OLB-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用的制作方法

olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。

背景技术：

2.杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy，dmd)是一种x连锁遗传性神经肌肉疾病，女性多为致病基因携带者，几乎只发生在男性身上，影响全球多达1/3600的活产男婴，已成为威胁全球儿童的最常见的罕见儿科疾病之一。dmd基因突变会导致肌营养不良蛋白表达的缺失，致使dmd患者出现严重的肌肉萎缩，心肌衰竭和，并且大部分患者30岁前就会死亡。
3.由于罕见病药物的研发难度高、成本大、受众少，极少医药企业愿意投入研究，因此，罕见病患者一出生便面临“病无所医”、“医无所药”的窘境。长久以来，国内外均无针对dmd的有效临床干预措施或药物。美国fda通过加快审批方式(仅进行12例临床试验)批准了新药eoxndys 51(eteplirsen)注射液，然而尚无足够的证据证明eteplirsen注射液对dmd的效果。
4.olb-01为4-羟基苯乙基((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)碳酸酯，检索未发现olb-01dmd的报道。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。
8.优选的，所述olb-01盐酸盐能够改善杜氏肌营养不良中的症状，所述症状包括骨骼肌肥大、行为功能障碍、肌肉无力、肌肉损伤、炎症、肌肉纤维化、胶原纤维化中的一种或多种。
9.优选的，所述olb-01的结构式如下：
[0010][0011]
优选的，所述药物包括olb-01盐酸盐以及药学上可接受的辅料。
[0012]
优选的，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、喷雾剂或乳膏剂。
[0013]
优选的，所述炎症包括腓肠肌炎症。
[0014]
优选的，所述行为功能包括运动、步态和四肢协调能力。
[0015]
优选的，所述药物中的olb-01盐酸盐的含量为1～99％。
[0016]
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0017]
本发明首次公开了一种olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。本发明的olb-01盐酸盐可有效改善dmd小鼠骨骼肌肥大症状、减轻体重，还能显著改善dmd小鼠的运动功能、肌肉力量、肌肉损伤、步态和四肢协调能力，同时还能减轻dmd小鼠腓肠肌炎症、肌肉纤维化以及胶原纤维程度，从而有效杜氏肌营养不良。本发明为在临床上杜氏肌营养不良药物的选择提供理论基础，具有广阔的应用前景和医疗价值。
附图说明
[0018]
图1中a为不同处理组的体重对比图，b为不同处理组的心脏重量对比图；c为不同处理组的腓肠肌重量对比图；d为不同处理组的三头肌重量对比图；
[0019]
图2中a为不同处理组的抓力测试对比结果；b为不同处理组的爬杆测试对比结果；
[0020]
图3中a1为不同处理组的左前肢步幅距离对比结果；a2为不同处理组的右前肢步幅距离对比结果；a3为不同处理组的左后肢步幅距离对比结果；a4为不同处理组的右后肢步态对比结果；b1为不同处理组的左前肢摆动速度对比结果；b2为不同处理组的右前肢摆动速度对比结果；b3为不同处理组的左后肢摆动速度对比结果；b4为不同处理组的右后肢摆动速度对比结果；c1为不同处理组的左前肢步行速度对比结果；c2为不同处理组的右前肢步行速度对比结果；c3为不同处理组的左后肢步行速度对比结果；c4为不同处理组的右后肢步行速度对比结果；
[0021]
图4为不同处理组的小鼠血清ck活性对比结果；
[0022]
图5为不同处理组对小鼠腓肠肌炎症影响对比结果；
[0023]
图6为不同处理组对小鼠腓肠肌炎症所致核沉积区域的对比结果；
[0024]
图7为不同处理组对dmd小鼠肌肉纤维化病变影响的对比结果；
[0025]
图8为不同处理组对dmd小鼠肌肉纤维化程度的对比结果；
[0026]
图9为不同处理组对dmd小鼠胶原纤维影响的对比结果；
[0027]
图10为不同处理组对dmd小鼠胶原纤维化程度的对比结果；
[0028]
图11为olb-01的结构式。
具体实施方式
[0029]
本发明提供了一种olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。
[0030]
在本发明中，所述olb-01为4-羟基苯乙基((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)碳酸酯，分子式为c
17h20
n2o4，分子量为316.36，结构式如下所示：
[0031][0032]
在本发明中，所述olb-01盐酸盐能够改善杜氏肌营养不良的症状，所述症状优选的包括骨骼肌肥大、行为功能障碍、肌肉无力、肌肉损伤、炎症、肌肉纤维化、胶原纤维化中的一种或多种。所述炎症是指大片炎症细胞浸润，优选的包括腓肠肌炎症。所述行为功能优
选的包括运动、步态和四肢协调能力。
[0033]
在本发明中，所述药物包括olb-01盐酸盐以及药学上可接受的辅料，所述药物中的olb-01盐酸盐的含量优选为1～99％。该药物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的药物与一种或多种辅料混合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形式。
[0034]
所述辅料包括粘合剂、润滑剂、矫味剂、填充剂、崩解剂等，所述粘合剂包括水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种。所述润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等中的一种或多种。所述矫味剂包括阿斯巴甜、蔗糖、单糖浆、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甜菊苷、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、酒石酸中的一种或多种。所述填充剂包括淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖中的一种或几种。所述崩解剂包括交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠的一种或多种。所述药物的剂型优选的包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、喷雾剂或乳膏剂。
[0035]
本发明的药物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等，优选口服。本发明的药物给药途径可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射等。
[0036]
本发明药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、目的，因此本发明的剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药物的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药物制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其有效量的要求，完成本发明的杜氏肌营养不良目的。本发明药物每天的用量为0.001～150mg/kg体重，优选为0.01～100mg/kg体重，更优选为0.01～60mg/kg体重。
[0037]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0038]
在本发明的实施例中，mdx小鼠是dmd基因缺陷，导致肌营养不良蛋白缺失的一种公认用于研究杜氏肌营养不良的模型鼠，本发明所用实验动物mdx型雄性小鼠为dmd基因移码突变的小鼠模型，品系为b10-dmd-ko，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
[0039]
实施例1
[0040]
(1)实验动物
[0041]
10周龄mdx型雄性小鼠(dmd基因移码突变的小鼠模型，品系b10-dmd-ko)，动物被安置在温度(20
±
2℃)和湿度(55
±
5％)稳定的12小时明暗循环室中，饮水自由。
[0042]
(2)实验方案
[0043]
将mdx型雄性小鼠随机分为正常对照组、模型组、olb-01盐酸盐组共3组，每组6只mdx型雄性小鼠，每日口服给药，连续56天。具体分组和给药剂量如表1所示：
[0044]
表1实验小鼠具体分组和给药剂量
[0045][0046]
(3)olb-01盐酸盐对dmd小鼠骨骼肌肥大症状及体重的影响
[0047]
实验方法：各组小鼠实验开始后每周一上午给药前称量一次体重，给药8周结束后，取材时对心脏、左右腓肠肌、左右肱三头肌进行称重。
[0048]
由图1结果表明，mdx小鼠比正常野生型小鼠重，经过给药可以一定程度的减轻mdx小鼠体重，olb-01盐酸盐可以显著降低mdx小鼠的骨骼肌肥大病变，表明olb-01盐酸盐可改善dmd小鼠骨骼肌肥大症状及减轻体重。数据表示为平均值
±
sem。*wt与mdx组相比，#mdx与给药组相比，#,p《0.05，##,p《0.01，###,p《0.001，####,p《0.0001。每组n＝6。
[0049]
(4)olb-01盐酸盐对dmd小鼠行为学的影响
[0050]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组运动功能。
[0051]
抓力测试方法：通过测定小鼠四肢抓力直接评估小鼠四肢肌肉的力量。将小鼠轻置于握力板中央台上，轻轻拉动小鼠尾部，促使小鼠抓住握力板，待其用力抓住握力板时及时加力后拉，致使小松爪，此时日记录到小盘的最大抓力。正式实验开始后，每目测试一次，每次重复测试三谝，取三次结果中的最大数值作为评估值。
[0052]
爬杆测试方法：使用爬杆测试来评估小鼠四肢的运动及协调能力。自制长约50cm，直径约1cm的长杆，杆上缠有纱布以增加摩擦力。木杆竖直立置于水平桌面上，将小鼠头朝下轻轻置干杆顶，小鼠在不受外力的驱动下自主向下爬行，记录小鼠从枉顶爬到底部平台的时间(爬杆时间)。给药前连续训练3天，每天3次，剔除不合格小鼠。正式实验开始后，每月测试一次，测试结果以15秒为分界值，超过15秒按15秒记录。该实验过程每次重复测试三遍，并计算每只小鼠三次结果的平均爬杆时间值作为评估值。
[0053]
由图2结果表明，mdx小鼠运动能力下降，olb-01盐酸盐可以减少mdx小鼠爬杆时间，前肢握力测试结果表明药物可以显著提升小鼠的抓力水平。数据表示为平均值
±
sem。*wt与mdx组相比，#mdx与给药组相比，#,p《0.05，##,p《0.01，###,p《0.001，####,p《0.0001。每组n＝6。
[0054]
(5)olb-01盐酸盐对dmd小鼠步态的影响
[0055]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组小鼠步态。
[0056]
步态检测方法：小鼠在肌肉损伤的情况下，步态会发生细微的改变。通过采用步行追踪分析系统，以获取小鼠的自然步态，并进行步态检测和分析。该系统采用德国the imaging source高速千兆网口相机(150帧/秒)、sony ccd感光原理，对小鼠进行实时跟踪，采用国际先进的边缘测量、图像降噪、二值化算法等技术，能够全方位智能地识别小鼠身体大小、头部、尾部、四肢等部位，并自动对足印进行分类，以实现对小鼠各个足印面积、步幅、
步行周期、运动速度、支撑时长、摆动速度、摆动时长、足印平均强度等指标的精准测量。使用仪器前，调节步行台走道宽度，使宽度正好适配小鼠体型，避免走道过宽或过窄，并设置好标尺。并对相机进行设置，适当调节增益值和白平衡值，使得录制和拍摄效果最佳。步态测试全程在安静、黑暗环境下进行。正式测试前，对小鼠进行步行训练，让小鼠重复多次走过50cm长的玻璃走道，熟悉环境。正式测试时，将小鼠从走道入口放入，小鼠会沿着玻璃走道行走，由高速千兆网口相机采集步行数据，并通过系统软件walkanalysator进行筛选和自行分析。如果小鼠在行走过程中因为害怕或者嗅探出现停顿或折返现象，需重新进行测量。如若自动分析足印判错，可采用手动分析对足印进行校准。分析完成后则可查看足印数据统计、图表分析，并导出数据。
[0057]
由图3结果表明，模型组小鼠相较干正常野生型小鼠，四肢运动能力有一定程度损伤，olb-01盐酸盐给药组可以提升mdx小鼠的四肢协调能力。数据表示为平均值
±
sem。*wt与mdx组相比，#mdx与给药组相比，#,p《0.05，##,p《0.01，###,p《0.001，####,p《0.0001。每组n＝6。
[0058]
(6)olb-01盐酸盐对dmd小鼠肌肉损伤的影响
[0059]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组小鼠血清中ck活性。
[0060]
ck检测方法：在各组小鼠安乐死之前从下腔静脉收集血液。将血液样品在4℃下以1500g离心10分钟，然后使用hitachi7080自动临床分析仪测量血清ck活性水平。
[0061]
由图4结果表明，肌酸激酶主要存在于骨骼肌、脑和心肌中，与正常野生型小鼠比较，模型组小鼠肌酸激酶明显升高，小鼠肌肉可能出现严重的损伤，olb-01盐酸盐给药后可以改善mdx小鼠的肌肉损伤程度。数据表示为平均值
±
sem。*wt与mdx组相比，#mdx与给药组相比，#,p《0.05，##,p《0.01，###,p《0.001，####,p《0.0001。每组n＝6。
[0062]
(7)olb-01盐酸盐对dmd小鼠腓肠肌炎症的影响
[0063]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组小鼠腓肠肌炎症病变。
[0064]
he染方法：取各组小鼠双侧腓肠肌进行切片，切片厚度为5μm，然后进行h&e染。h&e染流程如下：烘片30min，二甲苯脱蜡两次，分别15min，100％乙醇，95％乙醇，75％乙醇，30％乙醇，温水梯度水化，分别2min，苏木素染核6min，自来水返蓝6min，伊红染3min，增液冲洗后晾干。中性树脂封片。染后，使用10倍物镜倒置显微镜上获取组织学图像。每个图像选取两个等大区域通过image j手动圈出该区域中炎症所致核沉积，软件自动识别该肌肉炎症程度。
[0065]
由图5结果表明，与正常野生型小鼠比较，模型组小鼠腓肠肌切片出现大片炎症细胞浸润，olb-01盐酸盐各给药组可以显著减轻小鼠腓肠肌炎症病变。
[0066]
由图6结果表明，与正常野生型小鼠比较，模型组小鼠腓肠肌炎症所致的核沉积区域显著增大，olb-01盐酸盐各给药组可以显著减少腓肠肌炎症所致的核沉积区域。
[0067]
(8)olb-01盐酸盐对dmd小鼠肌肉纤维化病变的影响
[0068]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组小鼠肌肉纤维化病变。
[0069]
fibronectin免疫组化：取小鼠双侧腓肠肌进行切片，切片厚度为5μm，然后进行免
疫组化染。fibronectin免疫组化染流程如下：切片常规脱蜡复水，将切片浸泡在抗原修复液(1x)中，使用微波炉中火加热10分钟，pbs(ph7.4)浸洗3次，每次3min；用过氧化氢封闭液孵育15min；摇床上用pbs洗10min，3次；用蛋白酶封闭液或3％bsa(含0.3％的triyon-100)孵育1h；室温下直接用相应稀释好的一抗工作液孵育1h，然后转移到4℃冰箱中过夜；取出过夜的切片室温平衡1h，再在摇床上用pbs洗10min，4次；取适量二抗工作液孵育1h；摇床上用pbs洗5min，3次；把处理好的片子放在dab工作液中染1～10min；pbs洗两遍；依次行75％、85％、95％、100％乙醇脱水，每次3min；二甲苯透明2次，每次5min；用中性树脂封片。染后，使用10倍物镜倒置显微镜上获取组织学图像。每个图像选取两个等大区域通过image j手动圈出该区域中纤维蛋白染区域，评估纤维化程度。
[0070]
由图7和图8结果表明，野生型小鼠纤维蛋白极少，mdx小鼠可见大量纤维蛋白沉积，表示模型组小鼠出现严重的纤维化病变，olb-01盐酸盐给药后可以明显减轻mdx小鼠肌肉纤维化病变。
[0071]
(9)olb-01盐酸盐对dmd小鼠胶原纤维的影响
[0072]
mdx鼠10周龄时，按照步骤(2)所述的实验方案开始给药，共计给药8周，然后检测各组小鼠膈肌胶原纤维。
[0073]
masson染方法：取小鼠膈肌进行切片，切片厚度为5μm，然后进行masson染。masson染流程如下：切片常规脱蜡复水，用苏木素染5～10min。然后用酸性乙醇分化液分化，蒸馏水浸泡1min返蓝。再用丽春红品红染液染10min。用弱酸工作液洗1min；磷钼酸溶液洗2min；弱酸工作液洗1min。然后在苯胺蓝染液中染2min。用配制好的弱酸工作液洗1min。最后95％乙醇脱水10s，无水乙醇脱水3次，每次10s；二甲苯透明3次，每次2min。中性树胶封固。染后，使用10倍物镜在数字扫描显微镜成像系统(m8，precipoint，德国)上获取组织学图像。通过mipar图像分析软件直接识别红蓝区域面积，并计算蓝区域占整个组织区域的百分比，该百分比反映了纤维化程度。
[0074]
由图9和图10结果表明，相较于正常野生型小鼠，模型组小鼠可见大片胶原纤维沉积，olb-01盐酸盐给药后可以显著减少mdx小鼠胶原纤维。
[0075]
综上所述，本发明olb-01盐酸盐可有效改善dmd小鼠骨骼肌肥大症状、减轻体重，还能显著改善dmd小鼠的运动功能、肌肉力量、肌肉损伤、步态和四肢协调能力，同时还能减轻dmd小鼠腓肠肌炎症、肌肉纤维化以及胶原纤维程度，从而有效杜氏肌营养不良。
[0076]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.olb-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述olb-01盐酸盐能够改善杜氏肌营养不良中的症状，所述症状包括骨骼肌肥大、行为功能障碍、肌肉无力、肌肉损伤、炎症、肌肉纤维化、胶原纤维化中的一种或多种。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述olb-01的结构式如下：4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物包括olb-01盐酸盐以及药学上可接受的辅料。5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、喷雾剂或乳膏剂。6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述炎症包括腓肠肌炎症。7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述行为功能包括运动、步态和四肢协调能力。8.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物中olb-01盐酸盐的含量为1～99％。

技术总结

本发明公开了一种OLB-01盐酸盐在制备杜氏肌营养不良药物中的应用，属于医药技术领域，本发明的OLB-01盐酸盐可有效改善DMD小鼠骨骼肌肥大症状、减轻体重，还能显著改善DMD小鼠的运动功能、肌肉力量、肌肉损伤、步态和四肢协调能力，同时还能减轻DMD小鼠腓肠肌炎症、肌肉纤维化以及胶原纤维程度，从而有效杜氏肌营养不良。本发明为在临床上杜氏肌营养不良药物的选择提供理论基础，具有广阔的应用前景和医疗价值。用前景和医疗价值。用前景和医疗价值。