一种多重菌株发酵滤液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种多重菌株发酵滤液及其制备方法和应用。

背景技术：

2.随着生活水平的提高，面部皮肤的护理越来越受到人们的关注。皮肤受到来自周围环境的直接影响，会逐渐老化，出现皱纹、老人斑、暗沉、松弛等症状。美容护肤品已经从化学美容、植物美容发展到生物美容、基因美容的阶段，在护肤品中添加生物活性物质已经成为美容界的潮流。生物活性物质虽然含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用。在日常护理方面，生物活性物质是皮肤护理的最佳活性成分，能够控制或调节皮肤老化进程，保护受损皮肤，延缓皮肤老化，对保持正常皮肤的结构和功能、维持机体的正常生理活动和代谢具有重要意义。
3.到目前为止，研究发现的生物活性物质有很多，其中有不少被添加到美容护肤品中，例如植物或微生物中的生物酵素和动物胶原蛋白，在延缓皮肤衰老提供皮肤养分、促进皮肤细胞新生、消除皮肤皱纹等方面有着重要的作用。护肤品中的益生菌菌株，比如乳酸杆菌，可以帮助镇静皮肤刺激，有助于皮肤抗衰老、美白、抗菌，是一种应用潜力较大的成分。
4113952285a公开了一种多重菌株发酵技术及发酵产物。所述发酵技术具体为，采用仿生发酵方法将菌株组合物接种至豆浆中进行共培养，得到发酵产物。该技术采用人体仿生学发酵技术，将天然提取物转换为更稳定、护肤效果更显著的益生菌代谢物，为肌肤提供微生物屏障，提升皮肤酸碱稳定性，有利于保护脂质层完整性，优化肌肤屏障，提高肌肤锁水能力，抑制炎症因子的释放，减少肌肤过激免疫反应；另一方面添加至食品原料中，能够有效调理体内菌平衡，提升皮肤的抗过敏能力；最大化发挥发酵生物的代谢活性，获得高含量天然代谢产物，能够同时满足化妆品和食品原料的功效需求。
5113041200a公开了一种含释迦果多重发酵液的化妆品及其制备方法，其针对释迦果发酵液成分分析、发酵工艺探究，利用分批发酵逐一获得不同阶段发酵液，对发酵菌种发酵协同作用探究从而提升发酵液的功效，获得一种释迦果多重发酵滤液，该发酵液属天然植物，营养丰富，不易过敏、安全可靠，且有良好的保湿作用，可以有效清除自由基，抑制酪氨酸酶，还原黑素，进而达到美白的目的。
6.虽然现有技术中已经公开了一些菌株发酵技术和发酵产物，但是，目前对于发酵菌株在化妆品中的应用仍然存在抗氧化效果不佳、抗炎症效果不佳、抗皱效果差等特点，因此，开发一种菌株发酵滤液，具有优良的保湿、舒缓、修复皮肤损伤、抗炎症、抗皱等护肤功效，是本领域的研究重点。

技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多重菌株发酵滤液及其制备方法和应用，所述多重菌株发酵滤液实现多种益生菌的多重发酵，使本发明多重菌株发酵滤
液具有较好的保湿、舒缓肌肤、修复皮肤损伤、抗炎症、抗皱等护肤效果。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种多重菌株发酵滤液，所述多重菌株发酵滤液以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液60-80份，例如可以为65份、70份或75份等，乳酸菌发酵滤液20-40份，例如可以为25份、30份或35份等。
9.所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌包括酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母的组合。
10.本发明涉及的一种多重菌株发酵滤液，采用多种益生菌菌株发酵产物组成，其中酵母菌复合发酵滤液含有丰富的天然氨基酸，促进新陈代谢并加快自我修复的基础上还可以有效抑制弹性蛋白酶的活性具有抗皱的作用；乳酸菌发酵滤液作为抗氧化剂可以有效清除自由基，延缓衰老，同时还要抗粉刺和抗面疱的作用。本发明所述多重菌株发酵滤液中含有丰富的小分子多肽、氨基酸、有机酸、黄酮类和小分子多糖等有效成分，温和不刺激，可直接应用于化妆品中，具有较好的保湿、舒缓肌肤、修复皮肤损伤、抗炎症、抗皱等护肤效果。
11.优选地，所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3-4份，例如可以为3.2份、3.4份、3.6份或3.8份等，克鲁斯假丝酵母1-2份，例如可以为1.2份、1.4份、1.6份或1.8份等，丝孢酵母2-4份，例如可以为2.2份、2.4份、2.6份、2.8份、3份、3.2份、3.4份、3.6份或3.8份等，酒香酵母2-4份，例如可以为2.2份、2.4份、2.6份、2.8份、3份、3.2份、3.4份、3.6份或3.8份等。
12.酵母菌复合发酵滤液中酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母，这四种酵母的综合发酵，可以在代谢产物方面相互协同、相互促进以得到具有较好的保湿、舒缓肌肤、修复皮肤损伤、抗炎症、抗皱等护肤效果。
13.优选地，所述酵母菌复合发酵滤液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母接种于培养基中进行一次发酵，得到发酵液；将丝孢酵母和酒香酵母接种至所述发酵液中进行二次发酵，得到所述酵母菌复合发酵滤液。
14.酵母菌复合发酵采用分步发酵，一次发酵中酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母的发酵产物可以促进丝孢酵母和酒香酵母的发酵，以产生有护肤功效的有机酸、氨基酸、多酚等功能成分。
15.优选地，所述培养基以重量份计包括如下组分：植物花蕾
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4-10份大米
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2-4份小米
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1-4份白芷
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1-2份苦参
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1-3份碳源
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3-6份氮源
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1-2份。
16.通过筛选组分和优化条件，所述培养基具有前述组分，包括植物花蕾、谷物（大米和小米）、药材（白芷和苦参）的组合，本发明实现多种益生菌与植物花蕾、谷物、药材的多重发酵，使本发明所述多重菌株发酵滤液在具备植物花香的同时富含小分子糖类、氨基酸、有机酸等护肤成分，温和不刺激，具有较好的抗氧化、舒缓肌肤、抗炎症、抗皱等护肤效果。
17.所述植物花蕾为4-10份，例如可以为5份、6份、7份、8份或9份等。
18.所述大米为2-4份，例如可以为2.5份、3份或3.5份等。
19.所述小米为1-4份，例如可以为1.5份、2份、2.5份、3份或3.5份等。
20.所述白芷为1-2份，例如可以为1.2份、1.4份、1.6份或1.8份等。
21.所述苦参为1-3份，例如可以为1.5份、2份或2.5份等。
22.所述碳源为3-6份，例如可以为3.5份、4份、4.5份、5份或5.5份等。
23.所述氮源为1-2份，例如可以为1.2份、1.4份、1.6份或1.8份等。
24.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
25.优选地，所述植物花蕾包括玫瑰花、桃花、玉兰花、茉莉花、金茶花、山茶花、菊花、桂花、槐花、金银花、百合花、洛神花、木槿花、荷花、芍药花、橙花、藏红花、樱花、兰花、高山火绒草花、白池花中的任意一种或至少两种的组合。
26.优选地，所述碳源包括葡萄糖、海藻糖、蜂蜜中的任意一种或至少两种的组合，优选为蜂蜜和葡萄糖的组合。
27.优选地，所述氮源包括脱脂奶粉。
28.优选地，所述植物花蕾、大米、小米、白芷、苦参均粉碎至40-80目，例如可以为50目、60目或70目等。
29.优选地，所述培养基还包括水60-100份，例如可以为70份、75份、80份、85份、90份或95份等。
30.优选地，以培养基为100%计，所述酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母的接种量之和为3-5%，例如可以为3.5%、4%或4.5%等。
31.优选地，所述一次发酵的温度为25-35℃，例如可以为26℃、28℃、30℃、32℃或34℃等，时间为24-48 h，例如可以为26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36 h、38 h、40 h、42 h、44 h或46 h等。
32.优选地，所述一次发酵的通氧量0-5%且不为0，例如可以为1%、2%、3或4%等。
33.优选地，所述一次发酵在摇床中进行，所述摇床的转速为180-250 r/min，例如可以为200 r/min、220 r/min或240 r/min等。
34.优选地，以培养基为100%计，所述丝孢酵母和酒香酵母的接种量之和为4-6%，例如可以为4.5%、5%或5.5%等。
35.优选地，所述二次发酵的温度为26-32℃，例如可以为27℃、28℃、29℃、30℃或31℃等，时间为24-48 h，例如可以为26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36 h、38 h、40 h、42 h、44 h或46 h等。
36.优选地，所述二次发酵的通氧量0-5%且不为0，例如可以为1%、2%、3或4%等。
37.优选地，所述二次发酵在摇床中进行，摇床转速为200-300 r/min，例如可以为220 r/min、240 r/min、260 r/min或280 r/min等。
38.优选地，所述二次发酵后还包括后处理的步骤。
39.优选地，所述后处理的方法包括过滤和灭菌。
40.优选地，所述过滤采用5-12 μm陶瓷膜，例如可以为6 μm、8 μm或10 μm等，优选为8-10 μm。
41.优选地，所述灭菌的温度为85-90℃，例如可以为86℃、87℃、88℃或89℃等，灭菌
时间为20-30 min，例如可以为22 min、24 min、26 min或28 min等。
42.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
43.优选地，所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌包括德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、乳酸乳球菌中的至少两种的组合，优选为干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌的组合。
44.优选地，所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：干酪乳杆菌1-2份，例如可以为1.2份、1.4份1.6或1.8份等，青春双歧杆菌0.5-1.5份，例如可以为0.6份、0.8份、1份、1.2份或1.4份，长双歧杆菌1-2份，例如可以为1.2份、1.4份1.6或1.8份等。
45.优选地，所述乳酸菌发酵滤液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将发酵菌接种于培养基中进行发酵，得到所述乳酸菌发酵滤液。
46.优选地，所述乳酸菌发酵滤液的制备中，所述培养基与前述酵母菌复合发酵滤液制备中所用的培养基相同或不同，并具有相同的组分和用量范围；简明起见，不再一一赘述。
47.优选地，所述发酵为厌氧发酵。
48.优选地，以培养基为100%计，所述干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌的接种量之和为2-5%，例如可以为2.5%、3%、3.5%、4%或4.5%等。
49.优选地，所述发酵的温度为32-37℃，例如可以为33℃、34℃、35℃或36℃等，时间为45-50 h，例如可以为46 h、47 h、48 h或49 h等。
50.优选地，所述发酵在摇床中进行，摇床转速为180-250 r/min，例如可以为200 r/min、220 r/min或240 r/min等。
51.优选地，所述发酵后还包括后处理的步骤。
52.优选地，所述后处理的方法包括过滤和灭菌。
53.优选地，所述过滤采用5-12 μm陶瓷膜，例如可以为6 μm、8 μm或10 μm等，优选为8-10 μm。
54.优选地，所述灭菌的温度为85-90℃，例如可以为86℃、87℃、88℃或89℃等，灭菌时间为20-30 min，例如可以为22 min、24 min、26 min或28 min等。
55.优选地，所述多重菌株发酵滤液以重量份计还包括1-2份防腐剂，例如可以为1.2份、1.4份、1.6份或1.8份等。
56.优选地，所述防腐剂包括1,2-己二醇和/或对羟基苯乙酮。
57.优选地，所述多重菌株发酵滤液中1,2-己二醇的质量百分含量为0.5-1%，例如可以为0.6%、0.7%、0.8%或0.9%等。
58.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
59.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的多重菌株发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：将酵母菌复合发酵滤液和乳酸菌发酵滤液混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
60.第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的多重菌株发酵滤液在化妆品中的应用。
61.第四方面，本发明提供一种多重发酵精华水，所述多重发酵精华水包括第一方面所述的多重菌株发酵滤液。
62.优选地，所述多重发酵精华水以重量份计包括如下组分：所述多重菌株发酵滤液
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5-10份防腐剂
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0.3-0.5份保湿剂
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0.5-1份乳化剂
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0.08-0.12份螯合剂
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0.01-0.05份。
63.所述多重菌株发酵滤液为5-10份，例如可以为6份、7份、8份或9份等。
64.所述防腐剂为0.3-0.5份，例如可以为0.35份、0.4份或0.45份等。
65.所述保湿剂为0.5-1份，例如可以为0.6份、0.7份、0.8份或0.9份等。
66.所述乳化剂为0.08-0.12份，例如可以为0.09份、0.1份或0.11份等。
67.所述螯合剂为0.01-0.05份，例如可以为0.02、0.03或0.04等。
68.优选地，所述多重发酵精华水以重量份计还包括50-95份水，例如可以为60份、65份、70份、75份、80份、85份或90份等。
69.优选地，所述防腐剂包括1,2-己二醇和/或对羟基苯乙酮。
70.优选地，所述保湿剂包括1,3-丁二醇、甘油和甜菜碱中的任意一种或至少两种的组合。
71.优选地，所述乳化剂包括三乙醇胺。
72.优选地，所述螯合剂包括edta二钠。
73.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明所述多重菌株发酵滤液，采用多种益生菌菌株发酵产物组成，其中酵母菌复合发酵滤液含有丰富的天然氨基酸，促进新陈代谢并加快肌肤自我修复的基础上还可以有效抑制弹性蛋白酶的活性具有抗皱的作用；乳酸菌发酵滤液作为抗氧化剂可以有效清除自由基，延缓衰老，同时还要抗粉刺和抗面疱的作用。通过筛选反应物和优化条件，本发明多重菌株发酵滤液中含有丰富的小分子多肽、氨基酸、有机酸、黄酮类和小分子多糖等有效成分，其中，固含量最高达到6.8%、多酚含量最高达到1.83 g/l、有机酸含量最高达到0.11%、氨基酸含量最高达到0.6%。经测试，本发明制备得到的多重菌株发酵滤液的弹性蛋白酶抑制率最高达到68.9%、dpph自由基清除率最高达到60.1%、羟自由基清除率最高达到70.6%，5α-还原酶抑制率最高达到72.8%，因此，本发明制备得到的多重菌株发酵滤液不仅具有植物花香和发酵乳香，温和不刺激，可直接应用于化妆品中，而且还具有较好的抗氧化、舒缓肌肤、修复皮肤损伤、抗炎症、抗皱等护肤效果。
附图说明
74.图1为受试者使用应用例1前后皮肤黑素相对变化率图；图2为受试者使用应用例1前后皮肤亮度相对变化率图；图3为受试者使用应用例1前后面部红区域相对变化率图；图4为受试者使用应用例1前后脸部对比图；图5为受试者使用应用例1前后面部炎症对比图；图6为受试者使用应用例1前后皱纹数量相对变化率图；图7为受试者使用应用例1前后眼部对比图；
图8为受试者使用应用例1前后皮肤水分含量相对变化率图；图9为应用例1制备的多重发酵精华水功效的整体评价图。
具体实施方式
75.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
76.本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0077]“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0078]
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求（即出现次数）无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
[0079]
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
[0080]
以下实施例中试剂及试药来源如下：酿酒酵母：广州优科生物科技有限公司；鲁斯假丝酵母：广州优科生物科技有限公司；丝孢酵母：广州优科生物科技有限公司；酒香酵母：广州优科生物科技有限公司；干酪乳杆菌：广州优科生物科技有限公司；青春双歧杆菌：广州优科生物科技有限公司；长双歧杆菌：广州优科生物科技有限公司；1,2-己二醇：上海赛福化工发展有限公司；对羟基苯乙酮:上海赛福化工发展有限公司；甜菜碱：广州优科生物科技有限公司；三乙醇胺：济南博奥化工有限公司；edta二钠：济南德蓝化工有限公司；白芷：成都百岭源药业有限公司；苦参：亳州市惠苍药业销售有限公司。
[0081]
实施例1本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0082]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：（1）将干燥玫瑰花4份、干燥桃花4份、小米3份、大米3份、白芷2份、苦参2份粉碎至60目，与蜂蜜3份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水80份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min备用。
[0083]
（2）将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0084]
（3）将干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液2%、青春双歧杆菌种子液1%和长双歧杆菌种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0085]
（4）按照配方量将所述酵母菌复合发酵滤液、乳酸菌发酵滤液、1,2-己二醇和对羟基苯乙酮混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
[0086]
实施例2本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液60份，乳酸菌发酵滤液40份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3.5份，克鲁斯假丝酵母1.5份，丝孢酵母3份，酒香酵母2.5份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌1.5份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌1.5份。
[0087]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：（1）将干燥桂花5份、干燥山茶花4份、小米2份、大米4份、白芷1份、苦参3份粉碎至70目，与蜂蜜4份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水90份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min备用。
[0088]
（2）将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液3.5%和克鲁斯假丝酵母种子液1.5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量4%，30℃条件下摇床培养35 h，摇床转速为240 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液3%和酒香酵母种子液2.5%接种至发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养43 h，摇床转速为200 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用8 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0089]
（3）将干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液1.5%、青春双歧杆菌种子液1%和长双歧杆菌种子液1.5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用8 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0090]
（4）按照配方量将所述酵母菌复合发酵滤液、乳酸菌发酵滤液、1,2-己二醇和对羟基苯乙酮混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
[0091]
实施例3本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液80份，乳酸菌发酵滤液20份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母4份，克鲁斯假丝酵母1份，丝孢酵母2.5份，酒香酵母2.5份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌1.5份，青春双歧杆菌1.5份，长双歧杆菌1.5份。
[0092]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：（1）将干燥荷花4份、干燥芍药花5份、小米4份、大米2份、白芷2份、苦参1份粉碎至50目，与蜂蜜2份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水70份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min备用。
[0093]
（2）将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液4%和克鲁斯假丝酵母种子液1%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养42 h，摇床转速为190 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液2.5%和酒香酵母种子液2.5%接种至发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养35 h，摇床转速为280 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0094]
（3）将干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液1.5%、青春双歧杆菌种子液1.5%和长双歧杆菌种子液1.5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0095]
（4）按照配方量将所述酵母菌复合发酵滤液、乳酸菌发酵滤液、1,2-己二醇和对羟基苯乙酮混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
[0096]
实施例4本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本实施例的步骤（2）为：将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液
和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%、克鲁斯假丝酵母种子液2%、丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至步骤（1）得到的培养基中进行发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养60 h，摇床转速为240 r/min，得到发酵液；发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0097]
实施例5本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本实施例的步骤（2）为：将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0098]
实施例6本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（1）不同，本实施例的步骤（1）为：将蜂蜜3份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水25份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min备用。
[0099]
实施例7本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液130份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0100]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法同实施例1中多重菌株发酵滤液制备方法。
[0101]
实施例8本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液40份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0102]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法同实施例1中多重菌株发酵滤液制备方法。
[0103]
实施例9本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌3.3份，青春
双歧杆菌1.7份。
[0104]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述乳酸菌发酵滤液的制备方法、即步骤（3）不同，本实施例的步骤（3）为：将干酪乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到两种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液3.3%和青春双歧杆菌种子液1.7%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0105]
实施例10本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：长双歧杆菌3.3份，青春双歧杆菌1.7份。
[0106]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述乳酸菌发酵滤液的制备方法、即步骤（3）不同，本实施例的步骤（3）为：将青春双歧杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到两种乳酸菌种子液；将青春双歧杆菌种子液1.7%和长双歧杆菌种子液3.3%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0107]
实施例11本实施例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2.5份，长双歧杆菌2.5份。
[0108]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述乳酸菌发酵滤液的制备方法、即步骤（3）不同，本实施例的步骤（3）为：将干酪乳杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到两种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液2.5%和长双歧杆菌种子液2.5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0109]
对比例1本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母5份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0110]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将酿酒酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0111]
对比例2本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：克鲁斯假丝酵母5份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0112]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将克鲁斯假丝酵母种子液5%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0113]
对比例3本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母5份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0114]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液和丝孢酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液5%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0115]
对比例4本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，酒香酵母5份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0116]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将酒香酵母种子液5%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0117]
对比例5本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0118]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养60 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0119]
对比例6
本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液70份，乳酸菌发酵滤液30份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：丝孢酵母2份，酒香酵母3份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0120]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，所述酵母菌复合发酵滤液的制备方法、即步骤（2）不同，本对比例的步骤（2）为：将丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至步骤（1）得到的培养基中进行发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养60 h，摇床转速为240 r/min，得到发酵液；发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0121]
对比例7本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液100份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3份，克鲁斯假丝酵母2份，丝孢酵母2份，酒香酵母3份。
[0122]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：（1）将干燥玫瑰花4份、干燥桃花4份、小米3份、大米3份、白芷2份、苦参2份粉碎至60目，与蜂蜜3份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水80份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min，过滤得到培养基滤液。
[0123]
（2）将酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母分别接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到酿酒酵母种子液、克鲁斯假丝酵母种子液、丝孢酵母种子液和酒香酵母种子液；将酿酒酵母种子液3%和克鲁斯假丝酵母种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行一次发酵，含氧量3%，30℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为200 r/min，得到发酵液；将丝孢酵母种子液2%和酒香酵母种子液3%接种至所述发酵液中进行二次发酵，含氧量3%，28℃条件下摇床培养40 h，摇床转速为240 r/min，得到二次发酵液；二次发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到酵母菌复合发酵滤液。
[0124]
（3）按照配方量将所述酵母菌复合发酵滤液、1,2-己二醇和对羟基苯乙酮混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
[0125]
对比例8本对比例提供一种多重菌株发酵滤液，以重量份计包括如下组分：乳酸菌发酵滤液100份，1,2-己二醇1份、对羟基苯乙酮1份；所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括：干酪乳杆菌2份，青春双歧杆菌1份，长双歧杆菌2份。
[0126]
所述多重菌株发酵滤液的制备方法如下：（1）将干燥玫瑰花4份、干燥桃花4份、小米3份、大米3份、白芷2份、苦参2份粉碎至60目，与蜂蜜3份、葡萄糖2份、脱脂奶粉2份、水80份，混合均匀得到培养基，121℃灭菌20 min，过滤得到培养基滤液。
[0127]
（2）将干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌分别接种至mrs培养基中，培养转
接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液；将干酪乳杆菌种子液2%、青春双歧杆菌种子液1%和长双歧杆菌种子液2%接种至步骤（1）得到的培养基中进行厌氧发酵，35℃条件下摇床培养48 h，摇床转速为240 r/min，得到乳酸菌发酵液；乳酸菌发酵液在90℃温度下灭菌30 min后使用10 μm陶瓷膜进行过滤，得到乳酸菌发酵滤液。
[0128]
（3）按照配方量将所述乳酸菌发酵滤液、1,2-己二醇和对羟基苯乙酮混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。
[0129]
应用例1本应用例提供一种多重发酵精华水，按照重量份计所述多重发酵精华水的制备方法如下：实施例1制备得到的多重菌株发酵滤液8份，1,2-己二醇0.1份、对羟基苯乙酮0.2份、甜菜碱1份、三乙醇胺0.1份、edta二钠0.02份，水90份，混合均匀后得到所述多重发酵精华水。
[0130]
测试例1固含量检测分别称取2 g（m0）实施例1-11、对比例1-8的多重菌株发酵滤液样品置于95℃下干燥120 min，取出放入干燥器中，冷却至25℃后，称重为m1；再按照固含量=(m1/m0)*100%的公式计算固含量。检测结果如表1所示。
[0131]
测试例2多酚含量检测分别量取1.5 ml实施例1-11、对比例1-8的多重菌株发酵滤液，置于10 ml带刻度具塞试管中，加1 ml福林酚试剂，摇匀，加2 ml碳酸钠溶液，摇匀，补足定容至10 ml，摇匀，75℃水浴15 min，取出冷却至室温，在760 nm波长处测定吸光度，结果每组平均测定3次，取平均值，计算发酵滤液中多酚含量。检测结果如表1所示。
[0132]
测试例3有机酸含量检测将实施例1-11、对比例1-8的多重菌株发酵滤液用去离子水稀释5倍，用0.22 μm微孔滤膜过滤，利用高效液相谱测定发酵滤液中的有机酸含量。谱条件：谱柱为aminex@hpx-87h exclusion column 柱（300 mm
×
7.8 mm）；流动相为0.275%（体积比）的浓硫酸溶液；流速为0.4 ml/min；柱温为40 ℃；进样量为10 μl；检测波长为210 nm。检测结果如表1所示。
[0133]
测试例4氨基酸含量检测分别量取0.6 ml实施例1-11、对比例1-8的多重菌株发酵滤液，置于10 ml带刻度具塞试管中，加蒸馏水至2 ml，再加1 ml的1.5%茚三酮乙醇溶液，摇匀，加1 ml缓冲溶液，摇匀，90℃水浴15 min，取出冷却至室温，补足定容至10 ml，测定在760 nm波长处测定吸光度，结果每组平均测定3次，取平均值，计算发酵滤液中氨基酸含量。检测结果如表1所示。
[0134]
表1根据表1测试结果数据可知，酵母发酵滤液在使用酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母进行一步发酵，丝孢酵母和酒香酵母进行二次发酵时发酵滤液中固含量、多酚、有机酸和氨基酸都有优异的表现；当四种酵母菌一起使用进行单次发酵、两次发酵的菌种发生置换、每次发酵时使用单一菌种都会对发酵滤液中的固含量、多酚、有机酸和氨基酸产生不良影响；培养基中无花蕾、谷物和药材时，对于发酵滤液中的固含量、多酚、有机酸和氨基酸也会产生不良影响；乳酸菌发酵滤液中干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌三种菌协同作用增进多重菌株发酵滤液中固含量、多酚含量、有机酸含量和氨基酸含量；酵母菌发酵滤液和乳酸菌发酵滤液，两种发酵滤液协同作用增进多重菌株发酵滤液中固含量、多酚含量、有机酸含量和氨基酸含量。
[0135]
测试例5炎症因子抑制实验实验方法：采用raw264.7巨噬细胞作为研究对象，通过脂多糖lps（细菌内毒素）刺激细胞建立细胞炎症模型。接种巨噬细胞至12孔板，在培养箱以37℃、5% co2通气量条件下孵育24 h，分别加入实施例1-11和对比例1-8的多重菌株发酵滤液的1%稀释液，2 h后加入lps(1 μg/ml)，并设置不添加稀释液只添加lps的组以及不添加lps只添加稀释液的组，刺激24 h，收集上清液，离心，检测。采用elisa试剂盒分析raw264.7的促炎性炎症因子tnf-α释放量水平。
[0136]
tnf-α抑制率由如下公式计算得到：tnf-α抑制率(%)=[(lps刺激组炎症因子浓度-待测物作用组炎症因子浓度)/(lps刺激组炎症因子浓度-未刺激组炎症因子浓度)]
×
100%。
[0137]
tnf-α抑制率越高，说明所述多重菌株发酵滤液的抗炎效果越好。tnf-α抑制测试
结果如表2所示。
[0138]
测试例6弹性蛋白酶抑制实验实验方法：采用弹性蛋白酶(猪胰)作为研究对象。设有样品组为实施例1-11和对比例1-8的多重菌株发酵滤液的5%稀释液和阴性对照组，每组设立3个平行，分别取10 μl的待测样品加入到96孔板，阴性对照组加10 μl稀释溶剂，再向96孔板中加入20 μl浓度为0.1 u/ml的弹性蛋白酶溶液。将96孔板置于25℃恒温培养箱中孵育15 min，然后加入50 μl浓度为1 mg/ml的底物(98%的n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酸)，使用酶标仪测量样品在410 nm下的吸光度，并计算待测样品对弹性蛋白酶活性抑制率。
[0139]
弹性蛋白酶活性抑制率由如下公式计算得到：弹性蛋白酶活性抑制率(%)＝[(
△a‑△
b)/
△
a]
×
100%，
△
a表示不含待测样品的阴性对照组吸光度值，
△
b代表不同浓度待测液吸光度值。弹性蛋白酶抑制率越高，说明所述多重菌株发酵滤液的抗皱效果越好。
[0140]
弹性蛋白酶抑制测试结果如表2所示。
[0141]
测试例7dpph-自由基清除实验根据《化妆品-自由基(dpph)清除实验方法(t/shrh006-2018)》，分别检测上述实施例1-11和对比例1-8所制得的多重菌株发酵滤液和空白对照组的dpph自由基的清除率(%)。
[0142]
实验方法：采用96孔板，每组设置三个复孔，体系为200 μl。样品组：取适量所述多重菌株发酵滤液样品，溶于100 μl蒸馏水中，使待测样品在体系中的终浓度为5%，并向反应体系中加入100 μl 0.1 mm的dpph溶液；对照组：取100μl蒸馏水，再加入100 μl 0.1 mm的dpph溶液。反应体系构建完成后，避光摇晃10 min，使用酶标仪测试在520 nm处的吸光度。
[0143]
清除率的计算方法：清除率(%)=[(a0-ax)/a0]
×
100%，a0为对照组吸光度，ax为样品组吸光度。清除率越高，说明所述多重菌株发酵滤液的抗皱效果越好。
[0144]
dpph自由基清除测试结果如表2所示。
[0145]
测试例8羟自由基清除实验主要试剂：水杨酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、硫酸亚铁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、双氧水。
[0146]
主要设备：多功能酶标仪（spectra max m5 molecular device）实验方法：设有样品组实施例1-11和对比例1-8的多重菌株发酵滤液稀释至1/100，和阴性对照组，分别依次加入0.1份硫酸亚铁、0.1份乙醇、0.1份水杨酸、0.1份样品或阴性对照、1份等离子水、0.1份双氧水到1.5 ml离心管中，盖紧管盖上下颠倒摇匀，在37℃水浴锅中保温15 min，将溶液移到96孔板中，每组三个复孔。酶标仪测定510 nm处吸光度。
[0147]
羟自由基清除率由如下公式计算得到：羟自由基清除率%={[a0-(ax-ax0)]/a0}
×
100%，其中，a0为阴性对照组的吸光度，ax为样品组的吸光度，axo为样品背景的吸光度。测试结果如表2所示。
[0148]
测试例9
透明质酸酶活性抑制试验(1)溶液配制：透明质酸酶溶液：准确称取0.01 g透明质酸酶，加入4 ml醋酸缓冲溶液，最终浓度为1250 μg
·
ml-1
。
[0149]
0.5 mg
·
ml-1
透明质酸钠溶液：准确称取0.005 g透明质酸钠，加入到10 ml醋酸缓冲溶液中，充分溶解后备用。
[0150]
醋酸缓冲溶液(ph=5.6)：取1155 μl冰乙酸于容量瓶中稀释至100 ml，混匀后取4.8 ml为a溶液；取2.72 g乙酸钠结晶，溶解并定容至100 ml，混匀后量取45.2 ml为b溶液；混合a、b溶液，去离子水定容至100 ml混匀。精密测定其ph值，用溶液a或b调ph值至5.6。
[0151]
埃尔利希试剂：准确称取0.8 g对-二甲氨基苯甲醛溶于15 ml浓盐酸和15 ml无水乙醇中，备用。
[0152]
乙酰丙酮溶液：准确取3.5 ml乙酰丙酮溶于50 ml的l.0 mol
·
l-1
的碳酸钠溶液中。乙酰丙酮溶液需现用现配。
[0153]
受试样品溶液：取样品实施例1-11和对比例1-8的多重菌株发酵滤液0.3 g，溶于10 ml去离子水中，配置成3%溶液，备用。
[0154]
(2)实验过程：在试管中加入0.1 ml的0.25 mmol
·
l-1
cacl2溶液和0.5 ml透明质酸酶液，37℃保温培养20 min；加入0.5 ml受试样品溶液，37℃保温培养20 min；加入0.5 ml透明质酸钠液，37℃保温30 min；然后常温静置5 min，加入0.4 mol
·
l-1
的naoh溶液0.1 ml和乙酰丙酮溶液0.5 ml，沸水浴中加热反应15 min后立刻冰浴5 min；再加入1.0 ml埃尔利希试剂并用3.0 ml无水乙醇进行稀释，放置20 min后进行显，测定其吸光度值，代入下式计算抑制率。
[0155]
透明质酸酶抑制率(%)：{[(a-b)-(c-d)]/(a-b)}
×
100%，其中：a为对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；b为空白对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；c为受试样溶液吸光度值；d为试样空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。测试结果如表2所示。
[0156]
测试例105α-还原酶抑制实验试剂的配制：睾酮(t)溶液：精密称取36 mg睾酮，用无水乙醇定容至25 ml，浓度为5 mmol/l；nadph溶液：精密称取nadph四钠盐42.5 mg，用水定容至25 ml，浓度2 mmol/l；提酶缓冲液：0.32 mol/l蔗糖，0.1 mmol/l dtt，20 mmol/l磷酸钠，ph6.5。反应液：1 mmol/l的dtt，20 mmo/l磷酸钠。
[0157]
5α-还原酶抑制剂活性的测定：将反应成分依照先后顺序(反应液155 μl，37℃恒温；睾酮10 μl；nadph 10 μl：分别取样品实施例1-11和对比例1-8的多重菌株发酵滤液20 μl；5α-还原酶20 μl)，连续监测4 min内340 nm处反应体系吸光值的变化。根据nadph标准曲线、抑制剂活力单位及抑制百分率的计算公式，可以计算出5α-还原酶抑制率。
[0158]
抑制剂活力单位定义：在温度为37℃的反应体系中，使一个酶活力单位失活为一
个抑制剂活力单位。抑制百分率=(抑制剂活力/酶活力)
×
100%。测试结果如表2所示。
[0159]
表2根据表2测试结果数据可知，酵母发酵滤液在使用酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母进行一步发酵，丝孢酵母和酒香酵母进行二次发酵时在tnf-α抑制率、弹性蛋白酶抑制率、dpph自由基清除率、羟自由基清除率、透明质酸酶抑制率、5α-还原酶抑制率方面都有优异的表现；当四种酵母菌一起使用进行单次发酵、两次发酵的菌种发生置换、每次发酵时使用单一菌种都会对发酵滤液在抑制tnf-α、弹性蛋白酶、透明质酸酶、5α-还原酶，清除dpph自由基、羟自由基会产生不良影响；当酵母菌发酵滤液和乳酸菌发酵滤液的用量比例在本技术限定范围之外内时，多重菌株发酵滤液可以有效抑制tnf-α、弹性蛋白酶、透明质酸酶、5α-还原酶，并清除dpph自由基、羟自由基，具备较大的应用潜力。当培养基中无花蕾、谷物和药材时，会对多重菌株发酵滤液产生不利影响；乳酸菌发酵滤液中干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌三种菌协同作用增进多重菌株发酵滤液的护肤功效；酵母菌发酵滤液和乳酸菌发酵滤液，两种发酵滤液协同作用增进多重菌株发酵滤液的护肤功效。
[0160]
测试例11测试人：测试环境温度为20℃-22℃，湿度为40%-60%，并且进行实时动态监测。受试者的年龄均为18-55岁，男女均有，受试者共30名，使用相同的方法将应用例1制备得到的多重发酵精华水涂抹于脸部，每天早晚洁面后使用，连续使用8周，受试部位测试前2天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)。试验前，受试者需要统一清洁脸部，用干的面巾纸擦拭干净。清洁后，在受试者脸部做好测量区域标记。正式测试前，应该在符合标准的房间内静坐30 min，不能喝水，呈测试状态放置，保持放松。
[0161]
分别检测受试者使用本发明精华水之前的皮肤情况，然后将精华水分别涂抹到受试者的皮肤上，每个受试者涂抹上述精华水的用量均为2.0 mg/cm2，然后检测30名受试者分别使用上述精华水第4周和第8周时的皮肤情况。
[0162]
（1）皮肤美白效果测试仪器：皮肤黑素测试仪（mexameter mx18）；皮肤差测试仪；visia 7。
[0163]
受试者使用应用例1前后皮肤黑素相对变化率如图1所示；受试者使用应用例1前后皮肤亮度相对变化率如图2所示。
[0164]
在测试周期内，受试者皮肤黑素含量的相对变化率呈降低趋势，皮肤黑素相对降低率为6.92-9.61%，深层斑也有一定的减少；受试部位皮肤亮度相对提升率为5.10-6.75%，应用例1在淡斑、提亮肤方面有较好的效果。
[0165]
（2）修复皮肤敏感和损伤效果测试仪器：visia 7。
[0166]
受试者使用应用例1前后面部红区域相对变化率如图3所示；受试者使用应用例1前后脸部对比如图4所示；受试者使用应用例1前后面部炎症对比如图5所示。
[0167]
受试者的面部红区域总体降低幅度在20-45.6%，应用例1在舒缓敏感、修复红血丝、修复皮肤损伤方面有较好的效果。
[0168]
（3）祛除皱纹和持平细纹效果测试仪器：visia 7。
[0169]
受试者使用应用例1前后皱纹数量相对变化率如图6所示；受试者使用应用例1前后眼部对比如图7所示。
[0170]
受试者皮肤在皱纹数量和细纹数量方面均有明显下降，第8周时，皱纹下降幅度为38.9%，细纹下降幅度为47.3%，表明应用例1在祛除皱纹和细纹方面有良好的效果。
[0171]
（4）皮肤水合度变化和皮肤弹性测试仪器：corneometer cm825。
[0172]
受试者使用应用例1前后皮肤水分含量相对变化率如图8所示。
[0173]
受试者的皮肤水含水量有明显提升，在第8周时皮肤水合度提升约47%，表明本品在改善皮肤水合度，提升皮肤中含水量方面有较好的效果。
[0174]
结合前述四个方面的测试评价结果，所述应用例1的多重发酵精华水在淡斑、提亮肤、祛除皱纹和细纹、舒敏修复、保湿补水等方面均有良好的效果，尤其是在舒缓敏，修复皮肤损伤、保湿补水及祛除细纹方面效果更突出。
[0175]
应用例1制备的多重发酵精华水功效的整体评价如图9所示。
[0176]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局
限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：

1.一种多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述多重菌株发酵滤液以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液60-80份，乳酸菌发酵滤液20-40份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌包括酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母的组合。2.根据权利要求1所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：酿酒酵母3-4份，克鲁斯假丝酵母1-2份，丝孢酵母2-4份，酒香酵母2-4份。3.根据权利要求1所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述酵母菌复合发酵滤液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将酿酒酵母和克鲁斯假丝酵母接种于培养基中进行一次发酵，得到发酵液；将丝孢酵母和酒香酵母接种至所述发酵液中进行二次发酵，得到所述酵母菌复合发酵滤液。4.根据权利要求3所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述培养基以重量份计包括如下组分：植物花蕾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4-10份大米
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2-4份小米
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1-4份白芷
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1-2份苦参
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1-3份碳源
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3-6份氮源
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1-2份；所述植物花蕾包括玫瑰花、桃花、玉兰花、茉莉花、金茶花、山茶花、菊花、桂花、槐花、金银花、百合花、洛神花、木槿花、荷花、芍药花、橙花、藏红花、樱花、兰花、高山火绒草花、白池花中的任意一种或至少两种的组合；所述碳源包括葡萄糖、海藻糖、蜂蜜中的任意一种或至少两种的组合；所述氮源包括脱脂奶粉；所述一次发酵的温度为25-35℃，时间为24-48 h；所述一次发酵的通氧量0-5%且不为0；所述二次发酵的温度为26-32℃，时间为24-48 h；所述二次发酵的通氧量0-5%且不为0。5.根据权利要求1所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述乳酸菌发酵滤液的发酵菌以重量份计包括如下组分：干酪乳杆菌1-2份，青春双歧杆菌0.5-1.5份，长双歧杆菌1-2份。6.根据权利要求5所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述乳酸菌发酵滤液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将发酵菌接种于培养基中进行发酵，得到所述乳酸菌发酵滤液；所述发酵为厌氧发酵；所述发酵的温度为32-37℃，时间为45-50 h。7.根据权利要求1所述的多重菌株发酵滤液，其特征在于，所述多重菌株发酵滤液以重量份计还包括1-2份防腐剂；
所述防腐剂包括1,2-己二醇和/或对羟基苯乙酮。8.一种如权利要求1-7任一项所述的多重菌株发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将酵母菌复合发酵滤液和乳酸菌发酵滤液混合均匀，得到所述多重菌株发酵滤液。9.一种根据权利要求1-7任一项所述的多重菌株发酵滤液在化妆品中的应用。10.一种多重发酵精华水，其特征在于，所述多重发酵精华水包括如权利要求1-7任一项所述的多重菌株发酵滤液；所述多重发酵精华水以重量份计包括如下组分：所述多重菌株发酵滤液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5-10份防腐剂
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0.3-0.5份保湿剂
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0.5-1份乳化剂
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0.08-0.12份螯合剂
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0.01-0.05份。

技术总结

本发明提供一种多重菌株发酵滤液及其制备方法和应用，所述多重菌株发酵滤液以重量份计包括如下组分：酵母菌复合发酵滤液60-80份，乳酸菌发酵滤液20-40份；所述酵母菌复合发酵滤液的发酵菌包括酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、丝孢酵母和酒香酵母的组合。本发明采用多种益生菌菌株发酵产物组成，其中酵母菌含有丰富的天然氨基酸，促进新陈代谢并加快肌肤自我修复；乳酸菌作为抗氧化剂可以有效清除自由基，延缓衰老，同时还有抗粉刺和抗面疱的作用。本发明具有植物花香和发酵乳香，温和不刺激，可直接应用于化妆品中，具有较好的保湿、抗氧化、舒缓肌肤、抗炎症、抗皱等护肤效果。抗皱等护肤效果。抗皱等护肤效果。