一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法

1.本发明属于富营养化湖泊苦草植被修复技术领域，更具体涉及一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法。

背景技术：

2.苦草(vallisneria natana)是水鳖科苦草属沉水植物，是中国分布最为广泛的沉水植物之一。目前，湖泊生态系统逐渐退化，富营养化问题日益突出，恢复沉水植物是提升水质和改善生态环境的重要措施。苦草具有生命力强、生长迅速、对环境的适应范围较广等特点，被广泛应用于水质净化和水体生态修复。除无性克隆生长外，苦草还可以进行有性繁殖，在其生活史过程中会产生大量的种子，这对大面积恢复苦草种具有重要意义。在退化湖泊中恢复苦草种，除了栽种苦草成株，还可通过播撒种子来补充种源，具有成本低廉的优势。但由于环境因素的复杂性、多变性及种子本身的生物学特性限制，富营养化湖泊中苦草种子的萌发率和成苗率较低，难以通过直接播撒法进行苦草种的恢复。
3.苦草种子快速萌发与萌发后幼苗的正常生长是苦草恢复的重要前提。目前，促进苦草种子萌发和幼苗生长的方法有改变生长基质的方法，中国专利“一种促进沉水植物苦草种子发芽及幼苗生长的方法(申请号：cn201811182864.4)”包括如下步骤：1)将苦草种子撒播于多孔炭材料的表面或者孔内，待苦草种子发芽、幼苗着根生长，之后，将所述多孔炭材料及苦草幼苗一同放置于光照条件良好的水体内；2)调节所述幼苗在水体内的高度，确保苦草幼苗能够快速生长。但多孔炭材料的制备过程较为复杂，难以大量制备且投入成本高，在实际的苦草恢复工程中难以大规模推广使用。
4.其次，还有对种子进行化学试剂预处理的方法，中国专利“一种促进苦草种子萌发与生长的方法(申请号：cn201110002505)”包括如下步骤：1)在培养箱中,加入硝酸钾溶液或壳聚糖溶液,并辅以微量间歇式曝气,投入苦草种子,进行浸泡；2)于装有湖泊底泥作为基质的烧杯中对浸泡后的苦草种子进行培养；3)待苦草种子发芽后,将苦草幼苗再置于装有壳聚糖溶液的培养箱中浸泡,同时辅以微量间歇式曝气和间歇式短波紫外线照射。该方法使用的化学试剂最适处理浓度较难确定，如果处理浓度过高将对种子造成不可逆的损伤。同时，该发明还需要对幼苗进行壳聚糖浸泡以促进幼苗的生长，难以在湖泊苦草恢复工程中实际操作且成本较高。
5.植物激素预处理是常用的促进种子萌发和幼苗生长的方法，主要有生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类。已有研究表明对苦草种子进行吲哚乙酸(iaa)和激动素(kt)处理可促进萌发和提高幼苗的干重、株高，但最适浓度在100mg/l以上，与中国专利(申请号：cn201110002505)中硝酸钾处理的最适浓度8mg/l相比浓度较高，即成本较高。
6.因此，选择一种经济成本低、适用范围广、操作简单地促进苦草萌发及幼苗生长的方法是本发明的关键所在。

技术实现要素：

7.为了克服现有苦草种子萌发方法的不足和存在的技术问题，本发明的目的是在于提供了一种促进苦草种子萌发及幼苗生长的方法，该方法经济成本低、适用范围广、操作简单，促进效果非常显著，有效地提高了苦草种子的萌发率和萌发速率，有效地促进了萌发后苦草幼苗的生长。
8.为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
9.本发明的技术构思是：种子收集、灭菌处理、配制6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液、种子预处理、播种、设置培养环境以及幼苗生长。
10.一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，包括以下步骤：
11.(1)种子收集：挑选健康、无病虫害的苦草种荚，在纯水中浸泡7-9小时，挤出内部的种子，用纯水清洗干净(2-4次)；
12.(2)灭菌处理：将种子在3-5％次氯酸钠溶液中浸泡14-16分钟，用纯水清洗干净(2-4次)，备用；
13.(3)配制6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液：将2.5-7.5毫克6-苄氨基嘌呤(6-ba)溶解于少量1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成5-15mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液；
14.(4)种子预处理：将灭菌后的苦草种子完全浸入步骤(3)配制的6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液中，在恒温室(24-26℃)放置22-26小时，然后用纯水清洗干净(2-4次)，备用；
15.(5)播种：将预处理后的苦草种子放入盛有厚度为4-10cm湖泥和一定量自来水、已静置22-26小时的培养容器中；
16.(6)设置培养环境：播种后将培养容器放入恒温室(24-26℃)中萌发；
17.(7)幼苗生长：在恒温室内继续培养50天，每周补充水分，保持苦草幼苗完全浸没。
18.作为进一步技术改进，以上步骤(3)中优选的6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液浓度为10mg/l。
19.作为进一步技术改进，以上步骤(4)和(6)中所述恒温室的温度为25℃，光照强度为1200-1800lx，光暗比为12/12小时。
20.作为进一步技术改进，以上步骤(4)中将6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液浸泡后、清洗干净的苦草种子浸泡在纯水中备用，不超过24小时。
21.作为进一步技术改进，以上步骤(5)中所述培养容器为塑料烧杯，装有厚度4-5cm湖泥和深度6-7cm自来水，且播种前已静置24小时；湖泥总氮含量为0.7-2.5g/kg、总磷含量为0.5-2.0g/kg、有机质含量为4-9％；苦草种子单独、均匀地放置于湖泥表面。
22.在本发明中，最关键的步骤(4)中，将灭菌后的苦草种子完全浸入步骤(3)配制的6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液中，可有效地提高苦草种子的萌发率和萌发速率，并促进萌发后苦草幼苗的生长。该方法安全有效，不会对种子造成任何损伤；操作简单，无需二次处理即可促进幼苗的生长；所用的6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液浓度最高为15mg/l，经济成本低；适用于不同富营养化湖泊，可在实际苦草恢复工程中推广应用。
23.通过上述七个步骤的技术措施，播种后第四天时，苦草种子的萌发率较未处理种子可提高32.68-63.46％，平均萌发速率可提高32.64-63.44％。同时，显著促进了苦草幼苗的生长。幼苗生物量最高可增加34.41％，叶片的可溶性糖含量可增加40-56.60％，可溶性
蛋白含量最高可增加50％，根系活力可提高32.49-55.17％。
24.本发明与现有技术相比，具有以下优点和技术效果：
25.1、本发明中，种荚在浸泡时吸水、变软，8小时后可轻松挤出苦草种子。通过浸泡苦草种荚获得苦草种子，可有效保持种子的完整性，保障苦草种源质量。
26.2、本发明中，使用3-5％次氯酸钠溶液对苦草种子表面进行灭菌处理，可避免萌发过程中病原体霉变而降低种子萌发率，同时次氯酸钠具有腐蚀性可软化苦草种子的种皮，提高种子的吸胀能力，有助于胚根突破种皮。
27.3、本发明中，将苦草种子放置于湖泥表面，以模拟实际环境的基质条件。湖泥总氮含量为0.7-2.5g/kg、总磷含量为0.5-2.0g/kg、有机质含量为4-9％，营养状态涵盖轻污染至重污染程度。这说明本发明的适用范围广，可在不同富营养化湖泊的苦草恢复工作中推广使用。
28.4、与现有技术相比，本发明操作简单，适用范围广，且经济成本低，不仅能够促进苦草种子萌发，还能够对后续幼苗的生长产生一定的促进作用，进而有效减少富营养化湖泊底泥的氮磷含量、抑制底泥中氮磷营养盐释放，提升和稳定水质。
附图说明
29.图1为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种后第四天苦草种子萌发率对比示意图；
30.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组的苦草种子萌发率分别为34.67
±
3.06、46.00
±
3.06、51.33
±
4.16、56.67
±
4.16、33.33
±
4.16％。
31.图2为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种后第四天苦草种子平均萌发速率对比示意图；
32.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组的苦草种子平均萌发速率分别为8.67
±
0.76、11.50
±
1.00、12.83
±
1.04、14.17
±
1.04、8.33
±
1.04％/d。
33.图3为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种50天后苦草幼苗的生物量对比示意图；
34.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组播种50天后苦草幼苗的生物量分别为3.40
±
0.53、3.33
±
0.38、4.57
±
0.70、3.97
±
0.25、3.10
±
0.20g。
35.图4为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种50天后苦草幼苗叶片的可溶性糖含量对比示意图；
36.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组播种50天后苦草幼苗叶片的可溶性糖含量分别为0.15
±
0.00、0.21
±
0.00、0.24
±
0.00、0.21
±
0.00、0.27
±
0.01％。
37.图5为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种50天后苦草幼苗叶片的可溶性蛋白含量对比示意图；
38.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组播种50天后苦草幼苗叶片的可溶性蛋白含量分别为1.26
±
0.17、1.29
±
0.09、1.89
±
0.02、1.79
±
0.24、1.39
±
0.13mg/g。
39.图6为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种50天后苦草幼苗叶片的光合素含量对比示意图；
40.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组播种50天后苦草幼苗叶片的光合素含量
分别为0.84
±
0.05、0.69
±
0.00、0.82
±
0.01、0.78
±
0.07、0.78
±
0.02mg/g。
41.图7为一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的对照组和对苦草种子进行6-ba处理(5、10、15、20mg/l)播种50天后苦草幼苗的根系活力对比示意图。
42.对照组和5、10、15、20mg/l 6-ba处理组播种50天后苦草幼苗的根系活力分别为34.93
±
3.28、54.20
±
4.88、46.28
±
1.98、52.83
±
3.78、34.13
±
3.73mg/(g
·
h)。
具体实施方式
43.为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
44.实施例1：
45.一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，包括以下步骤：
46.(1)种子收集：挑选适量苦草种荚，在纯水中浸泡8或10或12小时，挤出内部的种子，用纯水清洗干净，2或3或4次；
47.(2)灭菌处理：将种子在3-5％次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用纯水清洗干净，2或3或4次；
48.(3)配制6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液：将2.5毫克6-苄氨基嘌呤(6-ba)溶解于少量1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成5mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液；(4)种子预处理：将灭菌后的苦草种子完全浸入步骤(3)配制的6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液中，在温度25℃、光照强度为1200-1800lx、光暗比为12/12小时的恒温室中放置24小时，然后用纯水清洗干净，2或3或4次，备用；
49.(5)基质制备：选择500毫升塑料烧杯作为培养容器，在塑料烧杯内铺设厚度为4cm的湖泥，加入深度为6cm的自来水，静置24小时；所用湖泥采自大型富营养化城市湖泊-武汉东湖。湖泥的总氮、总磷及有机质含量分别是1.77
±
0.01g/kg、1.88
±
0.04g/kg和8.13
±
0.33％，为重污染程度；
50.(5)播种：将预处理后的苦草种子单独、均匀地放置于培养容器中的湖泥表面，共放入50粒苦草种子；
51.(6)设置培养环境：播种后将培养容器放入温度为25℃、光照强度为1200-1800lx、光暗比为12/12小时的恒温室中萌发；
52.(7)幼苗生长：在恒温室内继续培养50天，每周补充水分，保持苦草幼苗完全浸没。50天后，收集培养容器内的所有苦草幼苗，测定其生物量。取适量叶片，测定其可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素a含量。取适量根系，测定其根系活力。
53.实施例1于2022年3月开始。播种四天后，苦草种子的萌发率为46.00
±
3.06％，平均萌发速率为11.50
±
1.00％/d。50天时，苦草幼苗的生物量为3.33
±
0.38g，叶片的可溶性糖、蛋白和光合素的含量分别为0.21
±
0.00％、1.29
±
0.09mg/g、0.69
±
0.00mg/g，根系活力为54.20
±
4.88mg/(g
·
h)。
54.实施例2：
55.本实施例与实施例1不同的是步骤(3)将5毫克6-苄氨基嘌呤(6-ba)溶解于少量1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成10mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液；其他与实施例1相同。
56.实施例2于2022年3月开始。播种四天后，苦草种子的萌发率为51.33
±
4.16％，平均萌发速率为12.83
±
1.04％/d。50天时，苦草幼苗的生物量为4.57
±
0.70g，叶片的可溶性糖、蛋白和光合素的含量分别为0.24
±
0.00％、1.89
±
0.02mg/g、0.82
±
0.01mg/g，根系活力为46.28
±
1.98mg/(g
·
h)。
57.实施例3：
58.本实施例与实施例1或2不同的是步骤(3)将7.5毫克6-苄氨基嘌呤(6-ba)溶解于少量1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成15mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液；其他与实施例1或2相同。
59.实施例3于2022年3月开始。播种四天后，苦草种子的萌发率为56.67
±
4.16％，平均萌发速率为14.17
±
1.04％/d。50天时，苦草幼苗的生物量为3.97
±
0.25g，叶片的可溶性糖、蛋白和光合素的含量分别为0.21
±
0.00％、1.79
±
0.24mg/g、0.78
±
0.07mg/g，根系活力为52.83
±
3.78mg/(g
·
h)。
60.实施例4：
61.本实施例与实施例1-3不同的是步骤(3)将10毫克6-苄氨基嘌呤(6-ba)溶解于少量1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成20mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤(6-ba)处理液；其他与实施例1-3相同。
62.实施例4于2022年3月开始。播种四天后，苦草种子的萌发率为33.33
±
4.16％，平均萌发速率为8.33
±
1.04％/d。50天时，苦草幼苗的生物量为3.10
±
0.20g，叶片的可溶性糖、蛋白和光合素的含量分别为0.27
±
0.01％、1.39
±
0.13mg/g、0.78
±
0.02mg/g，根系活力为34.13
±
3.73mg/(g
·
h)。
63.对照例：
64.本对照例与实施例1-4不同的是忽略步骤(3)，步骤(4)为将灭菌后的苦草种子完全浸入纯水中，在恒温室(24-26℃)放置24小时，然后用纯水清洗干净，备用；其他与实施例1-4相同。
65.对照例于2022年3月开始。播种四天后，苦草种子的萌发率为34.67
±
3.06％，平均萌发速率为8.67
±
0.76％/d。50天时，苦草幼苗的生物量为3.40
±
0.53g，叶片的可溶性糖、蛋白和光合素的含量分别为0.15
±
0.00％、1.26
±
0.17mg/g、0.84
±
0.05mg/g，根系活力为34.93
±
3.28mg/(g
·
h)。
66.如图1所示，与对照例1相比，播种四天后，实施例1-3的苦草种子萌发率提高了32.68-63.46％。从平均萌发速率来看(图2)，实施例1-3的苦草种子平均萌发速率提高了32.64-63.44％。由此可见，对苦草种子进行6-ba处理可有效提高苦草种子的萌发率和萌发速率。
67.如图3至图7所示，幼苗生物量和蛋白含量在实施例2中增加最多，比对照例分别高了34.41％、50.00％。实施例1-4的可溶性糖含量均高于对照例，在实施例4中最高，达到了0.27
±
0.01％。但光合素在所有实施例中均降低，降低最少的组别是实施例2(2.38％)。
68.实施例1-3中的幼苗根系活力比对照例升高32.49-55.17％。
69.单一的指标无法准确反映幼苗的生长状况，因此采用隶属函数法对种子萌发和幼苗生长情况进行标准化、综合评价。根据隶属函数法的公式1：某指标的隶属函数值＝(某组别该指标测定值-所有组别该指标的最大值)/(所有组别该指标的最大值-所有组别该指标
的最小值)和公式2：某指标的隶属函数值＝1-(某组别该指标测定值-所有组别该指标的最大值)/(所有组别该指标的最大值-所有组别该指标的最小值)对实施例1-4和对照例中种子萌发及幼苗生长的相关指标进行计算和排序，结果如表1所示。
70.表1实施例1-4及对照例各指标的隶属函数值
[0071][0072]
隶属函数综合值可直观反映出对照例和实施例中苦草种子萌发和幼苗生长的情况，综合值越大，其萌发和生长情况越好。由表1可知，实施例1-4的隶属函数综合值均高于对照例，实施例2最高，其次是实施例3，然后是实施例1和4，即通过对萌发及幼苗生长相关指标的综合评价发现苦草种子萌发及幼苗生长情况为10mg/l》15mg/l》5mg/l》20mg/l》对照例。这说明本发明中的5-15mg/l 6-ba处理对苦草种子萌发和幼苗生长的促进作用非常显著，10mg/l 6-ba处理为最优选。

技术特征：

1.一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其步骤是：(1)种子收集：挑选健康、无病虫害的苦草种荚，在纯水中浸泡7－9小时，挤出内部的种子，用纯水清洗干净；(2)灭菌处理：将种子在3-5％次氯酸钠溶液中浸泡14－16分钟，用纯水清洗干净，备用；(3)配制6-苄氨基嘌呤处理液：将2.5-7.5毫克6-苄氨基嘌呤溶解于1mol/l盐酸溶液，用纯水定容至500毫升，配制成5-15mg/l的一次性6-苄氨基嘌呤处理液；(4)种子预处理：将灭菌后的苦草种子完全浸入步骤(3)配制的6-苄氨基嘌呤处理液中，在恒温室放置22-26小时，然后用纯水清洗干净，备用；(5)播种：将预处理后的苦草种子放入盛有湖泊底泥和自来水、已静置22-26小时的培养容器中；(6)设置培养环境：播种后将培养容器放入恒温室中萌发；(7)幼苗生长：在恒温室内继续培养50天，每周补充水分，保持苦草幼苗浸没。2.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的6-苄氨基嘌呤处理液浓度为10mg/l。3.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(4)和(6)中恒温室为温度25℃，光照强度为1200-1800lx，光暗比为12/12小时。4.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中将6-苄氨基嘌呤处理后、清洗干净的苦草种子浸泡在纯水中备用。5.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(5)培养容器为塑料烧杯，装有湖泊底泥和自来水，播种前已静置24小时。6.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(5)中湖泊底泥总氮含量为0.7-2.5g/kg、总磷含量为0.5-2.0g/kg、有机质含量为4-9％。7.根据权利要求1所述的一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，其特征在于：所述的步骤(5)中苦草种子的放置方式为单独、均匀分布。

技术总结

本发明公开了一种促进沉水植物苦草种子萌发及幼苗生长的方法，步骤是：(1)种子收集：挑选苦草种荚，在纯水中浸泡，挤出内部的种子，用纯水清洗；(2)灭菌处理：将种子在次氯酸钠溶液中浸泡，用纯水清洗干净；(3)配制6-苄氨基嘌呤处理液：将6-BA溶解于盐酸溶液，用纯水定容；(4)种子预处理：将灭菌后的苦草种子完全浸入6-BA处理液中，在恒温室放置，用纯水清洗；(5)播种：将苦草种子置于湖泊底泥表面；(6)设置培养环境：播种后将培养容器置于恒温室中萌发；(7)幼苗生长：在恒温室内继续培养，保持苦草幼苗浸没。经济成本低、适用范围广、操作简单，促进效果非常显著，有效的促进了萌发后苦草幼苗的生长。的生长。