使产品的安全性没有保证。因此，天然、无毒、绿、环境友好的抗光老化的活性物质受到越来越多的关注。与植物相比，海藻由于生活环境的特殊性，有些海藻长期接受强的紫外线照射，为了保护海藻免受紫外损伤，海藻会自动合成很多抗紫外损伤的物质。如海藻多糖、蛋白具有清除ros的活性，具有潜在的抗光老化的性能。海藻衍生材料，如霉菌素样氨基酸(maa)是最有潜力的天然uva吸收分子。
4.褐藻胶寡糖是来源于褐藻的酸性多糖，主要由甘露糖醛酸和/或古罗糖醛酸组成，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。将褐藻胶寡糖进行分离纯化得到纯聚甘露糖醛酸寡糖并进行硫酸化反应，制备得到硫酸化的甘露糖醛酸寡糖，其重复结构单元如下：
[0005][0006]
本发明制备的褐藻胶寡糖衍生物一方面具有优异的吸湿保湿、抗氧化、抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶的活性。另一方面褐藻胶寡糖衍生物可以形成隐形膜，很好的贴合皮肤，保持皮肤的湿润环境，有效预防uv引起的光损伤，从多个途径保护和修复uv照射引起的皮
肤损伤，在抗光老化药物、医疗器械和化妆品领域具有很好的应用潜力。

技术实现要素：

[0007]
本发明针对现有技术的不足，提供了一种褐藻胶寡糖衍生物在抗光老化药物、医疗器械和化妆品中的应用。其特征在于，所述的应用是指褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的应用。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种褐藻胶寡糖衍生物的应用，其特征在于，所述的应用是指褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的应用。其中，所述褐藻胶寡糖衍生物的结构如下：
[0009][0010]
其中，所述抗光老化药物、医疗器械或护肤品，其特征在于，以褐藻胶寡糖衍生物为活性成分。
[0011]
其中，所述抗光老化药物、医疗器械或护肤品，其特征在于，所述医疗器械指具有抗皮肤光老化和光损伤皮肤修复功能的皮肤表层外用制剂，例如霜、乳液、凝胶、喷雾等。
[0012]
其中，所述抗光老化药物、医疗器械或护肤品，其特征在于，所述的褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的添加量为0.5-3％。
[0013]
其中，所述抗光老化药物、医疗器械或护肤品，其特征在于，所述的褐藻胶寡糖衍生物：聚合度为2-20的硫酸化的甘露糖醛酸，优选8-14；硫酸基含量为10-20％，优选15-18％；甘露糖醛酸连接方式为1-4连接，硫酸基取代位置为甘露糖醛酸的2位或/和3位。
[0014]
本发明发现所述的褐藻胶寡糖衍生物具有抗氧化、抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶的活性，可以预防和光老化引起的皮肤损伤的活性。所述的应用是指褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗光老化药物、医疗器械或护肤品中的应用。
[0015]
本发明提供了一种抗光老化褐藻胶寡糖衍生物。褐藻胶寡糖衍生物一方面具有优异的吸湿保湿性能，可以形成隐形膜阻止紫外线对皮肤的损伤，保持皮肤湿润环境；另一方面具有强抗氧化能力，抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶的活性，抑制黑素生成，抑制胶原蛋白的分解，减少光损伤造成的皮肤老化。褐藻胶寡糖衍生物无免疫原性，具有良好的透气性又能保持皮肤的湿润环境，安全无毒，应用方便。本发明特别适用于抗光老化药物、医疗器械和护肤品中，可以有效的减轻光老化造成的皮肤损伤。
[0016]
本发明所述的褐藻胶寡糖衍生物由以下方法制备：
[0017]
(1)硫酸化试剂so3－dmf的制备
[0018]
将盛有200-300ml n，n－二甲基甲酰胺的三口烧瓶置于冰浴中，三口烧瓶的各口分别接冷凝管、搅拌棒和滴液漏斗，逐滴加入35-50ml。滴加完毕，撤去滴液漏斗，冰浴搅拌至室温，静置30-60min，形成透明溶液。倒入干燥的棕瓶中待。
[0019]
(2)硫酸化反应
[0020]
称取干燥的甘露糖醛酸寡糖样品0.5-2g，倒入干燥的250ml三口瓶中，加入60-80ml甲酰胺，在50
ꢀ‑
60℃机械搅拌30-60min，滴加5-25ml的磺化试剂so3－dmf，反应2-4h。反应完毕后，将反应液倒出，在0.1％-0.3％ kcl存在下，用72-75％乙醇沉淀，并用95％乙醇洗涤沉淀2～3次，将沉淀在红外灯下烘干，溶于100－150ml蒸馏水中，用1-2m naoh中和到ph为7～8，g10脱盐。脱盐后溶液旋转蒸发至50-100ml，真空冻干，将得到的产物研磨成粉末得到褐藻胶寡糖衍生物，记为mos，室温避光干燥储存。
[0021]
本发明与现有技术比较拥有以下优点：
[0022]
1、本发明制备的褐藻胶寡糖衍生物具有优异的吸湿保湿、抗氧化、抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶的活性；
[0023]
2、本发明制备的褐藻胶寡糖衍生物极易溶于水，可以形成隐形膜，很好的贴合皮肤，保持皮肤的湿润环境，有效预防uv引起的光损伤，从多个途径保护和修复uv照射引起的皮肤损伤。
[0024]
3、本发明方法简单，实验材料易得，便于大批量制备。
附图说明
[0025]
图1褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos的ir谱图。
[0026]
图2褐藻胶寡糖衍生物mos-2放大75倍(a)和放大200倍(b)的扫描电镜图像。
[0027]
图3褐藻胶寡糖衍生物及aos的保湿性和吸湿性。(a)为相对湿度为80％条件下保湿性，(b)为相对湿度为50％条件下保湿性，(c)为相对湿度为81％条件下吸湿性，(d)为相对湿度为42％条件下吸湿性。
[0028]
图4褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos的抗氧化活性。(a)为羟基自由基清除率测定，(b)为超氧阴离子清除率测定，(c)为总还原力测定。
[0029]
图5褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos抑制酪氨酸酶活性。
[0030]
图6褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos抑制弹性蛋白酶的活性。
[0031]
图7褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos对hacat细胞的存活率的影响。
[0032]
图8褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos对角质细胞ros的抑制作用。(a)为10mj/cm2照射量下ros增量，(b)为1000mj/cm2照射量下ros增量。
[0033]
图9褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos对黑素细胞的酪氨酸酶的活性影响。
[0034]
图10褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos对紫外损伤的成纤维细胞ι型胶原蛋白mrna表达的影响。
[0035]
图11褐藻胶寡糖衍生物mos-2及aos对血细胞的溶血作用。
具体实施方式
[0036]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0037]
实施例1，甘露糖醛酸寡糖(aos,mannuronate oligosaccharides)的制备
[0038]
(1)海藻酸钠降解
[0039]
称取20.0g海藻酸钠溶于去离子水中，使胶液浓度为2.0％，机械搅拌使之成为均一体系，转移到三口瓶中，搅拌条件下缓慢滴加浓盐酸，使终浓度为0.5m，加热至100℃，反应10h。
[0040]
(2)甘露糖醛酸聚糖(pm，poly mannuronic acid)和古洛糖醛酸聚糖(pg，poly guluronic acid)分离纯化
[0041]
将(1)反应后的液体降温到室温，转速4000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用8％nahco3溶液溶解，滴加2m盐酸调节ph＝2.85，4000r/min离心10min，得上清液a和沉淀b，上清液a用1m氢氧化钠溶液调ph＝7～8，加入3倍体积95％乙醇醇沉，4000r/min离心10min，沉淀用无水乙醇脱水、烘干即得pm粗品，得到的粗品再次溶于8％nahco3溶液，重复上述操作2次即可得纯度较高的pm，收率：22.5％；
[0042]
沉淀b加入去离子水稀释，配成6.0％的溶液，用1m氢氧化钠溶液调ph＝7～8使沉淀溶解，硅藻土过滤，滤液用2m盐酸调节ph＝2.85，析出大量沉淀，抽滤并用去离子水洗涤沉淀，烘干即得pg粗品。得到的粗品再次用1m氢氧化钠溶液调ph＝7～8溶解，重复上述操作2次即可得纯度较高的pg，收率：11.3％。
[0043]
(3)甘露糖醛酸寡糖(aos)的制备
[0044]
称取上述pm 2.0g，加去离子水配成1.0％溶液，用2m盐酸调节ph＝4.0，转移到西林瓶中密封，加热到120℃，反应4h，体系降温到室温，1m氢氧化钠溶液调ph＝7～8，浓缩至最终体积2.0ml，bio-gel p2(2.6
×
100cm)柱层析纯化，淋洗剂为1.0m nacl溶液，流速为8.0ml/h，苯酚-硫酸法检测糖含量，495nm测吸光值。sephadex g10(2.6
×
60cm)柱层析除盐，去离子水为淋洗剂，流速为2.0ml/min，1.0％agno3溶液检查每管含盐情况，合并浓缩无盐组分，记为aos，收率：20.5％。
[0045]
实施例2，硫酸化甘露糖醛酸寡糖(mos)的制备
[0046]
(1)硫酸化试剂so3－dmf的制备
[0047]
将盛有300ml n，n－二甲基甲酰胺的三口烧瓶置于冰浴中，三口烧瓶的各口分别接冷凝管、搅拌棒和滴液漏斗，逐滴加入50ml。滴加完毕，撤去滴液漏斗，冰浴搅拌至室温，静置30min，形成透明溶液。倒入干燥的棕瓶中待。
[0048]
(2)硫酸化反应
[0049]
分别称取0.5g,1.0g,1.2g，1.5g,2.0g五份干燥的甘露糖醛酸样品，倒入干燥的250ml三口瓶中，加入60ml甲酰胺，在50℃机械搅拌30min，滴加15ml的磺化试剂so3－dmf，反应2h。反应完毕后，将反应液倒出，在0.1％ kcl存在下，用75％乙醇沉淀，并用95％乙醇洗涤沉淀3次，将沉淀在红外灯下烘干，溶于100ml蒸馏水中，用2m naoh中和到ph为7，g10脱盐。脱盐后溶液旋转蒸发至50ml，真空冻干，将得到的产物研磨成粉末得到褐藻胶寡糖衍生物，依次记为mos-1、mos-2、mos-3、mos-4和mos-5。
[0050]
实施例4，褐藻胶寡糖衍生物的化学成分分析和结构特征
[0051]
配制5mg/ml的褐藻胶寡糖衍生物水凝胶，利用高效液相谱测定衍生物的分子量；取0.1g褐藻胶寡糖衍生物溶解在25ml水中，取出5ml加入0.6ml浓盐酸105℃下水解4h，用氢氧化钠调节ph为中性，利用离子谱测定褐藻胶寡糖衍生物硫酸基(so
42-)含量；总糖含量以甘露糖醛酸(c6h
12
o6)为标准采用苯酚-硫酸法进行分析。实施例2中制备的褐藻胶寡糖衍生物的化学成分分析如表1所示。利用红外光谱对实施例2中制备的褐藻胶寡糖衍生物
mos-2进行表征，如图1所示。利用扫描电镜对实施例2中制备的mos-2的微观结构进行表征，如图2所示。
[0052]
表1褐藻胶寡糖衍生物的化学成分分析
[0053][0054]
mos-2、aos的ir谱图见图1，mos-2的sem图像见图2。通过红外谱图可以看到和原料aos相比，mos-2红外谱图中出现1246.94cm-1
、822.21cm-1
硫酸基的特征峰，说明硫酸化的褐藻胶寡糖衍生物成功制备。通过扫描电镜可以看到所得的mos-2水凝胶呈现三维网络结构，具有非常疏松的多孔结构，表明其有很强的吸水和保湿性。
[0055]
实施例5，褐藻胶寡糖衍生物的保湿、吸湿性质
[0056]
水凝胶良好的吸湿保湿性质可以维持皮肤长时间的湿润，减少皮肤干燥引起的诸多问题。本试验通过测试褐藻胶寡糖衍生物的吸湿性、保湿性评估其吸湿、保湿性质。
[0057]
测试样品：实施例2中制备的褐藻胶寡糖衍生物mos-2、mos-5。
[0058]
试验方法：
[0059]
保湿性：分别配置10mg/ml的mos-2和mos-5水溶液，放在恒温恒湿的干燥器中，室温放置于不同湿度下(高湿度为80％，低湿度为50％)，每组6个平行，以10mg/ml透明质酸钠作为阳性对照，每隔12h的时间间隔称重，计算保水性。
[0060]
保湿性(g/g)＝t时刻的样品重/初始样品重。
[0061]
吸湿性：分别取0.1g干燥至恒重的aos-3样品放在恒温恒湿的干燥器中，在室温下，在环境湿度为高湿度(80％)和低湿度(42％)下，测定其吸湿活性，每组6个平行，以0.1g干燥至恒重的透明质酸钠作为阳性对照，每隔12h的时间间隔称重，计算吸水性。
[0062]
吸湿性(g/g)＝t时刻的样品重/初始样品重。
[0063]
结果：
[0064]
褐藻胶寡糖衍生物mos-2和mos-5的保湿性和吸湿性见图3。
[0065]
mos-2和mos-5在高湿度(80％)和低湿度(50％)条件下的保水性均显著优于阳性对照透明质酸钠和未修饰的aos(实施例1得到的产物)，说明其具有良好的保湿性能，硫酸基含量对保湿活性有一些影响，高硫酸化样品的活性更好一些。
[0066]
mos-2和mos-5样品在高湿度(80％)和低湿度(42％)条件下的吸水性均显著优于阳性对照透明质酸钠和未修饰的aos(实施例1得到的产物))，，说明其具有良好的吸水性能，硫酸基含量对保湿活性有一些影响，高硫酸化样品的活性更好一些。
[0067]
根据吸湿保湿实验结果，硫酸化后的甘露寡糖具有更好的吸湿保湿活性，硫酸基含量高的样品活性较好，我们在后续的实施例中选用硫酸基含量较高的mos-2作为实验样品，比较mos-2与未修饰的甘露寡糖aos及化妆品及医美产品常用的透明质酸在抗氧化及抑制黑素的活性。
[0068]
实施例6，褐藻胶寡糖衍生物mos-2的抗氧化能力以及酪氨酸酶抑制作用
[0069]
水凝胶良好的抗氧化能力能够减少自由基引起的对皮肤的光损伤，包括胶原蛋白降解等。同时光损伤皮肤还会引起黑素沉积等，而黑素的生成与酪氨酸酶的活性直接
相关。本试验通过卡拉胶聚丙烯腈衍生物水凝胶对羟基自由基、超氧阴离子的清除率以及总还原力的测定检测其抗氧化能力。通过对酪氨酸酶活性的抑制活性来测定其在黑素生成方面的抑制作用。
[0070]
测试样品：实施例2中制备的褐藻胶寡糖衍生物mos-2，配置不同浓度的溶液。
[0071]
试验方法：
[0072]
羟基自由基清除实验：称取36.0mg番红花，加入去离子水溶解并转移至容量瓶中定容至100ml得到所需番红花溶液。称取55.6mg feso4·
7h2o、148.9mg edta-na2，加入去离子水溶解并转移至容量瓶中定容至100ml得到所需edta-fe
2+
溶液。吸取200μ30％过氧化氢加入10ml离心管中，加入4.8ml去离子水得到所需过氧化氢溶液。每个体系中加入200μ番红花溶液、200μedta-fe
2+
溶液以及200μ过氧化氢溶液，另加入200μ去离子水作为阴性对照，分别加入200μmos-2、透明质酸钠溶液作为实验组，仅加入200μ番红花溶液和200μedta-fe
2+
溶液以及400μ去离子水作为空白对照组。反应20min，待反应结束后，用酶标仪在520nm处测定吸光度值，计算羟基自由基清除率。
[0073]
羟基自由基清除率(％)＝(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(空白组吸光度值-阴性对照组吸光度值)
×
100％
[0074]
超氧阴离子清除实验：称取5mg邻苯三酚(焦性没食子酸)加入10ml pbs缓冲液(ph＝8)配制邻苯三酚试剂。在体系中加入100μl邻苯三酚溶液，加入100μl pbs缓冲液(ph＝8)作为阴性对照，加入100μl mos-2以及与之同浓度的透明质酸钠溶液作为实验，加入100μl与上述mos-2同浓度的vc溶液作为阳性对照。反应30s后，在325nm处吸光度值，计算超氧阴离子清除率。
[0075]
超氧阴离子清除率(％)＝(阴性对照组吸光度值-实验组吸光度值)/阴性对照组吸光度值
×
100％
[0076]
总还原力实验：配制1％的铁溶液，10％的三溶液，0.1％的氯化铁溶液。体系中加入铁溶液，加入vc作为阳性对照，再加入mos-2以及与之同浓度的透明质酸钠溶液作为实验组，在50℃条件下孵育20分钟。依次加入三溶液以及氯化铁溶液在700nm测定吸光度。
[0077]
酪氨酸酶抑制活性实验：用pbs缓冲液(ph＝6.6)配制5mmol/l酪氨酸溶液以及2000u/ml酪氨酸酶溶液。向体系中加入5μl的2000u/ml酪氨酸酶溶液，再加入265μl的mos-2以及与之同浓度的透明质酸钠溶液作为实验组，加入265μl的与上述mos-2同浓度的曲酸溶液作为阳性对照，以265μlpbs作为空白对照组。在37℃孵育10分钟，结束后，加入5mmol/l的酪氨酸溶液于475nm处每隔30s测一次吸光度，计算酪氨酸酶的相对酶活。
[0078]
结果：
[0079]
羟基自由基、超氧阴离子的清除率以及总还原力的测定结果见图4。酪氨酸酶的抑制活性见图5。
[0080]
与透明质酸钠相比，mos-2的羟基自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和总还原能力均显著高于同浓度下的透明质酸钠，说明mos-2具有较好的抗氧化能力。
[0081]
mos-2与透明质酸钠相比，酪氨酸酶抑制活性显著高于同浓度的透明质酸钠，具有较好的抑制酪氨酸酶活性，说明mos-2能够抑制酪氨酸酶的活性，具有良好的抑制黑素生成的能力。
[0082]
实施例7，褐藻胶寡糖衍生物mos-2对弹性蛋白酶的抑制作用
[0083]
弹性蛋白酶可以降解弹性蛋白，紫外辐射会导致弹性蛋白酶的表达增多，引起皮肤中弹性蛋白的流失，进而引起皮肤的松弛、皱纹等问题。本试验通过mos-2对弹性蛋白酶的抑制活性探究其在减缓皮肤老化的效果。
[0084]
测试样品：实施例2中制备的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0085]
实验方法：
[0086]
将100μl的mos-2以及与之同浓度的透明质酸钠溶液中加入25μl弹性蛋白酶溶液(60mu/ml)在25℃下孵育15min。孵育结束后，加入25μl的1.015mmol/l的n-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯(aaapan)反应15min，反应结束后，在410nm处测定吸光度值并计算mos-2对弹性蛋白酶的抑制率。
[0087][0088]
式中：a为不含样品的反应溶液的吸光度；b为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；c为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；d为不含酶的反应溶液的吸光度。
[0089]
结果：
[0090]
mos-2对弹性蛋白酶的抑制作用如图6。
[0091]
mos-2对弹性蛋白酶具有抑制作用，抑制活性显著高于同浓度的透明质酸和aos。说明mos-2有潜力作为弹性蛋白酶的天然抑制剂添加在护肤品中，起到减缓皮肤老化的效果。
[0092]
实施例8，褐藻胶寡糖衍生物mos-2对hacat细胞存活率测试
[0093]
本试验通过褐藻胶寡糖衍生物mos-2的细胞存活率实验，检验有无细胞毒性。
[0094]
测试样品：实施例2中的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0095]
试验方法：
[0096]
将正常生长的hacat细胞用胰蛋白酶消化后，用完全培养基配成细胞悬液，以每孔4
×
104ꢀ‑5×
104个/ml接种于96孔板，培养4-6h使细胞贴壁。对照组使用完全培养基继续培养，实验组使用mos-2、透明质酸钠，用完全培养基配制最终浓度均为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。37℃培养箱中培养24h后，加入mtt孵育4h，吸弃上清后每孔加入150μdmso，充分混匀后酶标仪490nm测定吸光度，比较细胞存活率。
[0097]
结果：
[0098]
mtt实验结果见图7。实验结果表明mos-2对hacat细胞并无细胞毒性，并且与对照组相比能够显著的促进hacat细胞的增殖。
[0099]
实施例9，褐藻胶寡糖衍生物mos-2对紫外损伤的hacat细胞ros产生的抑制作用
[0100]
活性氧是氧正常代谢的副产物，但是在外界环境较强紫外线照射条件下，活性氧水平会急剧上升对细胞造成损伤。本实验通过褐藻胶寡糖衍生物mos-2对紫外照射角质细胞产生的ros的作用评估其在细胞水平的清除活性氧的能力。
[0101]
测试样品：实施例2中的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0102]
试验方法：
[0103]
以每孔2
×
104个细胞的密度接种细胞，孵育24h后，分别加入mos-2、透明质酸钠，终浓度分别为100μg/ml，200μg/ml和400μg/ml。用10mj/cm2和1000mj/cm2的uvb照射细胞24
小时，对照组不进行紫外线照射。照射结束后，去除培养液，用hbss洗涤细胞。2，7-二氯荧光素二乙酯(dcfh-da)用dmso稀释后加入每孔细胞中，在室温下黑暗中孵育30分钟，使染料扩散到细胞中。孵育后，去除染料，加入无血清的dmem培养基。立即在485nm和535nm测量吸光度。光密度(od)值表示细胞内活性氧的增量变化。计算公式为：
[0104]
ros增加量(％)＝(odpretreatment
–
odcontrol)/odtreatment
×
100％。
[0105]
结果：
[0106]
mos-2对角质细胞ros产生的抑制活性见图8。
[0107]
mos-2对紫外照射后hacat细胞产生活性氧有一定的抑制作用，在低剂量紫外线照射下抑制作用明显，显著高于同浓度的透明质酸钠，高剂量下抑制作用稍弱。说明mos-2对紫外损伤引起的皮肤的氧化损伤方面有着很好的修复作用。
[0108]
实施例10，褐藻胶寡糖衍生物mos-2对黑素细胞的酪氨酸酶的活性影响
[0109]
黑素细胞中的酪氨酸酶能将酪氨酸转变成黑素，黑素的过度积累会导致皮肤素沉着。本试验通过褐藻胶寡糖衍生物mos-2在细胞水平上对酪氨酸酶的活性的作用评估其抑制黑素生成的能力。
[0110]
测试样品：实施例2中的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0111]
试验方法：
[0112]
用胰酶消化生长状态良好的黑素细胞，以1.2
×
105个/ml的密度接种与6孔板，在37℃，5％co2培养箱中培养24h。然后分别在不同浓度下100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml的mos-2溶液、透明质酸钠溶液以及曲酸溶液中继续培养48h，弃掉上清后，用pbs清洗两次，加细胞裂解液，冰上裂解30分钟后离心。取上清，加入0.1％ l-多巴溶液，37℃反应30分钟，在490nm处测定吸光度值，计算酪氨酸酶相对活性。
[0113]
酪氨酸酶相对活性(％)＝加药组吸光度/对照组吸光度
×
100％。
[0114]
结果：mos-2对黑素细胞的酪氨酸酶的活性抑制作用见图9。
[0115]
mos-2能明显降低黑素细胞中酪氨酸酶的含量，效果显著好于同浓度的透明质酸钠，说明mos-2在细胞水平关于抑制黑素生成方面有着良好的活性。
[0116]
实施例11褐藻胶寡糖衍生物mos-2对紫外损伤的成纤维细胞ι型胶原蛋白mrna表达的影响
[0117]
紫外辐射往往导致过量ros的产生，刺激基质金属蛋白酶的活性提升进而影响弹性蛋白的含量。本实验通过褐藻胶寡糖衍生物mos-2对紫外损伤条件下的成纤维细胞胶原蛋白的mrna表达的影响探究其在抗光老化方面的作用。
[0118]
测试样品：实施例2中的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0119]
试验方法：
[0120]
将用完全培养基培养的人包皮成纤维细胞(hff)以1
×
105个细胞/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃、5％ co2的培养箱中培养24h。用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，然后用uv处理(5j/cm2)照射。uv处理后，用不含fbs但含有100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml的mos-2溶液、透明质酸钠溶液以及曲酸溶液的新鲜培养基培养细胞24h作为实验组；以不加样品不进行uv照射作为空白组；以不加样品但进行uv照射作为模型组。
[0121]
按照提取总mrna的试剂盒说明书要求分离出总rna。向rna中加入dnasei和10x buffer去除基因组污染。取纯度较高的rna进行逆转录获取cdna。然后加入上游引物、下游
引物以及酶等进行pcr扩增。
[0122]
结果：
[0123]
mos-2对紫外损伤的成纤维细胞胶原蛋白的mrna表达的影响见图10。
[0124]
uv能够诱导i型胶原蛋白mrna表达的下调，导致i型胶原蛋白合成的减少，而mos-2能有效提升i型胶原蛋白mrna的表达，增加胶原蛋白的合成，作用效果显著好于同浓度下的透明质酸钠。
[0125]
实施例12，褐藻胶寡糖衍生物mos-2对血细胞的溶血性
[0126]
本试验通过测试褐藻胶寡糖衍生物mos-2通过溶血性实验检测是否具有溶血性。
[0127]
测试样品：实施例2中的褐藻胶寡糖衍生物mos-2。
[0128]
试验方法：
[0129]
取大鼠新鲜血液除去纤维蛋白原，制成2％的红细胞悬液。向试管中加入2.5ml红细胞悬液，阳性对照组加入2.5ml去离子水，阴性对照组加入2.5ml生理盐水，实验组分别加入2.5ml浓度为100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml的mos-2溶液以及与之同浓度的透明质酸钠溶液。37℃下温育，观察各组的溶血情况。3h时间后，1000r/min离心5min，取上清用酶标仪在545nm处测定吸光度计算溶血率。
[0130]
溶血率(％)＝(实验组吸光度值-阴性对照吸光度值)/(阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值)
×
100％。
[0131]
结果：
[0132]
溶血试验结果见图11。
[0133]
包括mos-2在内的所有测试样品在不同浓度下溶血率均极低，符合国家标准。
[0134]
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种褐藻胶寡糖衍生物在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的应用，其特征在于，所述的应用是指褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的应用。2.根据权利要求1所述一种褐藻胶寡糖衍生物的应用，其特征在于，褐藻胶寡糖衍生物为聚合度为2-20的硫酸化的甘露糖醛酸，硫酸基含量为10-20％，甘露糖醛酸连接方式为1-4连接，硫酸基取代位置为甘露糖醛酸的2位或/和3位。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械指具有抗皮肤光老化和光损伤皮肤修复功能的皮肤表层外用制剂，例如霜、乳液、凝胶、喷雾等。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，褐藻胶寡糖衍生物作为活性成分在制备抗皮肤光老化药物、医疗器械或护肤品中的添加量为0.5-3％。

技术总结

本发明涉及一种褐藻胶寡糖衍生物的应用，紫外线暴露可以诱导皮肤细胞中DNA损伤和活性氧的产生，进而引起皮肤炎症和细胞外基质重塑蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白的降解，最终导致皮肤的光老化。褐藻胶寡糖衍生物一方面具有优异的吸湿保湿性能，可以形成隐形膜阻止紫外线对皮肤的损伤，保持皮肤湿润环境；另一方面具有强抗氧化能力及抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶的活性，可以有效的抑制黑素生成和胶原蛋白的分解，减少光损伤造成的皮肤老化。褐藻胶寡糖衍生物无免疫原性，具有良好的透气性又能保持皮肤的湿润环境，安全无毒，应用方便。本发明特别适用于抗光老化药物、医疗器械和护肤品中，可以有效的减轻光老化造成的皮肤损伤。可以有效的减轻光老化造成的皮肤损伤。可以有效的减轻光老化造成的皮肤损伤。