小肽或蛋白质对TREML1/MD2相互作用的选择性靶向及其用于疫苗佐剂的用途的制作方法

receptor 4contributes to drug reinforcement,”j.neuorosci.,2012,32(33):11187-11200)。根据本发明的一些实施例，药物组合物可还包括抗原而作为疫苗，其中，treml1 ecd或茎多肽充当佐剂或免疫增强剂。抗原可以是癌症的标志物。癌症可以是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、肝癌、头颈癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、胃腺癌(gastric carcinoma)、宫颈癌(cervical cancer)、食道肿瘤(esophageal carcinoma)、膀胱癌、肾癌、脑癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、直肠癌、肛门区域癌、胃癌(stomach cancer)、睪丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈肿瘤(carcinoma of the cervix)、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌(esophagus cancer)、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴球性白血病)、儿童实体瘤、淋巴球性淋巴瘤、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、髓母细胞瘤毛母质瘤(medulloblastoma pilomatrixomas)、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤或t细胞淋巴瘤。
7.本发明的一个方面涉及用于增强免疫反应的方法。根据本发明的一个实施例的方法包括：将任一种上述药物组合物施用于给有需要的受试者。
8.利用以下描述及附图，本发明的其他方面将显而易见。
附图说明
9.图1示出了treml1的示意图，其示意性示出了细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域及细胞质结构域。ecd跨越treml1的残基16至残基162，且跨膜结构域跨越treml1的残基163至残基183。ecd包括单个igv结构域(残基16至残基121)及茎区域(残基122至残基162)。细胞质结构域(跨越treml1的残基184至残基313)包括免疫受体酪氨酸抑制基序(itim；残基279-284)。
10.图2示出了treml1 ecd与各种候选蛋白质结合的结果。结果显示，在固相结合试验中，重组treml1 ecd可结合至固定化的md2及tlr4。
11.图3a和图3b示出了md2与各种蛋白质结合的结果。结果显示，在固相结合试验中，人和小鼠md2蛋白质可分别结合至固定化的treml1茎及mtreml1茎。
12.图4示出了各种抗体与treml1 ecd竞争结合到表达md2和cd14的thp1/xblue/md2/cd14的结果。thp1为源自自然表达许多样式辨识受体(包括toll样受体)的人单核细胞。md2和cd14二者均为tlr4的共同受体且介导lps诱导的反应。结果显示，抗md2抗体(18h10)和抗tlr4抗体(hta125)能够与treml1 ecd竞争结合到thp1/xblue/md2/cd14单核细胞。
13.图5a和图5b示出了treml1 ecd可诱导thp1/xblue/md2/cd14单核细胞活化。图5a示出了在thp1/xblue/md2/cd14活化后treml1 ecd诱导的nf-κb分泌，并且图5b示出了在thp1/xblue/md2/cd14活化后treml1 ecd诱导的tnf-α分泌。
14.图6示出了抗md2抗体(18h10)及抗tlr4抗体(hta125)处理降低treml1 ecd诱导的thp1/xblue/md2/cd14单核细胞活化，如由降低的tnf-α分泌所证实。
15.图7a和图7b示出了treml1 ecd可增强细胞内tlr(即，tlr7、tlr8及tlr9)诱导的细胞活化。
16.图8示出了mtreml1 ecd和mtreml1茎肽可诱发树突细胞成熟。
17.图9a示出了用于在动物模型中测试treml1茎作为癌症疫苗佐剂的效应的时间表。图9b示出了mtreml1茎作为佐剂增强癌症疫苗的有效性。
具体实施方式
18.本发明实施例是关于用作免疫增强剂或tlr激动剂的源自treml1的treml1 ecd或茎肽。本发明的发明者意外地发现，treml1ecd或其茎可结合至可与细胞表面上的toll样受体4(tlr4)相关联的md2。md2与tlr4相互作用以对各种刺激物(例如内毒素脂多醣(lps))给予反应。tlr4活化导致细胞内信号传导，此增加负责活化先天性免疫反应的nf-kb及炎症细胞因子(例如tnf-α)产生。另外，treml1 ecd或其茎亦发现与tlr2、tlr7、tlr8或tlr9相互作用。treml1 ecd或其茎与tlr2/7/8/9之间的相互作用导致树突细胞(dc)活化及成熟，此进一步增强免疫反应。
19.trem样转录本-1(treml1)是trem家族的成员。如图1所示，treml1是单跨膜蛋白，其由细胞外结构域(ecd，残基16至162)、跨膜结构域(tmd，残基163至183)和细胞质结构域(残基184至311)组成，其中，细胞质结构域包括免疫酪氨酸抑制基序(itim，残基279至284)。treml1的ecd包括单一v-set免疫球蛋白(ig)结构域(残基16至121)及茎区域(残基122-162)。
20.为识别treml1 ecd的潜在结合配偶体，使用固相结合试验来评估treml1 ecd与候选蛋白质之间的相互作用。简言之，将各种候选蛋白质及bsa(作为阴性对照)涂布于96孔板上并将各种浓度的treml1ecd添加至孔。在结合及洗涤之后，将与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗treml1抗体添加至各孔。在洗涤之后，添加hrp底物，即，tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。在反应之后，测量在450nm的吸光度以评估treml1结合。一组例示性结果如图2所示，其中，重组treml1 ecd以浓度依赖性方式结合md2和tlr4。与此相比，treml1 ecd不与cd14或bsa结合。
21.此外，md2(ly96)以浓度依赖性方式与treml1茎结合。与此相比，tlr4及cd14不结合treml1茎(图3a及3b)。如同md2，cd14也用作共同受体(连同toll样受体tlr 4)用于检测细菌脂多醣(lps)。这些结果指示treml1茎直接与cd14/md2/tlr4受体复合物中的md2结合。
22.除固相结合试验以外，进一步使用表达md2和cd14的thp1/xblue/md2/cd14细胞(invivogen,san diego,usa)评估treml1ecd结合。这些细胞(invivogen,san diego,usa)源自人单核细胞thp1细胞株并表达nf-κb-及ap-1-可诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)报告基因。
23.如图4中所示，treml1 ecd可结合至thp1/xblue/md2/cd14细胞。结合测试亦使用抗md2抗体(18h10)及抗tlr4抗体(hta125)以与treml1竞争结合至thp1/xblue/md2/cd14细胞来确认。结合竞争的结果如图4所示。抗md2抗体及抗tlr4抗体能够与treml1竞争结合至thp1/xblue/md2/cd14细胞，且抗md2与抗tlr4抗体的组合产生相加作用。
24.通过treml1 ecd结合至由thp1/xblue/md2/cd14细胞表达的tlr4/md2表明treml1 ecd应能够活化单核细胞。实际上，如图5a和图5b所示，treml1 ecd诱导thp1/xblue/md2/cd14单核细胞活化，如由nf-κb(图5a)及tnf-α(图5b)分泌的诱导活化所证实。
25.thp1/xblue/md2/cd14单核细胞通过treml1活化系由md2及tlr4诱导，如由抗md2
抗体(18h10)及抗tlr4抗体(hta125)抑制treml1诱导的tnf-α分泌的能力所证实。图6示出了treml1诱导的tnf-α分泌由抗md2抗体(18h10)、抗tlr4抗体(hta125)或其组合特异性地抑制，而对照igg(mopc137及/或mpc-11)不具有此效果。
26.tlr家族在病原体辨识及先天性免疫活化中起重要作用。其辨识在感染物上表现的病原体相关分子样式(pamp)，且介导有效免疫性发展所需的细胞因子的产生。各种tlr展现不同表现样式且可介导不同功能。
27.除借助tlr4发挥功能以外，还发现treml1 ecd可增强细胞内tlr(即，tlr7、tlr8及tlr9)诱导的细胞活化。举例而言，图7a示出了r848的激动剂(tlr7和tlr8激动剂)可诱导tnf-α分泌。由tlr7/8介导的r848诱导的tnf-α分泌在treml1 ecd的存在下增强。对于tlr9观察到类似结果。如图7b所示，odn 2395(tlr9激动剂)诱导的tnf-α分泌在treml1 ecd的存在下以剂量依赖性方式增强。这些结果指示，treml1 ecd或茎肽可用作tlr受体的激动剂。作为这些受体的激动剂，treml1 ecd或茎肽可增强先天性免疫反应。
28.树突细胞(dc)调节获得性免疫的能力由其成熟状态及寿命控制。tnf是熟知的用于dc的成熟及存活因子。申请人发现，treml1是用于dc成熟的甚至更强效因子。如图8所示，小鼠treml1(mtreml1)ecd及mtreml1茎肽可诱发树突细胞成熟，如由增加的dc成熟标志物cd40、cd86、cd80及mhc ii的含量所证实。treml1 ecd或其茎肽的作用显着强于tnf-α的作用。这些结果指示，除增强先天性免疫反应以外，treml1 ecd或茎肽亦可增强获得性免疫反应。
29.以上结果共同指示treml1 ecd或treml1茎可与md2/tlr4相互作用，增强tlr7、tlr8及tlr9活化，以及触发dc成熟。tlr是先天性及获得性免疫反应二者的关键调节剂。(hayden ms,west ap,ghosh s(october 2006)."nf-κb and the immune response".oncogene.25(51):6758
–
80)。treml1 ecd(或其茎)与md2/tlr4或tlr7/8/9之间的相互作用导致nf-κb及tnf-α分泌的活化。
30.tnf-α的主要作用为调节免疫细胞。nf-κb是调节负责先天性及获得性免疫反应的基因的主要转录因子。t细胞或b细胞受体活化后，nf-κb被不同信号传导组分活化。借助一系列磷酸化事件，激酶复合物被活化且nf-κb进入细胞核，从而上调参与t细胞发育、成熟及增殖的基因。因此，treml1 ecd或茎与md2/tlr4之间的相互作用可增强先天性及获得性免疫反应二者。就此而言，某些tlr4激动剂已被用作免疫调节剂或疫苗佐剂。例如，mpl(单磷酰脂质a，即，脂多醣的去毒性形式)用于市售疫苗调配物中。
31.此外，treml1 ecd或茎与md2/tlr4之间的相互作用导致tlr7/8/9诱导的细胞活化增强。这些效应共同增强树突细胞(dc)的活化及成熟。通过tlr4/md2系统和tlr7/8/9系统二者工作的能力表明，treml1 ecd或其茎可称为强效的免疫增强剂。基于这些新颖的发现，本发明的实施例涉及使用treml1 ecd或其茎用于增强免疫反应的试剂及方法。因此，treml1 ecd或其茎可用于疫苗中以类似于佐剂的方式增强免疫反应。作为佐剂或免疫增强剂，treml1 ecd或其茎肽能够在存在或不存在另一佐剂或另一tlr受体激动剂的情况下与抗原一起使用。
32.为测试treml1 ecd或其茎作为疫苗佐剂或免疫增强剂，申请人使用ct26结肠癌动物模型。图9a示出了用于此研究的试验方案。简言之，在第0天将ct26结肠癌细胞(3x105个细胞)皮下注射于balb/c小鼠中。当肿瘤在第6天生长至30至100mm3时，皮下注射肿瘤疫苗
(肿瘤抗原5e-gp70-15/铝混合物，具有或不具有小鼠treml1茎；每次100μl/每只小鼠)。在第13天重复接种疫苗。每3至4天测量肿瘤体积。gp70是内源性亲嗜性鼠类白血病病毒，其与人肿瘤相关抗原相当。包括gp70基因的dna疫苗已用于诱导针对ct26细胞的保护性免疫。(参见.takeda et al.,“anti-tumor immunity against ct26 colon tumor in mice immunized with plasmid dna encoding beta-galactosidase fused to an envelope protein of endogenous retrovirus,”cell immunol.,(2000),204(1):11-18)。
33.如图9b所示，用肿瘤抗原5e-gp70-15/铝混合物与对照组(单独用铝)相比仅略微减小了肿瘤体积，而肿瘤抗原5e-gp70-15/铝混合物与mtreml1茎的组合导致肿瘤体积的显着减少。这些结果表面，treml1茎可通过增强免疫反应实质上增强疫苗有效性。treml1 ecd或茎的意外强免疫反应增强可能是由于对先天性及获得性免疫系统的组合效应(即，treml1 ecd或茎诱导抗原呈递细胞(apc)的成熟)以及treml1 ecd或茎与tlr4/md2及/或tlr7/8/9的相互作用，如上所述。
34.根据本发明的实施例，treml1 ecd或茎肽可单独用作tlr激动剂以增强先天性免疫反应。另外，在存在或不存在另一佐剂(例如明矾)或另一tlr激动剂(例如单磷酰脂质a)的情况下，treml1 ecd或茎肽可在疫苗接种或免疫疗法中作为佐剂或免疫增强剂与抗原一同使用。这些treml1 ecd或茎肽可在免疫疗法中用于癌症，由于其类似于佐剂的作用机制而不受限于任何特定肿瘤或疫苗。然而，treml1 ecd或茎肽被预计相比于常规的佐剂更加有效，因为其可以起到tlr激动剂的作用并且可以增强先天性及获得性免疫反应。出于这些原因，treml1 ecd或茎肽作为一般免疫增强剂可用于所有类型的疫苗接种或免疫疗法中，包括肿瘤免疫疗法。可使用treml1 ecd或茎肽的肿瘤及疫苗的示例包括，但不限于：结肠直肠肿瘤(gp70-15疫苗、癌胚抗原(cea)疫苗、muc-1疫苗、β人绒毛膜激性腺素(β-hcg)疫苗、鸟苷酸环化酶c(gucy2c)疫苗、表皮生长因子受体(egfr)疫苗、上皮细胞黏附分子(epcam)疫苗)、乳腺癌(muc-1疫苗、存活疫苗(surviving vaccine)、端粒酶疫苗及上皮肿瘤抗原疫苗)、肝细胞癌(α胎蛋白疫苗)、卵巢癌(ca-125)、恶性黑素瘤(酪氨酸酶疫苗及黑素瘤相关抗原疫苗)、病毒诱导的肿瘤(hpv 16以及18型e6/e7、hbv、hcv、ebv疫苗)及各种肿瘤(ras疫苗、p53疫苗、β-连环蛋白疫苗、cdk4基因bcr-abl蛋白质疫苗、个人化基因疫苗及个人化新抗原疫苗)。
35.用于本发明的实施例的treml1 ecd或茎肽可源自人treml1、小鼠treml1或其他动物treml1。用于本发明实施例的treml1蛋白质或肽的一些示例显示于表i中。表i：用于本发明的肽
36.本发明实施例将利用以下特定的示例进一步说明。本领域技术人员能够理解，这些示例仅用于说明，而在不背离本发明范围的情况下其他修改及变化是可能的。材料及方法重组treml1 ecd及treml1茎多肽的生成
37.用于本发明实施例的蛋白质和肽可利用本领域已知的重组技术或化学合成产生。举例而言，为生成重组treml1 ecd，在n末端具有多组氨酸标签的编码人或小鼠treml1 ecd(seq id no：1和seq id no：2)的pet30-treml1使用大肠杆菌(e.coli)表达，并使用ni-nta柱(novagen)纯化。重组蛋白的纯度使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测定且使用考马斯蓝(coomassie blue)染以可视化，重组蛋白的纯度为》95％。使用lal分析(qcl-1000；charles river laboratories,wilmington,massachusetts,usa)检查纯化的蛋白质的内毒素污染。所有蛋白质均是无菌的，且内毒素浓度低于检测限值(《0.1eu/μg蛋白质)。treml1茎多肽由kelowna international scientific inc.(taipei,taiwan)化学合成。固相结合试验
38.为研究蛋白质-蛋白质相互作用，将重组tlr4(5ug/ml于pbs中)、md2(5ug/ml于pbs中)、cd14(5ug/ml于pbs中)及bsa(阴性对照)蛋白质分别接种于96孔板上并在4摄氏度培养过夜。在室温下，添加阻断缓冲液(2％bsa于pbs中)以避免非特异性结合经过2小时。添加连续稀释的treml1 ecd(2.5ug/ml至156ng/ml，2倍稀释)溶液并在室温下培养2小时。然后，添加抗treml1抗体(1ug/ml于pbs中)经过1小时。接着，将具有hrp标记的二级抗体抗大鼠igg-hrp添加至板中并在室温下培养30分钟。在每步骤之间用0.05％tween20的pbs缓冲液(pbst)洗板3次。最后，添加tmb底物并培养10至15min以检测hrp标记的抗体。此后，添加1n hcl的终止溶液以终止反应。利用酶标仪测量在od450/540nm处的吸光度。
39.针对treml1或mtreml1茎与人或小鼠md2蛋白质的结合，将treml1茎或mtreml1茎(5ug/ml于pbs中)分别涂布于96孔板上。将重组htlr4、hmd2、hcd14或mmd2各自连续稀释并添加至板中。使用抗his标签抗体-hrp作为检测抗体以检测蛋白质结合。人白血球的制备
40.通过静脉穿刺抽血将来自健康志愿捐赠者的人外周血样品收集于acd真空采血管中。人外周血单核细胞(pbmc)是使用ficoll-paque plus(ge17-1440-03)根据制造商的说明书自全血分离。
41.将人外周血单核细胞(pbmc)在存在或不存在htreml1(10ug/ml、5ug/ml及1ug/ml)的条件下预处理并在37℃以及5％co2培养30min。处理后，将细胞用tlr激动剂(包括r848(invivogen#tlrl-r848)及odn2395(invivogen#tlrl-2395))刺激，并在37℃以及5％co2培养18小时。收集细胞培养基的上清液用于tnf-α测量。thp1/xblue/md2/cd14细胞株
42.thp1/xblue/md2/cd14细胞株是源自人单核细胞thp1细胞株并且购自invivogen。将细胞在包括10％热灭活fbs及抗生素的rpmi1640中在37℃以及5％co2培养。活体外测定
43.为研究抗tlr4抗体(hta125,biolegend#312814)及抗md2抗体(18h10,thermofisher#ma5-33351)对treml1 ecd结合至thp1/xblue/md2/cd14细胞的效应，将细胞用抗md2抗体、抗tlr4抗体、igg对照或组合在37℃以及5％co2预处理15min。抗体处理后，将细胞用treml1 ecd(10ug/ml)处理并培养1小时。将细胞用含1％fbs的pbs洗涤并用af647-抗人treml1抗体染，随后进行流式细胞分析。thp1/xblue/md2/cd14细胞中的nf-κb活化
44.为研究的抗tlr4抗体及抗md2抗体对treml1 ecd触发的tlr反应的效应，将thp1/xblue/md2/cd14细胞用抗tlr4抗体、抗md2抗体或用于指示组的igg对照预处理并在37℃以及5％co2培养15分钟。预处理后，thp1/xblue/md2/cd14细胞通过treml1 ecd(10ug/ml)刺激并以1x106个细胞/ml(每孔200ul)的浓度接种于96孔板的孔并在37℃、5％co2培养18小时。为测定nf-κb活化，收集培养基上清液并利用quanti-blue
tm
试剂(invivogen)根据制造商说明书进行评估。细胞因子分析
45.收获细胞上清液及血浆样品并储存于-80℃。使用tnf-αduoset elisa套组(r&d#dy210)根据制造商说明书检测人tnfα浓度。使用3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺使信号显影并利用酶标仪检测450nm吸光度。
流式细胞分析
46.将细胞以2x106个细胞/ml的密度重新混悬于含1％fbs的pbs中并使用human fc block(bd biosciences#564220)在室温下阻断ab的非特异性结合经过10min。使用af647-抗人treml1(克隆268420)(r&d#fab2394r)抗体作为treml1与细胞表面结合的检测抗体。根据fixable viability stain 780(fvs780)(bd horizon#565388)染来排除死细胞。在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上实施结合分析并使用kazula软件分析所收集数据。小鼠骨髓源性树突细胞生成
47.自雌性c57bl/6小鼠收获股骨及胫骨并去除额外的肌肉组织。将骨用70％酒精消毒，然后用rpmi-1640培养基洗涤，并将两端切除以使用26g针筒用rpmi-1640培养基冲洗出骨髓。为分散细胞团块，将骨髓混悬液用移液管吸入排出若干次并通过离心用rpmi-1640培养基洗涤两次。r10培养基包括rpmi1640以及抗生素、10％无活性胎牛血清及2-巯基乙醇(50μm,sigma usa)。在第0天，细胞计数之后，将白血球在含200u/ml rmgm-csf的r10培养基中以2
×
106个细胞/10ml的浓度接种于10mm直径的无菌皮氏培养皿(petri dish)并在37℃以及5％co2的条件下培养。在第3天，再添加10ml含200u/ml rmgm-csf的r10培养基。在第6天，取出一半上清液并离心，以收集细胞团块，将细胞团块用10ml含200u/ml gm-csf的r10培养基重新混悬在初始板中。在第8天，通过用移液管轻柔地吹打收集非黏附细胞并在300g离心5min。为获得更纯净的树突细胞，利用anti-f4/80microbeads ultrapure(130-110-443,miltenyi biotec,bergisch gladbach,germany)根据制造商说明书去除巨噬细胞(f4/80
high
)。简言之，将细胞团块重新混悬并在macs缓冲液中与anti-f4/80microbeads ultrapure充分混合。将此混合物在黑暗中在4℃培养15min。细胞用macs缓冲液洗涤之后，将细胞重新混悬于macs缓冲液中，用30μm尼龙网过滤，并添加至macs缓冲液洗涤的管柱中以分离f4/80
+
细胞。收集未标记的细胞并用r10培养基洗涤。为冷冻细胞，对细胞团块进行计数并在每冷冻保藏小瓶中以2ml cellbanker2(#11891,zenoaq)中1
×
107个细胞的浓度重新混悬并储存于-80摄氏度。
48.将bmdc解冻用于dc成熟实验。将这些细胞以1x106个细胞/2ml于含200u/ml rmgm-csf的r10培养基中接种于6孔组织培养皿的孔中并在37℃以及5％co2培养以恢复细胞活力。6小时后，将bmdc用mtreml1蛋白质的不同片段处理并在37℃以及5％co2培养。第二天，收集重新混悬于的细胞并通过流式细胞术分析。
49.将细胞在包括1％fbs及0.1％叠氮化钠的pbs(pbsba)中以1800rpm离心3min，且然后在流动管以1
×
105个细胞/100ul pbsba的浓度分开。在dc的表面标志物染的前，将细胞用小鼠fc阻断剂在室温处理30min以避免抗体非特异性结合。将细胞在4℃与以下抗体一起培养30min：pe抗小鼠cd11c抗体(biolegend#117308)、brilliant violet 421
tm
抗小鼠i-a/i-e抗体(biolegend#107631)、bv786大鼠抗小鼠cd40(bd#140891)、alexa488抗小鼠cd86抗体(biolegend#105018)或pe/dazzle
tm
594抗小鼠cd80抗体(biolegend#104737)。pbsba洗涤之后，使用cytoflex流式细胞仪利用cytexpert软件分析样品。小鼠
50.所有基因野生型实验balb/c及c57bl/6小鼠均购自national laboratory animal center(taiwan)。所有动物实验的实验程序均符合当地机构动物照顾与使用委员会
(institutional animal care and use committee,iacuc)的规定。肿瘤研究
51.为建立同基因小鼠结肠癌模型，balb/c小鼠背部皮下注射3x105个ct26细胞/小鼠。当所接种肿瘤的体积达到30至100mm3时，将小鼠随机分成队列用于不同。根据所指示的时间表皮下施用于肿瘤抗原疫苗。在每一动物研究期间，利用测径器测量检测肿瘤尺寸，并使用以下方程式计算肿瘤体积：v＝π/6(长度)
×
(宽度)，其中，长度是肿瘤的最长直径，并且宽度是最短直径。若肿瘤负荷的大小超过3000mm3，则认为小鼠在存活研究中死亡并使用co2或颈椎脱位使其安乐死。
52.已使用有限数量的示例阐述本发明实施例。本领域技术人员能够理解，这些示例仅用于说明，而在不背离本发明范围的情况下，其他修改及变化均是可能的。因此，保护范围应仅由随附的权利要求书限制。

技术特征：

1.一种用于增强免疫反应的药物组合物，其包括trem样转录本-1(treml1)细胞外结构域(ecd)或者treml1茎多肽。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述treml1 ecd或treml1茎多肽源自人或小鼠treml1。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述treml1 ecd或treml1茎多肽具有seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括tlr激动剂。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述tlr激动剂为脂多醣、热休克蛋白、纤维蛋白原、硫酸乙酰肝素片段、透明质酸片段、cpg寡脱氧核苷酸、4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α,α-二甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇(r848)或阿片类药物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括抗原，并且所述药物组合物用作疫苗。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述抗原为癌症的标志物。8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述癌症为选自由以下组成的组：结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、肝癌、头颈癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、胃腺癌、宫颈癌、食道肿瘤、膀胱癌、肾癌、脑癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睪丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈肿瘤、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴球性白血病的慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴球性淋巴瘤、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、髓母细胞瘤毛母质瘤、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤或t细胞淋巴瘤。9.一种用于增强免疫反应的方法，包括：将根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物施用于有需要的受试者。

技术总结

用于增强免疫反应的药物组合物包括TREM样转录本-1(TREML1)细胞外结构域(ECD)或茎多肽。该TREML1ECD或茎多肽源自人或小鼠TREML1。该药物组合物还包括抗原作为疫苗，其中，TREML1ECD或茎多肽用作佐剂或免疫增强剂。TREML1ECD或茎多肽用作佐剂或免疫增强剂。TREML1ECD或茎多肽用作佐剂或免疫增强剂。

技术研发人员：

李文机 吕衍达 张家鸣 黄品谚 蔡宜芳

受保护的技术使用者：

李文机

技术研发日：

2021.05.14

技术公布日：

2022/12/29