在淋巴细胞中按需表达外源性因子以HIV的制作方法

在淋巴细胞中按需表达外源性因子以hiv
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求的优先权是：美国临时专利申请第62/984,716号，于2020年3月3日提交，题为"在淋巴细胞中按需表达外源性因子以hiv(on demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat hiv)"，其公开内容通过引用而并入本文。
技术领域
3.本公开一般涉及用于和抑制hiv的免疫疗法领域。特别地，所公开的和抑制方法涉及病毒载体和系统的给予，用于递送基因产物和遗传载物以和抑制hiv。

背景技术：

4.联合抗逆转录病毒疗法(cart)(也称之为高活性抗逆转录病毒疗法或haart)限制了hiv-1复制并阻碍疾病进展，但是药物毒性和抗药性病毒的出现对于hiv感染者的长期控制而言是挑战。此外，传统的抗逆转录病毒疗法虽然成功地延迟了aids的发作或死亡，但是尚未实现功能性治愈。需要替代性的策略。
5.新的数据表明免疫系统在限制hiv复制中具有主要作用(尽管通常是不足的)，这引起了人们对hiv感染免疫的浓厚兴趣。对于维持细胞溶解性t细胞(ctl)功能至关重要的病毒特异性t辅助细胞有可能起一定作用。病毒血症还受到中和抗体的影响，但它们在hiv感染中的量级通常较低，并且跟不上体内进化的病毒变体。
6.这些数据一起表明，通过所谓的hiv免疫疗法，增加hiv特异性细胞免疫应答的强度和广度可能具有临床益处。一些研究已经测试了针对hiv的疫苗，但迄今为止取得的成功有限。此外，人们一直有志于通过利用基因技术来增强hiv免疫疗法，但与其他免疫方法一样，成功受到限制。因此，需要改善的hiv。

技术实现要素：

7.在一个方面，提供了病毒载体，其包含载物部分，其中所述性载物部分包含编码能够抑制hiv感染的至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列；和调节所述核苷酸序列表达的t细胞应答性启动子。在实施方式中，至少一种可溶性外源因子包括抗hiv抗体。在实施方式中，抗hiv抗体是vrc01抗体或3bnc117抗体。
8.在实施方式中，至少一种可溶性外源因子包括可溶性cd4蛋白或其片段。在实施方式中，可溶性cd4或其片段包含了二聚体可溶性cd4。在实施方式中，二聚体可溶性cd4包含与seq id no:9、seq id no:76或seq id no:77具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％序列相同性的序列。
9.在实施方式中，所述t细胞应答性启动子包括cmv启动子、ifn-α启动子、ifn-β启动子、ifn-γ启动子、ef-1α启动子、il-2启动子、cd69启动子，或其片段。在实施方式中，t细胞应答性启动子包含il-2启动子。
10.在实施方式中，性载物部分还包含分泌信号，所述分泌信号操作性地连接至
编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列。在实施方式中，分泌信号包括抗体分泌信号或il-2分泌信号。
11.在实施方式中，所述核苷酸序列包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9，或seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％的序列相同性的序列。在实施方式中，所述核苷酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9，或seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87。
12.在实施方式中，所述性载物部分还包含至少一种小rna，该小rna靶向vif、tat和ccr5中的任何一种或多种。在实施方式中，所述至少一种小rna包含与seq id no：62、seq id no:63，或seq id no:64具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的序列。在实施方式中，所述至少一种小rna包含seq id no:62、seq id no:63或seq id no:64。
13.在实施方式中，至少一种小rna包含vif、tat和ccr5中的任意两种。在实施方式中，至少一种小rna包含vif、tat和ccr5。在实施方式中，至少一种小rna包含微小rna簇，其包括vif、tat和ccr5。
14.在实施方式中，至少一种可溶性外源因子包括可溶性cd4或其片段。在实施方式中，可溶性cd4或其片段包含二聚体可溶性cd4。在实施方式中，t细胞应答性启动子包括cmv启动子、ifn-α启动子、ifn-β启动子、ifn-γ启动子、ef-1α启动子、il-2启动子、cd69启动子，或其片段。在实施方式中，性载物部分还包含分泌信号，所述分泌信号操作性地连接至编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列。在实施方式中，所述至少一种小rna包含与seq id no:65具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的序列。在实施方式中，至少一种小rna包含seq id no:65。
15.在一个方面，提供了一种由包装细胞产生并能够感染靶细胞的慢病毒颗粒，该慢病毒颗粒包含能够感染靶细胞的包膜蛋白；和本文所述的任何病毒载体。
16.在一个方面，提供了包含感染了慢病毒颗粒的淋巴细胞的修饰细胞，其中慢病毒颗粒包含能够感染淋巴细胞的包膜蛋白；和本文所述的任何病毒载体。在实施方式中，淋巴细胞包括t细胞、b细胞、nkt细胞或nk细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞，并且t细胞包括cd4 t细胞、cd8 t细胞或γδt细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞，并且t细胞包括cd4 t细胞。
17.在一个方面，提供了一种病毒递送系统，其包含至少一种辅助质粒，所述至少一种辅助质粒包含用于表达衍生自gag、pol和rev基因中的每一个的功能性蛋白质的核苷酸序列；包膜质粒，其包含用于表达能够感染靶细胞的包膜蛋白的dna序列；和本文所述的任何病毒载体。在实施方式中，至少一种辅助质粒包括第一和第二辅助质粒，其中第一辅助质粒编码用于表达源自gag和pol基因的功能性蛋白质的核苷酸序列，并且第二辅助质粒编码用于表达源自rev基因的蛋白质的核苷酸序列。
18.在一个方面，提供了一种hiv的方法，该方法包括使分离自对象的外周血单核
细胞(pbmc)与有效量的刺激剂接触，其中该接触是离体进行的；用慢病毒颗粒离体转导pbmc，其中慢病毒颗粒包含能够感染pbmc的包膜蛋白；和本文所述的任何病毒载体；并将转导的pbmc培养至少1天。在实施方式中，该方法还包括将转导的pbmc输注到对象体内。在实施方式中，刺激剂包含gag肽或hiv疫苗
19.附图简要说明
20.在本公开中：
21.图1描述了一个示例性的3-载体慢病毒载体系统。
22.图2描述了一个示例性的4-载体慢病毒载体系统。
23.图3a-3c描述了环状形式的编码不同的可溶性外源因子的载体。图3a描述的是编码外源性因子vrc01的慢病毒载体。图3b描述的是编码外源性因子scd4的慢病毒载体。图3c描述的是编码外源性因子scd4-igg1 fc的慢病毒载体。
24.图4描述了线性形式的编码多种可溶性外源因子的载体。
25.图5描述了在cd4 t细胞中外源性表达vrc01抗体，然后用hiv攻击cd4 t细胞的方案示意图。
26.图6描述了流式细胞术的数据，显示了t细胞产生的3bnc117抗体对体外hiv感染的影响。
27.图7描述了在cd4 t细胞中外源性地表达scd4，然后用hiv攻击cd4 t细胞的方案示意图。
28.图8a和8b描述了流式细胞术数据，显示了用表达scd4的慢病毒载体转导的cd4 t细胞对hiv的抑制作用。
29.图9描述了在cd4 t细胞中外源性地表达hiv抗体的方案示意图。
30.图10描述了流式细胞术数据，显示了用编码hiv抗体vrc01(agt111)和3bnc117(agt112)的慢病毒载体转导后的cd4 t细胞的肽刺激的效果。
31.图11描述了刺激cd4 t细胞后用编码hiv抗体的慢病毒载体进行转导的方案示意图。
32.图12描述了流式细胞术数据，显示当细胞受到刺激后，用编码vrc01(agt111)和3bnc117(agt112)抗体的慢病毒载体转导时，细胞内抗体在cd4 t细胞中的累积。
33.图13a描述了流式细胞术的数据，显示了t细胞产生的vrc01抗体对体外hiv感染的作用。
34.图13b描述的图表数据显示了vrc01抗体在t细胞中的表达以及vrc01抗体表达对hiv复制的作用。
35.图14描述了用编码vrc01的慢病毒载体转导的细胞中的c8166 t细胞系中的vrc01表达。
36.图15描绘了用编码hiv抗体的慢病毒载体转导c8166细胞系，然后用hiv攻击细胞的方案的示意图。
37.图16描述了流式细胞术数据，显示了用编码vrc01抗体(agt111)的慢病毒载体转导的c8166细胞中hiv的感染率。
38.图17描述了用编码vrc01抗体(agt113)的慢病毒转导c8166细胞后在培养中的抗体表达。
gfp载体以及形式2cd4-igg(seq id no:76)。
具体实施方式
53.概述
54.本文所公开的是用于和/或抑制人免疫缺陷病毒(hiv)疾病以实现功能性治愈的方法和组合物。该方法和组合物包括慢病毒载体和相关的病毒载体技术，如下所述。
55.定义和解释
56.除非另作说明，本方面所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非上下文要求另作别解，单数术语包涵复数含义且复数术语包涵单数含义。通常，本文中细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术总体遵循如本领域熟知并如各种通识或专题参考文献中所述的常规方法进行，本文全文多处引用并论及此类参考文献。参见例如，sambrook和russell d等，《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，纽约冷泉港(2000))；
57.ausubel等人，《分子生物学中的简要实验方案：分子生物学当前实验方案的方法概要》(short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology)，威利约翰父子公司(wiley,john&sons,inc.)(2002)；
58.harlow和lane，《抗体的使用：实验室手册》(using antibodies:a laboratory manual)；冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，纽约冷泉港(1998)；
59.和coligan等人，《蛋白质科学中的简要实验方案》(short protocols in protein science)，威利约翰父子公司(wiley,john&sons,inc)(2003)。.
60.各种酶促反应或纯化技术按照生产商的说明如本领域常规实践或本文所述进行。本文所述分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且常用的。
61.本文中，“约”是本领域普通技术人员所理解的并会视其使用所在的上下文而存在一定程度的差异。如果该词的用意结合其使用所在上下文对于本领域普通技术人员来说仍不清楚，则“约”意味某特定项的至多正负10％。
62.本文中，提及的“agt 103”、“agt111”、“agt112”、“agt113”、“agt114”、“agt115”、“agt116”、“agt117”、“agt118”、“agt119”、“agt120”、“agt121”、“agt122”、“agt123”、“agt124”和“agt125”指公开于表1的载体。
63.本文所用术语“给予”或“施用”活性剂表示为向此需要的对象提供活性剂，其形式为可以有用形式和有效量导入该个体的形式。
64.在本说明书和权利要求书中，词语“包括”或其变化形式如“包含”或“含有”应理解为表示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。此外，本文中，术语“包括”是指包括但不限于。术语“表达”，“表达的”或“编码”是指多核苷酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽，多肽或蛋白质的过程。表达可以包括真核细胞中的mrna
剪接或其他形式的转录后修饰或翻译后修饰。
65.术语“功能性治愈(functional cure)”指这样的状态或情况，其中之前需要持续hiv(例如cart或haart)的hiv+个体可以在使用较低剂量、间歇剂量或停止给药的情况下以低或无法检测到病毒复制存活。个体可被认为是已经“功能性治愈”的，但是仍需要辅助以维持低水平病毒复制并减缓或消除疾病进展。功能性治愈的可能转归是最终根除所有或几乎所有hiv，从而在特定时间范围内(例如1个月、3个月、6个月、1年、3年和5年),以及可能定义的所有其他时间范围内未检测到复发。
66.术语“体内”指代在生物体中发生的过程。术语“离体”指代在生物体外部发生的过程。例如，体内是指在患者体内进行的，而体外是指在患者体外进行的，但仍然使用或接触该患者的组织，或与该患者组织有相互作用。此后，体外步骤可包括随后的体内步骤。
67.术语“mirna”指微小rna，本文中也可称为“mir”。术语“微小rna簇”(microrna cluster)是指至少两个微小rna，它们位于载体上，彼此非常接近并且被共表达。
68.术语“包装细胞系”(packaging cell line)是指可用于表达慢病毒颗粒的任何细胞系。
69.在述及两个或更多个核酸或多肽序列的内容中，术语“百分比相同性”是指，当进行比较并以最大对应性比对时，两个或更多个具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比的序列或子序列，如使用下述的序列比较算法之一(例如，blastp和blastn或本领域普通技术人员可用的其他算法)或通过视觉检查所测量。取决于应用，“百分比相同性”可以存在于被比较的序列区域上，例如，在功能域上，或者，存在于待比较的两个序列的全长上。对于序列比较，一般将一条序列作为参比序列，测试序列则与之比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，视必要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算一条或多条测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
70.可进行最优序列比对以作比较，例如，通过smith和waterman的局部同源性算法，adv.appl.math.2:482(1981)；通过needleman和wunsch的同源性比对算法，j.mol.biol.48:443(1970)；通过pearson和lipman的相似性搜索法，proc.nat’l.acad.sci.usa 85:2444(1988)；通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(genetics computer group)的威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package)中的gap、bestfit、fasta和tfasta，575科学大道(science dr.)，威斯康星州麦迪逊)，或通过视觉检查。
71.适用于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的一个实例是blast算法，其在altschul等，j.mol.biol.215:403-410(1990)中描述。进行blast分析的软件可从国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)公开获得。
72.两个核苷酸序列之间的相同性百分比可用gcg软件包中的gap程序(可从http://www.gcg获取)来确定，采用nwsgapdna.cmp矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的相同性百分比也可用e.meyers和w.miller(cabios,4:11-17(1989))的算法确定，该算法已被整合到align程序(版本2.0)中，采用pam120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间
的百分比相同性可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法确定，该算法已经结合到gcg软件包(可从http://www.gcg获得)中的gap程序中，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
73.本公开中的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，例如由此鉴定相关序列。这类搜索可使用altschul等，1990，j.mol.biol.，215:403-10的nblast和xblast程序(2.0版本)来运行。可用nblast程序进行blast核苷酸搜索(得分＝100，字长＝12)来获取与本文中核酸分子同源的核苷酸序列。可用xblast程序进行blast蛋白质搜索(得分＝50，字长＝3)来获取与蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空位比对结果，可如altschul等，1997，nucleic acids res.所述利用空位blast。25(17):3389-3402.利用blast和空位blast程序时，可使用各程序(如xblast和nblast)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
74.本文中，“seq id no”与“序列id编号”同义。
75.如本文所用，“小rna”(small rna)是指长度通常小于约200个核苷酸或更少并且具有沉默或干扰功能的rna。在其他实施方式中，小rna长度为约175个核苷酸或更短，约150个核苷酸或更短，约125个核苷酸或更短，约100个核苷酸或更短，或约75个核苷酸或更短。此类rna包括微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)和短发卡rna(shrna)。本公开的小“rna”应能够抑制或敲减靶基因的基因表达，例如通过导致靶基因mrna破坏的途径。
76.本文中，短语“外源因子”是指能够在宿主细胞中表达并且源自宿主细胞以外的来源的任何核苷酸序列或氨基酸序列。在实施方式中，氨基酸序列能够被表达为蛋白质。在实施方式中，蛋白质是抗体。
77.本文中，术语“刺激剂”是指任何可以刺激免疫反应的外源性物质，并包括但不限于疫苗(例如核酸疫苗、碳水化合物疫苗和肽疫苗)，包括hiv疫苗，以及hiv或hiv相关的核酸和肽。刺激剂可以有偏向性地刺激t细胞反应。
78.本文中，术语“对象”是指具有hiv感染的对象或指未感染hiv但正在寻求保护免受未来潜在hiv感染的对象。对象可以包括人类病人，但也包括其他哺乳动物。术语“对象”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用。
79.本文中，短语"t细胞应答性启动子"是指任何可由t细胞受体信号转导及其同源的细胞内信号转导途径调节的启动子。
80.术语“有效量”是指足够量的活性剂，以合适的组合物和合适的剂型来或抑制患有给定轻病、损伤、疾病或病症的患者中出现的症状、进展或并发症发作。有效量摂取决于患者病症状态或其严重程度、所对象的年龄、体重等。有效量可以根据许多因素中的任何一种而变化，包括例如给药途径，对象的状况，以及本领域技术人员理解的其他因素。
81.本文所用术语“性载体”与慢病毒载体是同义词。
82.术语“”或“处理”通常是指试图改变所的对象的自然进程的干预，并且可以用于预防进行或在临床病理学过程中进行。理想的效果包括但不限于抑制疾病的发生或复发，缓解症状，遏制、减少或抑制疾病的各种直接或间接病理后果，改善或平息疾病状态，
以及引起缓解或改善预后。
83.本文中，术语“vrc01”是指人igg1单克隆抗体，其靶向hiv包膜gp120上的cd4结合位点。短语“vrc01抗体”可与术语“vrc01”互换使用。
84.本文中，术语“3bnc117”是指人igg1单克隆抗体，其靶向hiv包膜gp160上cd4的结合位点。术语“3bnc”和短语“3bnc117抗体”可与术语“3bnc117”互换使用。
85.本文中，术语“片段”是指从基因中分离出来的核苷酸序列的部分或从蛋白质中分离出来的氨基酸序列的部分。核苷酸或氨基酸序列的部分可以使用合成手段(例如在实验室环境下)分别从基因或蛋白质中分离出来。另外，核苷酸或氨基酸序列的部分可以通过自然发生的自发过程分别从基因或蛋白质分离。
86.本文中，术语"增强子"是能够被蛋白质结合的dna序列，当它被蛋白质结合时，会增加特定基因转录的机会。
87.本文中，"可溶性外源因子"是指能够从细胞中分泌并在细胞外空间发挥作用的"外源性因子"。
88.本文中，短语"分泌信号"是指可操作性连接到蛋白质的肽，该蛋白质指注定要从细胞中输出的肽。“分泌信号”的作用是将蛋白质引导至细胞内的外输组件，从而导致蛋白质的分泌。
89.本文中，术语"启动子"是一个dna序列，蛋白质能够与之结合，一旦结合，可导致转录的启动。
90.本公开各个方面和实施方式的描述
91.在一个方面，提供了一种病毒载体，其包含载物部分，其中所述性载物部分包含编码至少一种能够抑制hiv感染的可溶性外源因子的核苷酸序列；和调节所述核苷酸序列表达的t细胞应答性启动子。在实施方式中，该病毒载体包括一个或多个质粒dna。
92.在一个方面，提供了一种病毒载体，其包含性载物部分，其中性载物部分包括(i)编码至少一种外源因子的第一核苷酸序列和(ii)编码至少一种小rna的第二核苷酸序列，该小rna针对至少一种hiv基因；以及调控第一核苷酸序列和第二核苷酸序列表达的t细胞应答性启动子。
93.在实施方式中，至少一种可溶性外源因子包括抗hiv抗体。在实施方式中，抗hiv抗体包括vrc01抗体或3bnc117抗体中的至少一种。在进一步的实施方式中，抗hiv抗体至少包含下列抗体中的一种，包括pg9抗体、pg16抗体、pg141-145抗体、ch01-04抗体、pgdm1400抗体、cap256-vrc26.25抗体、vrc38抗体、pct64抗体、pgt121抗体、pgt128抗体、pgt135抗体、10-1074抗体、pcdn-33a抗体、pgdm12抗体、pgdm21抗体、vrc29.03抗体、bf520.1抗体、vrc41.01抗体、bg18抗体、dh270.1抗体、dh270.6抗体、10e8vls抗体、pgv04抗体、8anc131抗体、ch103抗体、ch235抗体、n6抗体、ioma抗体、n49-p7抗体、vrc07-523ls抗体、n6ls抗体、pgt151-158抗体、banc195抗体、35022抗体、n123-vrc34.01抗体、acs202抗体、vrc-pg05抗体、sf12抗体、10e8抗体或dh511抗体。在实施方式中，抗hiv抗体是本领域内所理解的任何现有或未来的抗hiv抗体。
94.在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜表面的包膜糖蛋白gp120(gp120)结合。在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜表面的包膜糖蛋白gp160(gp160)结合。
95.在实施方式中,抗hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的v1v2环结合。在实施方式中，抗
hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的v3环结合。在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的cd4结合位点结合。在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的gp120/gp41交界区域结合。在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的gp120沉默面结合。在实施方式中，抗hiv抗体与hiv包膜糖蛋白上的膜近端外侧区(mper)表位结合。
96.在实施方式中，抗hiv抗体包括与seq id no:69、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:74、seq id no:75或seq id no:86具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列相同性的序列。在实施方式中，抗hiv抗体包括seq id no:69、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:74、seq id no:75或seq id no:86。
97.在实施方式中，至少一种外源因子包括可溶性cd4蛋白或其片段。在实施方式中，可溶性cd4包括单体可溶性cd4。在实施方式中，可溶性cd4包括二聚体可溶性cd4。在实施方式中，抗hiv抗体包括与seq id no:9,seq id no:76，或seq id no:77具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列相同性的序列。在实施方式中，二聚体可溶性cd4包括seq id no:9、seq id no:76或seq id no:77。
98.在实施方式中，至少一种可溶性外源因子能够结合hiv的包膜，从而抑制hiv结合于淋巴细胞表面。在实施方式中，淋巴细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞，并且t细胞包括cd8 t细胞、cd4 t细胞或γδt细胞。在实施方式中，可溶性因子与hiv包膜表面上的包膜糖蛋白结合。在实施方式中，包膜糖蛋白是gp120。在实施方式中，包膜糖蛋白是gp160。在实施方式中，包膜糖蛋白是本领域已知的hiv表面上的任何包膜糖蛋白。
99.在实施方式中，编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列包括与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87具有至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列相同性的序列。在实施方式中，该核苷酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87。
100.在实施方式中，t细胞应答性启动子包括cmv启动子、ef-1α启动子、ifn-γ启动子、il-2启动子、cd69启动子，或其片段。
101.在实施方式中，cmv启动子包含与seq id no:13具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，cmv启动子包含seq id no:13。
102.在实施方式中，ef-1α启动子包含与seq id no:14具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，ef-1α启动子包含seq id no:14。
103.在实施方式中，ifn-γ启动子包含与seq id no:15具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，ifn-γ启动子包含seq id no:15。
104.在实施方式中，il-2启动子包含与seq id no:66具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，il-2启动子包含seq id no:66。
105.在实施方式中，cd69启动子包含与seq id no:67(cd69启动子(1050)+cns2)增强子)或seq id no:68(cd69启动子(625)+cns2增强子)具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，cd69启动子包含seq id no:67或seq id no:68。
106.在实施方式中，t细胞应答性启动子包含组成型启动子。在实施方式中，t细胞应答性启动子包含组织特异性启动子。在实施方式中，t细胞应答性启动子包含诱导型启动子。
107.在实施方式中，t细胞应答性启动子包括ifn-α启动子、ifn-β启动子、sv40启动子、pgk1启动子、cag启动子、ubc启动子、h1启动子或u6启动子中的至少一种。
108.在进一步的实施方式中，t细胞应答性启动子包括foxp3启动子、il2ra启动子、ctla4启动子、ikzf2启动子、cd40lg启动子、themis启动子、satb1启动子、lair2启动子、mettl7a启动子、rtkn2启动子、tcf7启动子、ank3启动子、nell2启动子中的至少一个。anxa1启动子、tgfb1启动子、tigit启动子、tnfrsf10b启动子、lag3启动子、gzma启动子、il10启动子、fgl2启动子、entpd1启动子、ccr6启动子、ccr9启动子、ccr10启动子、maf启动子、tbx21启动子、rorc启动子、ahr启动子、prdm1启动子。gata3启动子、ifng启动子、tnfa启动子、gzmb启动子、furin启动子、il12a启动子、icos启动子、lgals1启动子、ccr7启动子、ccl5启动子、ccl3启动子、ccl4启动子、ccr1启动子、icam1启动子、ccr3启动子、ccr8启动子、ccr2启动子和ccr5启动子。cxcr6启动子、cxcr3启动子、cxcr4启动子、cxcr5启动子、ccr9启动子、ccr10启动子、fer启动子、pecam1启动子、ccr4启动子、itga4启动子、selplg启动子、runx1启动子、stat5启动子、foxp3启动子、h3k27ac启动子、hpgk启动子、或rpbsa启动子中的至少一种。
109.在实施方式中，t细胞应答性启动子是本领域所理解的任何现有或未来的t细胞应答性启动子，其可被hiv、hiv基因或其他hiv结构特征所诱导。在实施方式中，hiv基因、蛋白质或结构特征包括以下中的至少一种：gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、tev、ltr、tar、rre、pe、slip、crs和ins。
110.在实施方式中，病毒载体还包含可操作性连接到t细胞应答性启动子的至少一个增强子。在实施方式中，至少一个增强子包括一个增强子、两个增强子、三个增强子、四个增
强子、五个增强子，或任何更大的数量。在实施方式中，至少一个增强子包含多于五个增强子。
111.在实施方式中，增强子以启动子/增强子组合的形式提供。在实施方式中，启动子/增强子组合包含与seq id no:16具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的序列。在实施方式中，启动子/增强子组合包含seq id no:16。
112.在实施方式中，性载物部分还包含分泌信号，所述分泌信号操作性地连接至编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列。在实施方式中，该分泌信号是il-2分泌信号。在实施方式中，编码il-2分泌信号的核苷酸序列与seq id no:11有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性。在实施方式中，编码il-2分泌信号的核苷酸序列包含seq id no:11。
113.在实施方式中，该分泌信号是抗体分泌信号。在实施方式中，编码抗体分泌信号的核苷酸序列与seq id no:12有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。在实施方式中，编码该抗体分泌信号的核苷酸序列包含seq id no:12。
114.在实施方式中，所述分泌信号包括apo分泌信号、arsf分泌信号、art4分泌信号、artn分泌信号、azgp1分泌信号、bsgat1分泌信号、bdnf分泌信号、bmp分泌信号、btn分泌信号、c1q分泌信号。c1r分泌信号、c3分泌信号、ca10分泌信号、calca分泌信号、calcb分泌信号、cck分泌信号、ccl分泌信号、cd14分泌信号、cd163分泌信号、cd6分泌信号、ceacam16分泌信号、cel分泌信号、cga分泌信号、cgb分泌信号、cklfclec分泌信号、col分泌信号、cpa分泌信号、cpb分泌信号、csf分泌信号、cshcsn分泌信号、ctrb2分泌信号、cxcl分泌信号、def分泌信号、dpp4分泌信号。f10分泌信号、f11分泌信号、f12分泌信号、f13分泌信号、f2分泌信号、f3分泌信号、f5分泌信号、f7分泌信号、f8分泌信号、f9分泌信号、fgf分泌信号、fgfbp分泌信号、fshb分泌信号。gcg分泌信号，gzm分泌信号，hspg2分泌信号，ifna分泌信号，ifnb分泌信号，ifne分泌信号，ifng分泌信号，ifnk分泌信号，ifnl分泌信号，ifnw1分泌信号，igf分泌信号，il分泌信号。ins分泌信号、insl分泌信号、klk分泌信号、lalb分泌信号、lbp分泌信号、lif分泌信号、ltf分泌信号、lygmbl2分泌信号、mmp分泌信号、muc分泌信号、ndnf分泌信号、ngfn分泌信号、nppa分泌信号、nrp1分泌信号、nrp2分泌信号、plag2g分泌信号、plac1分泌信号、plat分泌信号、plau分泌信号、ppia分泌信号、prl分泌信号、proc分泌信号、prss分泌信号、pth分泌信号、rnas分泌信号。sdc4分泌信号、serpina分泌信号、sftpa分泌信号、tnfrs分泌信号、tslp分泌信号、trh分泌信号、ttr分泌信号、uts分泌信号、vip分泌信号、vtn分泌信号、vwa分泌信号或wif分泌信号。在实施方式中，该分泌信号包括本领域所理解的任何已知或未来的分泌信号。
115.在实施方式中，该分泌信号包括任何可促进靶向hiv的外源因子分泌的分泌信号。在实施方式中，外源性因子可以靶向任意hiv基因、蛋白质或结构特征。在实施方式中，hiv基因、蛋白质或结构特征可以包含以下任意一种：gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、
tev、ltr、tar、rre、pe、slip、crs和ins。
116.在实施方式中，至少一种hiv基因是vif。在实施方式中，至少一种hiv基因是tat。在实施方式中，至少一种hiv基因是vif和tat。在实施方式中，至少一种hiv基因包括本领域已知的任意一种或多种hiv基因。在实施方式中，至少一个hiv基因包含gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu和tev中的至少一个。
117.在实施方式中，性载物部分进一步包含了编码靶向ccr5的至少一种小rna的核苷酸序列。在实施方式中，性载物部分包括靶向ccr5和至少一种hiv基因的至少一种小rna。在实施方式中，至少一种hiv基因是vif。在实施方式中，至少一种hiv基因是tat。在实施方式中，至少一种hiv基因是vif和tat。在实施方式中，至少一种hiv基因是本领域已知的任意一种或多种hiv基因。在实施方式中，所述至少一种hiv基因包含gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu和tev中的至少一种。在实施方式中，所述至少一种小rna是至少一种微小rna，至少一种shrna，或至少一种sirna。在实施方式中，至少一种小rna是本领域理解的任何已知或未来的小rna。
118.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向ccr5的微小rna。在实施方式中，靶向ccr5的微小rna包含与seq id no:62具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列相同性的序列。在实施方式中，靶向ccr5的微小rna包括seq id no:62。
119.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向ccr5的小rna。
120.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向vif的微小rna。在实施方式中，靶向vif的微小rna包含与seq id no:63具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列相同性的序列。在实施方式中，靶向vif的微小rna包括seq id no:63。
121.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向vif的小rna。
122.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向tat的微小rna。在实施方式中，靶向tat的微小rna包含与seq id no:64具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列相同性的序列。在实施方式中，靶向tat的微小rna包括seq id no:64。
123.在实施方式中，所述至少一种小rna包含靶向tat的小rna。
124.在实施方式中，至少一种小rna包含靶向vif、tat和ccr5的小rna。在实施方式中，小rna包含与seq id no:65具有至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列相同性的序列。在实施方式中，微小rna簇包含seq id no:65。
125.在实施方式中，至少一种小rna包含靶向vif的小rna、靶向tat的小rna和靶向ccr5的小rna。在实施方式中，至少一种小rna为微小rna簇。
126.在一个方面，提供了慢病毒颗粒。该慢病毒颗粒以各种不同方式包含能够感染靶
细胞的包膜蛋白；以及本文所述的任何病毒载体。在实施方式中，由包装细胞产生的慢病毒颗粒可感染靶细胞。
127.在实施方式中，靶细胞是淋巴细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞、b细胞、nkt细胞或nk细胞。在实施方式中，t细胞是cd4 t细胞、cd8 t细胞或γδt细胞。
128.在一个方面，提供了一种包括感染了慢病毒颗粒的淋巴细胞的修饰细胞。在实施方式中，该慢病毒颗粒以各种不同方式包含能够感染淋巴细胞的包膜蛋白；以及本文所述的任何病毒载体。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞、b细胞、nkt细胞或nk细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞，并且t细胞是cd4 t细胞、cd8 t细胞或γδt细胞。
129.在一个方面，提供了一种病毒递送系统。在实施方式中，病毒递送系统以各种不同方式包含至少一个辅助质粒，该辅助质粒包含用于表达衍生自gag、pol和rev基因中的每一个的功能性蛋白质的核苷酸序列；包膜质粒，其包含用于表达能够感染靶细胞的包膜蛋白的dna序列；和本文所述的任何病毒载体。在实施方式中，至少一个辅助质粒包含第一和第二辅助质粒，其中第一辅助质粒编码用于表达源自gag和pol基因的功能性蛋白质的核苷酸序列，并且第二辅助质粒编码用于表达源自rev基因的蛋白质的核苷酸序列。
130.在一个方面，提供了一种hiv的方法。在实施方式中，该方法以各种不同方式包含用有效量的刺激剂接触从对象分离出来的外周血单核细胞(pbmc)，其中接触是离体进行的；用慢病毒颗粒离体转导pbmc，其中慢病毒颗粒包括能够感染pbmc的包膜蛋白；和本文所述的任何病毒载体；以及将转导的pbmc培养至少一天。
131.在实施方式中，该方法还包括将转导的pbmc输注到对象体内。
132.在实施方式中，刺激剂来自于hiv。在实施方式中，刺激剂是多肽，该多肽来自于hiv。在实施方式中，该多肽包含gag肽。在实施方式中，刺激剂包括env肽。
133.在另一个方面，该方法包括施用两种刺激剂，即第一刺激剂和第二刺激剂。在实施方式中，第一刺激剂和第二刺激剂是同一刺激剂。在实施方式中，第一刺激剂和第二刺激剂各自为gag肽。在实施方式中，第一刺激剂和第二刺激剂各自为env肽。一些实施方式中，第一刺激剂和第二刺激剂是不同的刺激剂。在实施方式中，第一刺激剂是离体施用的。在实施方式中，第二刺激剂在体内施用。在实施方式中，该方法包括施用第一刺激剂，用本文所述的任何慢病毒载体转导细胞，并施用第二刺激剂。
134.在实施方式中，该多肽可活化至少一种淋巴细胞。在实施方式中，至少一种淋巴细胞是t细胞、b细胞、nkt细胞或nk细胞。在实施方式中，淋巴细胞是t细胞。在实施方式中，t细胞是cd4 t细胞、cd8 t细胞或γδt细胞。在实施方式中，被激活的淋巴细胞是mhc i类限制性淋巴细胞。在实施方式中，被激活的淋巴细胞是mhc ii类限制性淋巴细胞。
135.在实施方式中，转导的pbmc可以培养1天以上。在实施方式中，将转导的pbmc培养2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天32天、33天、34天、35天或更长时间。在实施方式中，将转导的pbmc培养35天以上。
136.在一个方面，提供了一种抑制hiv感染cd4 t细胞的机制。在实施方式中，图28a和28b提供了抑制hiv感染的机制。在实施方式中，如图28a所示，hiv与cd4 t细胞(140)表面的cd4受体(100)结合。在实施方式中，当可溶性cd4(在此也称为scd4)(110)存在于细胞外的空间时，它与hiv(130)表面的包膜蛋白(如gp120)(120)结合(图28b)。这抑制了hiv与cd4 t
细胞(140)表面的cd4受体(100)的结合(图28b)。在实施方式中，scd4可以被抗hiv抗体取代。在实施方式中，抗hiv抗体包括本文公开的任何抗hiv抗体或其任何变体。在实施方式中，抗hiv抗体包括本领域内理解的任何抗hiv抗体或其任何变体。在实施方式中，提供scd4或抗hiv抗体以结合hiv表面的任意糖蛋白，从而抑制hiv进入细胞。
137.在一个方面，提供了一种hiv的方法。在实施方式中，该方法以各种不同方式包括从患者获得外周血单核细胞(pbmc)。在实施方式中，外周血单核细胞(pbmc)将用合适的技术被分离出来。在实施方式中，pbmc与有效量的刺激剂接触。在实施方式中，pbmc与刺激剂的接触是离体进行的。在实施方式中，刺激剂包括hiv疫苗。在实施方式中，刺激剂包括gag肽。在实施方式中，刺激剂包括env肽。在实施方式中，刺激剂导致pbmc更容易被转导。在实施方式中，与有效量刺激剂的接触离体发生。在实施方式中，与刺激剂接触后，用慢病毒颗粒进行转导。在实施方式中，慢病毒颗粒包括能够感染pbmc的包膜蛋白。在实施方式中，该慢病毒颗粒是本文所公开的任意慢病毒颗粒。在实施方式中，在转导之后，将pbmc培养足够长的时间以允许pbmc适当扩增。在实施方式中，该时间段至少为1天。在实施方式中，将pbmc施用于患者。
138.人类免疫缺陷病毒(hiv)
139.人类免疫缺陷病毒通常也称为“hiv”，其是在人类中导致获得性免疫缺陷综合症(aids)的逆转录病毒。如果没有的情况下，感染hiv后的平均存活时间预计为9-11年，取决于hiv亚型。hiv感染通过体液的转移而发生，包括但不限于血液、精液、阴道液、预射精液、唾液、眼泪、淋巴液或脑脊液或母乳。hiv可以游离的病毒颗粒和在感染的免疫细胞内的状态存在于感染的个体中。
140.hiv感染人类免疫系统中的重要细胞，如辅助t细胞，虽然在hiv亚型中的趋向性可能有所不同。可能特别容易受到hiv感染的免疫细胞包括但不限于cd4+t细胞、巨噬细胞和树突细胞。hiv感染通过多种机制导致cd4+t细胞水平降低，包括但不限于未感染的旁邻细胞凋亡、病毒直接杀死受感染的细胞，以及通过可识别受感染细胞的cd8细胞毒性淋巴细胞杀死受感染的cd4+t细胞。当cd4+t细胞数量下降到临界水平以下时，就会丧失细胞介导的免疫。
141.结构上，hiv与许多其他逆转录病毒不同。rna基因组包括至少7个结构标志(ltr、tar、rre、pe、slip、crs和ins)和至少9个基因(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu，并且有时有第10个tev，是tat、env和rev的融合体)，编码19个蛋白质。这些基因中的3个，gag、pol和env包含产生新病毒颗粒结构蛋白所需的信息。
142.hiv主要在cd4 t细胞中复制，并且导致细胞破坏或调节异常以降低宿主免疫力。因为hiv建立作为整合原病毒的感染并且可能进入潜伏状态，其中特定细胞中的病毒表达降低至低于影响该细胞或宿主免疫系统检测的细胞病理学水平，所以hiv难以并且即使经长时间间隔的高效抗逆转录病毒(haart)后也未能被根除。在绝大多数情况下，hiv感染导致致命的疾病，虽然可以通过haart延长存活。
143.对抗hiv的一个主要目标是开发用于治愈疾病的策略。延长的haart尚未实现该目标，所以研究人员已经转向其他方法。早期通过性免疫(感染发生后使用疫苗)提高宿主免疫力的努力作用甚微或没有作用。同样地，强化有中度作用或没有作用。
144.使用基因疗法已经取得了一些进展，但阳性结果是零星的，并且只在罕有携带编
码ccr5(趋化因子受体)的一个或两个等位基因缺陷的人类中发现。然而，许多研究人员乐观地认为，基因疗法最终有望实现hiv治愈。
145.如本文所公开的，这些方法和组合物能够实现功能性治愈。实现功能性治愈的主要障碍是hiv自身的基础生物学。病毒感染使得对于几乎所有免疫功能至关重要的cd4 t细胞缺失。最重要的是，hiv感染以及cd4 t细胞的消耗需要个体细胞的激活。激活是使用重排的t细胞受体识别病原体或其他分子的单个cd4 t细胞克隆的特异性机制。
146.就hiv而言，感染激活了hiv特异性t细胞，使其被感染并会在其他对病毒特异性较低的t细胞之前被耗尽，而这有效地削弱了免疫系统对病毒的防御能力。hiv特异性t细胞应答的能力在长期的haart期间重建；然而，当haart中断时，反弹的病毒感染重复上述过程并再次使病毒特异性细胞缺失，促进病程发展。
147.一旦haart中断时，只有当足够多的hiv特异性cd4 t细胞被保护以使宿主的天然免疫力可对抗和控制hiv时，才可能实现功能性治愈。
148.在许多方面，提供了改善基因效果的方法和组合物，以实现hiv疾病的功能性治愈。在实施案例中，提供了用于增强针对hiv的宿主免疫力以提供功能性治愈的方法和组合物。在进一步的实施方式中，提供了用于富集患者中的hiv特异性cd4 t细胞以实现功能性治愈的方法和组合物。
149.基因疗法
150.本文提供病毒载体将遗传构建体递送至宿主细胞以用于或抑制hiv。
151.这些遗传构建体可以包括但不限于，修正或补足现有缺陷的功能性基因或基因的部分，编码调节性蛋白的dna序列，编码调节性rna分子的dna序列，所述调节性rna分子包括反义，短同源rna，长非编码rna，小干扰rna等，以及编码旨在竞争重要的细胞因子以改变疾病状态的rna或蛋白质的诱饵序列(decoy sequence)。本文提供的基因疗法涉及递送这些性遗传构建体至靶细胞以提hiv相关疾病的或缓解。
152.本文提供的基因疗法可以包括但不限于，亲和性增强的t细胞受体，cd4 t细胞上(或者cd8 t细胞或γδt细胞上)的嵌合抗原受体，修饰信号转导途径以避免由病毒蛋白导致的细胞死亡，增加hiv限制性元件的表达，所述hiv限制性元件包括rex、samhd1、mxa或mxb蛋白，apobec复合物，trim5-α复合物，束缚蛋白(tetherin)(bst2)，和鉴定为能够减少哺乳动物细胞中hiv复制的相似蛋白质。
153.免疫
154.从历史上看，疫苗已成为抵御致命传染病的首选武器，包括天花、脊髓灰质炎、麻疹和黄热病。可惜的是，当前还没有已获批准的hiv疫苗。hiv病毒有其独特的逃避免疫系统的方式，人体似乎无法对它产生有效的免疫反应。因此，科学家们并不清楚提供hiv防治所需的条件。然而，免疫疗法可能提供了一个解决方案，这是传统的疫苗方法无法解决的。
155.在不同方面和实施方式中，免疫方法富集了hiv特异性cd4 t细胞，以增加宿主的抗hiv免疫力。在实施方式中，整合型或非整合型慢病毒载体被用于转导宿主的免疫细胞，用于增加宿主的抗-hiv免疫力。在进一步的实施方式中，提供了一种包含hiv蛋白的疫苗，包括但不限于灭活颗粒、病毒样颗粒、hiv肽或肽片段、重组病毒载体、重组细菌载体、纯化的亚基或质粒dna(其与合适的载体和/或生物或化学佐剂相组合以提高宿主的免疫反应)。这种疫苗可用于富集病毒特异性t细胞或抗体。提供了各种方法，以通过使用慢病毒或
其他病毒载体的hiv靶向基因来进一步增强疗效。
156.方法
157.在不同方面，提供了使用病毒载体实现hiv疾病功能性治愈的方法。这些方法以各种不同方式包括免疫疗法以富集hiv特异性cd4 t细胞的比例，以及使用慢病毒转导以实现可抑制hiv的外源性因子的递送。
158.在实施方式中,本方法包括第一刺激事件以富集一定比例的hiv特异性cd4t细胞。第一刺激事件可以包括施用一种或多种适用于富集患者的hiv特异性cd4+t细胞的任何试剂，包括但不限于疫苗。
159.性疫苗可以包括一种或多种hiv蛋白，其蛋白序列代表发生的地理区域的主要病毒类型。性疫苗包括纯化的蛋白质，灭活的病毒，病毒载体化蛋白(virally vectored protein)，细菌载体化蛋白(bacterially vectored protein)，肽或肽片段，病毒样颗粒(vlp),包含细胞因子和/或趋化因子的生物或化学佐剂，载剂，和用于免疫的方法。免疫接种可以根据本领域已知的标准方法施用，并且hiv患者在免疫和后续的离体淋巴细胞培养(包括慢病毒转导)的间隔期间可以继续进行抗逆转录病毒疗法。
160.在实施方式中，这些方法包括使用纯化的蛋白质、灭活的病毒、病毒载体的蛋白质、细菌载体的蛋白质、包括细胞因子和/或趋化因子的生物或化学佐剂、载体和刺激方法，对先前通过性疫苗接种免疫的人或病人的cd4 t细胞进行离体刺激。体外刺激可以使用用于免疫的相同疫苗或免疫刺激化合物进行，也可以使用不同于用于免疫的那些的疫苗或免疫刺激化合物进行。
161.在实施方式中，可通过标准技术包括白细胞清洗术获得外周血单核细胞(pbmc)。在实施方式中，pbmc被离体处理。在进一步的实施方式中，该产生cd4 t细胞的扩增。在实施方式中，可获得1x10
10
个cd4 t细胞，其中约0.1％、约1％、约5％或约10％或约30％在抗原应答方面可能是hiv特异性的，并且由于携带由所公开的慢病毒载体递送的性转基因而具有hiv抗性。另外，可分离出约1x107、约1x108、约1x109、约1x10
10
、约1x10
11
或约1x10
12
的cd4t细胞用于离体刺激。分离出任意适当量的cd4 t细胞用于离体刺激。
162.分离的cd4 t细胞可在采用hiv疫苗抗原进行再刺激期间于适当的培养基中培养，所述hiv疫苗抗原可以包括存在于先前性疫苗接种中的抗原。可以添加包含逆转录酶、蛋白酶或整合酶的抑制剂的抗逆转录病毒物，以在延长的离体培养期间抑制病毒再次出现。cd4 t细胞的离体刺激被用于在培养中富集所述比例的hiv特异性cd4 t细胞。相同的方案还可以用于分析目标，即通过纯化获得的较小血量的外周血单核细胞，用于识别hiv特异性t细胞并测量该亚的频率。
163.通过使pbmc细胞与与先前用于体内免疫的疫苗成分相匹配或互补的hiv蛋白接触，可以富集hiv特异性cd4 t细胞。体外刺激可使hiv特异性cd4 t细胞的相对频率增加约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约75倍、约100倍、约125倍、约150倍、约175倍、或约200倍。
164.多种方法还包括将体内性免疫和cd4 t细胞的离体刺激与离体慢病毒转导和培养相结合。
165.在不同的实施方式中，可以用编码能够抑制hiv的外源因子的性慢病毒或其他载体，转导已从体外刺激的pbmc中富集的hiv特异性cd4 t细胞，并在培养基中保持足够的时间段用于这种转导，例如约1至约21天，包括最多约35天，或大于35天。在进一步的实施
方式中，可以培养细胞约1至约18天，约1至约15天，约1至约12天，约1至约9天，或约3至约7天。转导细胞可以培养约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15，约16，约17，约18，约19，约20，约21，约22，约23，约24，约25，约26，约27，约28，约29，约30，约31，约32，约33，约34，约35天，或大于35天。
166.在进一步的实施方式中，将转导的cd4 t细胞回输到患者体内，例如取得cd4 t细胞的原始患者。输注可以用任何合适的装置和方法进行。在一些实施方式中，输注可以伴随着使用环磷酰胺或相似化合物的处理以增加再移植的效率。
167.在多种实施方式中，提供持续的病毒抑制，包括抗逆转录病毒疗法，例如cart或haart。在其他实施方式中，抗逆转录从预输注剂量和/或水平减少。在一些实施方式中，约26周的减少或不进行辅助可被认为是hiv的功能性治愈。在此描述了功能性治愈的其他定义。
168.本文中的病毒载体可以编码至少一种，至少两种，至少三种，至少四种或至少五种感兴趣的基因，或至少六种感兴趣的基因，或至少七种感兴趣的基因，或至少八种感兴趣的基因，或至少九种感兴趣的基因，或至少十种感兴趣的基因，或至少十一种感兴趣的基因，或至少十二种，或更多感兴趣的基因。这里的病毒载体可以编码包括但不限于以下的基因或核酸序列：(i)针对与hiv疾病相关的hiv抗原或由hiv产生的毒素的抗体；(ii)包括免疫细胞生长或功能所需的白细胞介素，并可对hiv中遇到的免疫失调进行；(iii)抑制hiv在体内生长的因子，包括cd8抑制因子，(iv)趋化因子受体ccr5的突变或缺失，趋化因子受体cxcr4的突变或缺失，或趋化因子受体cxcr5的突变或缺失，(v)针对与hiv相关的特定受体或肽或与hiv相关的宿主蛋白的反义dna或rna，(vi)针对与hiv相关的特定受体或肽或与hiv相关的宿主蛋白的小干扰rna，(vii)外源因子如，例如，cd4(例如，scd4)，与细胞外空间的hiv结合，导致hiv进入细胞的抑制，或(viii)可用于hiv或aids的各种其他上有用的序列。用于所公开方法的hiv靶向基因的其他例子包括但不限于亲和力增强的t细胞受体、cd4 t细胞上的嵌合抗原受体(或替代性地在cd8 t细胞或γδt细胞上)、修改信号转导途径以避免由病毒蛋白引起的细胞死亡。增加hiv限制因子的表达，所述hiv限制因子包括trex、samhd1、mxa或mxb蛋白、apobec复合物、trim5-α复合物、拴系蛋白(tetherin)(bst2)，以及类似的被认为能够减少hiv在哺乳动物细胞中复制的蛋白。在实施方式中，患者在根据本公开的方法进行的同时可以接受cart或haart。在一些实施方式中，患者在根据本公开的方法进行的之前或之后可以接受cart或haart。在其他实施方式中，cart或haart在整个过程中保持，并且可以监测患者血液中的hiv病毒载量和血液中慢病毒转导的cd4 t细胞的频率。优选的是，在接受之前接受cart或haart的患者能够在后停止或减少cart或haart。
169.如本文更详细的讨论中,可以确定转导的hiv特异性cd4 t细胞(其是基因疗法效用的新型替代标志物)的频率。
170.组合物
171.如图1-4所示，示例性的构建体可以包括许多组分。例如，在一个实施方式中，示例性的lv构造可包括以下区段或组分：
172.rsv-劳斯氏肉瘤(rous sarcoma)病毒长末端重复；
173.·5’
ltr-hiv长末端重复的部分，其可以被截短以在染体整合后抑制载体复制；
174.·
ψ-包装信号，其能够在包装期间将载体rna基因组纳入病毒颗粒；
175.·
rre-rev反应元件可被添加以通过使rna从细胞核移出并进入细胞的胞质来提高转基因的表达；
176.·
cppt
–
多聚嘌呤区(tract)，其在将转基因整合到宿主细胞染体之前促进第二链dna合成；
177.·
启动子-启动子从整合的转基因启动rna转录以表达外源因子,小rna,微小rna簇(或构建体的其他遗传元件)，并且在一些实施方式中，载体可以使用ef-1启动子；
178.·
抗vrc01抗体和抗3bnc117以及其他hiv抗体可阻断hiv与cd4受体相互作用，从而抑制hiv进入cd4 t细胞；
179.·
scd4-阻断hiv与t细胞表面cd4受体的相互作用，从而抑制hiv进入cd4 t细胞；
180.·
抗-ccr5-宿主细胞因子ccr5的微小rna靶向信使rna以减少其在细胞表面的表达；
181.·
抗-rev/tat-hiv rev和tat编码区之间接合处的微小rna靶向hiv基因组或信使rna，在本技术中有时称其mirna tat或给予相似的描述；
182.·
抗-vif-vif编码区内的微小rna靶向hiv基因组或信使rna；
183.·
wpre-土拨鼠肝炎病毒转录后条件元件，其是可以用于促进rna转运出细胞核的其他载体组件；和
184.·
δu3 3’ltr-hiv 3’长末端重复的修饰形式，其中已经使u3区域部分缺失以改善载体的安全性。
185.慢病毒载体系统
186.提供了一种慢病毒(颗粒)。根据多个方面和实施方式，它可以通过编码必要的病毒蛋白的载体系统来表达，以产生病毒体(病毒颗粒)。在多个实施方式中，提供了一个含有编码慢病毒pol蛋白的核酸序列(可操作性地连接至启动子)的载体质粒，用于逆转录和整合。在另一个实施方式中，pol蛋白由多个载体质粒表达。在其他实施方式中，提供了含有编码用于形成病毒衣壳的慢病毒gag蛋白的核酸序列(可操作性地连接至启动子)的载体质粒。在实施方式中，该gag核酸序列与至少部分pol核酸序列位于分开的载体上。在其他实施方式中，gag核酸与编码pol蛋白的所有p o l核酸序列位于分开的载体上。
187.可以对本文所述的载体进行多种修饰。在不同的实施方式中，这种修饰可用于构建颗粒，以进一步最小化获得野生型回复体的机会。这些修饰包括但不限于ltr的u3区缺失，tat缺失和基质(ma)缺失。在实施方式中，gag、pol和env载体中的一个或多个不包含慢病毒基因组中包装慢病毒rna的核苷酸(被称为慢病毒包装序列)。
188.形成颗粒的载体质粒最好不含表达包膜蛋白的慢病毒基因组核酸序列。优选地，使用含有编码包膜蛋白的核酸序列的独立载体质粒，该核酸序列与启动子可操作地连接在一起。该env载体也不含慢病毒包装序列。在一个实施方式中，env核酸序列编码慢病毒包膜蛋白。其他实施方式中，包膜蛋白不来自慢病毒，而是来自不同的病毒。所得颗粒可称为假型颗粒。通过适当选择包膜几乎可以“感染”任何细胞。例如，我们可以使用一个编码包膜蛋白的env基因，它针对的是一个内细胞区室。此类env基因和包膜蛋白可源自的病毒的实例包括：流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(isavirus)、夸兰扎病毒(quaranjavirus)和托高土病毒(thogotovirus))、
id no:21)，cmv启动子(seq id no:13)，人ef-1α(seq id no:14)，干扰素γ(ifnγ)启动子(seq id no:15)，或凝血酶原人α-1抗胰蛋白酶增强剂/促进剂(seq id no:16))，woodchuck转录后调控元件(wpre)(seq id no:22(长wpre序列)或seq id no:23(短wpre序列))，以及3'δltr(seq id no:24)。在其他方面中，可用通过取代、缺失、添加或突变的方式使用序列变异来修改本文引用的序列。
194.在进一步的方面中，辅助质粒包含下述元件：cag启动子(辅助/rev；鸡β肌动蛋白(cag)启动子；转录)(seq id no:25)；hiv组分gag(辅助/rev；hiv gag；病毒外壳)(seq id no:26)；hiv组分pol(辅助/rev；hiv pol；蛋白酶和逆转录酶)(seq id no:27)；hiv int(辅助rev：hiv整合酶；病毒rna的整合)(seq id no:28)；hiv rre(辅助/rev；hiv rre；结合rev元件)(seq id no:29)；和hiv rev(辅助/rev；hiv rev；核输出和稳定病毒mrna)(seq id no:30)。在进一步的方面，可以修饰辅助质粒以包括用于表达gag和pol基因的第一辅助质粒，和用于表达rev基因的第二质粒。在进一步的层面中，可用通过取代、缺失、添加或突变的方式使用序列变异来修改本文引用的序列。
195.在另一方面中，包膜质粒包含下述元件：rna聚合酶ii启动子(包膜，cmv启动子)(seq id no:31)和疱疹性口炎病毒g糖蛋白(vsv-g)(包膜；vsv-g；糖蛋白包膜-细胞进入)(seq id no:32)。另一方面中，通过替换、删除、添加或突变的方式进行的序列变化可用于修改本文提及的序列。
196.在进一步的方面，辅助质粒包含下述元件：cmv增强子、鸡β肌动蛋白启动子、兔β球蛋白内含子、hiv组分gag；hiv组分pol；hiv int；hiv rre；hiv rev和兔β球蛋白多聚a。
197.在多方面中，辅助质粒被修饰为包括用于表达gag和pol基因的第一辅助质粒，以及用于表达rev基因的第二且独立的质粒。在进一步的方面中，可用通过取代、缺失、添加或突变的方式使用序列变异来修改本文引用的序列。在进一步的方面中，用于慢病毒包装的质粒被用类似的元件修饰并且有可能可以去除内含子序列而不丢失载体功能。例如，可用以下元件替换构成包装系统质粒中的类似元件：延长因子-1(ef-1)，磷酸甘油酸激酶(pgk)和泛素c(ubc)启动子可替换cmv或cag启动子。sv40多聚a和bgh多聚a可取代兔β球蛋白多聚a。辅助质粒中的hiv序列可以构建自不同的hiv病毒株或进化枝。vsv-g糖蛋白可用来自人内源性逆转录病毒的膜糖蛋白替代，包括herv-w，狒狒内源性逆转录baev，猫科动物内源性病毒(rd114)，长臂猿白血病病毒(galv)，狂犬病病毒(fug)，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)，甲型鸡瘟病毒(fpv)，罗斯河α病毒(rrv)，鼠白血病病毒10a1(mlv)或埃博拉病毒(ebov)。
198.值得注意的是，慢病毒包装系统可以通过商业途径获得(例如，来自马里兰州罗克维尔的origene技术公司的lenti-vpak包装试剂盒)，也可以用标准技术进行合成。此外，替代或修改慢病毒包装系统的各个项以改善任意数量的相关因素(包括慢病毒颗粒的生产效率)属于本领域技术人员的技能范围之内。
199.实施例
200.实施例1：慢病毒载体系统的开发
201.如图1-3(环状形式)和图4(线性形式)所概述的那样开发了慢病毒载体系统。首先请参考图4，有代表性的载体已经被设计和生产出来，其从左到右具有以下元件：混合5'长末端重复(rsv/5'ltr)seq id no:17(rous肉瘤病毒(rsv)启动子)和seq id no:18(5'
长末端重复(ltr))，ψ序列(rna包装位点)(seq id no:19)，rre(rev-反应元件)(seq id no:20)，cppt(多嘌呤区)(seq id no:21)，启动子/启动子增强子组合(cmv启动子(seq id no:13))，ef-1α启动子(seq id no:14)，ifnγ启动子(seq id no:15)，il-2启动子(seq id no:66)，cd69启动子(seq id no:67和68)，或凝血酶人α-1抗胰蛋白酶(haat)增强子/启动子(seq id no:16))，外源性因子(例如，vrc01抗体(图3a)，3bnc117抗体，scd4(图3b)，和scd4-igg1 fc(图3c))，woodchuck转录后调控元件(wpre)(seq id no:22或23)，和δu3 3'ltr(seq id no:24)。
202.已设计并生产了辅助质粒，其中包含以下元件：cag启动子(seq id no:25)；hiv组分gag(seq id no:26)；hiv组分pol(seq id no:27)；hiv int(seq id no:28)；hiv rre(seq id no:29)；和hiv rev(辅助/rev；hiv rev；核输出和稳定病毒mrna)(seq id no:30)。已设计并生产了包膜质粒，其中包含以下元件：rna聚合酶ii启动子(巨细胞病毒(cmv)启动子(seq id no:13)和疱疹性口炎病毒g糖蛋白(vsv-g)(seq id no:32)。
203.在293t/17hek细胞(购自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)，弗吉尼亚州玛纳萨斯)中，在用载体、包膜质粒和辅助质粒转染后，生产慢病毒颗粒。293t/17hek细胞(由其生产功能性病毒颗粒)的转染使用试剂聚(乙烯亚胺)(pei)来提高质粒dna的摄取效率。先将质粒和dna按照3:1(pei比dna的质量比)的比例分别加入不含血清的培养基中。2-3天后，收集细胞培养基，并通过高速离心和/或过滤然后阴离子交换谱纯化慢病毒颗粒。慢病毒颗粒的浓度可以用转导单位/ml(tu/ml)表示。如下确定tu：测定培养液中的hiv p24水平(p24蛋白包含于慢病毒颗粒内)，定量pcr测定每个细胞的病毒dna拷贝数，或通过感染细胞和采用光学手段(如果载体编码荧光素酶或荧光蛋白标志物)。设计了一种3-载体系统(即，2-载体慢病毒包装系统)用于生产慢病毒颗粒。3-载体系统的示意图如图1所示。简而言之，并参照图1，上方载体是辅助质粒，此例中包含rev。中间载体是包膜质粒。下方载体是性载体。
204.更具体地，参照图1中的上方载体，辅助加rev质粒包括cag增强子(辅助/rev；cmv早期(cag)增强子；增强转录)；cag启动子(seq id no:25)；鸡β肌动蛋白内含子(辅助/rev；鸡β肌动蛋白内含子；增强基因表达)(seq id no:34)；hiv gag(seq id no:26)；hiv pol(seq id no:27)；hiv int(seq id no:28)；hiv rre(seq id no:29)；hiv rev(辅助/rev；hiv rev；核输出和稳定病毒mrna)(seq id no:30)；和兔β球蛋白多聚a(辅助/rev；兔β球蛋白多聚a；rna稳定性)(seq id no:35)。
205.包膜质粒(图1的中间载体)包括cmv启动子(seq id no:13)；β球蛋白内含子(包膜；β球蛋白内含子；增强基因表达)(seq id no:36)；vsv-g(seq id no:32)；和兔β球蛋白多聚a(包膜；兔β球蛋白多聚a；rna稳定性)(seq id no:37)。
206.合成包含辅助质粒(+rev)和包膜质粒的2-载体慢病毒包装系统。
207.材料和方法：
208.辅助质粒的构建：辅助质粒的构建先从pnl4-3 hiv质粒(美国国立卫生研究院艾滋病试剂计划(nih aids reagent program))pcr扩增含有gag、pol和整合酶基因的dna片段。设计引物以用ecori和noti限制性位点扩增片段，其可用于插入pcdna3质粒(英杰公司(invitrogen))中的相同位点。正向引物为seq id no:38，反向引物为seq id no:39。gag、pol、整合酶片段的序列是seq id no:40(gag、pol、整合酶片段)。
209.通过mwg操纵子合成含有具有xbai和xmal侧翼限制性位点的rev、rre和兔β球蛋白多聚a序列的dna片段。然后在xbai和xmai限制性位点将该dna片段插入质粒(seq id no:41)(含有rev、rre和兔β球蛋白多聚a的dna片段)。
210.用cag增强子/启动子和鸡β肌动蛋白内含子序列替换pcdna3.1的cmv启动子。通过mwg操纵子合成含有具有mlui和ecori侧翼限制性位点的cag增强子/启动子/内含子序列的dna片段。然后在mlui和ecori限制性位点将该dna片段插入质粒(seq id no:42)(含有cag增强子/启动子/内含子的dna片段)。
211.构建vsv-g包膜质粒：
212.水泡性口炎印第安纳病毒糖蛋白(vsv-g)序列由mwg阿普龙公司(mwg operon)合成，具有侧接的ecori限制性位点。然后将该dna片段插入pcdna3.1质粒(invitrogen)的ecori限制性位点，并通过使用cmv特异性引物(seq id no:43)(含有vsv-g的dna片段)测序确定正确方向。
213.还用本文所述的方法和材料设计并生产了4-载体系统(即3-载体慢病毒包装系统)。4-载体系统的示意图如图2所示。简而言之，并参照图2，上方的载体是辅助质粒，此例中不含rev。由上方正数第二个载体是独立的rev质粒。由下方倒数第二个载体是包膜质粒。下方载体是性载体。
214.部分参考图2中的顶部载体。辅助质粒包括cag增强子(辅助/rev cmv早期(cag)增强子；增强转录)(seq id no：33)；cag启动子(辅助/rev鸡β肌动蛋白(cag)启动子)(seq id no。25)；鸡β肌动蛋白内含子(辅助/rev；鸡β肌动蛋白内含子；增强基因表达)(seq id no:34)；hiv gag(辅助/rev；hiv gag；病毒衣壳)(seq id no:26)；hiv pol(辅助/rev；hiv pol；蛋白酶和逆转录酶)(seq id no:27)；hiv int(辅助rev；hiv整合酶；病毒rna的整合)(seq id no:28)；hiv rre(辅助/rev；hiv rre；结合rev元件)(seq id no:29)；以及兔β球蛋白多聚a(辅助/rev；兔β球蛋白多聚a；rna稳定性)(seq id no:35)。
215.图2中从上往下第二个载体所描述的rev质粒包括rsv启动子和hiv rev(seq id no:45)；以及兔β球蛋白多聚a(包膜兔β球蛋白多聚a；rna稳定性)(seq id no:37)。
216.图2中从下往上第二个描述的包膜质粒包含cmv启动子(seq id no:13)；β球蛋白内含子(seq id no:36)；vsv-g(seq id no:32)和兔β球蛋白多聚a(seq id no:37)。
217.合成包含辅助质粒、rev质粒和包膜质粒的3-载体慢病毒包装系统。
218.材料和方法：
219.无rev辅助质粒的构建：
220.通过插入含有rre和兔β球蛋白多聚a序列的dna片段构建不含rev的辅助质粒。该序列由mwg阿普龙公司(mwg operon)合成，具有侧接的xbai和xmai限制性位点。然后在xbai和xmai限制性位点将rre/兔多聚aβ球蛋白序列插入辅助质粒(seq id no:44)(含有rre和兔β球蛋白多聚a的辅助质粒)。
221.rev质粒的构建：
222.rsv启动子和hiv rev序列由mwg阿普龙公司(mwg operon)合成为单个dna片段，具有侧接的mfel和xbai限制性位点。然后将该dna片段在mfei和xbai限制性位点处插入pcdna3.1质粒(invitrogen)中，以rsv启动子(seq id no:45)(rsv启动子和hiv rev)替换cmv启动子。
223.可用类似元件修饰2-载体和3-载体包装系统的质粒，并且存在可以去除内含子序列而不损失载体功能的可能。例如，可用以下元件替换2-载体和3-载体包装系统中的类似元件：
224.启动子：延长因子-1(人延长因子α(ef-1α)启动子)(seq id no:14)，磷酸甘油酸激酶(pgk)(启动子；pgk)(seq id no:65)和泛素c(ubc)(启动子；ubc)(seq id no:46)可以替代cmv(seq id no:13)或cag启动子(seq id no:48)。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。
225.多聚a序列：sv40多聚a(多聚a；sv40)(seq id no:49)和bgh多聚a(多聚a；bgh)(seq id no:50)可以替代兔β球蛋白聚a(seq id no:35)。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。
226.hiv gag、pol和整合酶序列：辅助质粒中的hiv序列可由不同的hiv病毒株或进化枝构建。例如，可用来自bal株的hiv gag(hiv gag；bal)(seq id no:51)，hiv pol(hiv pol；bal)(seq id no:52)；和hiv int(hiv整合酶；bal)(seq id no:53)与本文所述辅助/辅助加rev质粒中的gag、pol和int序列互换。这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。
227.包膜：vsv-g糖蛋白可以被来自下述病毒的膜糖蛋白取代：猫内源病毒(rd114)(包膜；rd114)(seq id no:54)、长臂猿白血病病毒(galv)(galv)(包膜；galv)(seq id no:55)、狂犬病毒(fug)(包膜fug)(seq id no:56)，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)(包膜lcmv)(seq id no:55)，甲型鸡瘟流感病毒(fpv)(包膜；fpv)(seq id no:58)，罗斯河甲病毒(rrv)(包膜；rrv)(seq id no:59)，小鼠白血病病毒10a1(mlv)(包膜e；mlv 10a1)(seq id no:60)，或埃博拉病毒(ebov)(包膜；埃博拉)(seq id no:61)。这些包膜的序列在本文序列部分中确定。此外，这些序列还可以通过添加、取代、缺失或突变进一步改变。
228.概括地说，如下所示，可部分地比较和对照3-载体系统和4-载体系统。3-载体慢病毒系统包含：1.辅助质粒：hiv gag，pol，整合酶和rev/tat；2.包膜质粒：vsv-g/fug包膜；和3.性载体：rsv 5'ltr，ψ包装信号，gag片段，rre，env片段，cppt，wpre和3'δltr。4-载体慢病毒系统包含：1.1.辅助质粒：hiv gag，pol和整合酶；2.rev质粒：rev 3.包膜质粒：vsv-g/fug包膜；和4.性载体：rsv 5'ltr，ψ包装信号，gag片段，rre，env片段，cppt，wpre和3'δltr。与上述元件相对应的序列在本文序列表部分中确定。
229.实施例2：构建含有vrc01序列、3bnc117序列、scd4序列或者scd4-igg1fc序列的慢病毒
230.抗hiv中和抗体的重链可变区(hv)和轻链可变区(lv)被合成(整合dna技术-idt)并插入到含有人igg1重链(seq id no:70)(igg1重恒定链)(ch)(gen bank:ay623427.1)和轻链(seq id no:73)(igg1轻恒定链)(cl)(gen bank:jq837832.1)恒定区的慢病毒质粒。用限制酶xhoi和agei(neb)消化含有igg1抗体恒定区和vrc01(gen bank:gu980702.1)和3bn117(gen bank:he584537.1)重链可变区的基因片段的慢病毒质粒，从1％琼脂糖凝胶(thermofisher)中分离和提取质粒，然后用t4dna连接酶(neb)连接质粒和片段。用限制酶bamhi和noti(neb)消化含有igg1抗体恒定区和vrc01(gen bank:gu980703.1)和3bn117(gen bank:he584538.1)轻链可变区的基因片段的慢病毒质粒。1％琼脂糖凝胶(thermofisher)中分离和提取dna片段，然后用t4 dna连接酶(neb)连接质粒和片段。scd4
和scd4-igg1 fc的基因片段被合成(idt)并插入到慢病毒质粒中。scd4由带有抗体分泌序列的cd4(gen bank:nm_000616.5)的结构域1和2组成，scd4-igg1 fc由融合到igg1-fc区的cd4结构域1、2(genbank:af237583.1)和抗体分泌序列组成。用bsrgi和noti(neb)消化scd4和scd4-igg1 fc的慢病毒质粒和基因片段，从1％琼脂糖凝胶中分离和提取质粒，然后用t4dna连接酶(neb)连接质粒和片段。图4显示了含有启动子和分泌序列变化形式的慢病毒载体以调节抗hiv中和抗体和scd4的表达的线性图谱。表1说明了表达抗hiv抗体或scd4的慢病毒载体。
231.表1
232.233.[0234][0235]
实施例3：hiv感染表达3bnc117的cd4 t细胞的能力减损
[0236]
hiv抗体3bnc117在cd4 t细胞中被表达，然后用hiv攻击细胞。分析细胞以确定hiv感染细胞的频率。
[0237]
方法：第0天，耗尽pbmc中的cd8+t细胞，然后用transact(cd3/cd28珠)(miltenyibiotec)进行刺激。第1天，用慢病毒载体转导pbmc，该慢病毒载体表达抗hiv的广泛中和抗体(bnab)(seq id no:4；agt112)。载体的组成部分显示在表2中。agt112载体(seq id no:4)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动3bnc117抗体序列的表达，该抗体序列包含il-2分泌序列(seq id no:74(3bnc117重可变链(与il-2分泌序列))和seq id no:75(3bnc117轻可变链(具有il-2分泌序列))。il-2分泌序列是seq id no:11。
[0238]
第二(2)天，用hiv nl43-gfp感染pbmc。第3天，清洗细胞三次。在第六天，对hiv感染的gfp阳性细胞进行检测。该方案如图5所示，但这里用lv-3bnc117代替了lv-vrc01。
[0239]
图6描述了流式细胞术的数据，显示了t细胞产生的3bnc117抗体对体外hiv感染的作用。图6的上图和下图表示来自不同供体(ny025供体和ny026供体)的测试的pbmc。如两个供体所示，与对照处理的细胞(未用编码3bnc117的慢病毒载体处理的细胞)相比(参见标记为nl43-gfp的列)(ny025供体的gfp阳性细胞为3.96％，ny026供体的gfp阳性细胞为0.57％)，用编码3bnc117的慢病毒载体转导的细胞中gfp表达降低(参见标记为nl43+3bnc117的列)(ny025供体的的gfp阳性细胞为1.79％，而ny026供体的gfp阳性细胞为0.30％)。沙奎那韦处理的细胞显示，来自ny025和ny026供体的gfp阳性细胞分别为0.025％和2.43e-3％。
[0240]
实施例4：hiv感染表达可溶性cd4的cd4 t细胞的能力减损
[0241]
可溶性cd4(scd4)在cd4t细胞中表达。然后用hiv感染cd4t细胞。分析细胞以确定hiv感染细胞的频率。
[0242]
方法：第0天，耗尽pbmc中的cd8+t细胞，然后用transact(cd3/cd28珠)(miltenyibiotec)进行刺激。在第1天，用表达scd4(seq id no:8(agt116)和seq id no:10(agt117))的慢病毒载体转导pbmc。载体的组成组分描述于表2中。agt116载体(seq id no:8)包含scd4序列(seq id no:7)和scd4序列上游的ef-1α启动子(seq id no:14)。agt117载体(seq id no:10)包含scd4-igg1 fc序列(seq id no:9)和scd4-igg1 fc序列上游的ef-1α启动子(seq id no:14)。
[0243]
第2天，用hiv nl43-gfp感染pbmc。第3天，清洗细胞三次。然后将细胞培养4天。在第6天，对hiv感染的gfp阳性细胞进行检测。图7显示了该方法的示意图。
[0244]
图8a和8b描述了流式细胞术的数据，显示了t细胞产生的scd4抗体对体外hiv感染
的影响。如图8a和8b的上排所示，scd4的转导效率很低。在图8a(上排)中，agt116(seq id no:8)(见标有nl43-scd4一栏)的转导效率为12.7％，agt117(seq id no:10)(见标有nl43-scd4-ig和nl43+scd4-ig-r5一栏)的转导效率为6.39％和2.36％。在图8b(上排)中，agt116(seq id no:8)(见标有nl43-scd4的列)的转导效率为22.7％，agt117(seq id no:10)(见标有nl43-scd4-ig和nl43+scd4-ig-r5的列)的转导效率为12.1％和4.37％。
[0245]
表达scd4的cd4 t细胞部分地阻断了hiv感染(见图8a和8b的底排)。在图8a(底排)中，在对照组处理的细胞中(见标有nl43的一栏)，gfp阳性细胞的百分比为.46％。然而，当用agt116(seq id no:8)处理细胞时(见标有nl43+scd4一栏)，gfp阳性细胞的百分比为0.30％，而当用(agt117)(seq id no:10)处理细胞时(见标有nl43-scd4-ig和nl43+scd4-ig-r5一栏)，gfp阳性细胞的百分比为0.26％和0.25％。这可以与沙奎那韦处理的细胞(见标有nl43-沙奎那韦的栏)中gfp阳性细胞的百分比0.017％进行比较。在图8b(底排)中，在对照组处理的细胞中(见标有nl43的一栏)，gfp阳性细胞的百分比为7.75％。然而，当用agt116(seq id no:8)(见标有nl43+scd4一栏)处理细胞时，gfp阳性细胞的百分比为3.67％，当用(agt117)(seq id no:10)(见标有nl43-scd4-ig和nl43+scd4-ig-r5一栏)处理细胞，gfp阳性细胞的百分比为2.98％和5.40％。这可以与沙奎那韦处理的细胞(见标有nl43-沙奎那韦的栏目)中gfp阳性细胞的百分比0.026％进行比较。
[0246]
表2
[0247][0248]
实施例5：hiv gag特异性cd4 t细胞的抗体表达
[0249]
hiv抗体vrc01或3bnc117在cd4 t细胞中表达。用gag刺激cd4 t细胞导致抗体表达增加。
[0250]
方法：为了测量hiv gag特异性cd4 t细胞的抗体表达，用ficoll-paque plus(ge healthcare，目录号17-1440-02)分离hiv阳性人类外周血单核细胞(pbmc)。用pepmix橦iv
(gag)ultra(目录号pm-hiv-gag，jpt肽科技公司)在24孔板中的1ml培养基中刺激分离的pbmc(1x107)18小时。用pe标记的特异性抗体和抗-pe微珠消耗cd8 t、γδ、nk和b细胞。将负筛选的细胞以2x106/ml在含有il7(170-076-111,miltenyi biotec)、il15(170-076-114,miltenyi biotec)和沙奎那韦(目录号：4658，nih aids试剂项目)的texmacs gmp培养基(目录号：170-076-309,miltenyi biotec)中培养。24小时后以5的感染复数(moi)加入编码抗hiv抗体vrc01的慢病毒载体agt111(seq id no:2)或编码抗hiv抗体3bnc117的慢病毒载体agt112(seq id no:4)。
[0251]
agt111载体(seq id no:2)包含一个cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该抗体序列包含il-2分泌序列(seq id no:69(vrc01重可变链(与il-2分泌信号))和seq id no：72(vrc01轻可变链(具有il-2分泌信号))。il-2分泌序列是seq id no:11。
[0252]
agt112载体(seq id no:4)包含一个cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动一个3bnc117抗体序列的表达，该抗体序列包含一个il-2分泌信号(seq id no:74(3bnc117重可变链(与il-2分泌信号))和seq id no:75(3bnc117轻可变链(具有il-2分泌信号))。il-2分泌信号是seq id no:11。
[0253]
在细胞扩增过程中，每2-3天添加含有il7、il15和沙奎那韦的新鲜培养基。il7和il15的起始浓度为10ng/ml。在第12-16天，收集2-3x106个细胞用于肽刺激。用pe抗ifn-γ抗体和apc抗igg1fc抗体(biolegend)检测ifnγ和iggfc的细胞内表达。图9显示了该方法的示意图。
[0254]
如图10所示，抗原特异性cd4 t细胞表达ifnγ和抗hiv抗体vrc01或3bnc117。这证明了在gag特异性cd4 t细胞中可诱导抗体表达(由肽诱导)(图10)。此外，在第12天用gag pepmix(jpt peptide technologies)进行刺激(见下行标记的gag pepmix，显示有1.66％用vrc01转导的细胞和1.58％用3bnc117转导的细胞对igg fc呈阳性)，相对于用dmso处理的细胞，igg的荧光强度增加了约10倍(见上排标有dmso，显示0.18％用vrc01转导的细胞和0.13％用3bnc117转导的细胞对igg fc呈阳性)(图10)。
[0255]
实施例6：cd3/cd28珠刺激的cd4 t细胞的抗体表达
[0256]
用编码3bnc117 hiv抗体的慢病毒载体转导的丝裂原刺激的cd4 t细胞导致细胞内抗体积累。方法：为了测量原代cd4 t细胞中的抗体表达，从全血中纯化pbmc，并使用磁珠通过负筛选富集cd4+t细胞亚。1
×
106cd4 t细胞在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的2ml rpmi1640培养基(thermo fisher scientific)中，在37℃培养箱中以5％co2培养，然后以重组人类il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)和transact(cd3/cd28微珠)(miltenyi biotec)进行补充。细胞培养1天，然后加入编码抗hiv抗体vrc01的慢病毒载体agt111(seq id no:2)或编码抗hiv抗体3bnc117的agt112(seq id no:4)，moi为5。
[0257]
agt111载体(seq id no:2)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该抗体序列包含il-2分泌信号(seq id no:69(vrc01重可变链(具有il-2分泌信号))和seq id no:72(vrc01轻可变链(具有il-2分泌信号))。il-2分泌信号是seq id no:11。
[0258]
agt112载体(seq id no:4)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动
3bnc117抗体序列的表达，该抗体序列包含il-2分泌信号(seq id no:74(3bnc117重可变链(具有il-2分泌信号))和seq id no:75(3bnc117轻可变链(具有il-2分泌序列))。il-2分泌信号是seq id no:11。
[0259]
转导一天后，去除培养基，用添加il-2的新鲜培养基替换。细胞再培养3天，清洗并收集cd4 t细胞以测量转导的效率。通过cd3和cd4糖蛋白的细胞表面染来识别转导的细胞，这些糖蛋白是辅助t细胞的特征，并测试测量细胞内igg fc的vrc01表达。该方法的示意图见图11。
[0260]
如图12所示，cd4 t细胞用pe标记的抗cd4抗体染，转导的细胞用apc标记的抗人igg fc抗体(biolegend)鉴定。在agt111(seq id no:2)转导细胞中(见标有agt111的栏)，培养物中总细胞的41.6％对cd4和igg fc均呈阳性。在agt112(seq id no:4)中，培养物中总细胞的17.9％对cd4和igg fc都呈阳性。在对照组处理的细胞中(见标有对照组的一栏)，只有0.13％的细胞对cd4和igg均呈阳性。这些数据表明，抗体可由受刺激的原代cd4 t细胞表达。
[0261]
实施例7：抗hiv抗体的产生可保护cd4 t细胞免受hiv感染
[0262]
抗hiv抗体vrc01的表达能保护cd4 t细胞免受hiv感染。
[0263]
方法：通过负筛选分离cd4 t细胞，用transact(cd3/cd28珠)(miltenyi biotec)加il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)刺激1天，然后用慢病毒载体agt111(seq id no:2)以不同moi转导。
[0264]
agt111载体(seq id no:2)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该抗体序列包含il-2分泌信号(seq id no:69(vrc01重可变链(具有il-2分泌信号))和seq id no:72(vrc01轻可变链(具有il-2分泌信号))。il-2分泌信号是seq id no:11。
[0265]
一天后，细胞被1moi表达gfp的hiv重组病毒株nl43感染。24小时后，用pbs洗涤3次去除cd3/cd28珠、慢病毒和hiv，并在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基中添加il-2(30u/ml)，并在37℃、5％co2下培养7天，并根据需要补充培养基。作为对照，用200nm沙奎那韦处理hiv感染的细胞。在培养结束时，收集细胞并通过流式细胞仪分析gfp的表达，并使用apc抗cd4抗体进行分析。如果cd4细胞表达gfp，该细胞被hiv感染。
[0266]
如图13a所示，更高比例的gfp+细胞表明原代cd4 t细胞中产生了更多的hiv。在原代t细胞培养中产生的hiv水平更高，与agt111提供的保护较少有关。在用nl43-gfp处理但没有任何载体的细胞中，gfp阳性细胞的百分比在第5、7和9天分别为0.71％、2.18％和1.95％。在agt111(seq id no:2)处理的细胞中，在8moi时，gfp阳性细胞的百分比在第5、7和9天分别为0.25％、0.36％和0.59％。在agt111(seq id no:2)处理的细胞中，在4moi时，gfp阳性细胞的百分比在第5、7和9天分别为0.32％、0.94％和1.83％。在agt111(seq id no:2)处理的细胞中，在2moi下，gfp阳性细胞的百分比在第5、7和9天分别为0.38％、1.37％和1.85％。这可以与用沙奎那韦处理的细胞相比较，其中gfp阳性细胞的百分比在第5、7和9天分别为0.19％、0.22％和0.24％。
[0267]
图13b显示了用agt 111(seq id no：2)处理的细胞在不同日期和不同moi下的抑制百分比。第5天，在moi为8、4和2时，agt111分别保护了88％、75％和63％的细胞。第7天，在
fisher scientific)，使用easytiter igg fc抗体检测试剂盒测定抗体表达。
[0282]
如图17所示，用编码vrc01(seq id no：6)的慢病毒(见图17中标有lv-agt113的条形图)转导c8166细胞，使细胞培养基中的抗体浓度达到约1,500ng/ml。与此相比，对照处理细胞的培养基中的抗体量可以忽略不计(见标有无lv的条形图)。
[0283]
实施例11：抗hiv抗体的产生可保护高度受纳细胞系免受hiv感染
[0284]
用编码vrc01抗体的慢病毒转导c8166细胞系，可保护该细胞系免受hiv感染。
[0285]
方法：c8166细胞在含有10％fbs(gemini bio)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中培养，然后在第0天以5moi不含或含慢病毒agt113(seq id no:6)的情况下转导细胞。agt113载体(seq id no:6)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该序列包含抗体分泌信号(seq id no:86(vrc01重可变链(具有抗体分泌信号)seq id no:71(vrc01轻可变链(带有抗体分泌信号))。il-2分泌信号是seq id no:12。
[0286]
第3天，用1moi的hiv重组病毒株nl43感染细胞，该病毒株本身表达gfp。第7天，收集细胞，通过流式细胞术测量gfp阳性的hiv感染细胞。如果c8166细胞表达gfp,该细胞被hiv感染。gfp+c8166细胞的比例越高，说明产生的hiv越多。
[0287]
如图18所示，agt113(seq id no：6)保护c8166细胞免受hiv感染。在agt113(seq id no:6)转导的细胞中(见标有c8166+agt113+nl43-gfp一栏)，1.06％的c8166细胞为hiv阳性。在未用慢病毒转导的细胞中(见标有c8166+nl43-gfp一栏)，31.8％的细胞为hiv阳性。因此，使用agt113后，hiv感染率下降了96.7％。
[0288]
实施例12：可溶性cd4的产生保护了高度受纳细胞系免受hiv的感染
[0289]
用编码可溶性cd4的慢病毒转导c8166 t细胞，可保护其免受hiv感染。
[0290]
方法：c8166细胞在用不含或含编码scd4-igg1 fc的慢病毒agt117(seq id no:10)在5moi情况下转导。agt117载体(seq id no:10)包含一个ef-1α启动子(seq id no:14)，驱动scd4-igg1 fc(seq id no:9)(scd4(d1+d2)-igg1 fc)表达。第5天，用携带gfp的hiv nl43感染细胞。第7天，收集细胞，通过流式细胞术测量gfp阳性的hiv感染细胞。
[0291]
如图19所示，与只用nl43-gfp处理的细胞的gfp荧光强度(见标有c8166+nl43-gfp一栏，显示32.2％的gfp阳性细胞)对比，用编码scd4的慢病毒转导并经nl43 gfp(agt117(seq id no：10))(见标有c8166+scd4+nl43-gfp一栏，显示0.41％的gfp阳性细胞)处理的细胞中，gfp荧光强度显著降低。这表明，scd4的产生保护了高度受纳的细胞系免受hiv感染。
[0292]
实施例13：cd3/cd28珠刺激的cd4 t细胞内抗体的表达
[0293]
用编码vrc01 hiv抗体的慢病毒载体转导的丝裂原刺激的cd4 t细胞导致细胞内抗体积累。
[0294]
方法：为了测量初级cd4 t细胞的抗体表达，从全血中纯化外周血单核细胞(pbmc)，用磁珠进行负筛选，富集cd4+t细胞亚。1
×
106个cd4 t细胞在2ml含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，在37℃，5％c02的培养箱中培养，并辅以重组人类il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)和transact(cd3/cd28微珠)(miltenyi bio)。在加入5moi慢病毒agt113(seq id no:6)之前，将细胞培养1天。
[0295]
agt113载体(seq id no:6)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该序列包含抗体分泌信号(seq id no:86(vrc01重可变链(具有抗体分泌信号)和seq id no:71(vrc01轻可变链(具有抗体分泌信号))。抗体分泌信号是seq id no:12。。
[0296]
转导1天后，除去培养基并用添加il-2的新鲜培养基替换。将细胞再培养3天，清洗并收集cd4 t细胞以测量转导效率。用pe抗人类igg fc抗体(biolegend)测试转导的细胞以测定胞内igg fc的vrc01表达。
[0297]
如图20所示，ifnγ阳性，抗原特异性cd4 t细胞表达了vrc01抗体。
[0298]
实施例14：hiv gag特异性cd4 t细胞内的抗体表达
[0299]
为了测量hiv gag特异性cd4 t细胞中的抗体表达，用ficoll-paque plus(ge healthcare，目录号：17-1440-02)分离hiv阳性人类pbmc。方法：pbmc(1x107)含1ml培养基的24孔盘中用pepmix
tm hiv(gag)ultra(目录号：pm-hiv-gag，jpt peptide technologies)刺激18小时。cd8 tγδ、nk和b细胞被pe标记的特异性抗体和抗pe微珠耗尽。将负筛选的细胞以2x106/ml在含有il7(170-076-111,miltenyi biotec)、il15(170-076-114,miltenyi biotec)和沙奎那韦(目录号：4658，nih aids试剂项目)的texmacs gmp培养基(目录号：170-076-309,miltenyi biotec)中培养。24小时后加入慢病毒agt113(seq id no:6)，moi为5。agt113载体(seq id no:6)含有驱动vrc01抗体序列表达的cmv启动子(seq id no:13)，该序列包含抗体分泌信号(seq id no:86(vrc01重可变链(带有抗体分泌信号)和seq id no:71(vrc01轻可变链(带有抗体分泌信号))。抗体分泌信号是seq id no:12.
[0300]
在细胞扩增过程中，每2-3天添加含有il7、il15和沙奎那韦的新鲜培养基。il7和il15的起始浓度为10ng/ml。在第12-16天，收集2-3x106个细胞用于肽刺激。用pe抗ifnγ抗体和apc抗igg1 fc抗体(biolegend)检测ifnγ和vrc01抗体的细胞内表达。
[0301]
如图21所示。ifnγ阳性、抗原特异性cd4 t细胞表达所含vrc01抗体(见标有agt113的列-上排(6.37％阳性细胞)和底排(5.23％阳性细胞)的右上象限，相对到对照处理的细胞(见标有对照的列-上排(0.24％阳性细胞)和底排(0.24％阳性细胞)的右上象限。
[0302]
实施例15：抗hiv抗体的产生可保护cd4 t细胞对抗hiv感染
[0303]
在原代cd4 t细胞中转导编码vrc01抗体的慢病毒可抑制hiv nl43-gfp感染。
[0304]
方法：通过负筛选分离cd4 t细胞并用transact(cd3/cd28珠)(miltenyi biotec)加il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)刺激1天，然后用5moi慢病毒agt113(seq id no:6)进行转导。agt113载体(seq id no:6)包含cmv启动子(seq id no:13)，该启动子驱动vrc01抗体序列的表达，该序列包含抗体分泌信号(seq id no:86(vrc01重可变链(具有抗体分泌信号)和seq id no:71(vrc01轻可变链(具有抗体分泌信号))。抗体分泌信号是seq id no:12。
[0305]
1天后，细胞被1moi表达gfp的hiv重组病毒株nl43感染。24小时后，pbs洗涤3次去除cd3/cd28珠、慢病毒和hiv，并在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，添加il-2(30u/ml)一起在37℃培养箱，5％co2下培养7天，并根据需要补充培养基。在培养结束时，收集细胞并通过流式细胞术进行分析。如果cd4细胞表达gfp，说明该细胞被hiv感染。该方法的示意图如图1所示。22.
[0306]
如图23所示，agt113保护原代cd4 t细胞免受hiv感染。在agt113转导的细胞(seq id no:6)(参见标记为nl43-gfp-agt113的列)中，0.36％的细胞是hiv阳性的。在未转导的细胞中(参见标记为nl43-gfp的列)，1.28％的细胞为hiv阳性。
[0307]
实施例16：可溶性cd4-igg fc融合蛋白的产生保护cd4 t细胞对抗hiv感染
[0308]
可溶性cd4-igg fc融合蛋白保护cd4 t细胞对抗hiv感染。
[0309]
方法(i)：通过负筛选分离cd4 t细胞并用transact(cd3/cd28珠)(miltenyi biotec)加il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)刺激1天，然后用5moi慢病毒agt116(seq id no:8)或agt117(seq id no:10)进行转导。agt116载体(seq id no:8)包含驱动scd4(seq id no:7)(scd4(d1+d2)表达的ef-1α启动子(seq id no:14)。agt117载体(seq id no:10)含有驱动scd4-igg1 fc(seq id no:9)(scd4(d1+d2)-igg1 fc)表达的ef-1α启动子(seq id no:14)。
[0310]
1天后，细胞被1moi表达gfp的hiv重组株nl43感染。24小时后，pbs洗涤3次去除cd3/cd28珠、慢病毒和hiv，并在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，添加il-2(30u/ml)一起在37℃培养箱，5％co2下培养7天，并根据需要补充培养基。在培养结束时，收集细胞并通过流式细胞术进行分析。如果cd4 t细胞表gfp，则该细胞已被重组hiv感染。
[0311]
如图24所示，编码可溶性cd4-igg fc融合蛋白的agt117(seq id no:10)保护原代cd4 t细胞免受hiv感染。具体来说，在用agt117处理的细胞中(参见标记为nl43-gfp+agt117的列)，0.65％的细胞是hiv阳性的。这可以与对照组处理的细胞(见标有nl43-gfp的一栏)进行比较，其中2.83％的细胞为hiv阳性。因此，使用agt117可以减少77％的hiv感染。然而，编码可溶性cd4的慢病毒agt116(seq id no:8)显示出低水平的hiv抑制作用(见标有nl43-gfp+agt116一栏，显示2.65％的细胞为hiv阳性)。
[0312]
方法(ii)通过负筛选分离cd4 t细胞并用transact(cd3/cd28珠)(miltenyi biotec)加il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)刺激1天，然后用，5moi慢病毒agt117(seq id no:10)或agt124(seq id no:88)或agt125(seq id no:89)进行转导。agt117载体(seq id no:10)包含ef-1α启动子(seq id no:14)，该启动子驱动cd4-igg表达，其中fc区被截短(seq id no:7)。agt124载体(seq id no:88)包含ef-1α启动子(seq id no:14)，该启动子驱动scd4-igg1的表达，其中fc区是完整的并使用野生型序列(seq id no:76)。agt125载体(seq id no:89)包含ef-1α启动子(seq id no:14)，该启动子驱动scd4-igg1的表达，其中fc区被突变以去除fcγ受体ii(seq id no:77)的结合位点。
[0313]
1天后，细胞被1moi表达gfp的hiv重组株nl43感染。24小时后，pbs洗涤3次去除cd3/cd28珠、慢病毒和hiv，并在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，添加il-2(30u/ml)一起在37℃培养箱，5％co2下培养7天，并根据需要补充培养基。在培养结束时，收集细胞并通过流式细胞术进行分析。如果cd4 t细胞表gfp，则该细胞已被重组hiv感染。
[0314]
如图27所示，使用两个不同的血液供者(ny035和ny036)的数据，不添加慢病毒载体的nl43-gfp病毒感染产生平均2％的感染细胞。用agt117转导t细胞可以防止hiv感染，并将感染细胞的比例降低到0.024％。用agt124转导可保护cd4 t细胞免受感染，并将感染细胞的数量减少到对照水平的0.003％，用agt125转导可将cd4 t细胞的感染减少到对照水平
的0.004％。虽然agt117、agt124和agt125载体都能保护cd4 t细胞免受hiv感染，但与agt117相比，agt124和agt125的效力更高。
[0315]
实施例17：编码可溶性cd4-igg fc融合蛋白和针对ccr5、hiv vif和tat的抑制性rna的慢病毒载体保护cd4 t细胞免受hiv感染
[0316]
表达可溶性scd4-igg fc和针对ccr vif和tat的抑制性rna，比单独表达可溶性scd4-igg fc对hiv有更好的保护作用。
[0317]
方法：通过负筛选分离cd4 t细胞，用transact(cd3/cd28珠)(miltenyi biotec)加il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)刺激1天，然后用5moi慢病毒agt103(seq id no:78)或agt118(seq id no:80)进行转导。agt103载体(seq id no:78)包含一个ef-1α启动子(seq id no:14)，该启动子驱动mir30-ccr5/mir21-vif/mir185-tat微小rna簇序列(seq id no:65)(mir30-ccr5/mir21-vif/mir185-tat微小rna簇序列)的表达。mir30-ccr5序列是seq id no:62。mir21-vif序列是seq id no：63。mir185-tat序列是seq id no:64。agt118载体(seq id no：80)包含ef-1α启动子(seq id no:14)，该启动子驱动scd4(d1+d2)-igg1 fc(seq id no:9)和mir30-ccr5/mir21-vif/mir185-tat微小rna簇序列(seq id no:65)的表达。
[0318]
1天后，细胞被1moi表达gfp的hiv重组株nl43感染。24小时后，pbs洗涤3次去除cd3/cd28珠、慢病毒和hiv，并在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，添加il-2(30u/ml)一起在37℃培养箱，5％co2下培养7天，并根据需要补充培养基。在培养结束时，收集细胞并通过流式细胞术进行分析。如果cd4 t细胞表gfp，则该细胞已被重组hiv感染。
[0319]
如图25所示，agt118(seq id no:80)进一步提高了agt103的保护作用，agt103编码针对ccr和hiv vif和tat的抑制性rna。在agt118转导的细胞中(参见标记为nl43-gfp+agt118一列)，0.21％的细胞为hiv阳性。在agt103转导细胞中(参见标记为nl43-gfp+agt103的列)，0.86％的细胞为hiv阳性。在对照处理的细胞中(参见标记为nl43-gfp一列)，2.35％的细胞是hiv阳性的。因此，agt118感染的组别hiv减少了91.1％，agt103感染的组别hiv减少了75.6％。
[0320]
实施例18：ef-1α、il-2和ifnγ启动子通过pha/离子霉素刺激的cd4 t细胞调节cd4-igg1 fc融合蛋白表达
[0321]
t细胞活化的结果可以使用il-2启动子诱导cd4-igg1 fc的表达。
[0322]
方法：为了测量cd4-igg1 fc融合蛋白在原代cd4 t细胞中的表达，从全血中纯化pbmcs，用磁珠进行负筛选，富集cd4+t细胞亚。1
×
106cd4 t细胞在含有10％fbs(gemini bio)和1％pen-strep(thermo fisher scientific)的2ml rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中，在37℃培养箱中以5％co2培养，然后以重组人类il-2(30u/ml)(thermo fisher scientific)和transact(cd3/cd28微珠)(miltenyi biotec)进行补充。
[0323]
将细胞培养1天，然后添加5moi的慢病毒载体agt117(seq id no:10)、agt120(seq id no:82)和agt121(seq id no:83)。agt117载体、agt120载体和agt121载体各自编码scd4-igg1 fc序列(seq id no:9)(scd4(d1+d2)-igg1 fc)。agt117载体在scd4(d1+d2)-igg1序列上游包含ef-1α启动子(seq id no:14)。agt120载体在scd4(d1+d2)-igg1序列上游含有il-2启动子(seq id no:66)。agt121载体在scd4(d1+d2)-igg1序列上游含有ifnγ
启动子(seq id no:15)。
[0324]
转导1天后，去除培养基并以添加il-2的新鲜培养基替换。将细胞再培养6天，然后更换不含il-2的培养基培养16小时。接下来，用pma(20ng/ml)(millipore sigma)和离子霉素(1μg/ml)(millipore sigma)刺激细胞24小时。洗涤并收集细胞并用pe抗人类igg1 fc抗体(目录号12-4998-82，thermo fisher scientific)测量cd4-igg fc融合蛋白的细胞内表达。
[0325]
如图26所示，用pe标记的针对人类igg fc的抗体检测表达cd4-igg1 fc的cd4 t细胞。pma/离子霉素通过pkc途径刺激t细胞活性。在agt117(seq id no:10)转导的细胞中，ef-1启动子调节表达，56％的细胞表达cd4-igg1 fc(见标有lv-agt117的栏目，上图)。在pma/离子霉素处理下，cd4-igg1 fc的表达百分比增加到60.3％(见标有lv-agt117的栏目，下图)。在agt121(seq id no:83)转导细胞中，其中ifnγ启动子调节表达，3.83％的细胞表达cd4-igg1fc(参见标记为lv-agt121一栏，上图)。通过pma/离子霉素处理，cd4-igg1fc的表达百分比增加到4.92％(参见标记为lv-agt121一栏，下图)。。在agt120(seq id no:82)转导的细胞中，其中il-2启动子调节表达，8.75％的细胞表达cd4-igg1 fc(参见标记为lv-agt120一栏，上图)。通过pma/离子霉素处理，cd4-igg1 fc的表达百分比增加到31.8％(参见标记为lv-agt120的列，下图)。这些数据表明cd4-igg1 fc可以在cd4 t细胞中被t细胞活化化合物pma/离子霉素诱导以增加il-2启动子活性。
[0326]
实施例19：用于本文所述实施例的材料和方法
[0327]
慢病毒质粒中启动子的克隆：
[0328]
ef-1(基因库：j04617.1)、il-2(gen bank：m13879.1)、ifn(gen bank：af330164.1)或cd69启动子(gen bank：z38109.1)的dna片段由integrated dna technologies公司合成，侧翼有clai和ecori限制酶位点。用clai/ecori限制酶(new england biolabs)消化启动子片段和慢病毒质粒。消化的慢病毒质粒在1％琼脂糖凝胶(thermo fisher scientific)上进行电泳，切除，并使用purelink dna凝胶提取试剂盒(thermo fisher scientific)从凝胶中提取。测定dna浓度，然后使用3:1的载体与插入片段比与消化的dna片段混合。将混合物与t4 dna连接酶(new england biolabs)在室温下连接16小时，然后将3μl的连接混合物添加到23μl的stbl3感受态细菌细胞(thermo fisher scientific)中。42℃热休克进行转化。将细菌细胞划线到含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，然后在lb肉汤(vwr)中扩增菌落。为了检查dna片段的插入，使用purelink dna质粒小型制备试剂盒(thermo fisher scientific)从收集的细菌培养物中提取质粒dna。通过dna测序(eurofins genomics)验证插入的dna片段。然后使用含有已验证启动子序列的慢病毒质粒插入抗hiv抗体序列或cd4-igg1 fc。
[0329]
克隆慢病毒载体中的抗hiv抗体
[0330]
vrc01抗hiv免疫球蛋白重链可变区(gen bank：gu980702.1)或3bnc117(gen bank：he584537.1)的dna片段，侧翼有xhoi和nhei限制酶位点，vrc01轻链可变区(gen bank：gu980703.1)或3bnc117(gen bank：he584538.1)侧翼有ecori和noti限制酶位点，由集成dna技术公司合成。用xhoi/nhei限制性酶(new england biolabs)消化vrc01或3bnc117重链可变片段，并在插入轻链可变片段前插入慢病毒质粒。用xhoi/nhei或ecori/noti限制酶消化含有重链和轻链恒定区的慢病毒质粒。消化的产物在1％琼脂糖凝胶
(thermo fisher scientific)上进行电泳，切除，并使用purelink dna凝胶提取试剂盒(thermo fisher scientific)从凝胶中提取。测定dna浓度，然后使用3:1的载体与插入片段比与消化的dna片段混合。用t4 dna连接酶(new england biolabs)在室温下连接16小时，然后将3μl连接混合物加入23μl stbl3感受态细菌细胞(thermo fisher scientific)。42℃热休克进行转化。将细菌细胞划线到含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，然后在lb肉汤(vwr)中扩增菌落。为了检查dna片段的插入，使用purelink dna质粒小型制备试剂盒(thermo fisher scientific)从收集的细菌培养物中提取质粒dna。插入的dna片段通过dna测序(eurofins genomics)进行验证。然后用含有已验证序列的慢病毒质粒在293t细胞中包装慢病毒颗粒，通过在流式细胞仪上用apc标记的抗igg1或抗igg fc抗体(biolegend)检测，测试其表达vrc01或3bnc117抗体的能力。
[0331]
慢病毒质粒中cd4-igg1 fc的克隆：
[0332]
与含有铰链区和fc区的人免疫球蛋白重链融合的cd4的dna片段由integrated dna technologies合成，其侧翼具有bsrgi和noti限制酶位点。cd4-igg1 fc片段和慢病毒质粒用bsrgi/noti限制酶(new england biolabs)消化。消化的质粒在1％琼脂糖凝胶(thermo fisher scientific)上进行电泳，切除，并使用purelink dna凝胶提取试剂盒(thermo fisher scientific)从凝胶中提取。测定dna浓度，然后使用3:1的载体插入比与消化的dna片段混合。用t4 dna连接酶(new england biolabs)在室温下连接16小时，然后将3μl连接混合物加入23μl stbl3感受态细菌细胞(thermo fisher scientific)。42摄氏度热休克进行转化。将细菌细胞划线到含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂板上，然后在lb肉汤(vwr)中扩增菌落。为了检查dna片段的插入，使用purelink dna质粒小型制备试剂盒(thermo fisher scientific)从收获的细菌培养物中提取质粒dna。通过dna测序(欧陆基因组学公司)验证序列的插入。然后使用含有已验证序列的慢病毒质粒将慢病毒颗粒包装在293t细胞中，以通过在流式细胞仪上用pe标记的抗igg fc抗体(分类号12-4998-82，thermo fisher scientific)检测它们表达cd4-igg1 fc的能力。
[0333]
实施例20：可溶性cd4-igg fc在白血病t细胞系中的表达
[0334]
c8166是一种t细胞白血病细胞系，可用于慢病毒载体修饰。用慢病毒编码融合蛋白转导c8166 t细胞白血病细胞系，该融合蛋白包含可溶性cd4和人igg1的fc区。三个不同形式的fc区域被测试。形式1(seq id:9)是截短的fc序列，延续了氨基末端序列到铰链区。形式2(seq id:76)包含完整的igg1 fc区和可接受的野生型序列。形式3(seq id:77)包含完整的igg1 fc区，其突变使补体结合和与细胞表面fcγ受体ii型的结合失效。与fcγ受体的结合可能对淋巴结中的抗体产生具有抑制作用，我们预计可溶性cd4-igg1 fc分子在淋巴结中的表达最高。形式3保留了抑制hiv的功能，但减少了与fcγ受体ii的结合。如图29所示，形式1(seq id no:9)及其对应的慢病毒载体(seq id no:10；agt117)，形式2(seq id no:76)及其对应的慢病毒载体(seq id no:88；agt124)，或形式3(seq id no:77)及其对应的慢病毒载体(seq id no:89；atg125)，在c8166细胞中。图30分泌的形式1、2或3蛋白与cd4阴性、fcγ受体iii表达的thp-1细胞(单核细胞样细胞系)的相对结合。图31a-31g显示了形式1或2抑制hiv感染的效力，使用hiv-1的nl4和hxb2株以及c8166细胞作为靶标。
[0335]
方法：c8166细胞在含有10％fbs的rpmi 1640培养基(thermo fisher scientific)中培养，然后用5moi编码cd4-igg1 fc形式1(agt117)、2(agt124)或3(agt125)
的慢病毒载体进行转导。
[0336]
72小时后，将细胞收集在12x75mm facs管中并以1000rpm离心3分钟。用pbs洗涤细胞并以1000rpm离心3分钟。将bd固定/透化试剂盒中的0.2ml固定溶液添加到每个试管中，并将细胞在4℃下保持15分钟。用bd perm/wash缓冲液洗涤细胞2次，每管中加入0.1ml和2.5μl pe抗人类igg1 fc抗体(biolegend)。将试管在4℃下保持20分钟，然后用pbs洗涤2次。将细胞重新悬浮在0.7ml的pbs中，并在facs calibur流式细胞仪上进行检测。
[0337]
如图29所示，在agt117转导的c8166细胞中检测到cd4-igg1 fc表达。蛋白质表达水平与染后的平均荧光强度(mfi)成正比。形式3的表达最高，为88.2mfi，与形式2相似，为48.4mfi(对数刻度)。形式1表达较低，为13.4mfi，非转导细胞(背景)为2.79mfi。因此，形式2和形式3的表达水平很高并且大致相似。
[0338]
接下来，从agt124或agt125载体转导的细胞中收集无细胞的培养上清液。将上清液覆盖在thp-1细胞上30分钟，然后如上所述固定细胞并染，因为我们正在测试细胞表面结合，所以没有渗透步骤。使用thp-1细胞系是因为其表达fcγ受体iii并会结合含有人igg1天然fc序列的抗体。如图30所示，agt124作为fc区的天然或野生型形式，与具有mfi 16.5的agt125相比，显示出与具有mfi460的thp-1细胞的最高结合水平，其接近于未处理的对照thp-2细胞(mfi 5.87)的背景。结果证实agt125中fc区的定点突变消除了fcγ受体iii的结合位点。
[0339]
如图31a-31g所示，cd4-igg1 fc载体的agt117和agt124形式都是hiv-1感染的有效抑制剂。用agt117或agt124载体转导c8166细胞3天，然后用同样表达绿荧光蛋白的hxb2株或同样表达gfp的nl4病毒株用hiv攻击。将感染性hiv覆盖在转导细胞上1天，通过洗涤除去，固定细胞并通过流式细胞术以检测gfp表达水平作为感染效率的量度。
[0340]
图31a显示，在两(2)次重复中，当没有将病毒被引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为0.21％和0.33％(0.27％gfp阳性细胞的平均值)。图31b显示，在两(2)个重复中，当hxb2-gfp病毒被引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为13.1％和11.4％(平均12.25％的gfp阳性细胞)。图31c显示，在两(2)次重复中，当hxbc2-gfp病毒与cd4-igg(seq id no:9)的形式1一起被引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为1.05％和1.22％(平均1.14％gfp阳性细胞)。图31d显示，在两(2)次重复中，当hxb2-gfp病毒与cd4-igg(seq id no:76)的形式2一起被引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为1.76％和1.20％(平均1.48％gfp阳性细胞)。
[0341]
图31e显示当nl4-gfp病毒导入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为18.2％。图31f显示，在两(2)次重复中，当将nl4-gfp病毒与cd4-igg(seq id no:9)的形式1一起引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为9.44％和7.49％(平均8.47％gfp阳性细胞)。图31g显示，在两(2)次重复中，当将nl4-gfp病毒连同cd4-igg(seq id no:76)的形式2一起引入c8166细胞时，gfp阳性细胞的百分比为5.14％和4.77％(平均4.96％gfp阳性细胞)。
[0342]
使用hxb2-gfp病毒攻击，agt117(病毒感染抑制91％)和agt124(病毒感染抑制88％)都被证明是有效的抗病毒剂。与agt117(53％病毒抑制)相比，使用nl4-gfp病毒攻击显示了agt124(73％病毒抑制率)的优势。
[0343]
实施例21：比较使用cd69启动子1050与cd69启动子625在gag特异性cd4+t细胞中表达cd4-igg1 fc的诱导表达
[0344]
测试了两个形式的cd69基因启动子，以测量原代抗原特异性cd4 t细胞中基因表达的强度和可诱导性。agt122(seq id no:84)使用cd69 1050启动子(seq id no:67)(cd69启动子((1050)+cns2增强子)来表达cd4-igg1 fc(seq id no:9)，agt123(seq id no:85)使用cd69 625启动子(seq id no:68)(cd69启动子(625)+cns2增强子)来表达cd4-igg1 fc(seq id no:9)。将表达水平与agt120(seq id no:82)进行比较，agt120使用il-2启动子(seq id no:66)表达cd4-igg1 fc(seq id no:9)。
[0345]
方法：从hiv+供体获得的外周血单核细胞(pbmc)被纯化，并用代表hiv-1gag多聚蛋白序列的152个重叠肽刺激过夜。第二天用磁珠去除表达cd8、cd56或cd19的细胞，高度富集cd4+t细胞，用10moi的agt122(seq id no:84)、agt123(seq id no:85)或对照agt120(seq id no:82)转导细胞，。转导的细胞在静态条件下培养8天，然后进行细胞收集、洗涤和冷冻保存。将冷冻保存的细胞解冻，悬浮在培养基中并洗涤3次以去除dmso，然后在含有10％胎牛血清的rpmi完全培养基中培养。1天后，用之前使用的相同的肽重新刺激细胞，或用含有赋形剂但没有肽的模拟溶液处理。肽刺激后6小时，收集无细胞液和细胞。
[0346]
72小时后，将细胞收集在12x75mm facs管中并以1000rpm离心3分钟。用pbs洗涤细胞并以1000rpm离心3分钟。将bd固定/透化试剂盒中的0.2ml固定溶液添加到每个试管中，并将细胞在4℃下保持15分钟。用bd perm/wash缓冲液洗涤细胞2次，每管中加入0.1ml和2.5μl pe抗人类igg1 fc抗体(biolegend)。将试管在4℃下保持20分钟，然后用pbs洗涤2次。将细胞重新悬浮在0.7ml的pbs中，并在facs calibur流式细胞仪上进行检测。
[0347]
实施例22：比较使用不同启动子表达可溶性外源因子的诱导表达
[0348]
如实施例19所述，可将启动子克隆到慢病毒质粒中。如实施例19所述，可将可溶性cd4-igg1 fc克隆到慢病毒质粒中。使用该方法，可以合成多个慢病毒质粒，其中不同的启动子用于表达可溶性cd4-igg1 fc。
[0349]
方法：从hiv+供体获得的外周血单核细胞(pbmc)被纯化，并用代表hiv-1gag多聚蛋白序列的152种重叠肽刺激过夜。第二天用磁珠去除表达cd8、cd56或cd19的细胞，剩下的细胞高度富集为cd4+t细胞，用先前合成的慢病毒载体进行转导。转导的细胞在静态条件下培养8天，然后进行细胞收集、清洗并冷冻保存。
[0350]
将冷冻保存的细胞解冻，悬浮在培养基中并清洗三次以去除dmso，然后在含有10％胎牛血清的rpmi完全培养基中培养。1天后，用之前使用的相同的肽重新刺激细胞，或用含有赋形剂但没有肽的模拟溶液处理。肽刺激后6小时，收集无细胞液和细胞。
[0351]
72小时后，将细胞收集在12x75mm facs管中并以1000rpm离心3分钟。用pbs洗涤细胞并以1000rpm离心3分钟。将bd固定/透化试剂盒中的0.2ml固定溶液添加到每个试管中，并将细胞在4℃下保持15分钟。用bd perm/wash缓冲液洗涤细胞2次，每管中加入0.1ml和2.5μl pe抗人类igg1 fc抗体(biolegend)。将试管在4℃下保持20分钟，然后用pbs洗涤2次。将细胞重新悬浮在0.7ml的pbs中，并在facs calibur流式细胞仪上进行检测。
[0352]
序列
[0353]
本文提及以下序列：
[0354]
[0355]
[0356]
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[0358]
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[0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443][0444]
虽然上面已经描述和具体举例了某些优选的实施方式，但并不打算将本公开内容局限于此类优选的实施方式。在不偏离本文所述的本发明实施例的范围和精神的情况下，可以对其进行各种修改。

技术特征：

1.一种病毒载体，其包含性载物部分，其中所述性载物部分包含编码能够抑制hiv感染的至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列，和调节所述核苷酸序列表达的t细胞应答性启动子。2.根据权利要求1所述的病毒载体，其中，所述至少一种可溶性外源因子包括抗hiv抗体。3.根据权利要求2所述的病毒载体，其中所述抗hiv抗体为vrc01抗体或3bnc117抗体。4.根据权利要求1所述的病毒载体，其中所述至少一种可溶性外源因子包括可溶性cd4蛋白或其片段。5.根据权利要求4所述的病毒载体，其中所述可溶性cd4或其片段包含二聚体可溶性cd4。6.根据权利要求5所述的病毒载体，其中所述二聚体可溶性cd4包含与seq id no:9、seq id no:76或seq id no:77具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％序列相同性的序列。7.根据权利要求6所述的病毒载体，其中所述二聚体可溶性cd4包含seq id no:9、seq id no:76或seq id no:77。8.根据权利要求1所述的病毒载体，其中所述t细胞应答性启动子包括cmv启动子、ifn-α启动子、ifn-β启动子、ifn-γ启动子、ef-1α启动子、il-2启动子、cd69启动子，或其片段。9.根据权利要求8所述的病毒载体，其中，所述t细胞应答性启动子包含il-2启动子。10.根据权利要求1所述的病毒载体，其中所述性载物部分还包含分泌信号，所述分泌信号操作性地连接至编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列。11.根据权利要求10所述的病毒载体，其中，所述分泌信号包括抗体分泌信号或il-2分泌信号。12.根据权利要求1所述的病毒载体，其中，所述核苷酸序列包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％的序列相同性的序列。13.根据权利要求1所述的病毒载体，其中，所述核苷酸序列包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:78、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85，或seq id no:87。14.根据权利要求1所述的病毒载体，其中所述性载物部分还包含至少一种小rna，该小rna靶向vif、tat和ccr5中的任何一种或多种。15.根据权利要求14所述的病毒载体，其中所述至少一种小rna包含与seq id no:62、seq id no:63或seq id no:64具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％序列相同性的序列。16.根据权利要求15所述的病毒载体，其中，所述至少一种小rna序列包含seq id no:62,seq id no:63或seq id no:64。17.根据权利要求14所述的病毒载体，其中所述至少一种可溶性外源因子包含可溶性
cd4或其片段。18.根据权利要求17所述的病毒载体，其中所述可溶性cd4或其片段包含二聚体可溶性cd4。19.根据权利要求14所述的病毒载体，其中所述t细胞应答性启动子包括cmv启动子、ifn-α启动子、ifn-β启动子、ifn-γ启动子、ef-1α启动子、il-2启动子、cd69启动子，或其片段。20.根据权利要求14所述的病毒载体，其中所述性载物部分还包含分泌信号，所述分泌信号操作性地连接至编码至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列。21.根据权利要求14所述的病毒载体，其中所述至少一种小rna包含与seq id no:65具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％序列相同性的序列。22.根据权利要求21所述的病毒载体，其中所述至少一种小rna包含seq id no:65。23.一种由包装细胞产生并能够感染靶细胞的慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒包含：能感染所述靶细胞的包膜蛋白；和权利要求1所述的病毒载体。24.一种修饰细胞，其包含感染了慢病毒颗粒的淋巴细胞，其中所述慢病毒颗粒包含：能感染所述淋巴细胞的包膜蛋白；和权利要求1所述的病毒载体。25.根据权利要求24所述的修饰细胞，其中所述淋巴细胞包括t细胞、b细胞、nkt细胞或nk细胞。26.根据权利要求25所述的修饰细胞，其中所述淋巴细胞是t细胞，其中所述t细胞包括cd4 t细胞、cd8 t细胞或γδt细胞。27.如权利要求26所述的修饰细胞，其中所述t细胞是cd4 t细胞。28.一种病毒递送系统，包括：至少一种辅助质粒，其包含用于表达源自gag、pol和rev中的每一个基因的功能蛋白的核苷酸序列；包膜质粒，其包含用于表达能够感染靶细胞的包膜蛋白的dna序列；和权利要求1所述的病毒载体。29.根据权利要求28所述的病毒递送系统，其中所述至少一种辅助质粒包括第一和第二辅助质粒，其中所述第一辅助质粒编码用于表达源自gag和pol基因的功能蛋白的核苷酸序列，并且第二辅助质粒编码用于表达源自rev基因的蛋白质的核苷酸序列30.一种hiv的方法，所述方法包括：将自对象分离的外周血单核细胞(pbmc)与有效量的刺激剂接触，其中所述接触离体进行；用慢病毒颗粒离体转导pbmc，其中慢病毒颗粒包含：能够感染pbmc的包膜蛋白；和权利要求1所述病毒载体；并将转导的pbmc培养至少1天。31.根据权利要求30所述的方法，其还包括将所述转导的pbmc输注到所述对象中。32.如权利要求30所述的方法，其中，所述刺激剂包括gag肽或hiv疫苗。

技术总结

本公开一般涉及用于或抑制HIV的免疫和免疫疗法。在实施方式中，公开了一种病毒载体，该病毒载体包括性载物部分，其中包括编码能够抑制HIV感染的至少一种可溶性外源因子的核苷酸序列，以及调节该核苷酸序列表达的T细胞应答性启动子。T细胞应答性启动子。T细胞应答性启动子。

技术研发人员：

李海山 T

受保护的技术使用者：

美国基因技术国际有限公司

技术研发日：

2021.03.03

技术公布日：

2022/12/30