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纤溶酶可裂解的PSD-95抑制剂与再灌注联合中风的制作方法

纤溶酶可裂解的psd-95抑制剂与再灌注联合中风
相关申请的交叉引用
1.本技术要求分别于2020年2月19日提交的us 62/978,759和us 62/978,792的优先权，出于所有目的将它们通过引用整体并入本文。序列表
2.本技术包括在名为552735seqlst.txt的文本文件中公开的序列，该文件的大小为22,109字节，创建于2021年2月17日，通过引用并入。

背景技术：

3.tat-nr2b9c(也称为na-1或nerinetide)是一种抑制psd-95的药物，从而破坏与n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)和神经元一氧化氮合酶(nnos)的结合，并减少脑缺血引起的兴奋性神经毒性。可减少脑损伤和神经退行性疾病模型中的梗死面积和功能缺陷。tat-nr2b9c已成功进行ii期试验(参见wo 2010144721和aarts et al.,science 298,846-850(2002),hill et al.,lancet neurol.11:942
–
950(2012))和ⅲ期试验(hill et al.,lancet 395:878-887(2020))。

技术实现要素：

4.本发明提供了一种患有局部缺血或有局部缺血风险的受试者体的方法，包括向受试者施用抑制psd-95、可被纤溶酶切割的活性剂，和再灌注。所述受试者体包括被给予抑制psd-95的活性剂和机械再灌注或血管扩张剂或高血压剂以实现再灌注的受试者；和/或被给予抑制psd-95的所述活性剂和溶栓剂以实现再灌注的受试者，其中抑制psd-95的所述活性剂在所述溶栓剂之前至少10分钟施用，并且所述受试者体缺少在给予抑制psd-95的所述活性剂之前不到3小时或之后不到10分钟给予溶栓剂的受试者。
5.可选地，所述受试者患有缺血性中风。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前少于4小时或在抑制psd-95的所述活性剂之后少于10分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前少于8小时和在给予抑制psd-95的所述活性剂之后少于10分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到10分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到20分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到30分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到60分钟给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述受试者体包括被给予抑制psd-95的所述活性剂和机械再灌注而不接受溶栓剂的受试者。
6.可选地，接受的所述受试者体包括：(a)被给予抑制psd-95的所述活性剂和机械再灌注、血管扩张剂、或高血压剂，但不使用溶栓剂的受试者；和(b)被给予抑制psd-95的活性剂和溶栓剂的受试者，其中所述溶栓剂在抑制psd-95的所述活性剂之后至少10、20、
30、60或120分钟施用。可选地，至少一些根据项目(b)的受试者也被给予机械再灌注。可选地，所述体包括当受试者在中风发作后不到3小时内被确定有资格接受溶栓剂时，在中风发作后超过3或4.5小时被给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述体包括至少100个受试者。可选地，所述体包括在10分钟内被给予抑制psd-95的所述活性剂，并且在开始被给予所述活性剂至少30分钟后被给予所述溶栓剂的受试者。可选地，所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。可选地，所述活性剂是nerinetide。
7.本发明进一步提供了一种接受血管内血栓切除术以缺血性中风的受试者体的方法，包括向一些所述受试者给予抑制psd-95、可被纤溶酶切割的活性剂和溶栓剂，其中在所述溶栓剂之前至少10、20、30、60或120分钟给予抑制psd-95的所述活性剂，以及将抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂给予所述体中的其他受试者，但不能同时给予两者。可选地，所述受试者在接受血管内血栓切除术之前，接受抑制psd-95的所述活性剂和所述溶栓剂。可选地，所述受试者在接受血管内血栓切除术之前，接受抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂，但不能同时接受两者。可选地，在接受抑制psd-95的所述活性剂和溶栓剂的受试者中，抑制psd-95的所述活性剂在所述溶栓剂之前至少10分钟给药，并且将抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂但不是两者都给予其他受试者。
8.本发明进一步提供了一种患有局部缺血或有局部缺血风险的受试者体的方法，包括向所述受试者给予抑制psd-95的活性剂和溶栓剂，其中所述受试者体包括：被给予抑制psd-95、可被纤溶酶切割的第一活性剂和溶栓剂的受试者，其中抑制psd-95的所述第一活性剂以选自所述溶栓剂之前至少10、20、30、60或120分钟的间隔给予；和被给予抑制psd-95、抗纤溶酶裂解的第二活性剂和溶栓剂的受试者，其中在抑制psd-95的所述活性剂之前或之后的间隔内给予所述溶栓剂。
9.本发明进一步提供了一种怀疑患有缺血性中风的受试者的方法，包括：确定所述受试者接受溶栓剂的资格；给予抑制psd-95、可被纤溶酶裂解的活性剂；以及至少10、20、30、60或120分钟后，给予所述溶栓剂。可选地，抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内给药，并且所述溶栓剂在开始给予活性剂至少20分钟后给药。可选地，所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。可选地，所述活性剂是nerinetide。可选地，成像确定缺血性中风的存在和脑出血的不存在。可选地，在缺血性中风发作后3小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后3小时以上给予所述溶栓剂。可选地，在缺血性中风发作后4.5小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后4.5小时以上给予所述溶栓剂。可选地，在缺血性中风发作后3小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后4.5小时以上给予所述溶栓剂。
10.在上述任一种方法中，抑制psd-95的所述活性剂包括在c端包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:1)的肽或在c端包含x
1-[t/s]-x2v(seq id no:2)的肽，其中[t/s]是备选氨基酸，x1选自e、q和a，或其类似物，x2选自a、q、d、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d和n-me-n或其类似物，以及与所述肽的n端连接的内化肽。可选地，抑制与所述内化肽相连的psd-95的所述活性剂是tat-nr2b9c(nerinetide)。优选地，所述溶栓剂是tpa。
[0011]
本发明进一步提供了一种用抑制psd-95、对纤溶酶敏感(即，可被纤溶酶裂解)的活性剂中风受试者的方法，其中对纤溶酶敏感的抑制剂是在溶栓剂前至少10分钟给药，或在溶栓剂给药后至少2、3、4小时或更长时间给药，或在没有溶栓剂的情况下给药。优选地，抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内给药，并且所述溶栓剂在开始给予所述活性剂
no:3)(全长na-1，未消化)、rrqrrrklssiesdv(seq id no:4)、rqrrrklssiesdv(seq id no:5)、qrrrklssiesdv(seq id no:6)、rrklssiesdv(seq id no:7)、rklssiesdv(seq id no:8)、klssiesdv(seq id no:9)、lssiesdv(seq id no:10)。
[0019]
图5a-d：nerinetide给药和rt-pa再灌注之间的剂量分离解决了nerinetide益处的无效化。nerinetide(7.6mg/kg)在60分钟rt-pa输注(5.4mg/kg，10％推注，随后90％超过60分钟)开始前30分钟或同时静脉推注给药。(a)实验时间线。bp＝血压。ttc＝用2、3、5-氯化三苯基四氮唑染。(b)emcao后24小时的半球梗塞体积测量。(c)emcao后24小时大脑半球肿胀百分比和(d)emcao后24小时的神经系统评分。在(a)中所示的时间静脉内给予。条形代表平均值
±
sd，绘制了所有单独的数据点。当与单独的对照组/nerinetide相比时，显著差异(在b中)和(在c中)用星号表示，或者当与溶栓剂(多重比较检验的单因素方差分析事后tukey校正，*p《0.01或#p《0.01，分别地)n＝12-15只动物/组相比时，显著差异用数字符号表示。当与单独的对照组/nerinetide相比时，显著差异(在d中)用星号表示，或者当与溶栓剂(kruskal-wallis等级方差分析，以及多重比较检验的事后dunn校正，分别为*p《0.01或#p《0.01)相比时，用数字符号表示。
[0020]
图6a-f：d-tat-l-2b9c具有与nerinetide相同的靶标亲和力，但对溶栓剂的切割不敏感。(a)nerinetide和d-tat-l-2b9c对psd-95pdz2结构域具有相似的结合亲和力。指示的生物素化肽与psd-95的pdz2结构域的直接elisa。nerinetide ec50＝0.093μm。d-tat-l-2b9c ec50＝0.151μm。符号表示三次实验的平均值
±
sd。所有相互作用都经过多次滴定并显示出一致的结果。(b)用rt-pa(135μg/ml)或纤溶酶(10μg/ml)挑战期间，pbs中nerinetide(65μg/ml)或d-tat-l-2b9c(65μg/ml)含量的时间进程。c、d，在用rt-pa(135μg/ml)挑战期间大鼠血浆(c)和人血浆(d)中nerinetide或d-tat-l-2b9c含量的时间过程。e、f，在用替奈普酶(tnk；分别为37.5μg/ml或6.25μg/ml)挑战期间，大鼠血浆(e)和人血浆(f)中nerinetide或d-tat-l-2b9c含量的时间进程。与单独的对照组/nerinetide相比，nerinetide+纤溶酶(在b中)、nerinetide+rt-pa(在c、d中)和nerinetide+tnk(在e、f中)的显著差异用星号表示。(使用事后sidak多重比较检验重复测量双因素方差分析，*p《0.01)。符号是平均值
±
sd。
[0021]
图7a-c：nerinetide和d-tat-l-2b9c具有相似的药代动力学特征。(a)大鼠静脉推注nerinetide(7.6mg/kg)和d-tat-l-2b9c(7.6mg/kg)的时间进程。符号代表平均值
±
sd。星号(*)表示与安慰剂或对照相比具有统计显著性，*p《0.01，采用事后sidak多重比较检验的重复测量双因素方差分析。(b)从时间0到60分钟的浓度-时间曲线下面积。*p《0.05，采用非配对学生t检验。(c)指示的药代动力学参数的比较(cmax＝最大浓度，tmax＝达到cmax的时间，t1/2＝半衰期，auc(0-last)＝到最后一次测量的曲线下面积，auc(0-inf)＝外推至无穷大的auc，ci＝清除率。
[0022]
图8a-d：在中风发作后1小时同时施用d-tat-l-2b9c和rt-pa可减少经受emcao的动物的梗塞体积。a、实验时间线。bp＝血压。ttc＝用2、3、5-氯化三苯基四氮唑染。b、梗死体积，c、半球肿胀、和d、emcao后24小时的神经系统评分。在emcao后60分钟，d-tat-l-2b9c和nerinetide以推注方式静脉内给药。条形表示平均值
±
标准差，绘制了所有单独的数据点。当与单独的对照组/nerinetide相比时，显著差异(在b中)和(在c中)用星号表示，或者当与溶栓剂(多重比较检验的单因素方差分析事后tukey校正，*p《0.01或#p《0.01，分别)n
＝10-17只动物/组相比时，显著差异用数字符号表示。与单独的对照组/nerinetide相比(kruskal-wallis等级方差分析，以及多重比较检验的事后dunn校正，*p《0.01)，显著差异(在d中)用星号表示。e、来自指定组的代表性冠状脑切片用2、3、5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染，用于梗塞体积和半球肿胀评估。
[0023]
图9：健康人给药后nerinetide的血浆水平。
[0024]
图10a-c：在10分钟nerinetide输注结束后施用阿替普酶10分钟可显著减少nerinetide的切割。图10a，nerinetide的血浆浓度，图10b，曲线下面积，和图10c药理参数变化。
[0025]
图11a-b：在大鼠tmcao模型中，nerinetide在至少0.025-25mg/kg的剂量范围内有效(a)减少梗死面积和(b)减少神经功能缺损。定义
[0026]“药物制剂”或组合物是允许活性剂有效的制剂，并且缺少对将要施用制剂的对象有毒的附加组分。
[0027]
除非上下文另有说明，使用大写的单字母氨基酸代码可以指代d或l氨基酸。小写单字母代码用于表示d氨基酸。甘氨酸没有d和l形式，因此可以用大写或小写字母互换表示。
[0028]
诸如浓度或ph值之类的数值在一个公差范围内给出，反映了可以测量该值的精度。除非上下文另有要求，否则小数值会四舍五入到最接近的整数。除非上下文另有要求，否则引用范围值意味着可以使用范围内的任何整数或子范围。
[0029]
术语“疾病”和“病”同义使用，表示受试者正常结构或功能的任何破坏或中断。
[0030]
指示剂量应理解为包括在典型医院环境中可以测量剂量的准确性所固有的误差范围。
[0031]
术语“分离的”或“纯化的”是指目标种类(例如肽)已经从样品中存在的污染物中纯化，例如从含有目标种类的天然来源获得的样品。如果目标种类是分离或纯化的，它是样品中(即，在摩尔基础上，它比组合物中的任何其他单一物质更丰富)存在的主要大分子(例如多肽)种类，并且优选地，目标种类包括存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，分离的、纯化的或基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子种类的80％至90％以上。最优选地，目标种类被纯化至基本均质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)，其中组合物基本上由单一的大分子种类组成。术语分离的或纯化的并不一定排除旨在与分离的物质组合作用的其他组分的存在。例如，内化肽可以被描述为分离的，尽管它与活性肽相连。
[0032]“模拟肽”是指具有与由天然氨基酸组成的肽基本相同的结构和/或功能特征的合成化合物。模拟肽可以包含完全合成的非天然氨基酸类似物，或者可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟肽也可以掺入任何量的天然氨基酸保守取代，只要这些取代也不会显著改变模拟物的结构和/或抑制或结合活性。多肽模拟组合物可以包含非天然结构组分的任意组合，其通常来自三个结构组：a)天然酰胺键(“肽键”)键以外的残基键合基团；b)非天然残基代替天然存在的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟的残基，即诱导或稳定二级结构，例如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象等。在包含活性肽和内化肽的嵌合肽的拟肽中，活性部分或内化部分或两者可以是拟肽。
[0033]
术语“特异性结合”是指两个分子之间的结合，例如配体和受体，其特征在于一个分子(配体)即使在许多其他不同分子存在的情况下也能与另一个特定分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一个分子优先结合另一个分子。配体与受体的特异性结合也通过在过量未标记配体存在下可检测标记的配体与受体的结合减少来证明(即，结合竞争测定)。
[0034]
兴奋性中毒是神经元和周围细胞因兴奋性神经递质谷氨酸受体(例如nmda受体，例如带有nmdar 2b亚基的nmda受体)的过度激活而受损和死亡的病理过程。
[0035]
术语“受试者”包括人和兽医动物，例如哺乳动物，以及实验室动物模型，例如用于临床前研究的小鼠或大鼠。
[0036]
tat肽意指包含rkkrrqrrr(seq id no:11)或由rkkrrqrrr组成的肽，其中不超过5个残基被删除、取代或插入序列内，其保留了促进连接的肽或其它药剂进入细胞的能力。优选地，任何氨基酸变化都是保守取代。优选地，聚集体中的任何取代、缺失或内部插入使肽带有净阳离子电荷，优选类似于上述序列的电荷。这可以通过例如不取代任何r或k残基，或保留相同总数的r和k残基来实现。tat肽的氨基酸可以用生物素或类似分子衍生以减少炎症反应。
[0037]
药剂的共同给药意味着药剂在时间上足够接近以使可检测量的药剂同时存在于血浆中，和/或药剂对同一疾病发作产生效果，或药剂在同一疾病发作时合作地或协同地起作用。例如，当抗炎剂与包括tat肽的药剂在足够近的时间施用时，抗炎剂与包括tat肽的药剂合作地起作用，以使抗炎剂可以抑制可由内化肽诱导的抗炎反应。
[0038]
统计学显著是指p值《0.05，优选《0.01，最优选《0.001。
[0039]
疾病的发作是指存在疾病的体征和/或症状的时期，其两侧散布着较长的时期，其中体征和/或症状或不存在或以较小程度存在。
[0040]
如果药物的给药不是瞬时的，除非另有明确说明，否则从给药的初始点或到给药的初始点计算间隔。
[0041]
术语“nmda受体”或“nmdar”是指已知与nmda相互作用的膜相关蛋白，包括下文所述的各种亚基形式。这样的受体可以是人的或非人的(例如，小鼠、大鼠、兔、猴)。
具体实施方式
i.总则
[0042]
本发明部分基于以下观察：psd-95、tat-nr2b9c的肽抑制剂和相关肽被血清蛋白酶、纤溶酶切割，其由溶栓剂如tpa诱导。如果将tat-nr2b9c和溶栓剂一起给药或在时间上足够接近以导致tat-nr2b9c和溶栓剂诱导的纤溶酶之间的血浆停留的实质性重叠，然后会发生tat-nr2b9c的切割，从而降低或消除其效果。相反，tat-nr2b9c对溶栓剂的活性没有有害影响。可以通过几种方法减少或避免溶栓剂对tat-nr2b9c的失活，包括间隔施用相应的药物以避免tat-nr2b9c和纤溶酶之间血浆停留的实质性重叠，使用机械而不是溶栓再灌注或使用抑制psd-95不受纤溶酶裂解的活性剂，例如tat-nr2b9c的d氨基酸变体。ii.活性剂
[0043]
本发明的活性剂特异性结合psd-95(例如，stathakism,genomics44(1):71-82(1997))，从而抑制其与nmda受体2亚基的结合，包括nmdar2b(例如，genbank id 4099612)
和/或nos(例如，神经元的或nnos swiss-prot p29475)。优选的肽抑制用于人受试者的人形式的psd-95 nmdar2b和nos。然而，抑制也可以从蛋白质的物种变体中显示出来。这样的药剂可以包括psd-95肽抑制剂和内化肽以促进psd-95肽抑制剂穿过细胞膜和血脑屏障。此类药剂包括碱性残基r和k的上述正常表示。当药剂由常规的l氨基酸形成时，r和k残基的比例过高使它们在r和k残基之间的位点以及c端侧的邻近残基处特别容易受到纤溶酶的切割。nerinetide或其他活性剂的纤溶酶敏感性可以如实施例中所示。
[0044]
一些肽抑制剂在其c端具有包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:1)的氨基酸序列。示例性肽包括：作为c端氨基酸的esdv(seq id no:12)、esev(seq id no:13)、etdv(seq id no:14)、etav(seq id no:15)、etev(seq id no:16)、dtdv(seq id no:17)和dtev(seq id no:18)。一些肽的氨基酸序列在其c端包含[i]-[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:19)。示例性肽包括：作为c端氨基酸的iesdv(seq id no:20)、iesev(seq id no:21)、ietdv(seq id no:22)、ietav(seq id no:23)、ietev(seq id no:24)、idtdv(seq id no:25)和idtev(seq id no:26)。一些抑制肽在其c端具有包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:1)的氨基酸序列，或在其c端具有包含x
1-[t/s]-x2v(seq id no:2)的氨基酸序列，其中[t/s]是替代氨基酸，x1选自e、q和a或其类似物，x2选自a、q、d、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d和n-me-n或其类似物(参见bach,j.med.chem.51,6450-6459(2008)和wo 2010/004003)。一些抑制肽在c端具有包含x
3-[t/s]-x4-v(seq id no:27)的氨基酸序列，其中[t/s]是替代氨基酸，x3选自e、d、q和a，或其类似物，x4选自a、q、d、e、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d、n-me-e和n-me-n或其类似物。可选地，所述肽在p3位置(c端的第三个氨基酸，即[t/s]占据的位置)被n-烷基化。所述肽可以用环己烷或芳族取代基进行n-烷基化，并且在肽或肽类似物的取代基和末端氨基之间进一步包含间隔基团，其中间隔基是烷基，优选选自亚甲基、亚乙基、丙烯和亚丁基。芳族取代基可以是萘-2-基部分或被一个或两个卤素和/或烷基取代的芳环。一些抑制肽在c端具有包含i-x
1-[t/s]-x
2-v(seq id no:28)的氨基酸序列，其中[t/s]是替代氨基酸，x1选自e、q和a或其类似物，x2选自a、q、d、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d和n-me-n或其类似物。一些抑制肽在c端具有包含i-x
3-[t/s]-x4-v(seq id no:29)的氨基酸序列，其中[t/s]是替代氨基酸，x3选自e、q、a或d或其类似物，x4选自a、q、d、e、n、n-me-a，n-me-q、n-me-d、n-me-e和n-me-n或其类似物。示例性抑制肽具有序列iesdv(seq id no:20)、ietdv(seq id no:22)、klssiesdv(seq id no:9)和klssietdv(seq id no:30)。抑制肽通常具有3-25个氨基酸(没有内化肽)，5-10个氨基酸的肽长度，特别优选是9个氨基酸(也没有内化肽)。
[0045]
内化肽是众所周知的一类相对较短的肽，它允许许多细胞或病毒蛋白穿过膜。它们还可以促进连接肽穿过细胞膜或血脑屏障。内化肽，也称为细胞膜转导肽、蛋白质转导结构域、脑穿梭或细胞穿透肽，可以具有例如5-30个氨基酸。此类肽通常具有来自精氨酸和/或赖氨酸残基的高于正常表现(通常相对于蛋白质)的阳离子电荷，据信这有助于它们通过膜。一些这样的肽具有至少5、6、7或8个精氨酸和/或赖氨酸残基。例子包括antennapedia蛋白(bonfanti,cancer res.57,1442-6(1997))(及其变体)、人类免疫缺陷病毒的tat蛋白、蛋白vp22、1型单纯疱疹病毒的ul49基因的产物、penetratin、synb1和3、transportan、amphipathic、gp41nls、polyarg和几种植物和细菌蛋白毒素，如蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、modeccin、白喉毒素、毒素、毒素、不耐热毒素和铜绿假单胞菌外毒素a(eta)。其他
示例在以下参考文献(temsamani,drug discovery today,9(23):1012-1019,2004；de coupade,biochem j.,390:407-418,2005；saalik bioconjugate chem.15:1246-1253,2004；zhao,medicinal research reviews 24(1):1-12,2004；deshayes,cellular and molecular life sciences 62:1839-49,2005)；gao,acs chem.biol.2011,6,484
–
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–
1493(2018))。
[0046]
优选的内化肽是来自hiv病毒的tat。先前工作中报道的tat肽包含在hiv tat蛋白中发现的标准氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seq id no:2)或由该标准氨基酸序列组成。也可以使用rkkrrqrrr(seq id no:11)和grkkrrqrrr(seq id no:32)。如果存在这种tat基序侧翼的附加残基(除了抑制肽)，这些残基可以是例如来自tat蛋白的该区段侧翼的天然氨基酸、通常用于连接两个肽结构域类型的间隔区或接头氨基酸，例如，gly(ser)4(seq id no:33)、tgekp(seq id no:34)、ggrrgggs(seq id no:35)或lrqrdgerp(seq id no:36)(参见例如,tang et al.(1996),j.biol.chem.271,15682-15686；hennecke et al.(1998),protein eng.11,405-410))，或可以是不显著降低无侧翼残基的变体吸收能力的任何其他氨基酸。优选地，在ygrkkrrqrrr(seq id no：2)的任一侧，除活性肽之外的侧翼氨基酸的数目不超过十个。然而，优选地，不存在侧翼氨基酸。包含ygrkkrrqrrr(seq id no：2)的c端侧翼的附加氨基酸残基的一种合适的tat肽或其他抑制肽是ygrkkrrqrrrpq(seq id no：37)。可以使用的其他tat肽包括grkkrrqrrrpq(seq id no:38)和grkkrrqrrrp(seq id no:39)。
[0047]
wo2008/109010描述了结合n型钙通道的能力降低的上述tat肽的变体。此类变体可包含氨基酸序列xgrkkrrqrrr(seq id no:40)或由其组成，其中x是除y之外的氨基酸或可包含氨基酸序列grkkrrqrrr(seq id no:32)或由其组成。优选的tat肽具有被f取代的n端y残基。因此，优选包含fgrkkrrqrrr(seq id no：41)或由其组成的tat肽。另一种优选的变体tat肽包含grkkrrqrrr(seq id no：32)或由其组成。另一种优选的tat肽包含rrrqrrkkrg(seq id no：42)或rrrqrrkkrgy(seq id no：43)或由其组成。其他促进抑制肽摄取而不抑制n-型钙通道的tat衍生肽包括以下提供的那些。x-fgrkkrrqrrr(f-tat)(seq id no:41)x-gkkkkkqkkk(seq id no:44)x-rkkrrqrrr(seq id no:11)x-gakkrrqrrr(seq id no:45)x-akkrrqrrr(seq id no:46)x-grkarrqrrr(seq id no:47)x-rkarrqrrr(seq id no:48)
x-grkkarqrrr(seq id no:49)x-rkkarqrrr(seq id no:50)x-grkkrrqarr(seq id no:51)x-rkkrrqarr(seq id no:52)x-grkkrrqrar(seq id no:53)x-rkkrrqrar(seq id no:54)x-rrprrprrprr(seq id no:55)x-rrarrarrarr(seq id no:56)x-rrrarrrarr(seq id no:57)x-rrrprrrprr(seq id no:58)x-rrprrprr(seq id no:59)x-rrarrarr(seq id no:60)
[0048]
x可以代表游离氨基末端、一个或多个氨基酸或缀合部分。
[0049]
优选的活性剂是tat-nr2b9c，也称为na-1或nerinetide，具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：3)。另一种优选的药剂是ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no：61)。nerinetide的所有氨基酸都是l氨基酸。这也可以是上述任何活性剂的情况。因此，由l氨基酸形成的nerinetide和其他活性剂对纤溶酶切割敏感。
[0050]
一些活性剂包括d氨基酸以减少或消除纤溶酶介导的肽切割。在这样的药剂中，抑制肽的至少四个c端残基，优选抑制肽的五个c端残基是l氨基酸，并且抑制肽和内化肽中剩余的残基中的至少一个是d残基。可以选择包含d残基的位置，以使d残基紧接着出现在任何碱性残基(即精氨酸或赖氨酸)之后(即在c端侧)。纤溶酶通过切割此类碱性残基的c端侧的肽键而发挥作用。包含切割位点侧翼的d残基，特别是在碱性残基的c端侧，可减少或消除肽切割。碱性残基的c端侧的任何或所有残基都可以是d残基。任何碱性残基也可以是d氨基酸。
[0051]
一些活性剂在内化肽和抑制肽中都包括至少一种d氨基酸。一些活性剂在内化肽的每个位置包括d氨基酸。一些活性剂在抑制肽的每个位置都包括d氨基酸，除了四个或五个c端残基，它们是l氨基酸。一些抑制肽在内化肽的每个位置包括d氨基酸，以及抑制肽的每个位置不包括最后四个或五个c端氨基酸残基，它们是l氨基酸。
[0052]
tat-nr2b9c具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:3)。一些活性剂是该序列的变体，其中esdv(seq id no：12)或iesdv(seq id no：20)是l氨基酸，而其余氨基酸中的至少一个是d氨基酸。在一些活性剂中，至少从c端起第八和第九位的l或k残基，或两者，是d残基。在一些活性剂中，从n端起第6、7、8、10和11位的r、r、q、r、r残基中的至少一个是d残基。在一些活性剂中，所有这些残基都是d残基。在一些活性剂中，残基4-8和残基10-13的每一个都是d氨基酸。在一些活性剂中，残基4-13或3-13的每一个都是d氨基酸。在一些活性剂中，内化肽的十一个残基中的每一个都是d氨基酸。一些示例性活性剂包括ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:62)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:63)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:64)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:65)、ygrkkrrqrrrkssiesdv(seq id no:66)、ygrkkrrqrrrksiesdv(seq id no:67)、和ygrkkrrqrrrkiesdv(seq id no:68)。其他活性剂包括上述序列的变体，其中从c端起第三
个位置的s被t替换：ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:69),ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:70)、ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:71)、ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:72)、ygrkkrrqrrrkssietdv(seq id no:73)、ygrkkrrqrrrksietdv(seq id no:74)、和ygrkkrrqrrrkietdv(seq id no:75)。活性剂包括ygrkkrrqrrriesdv(seq id no:76)(d-tat-l-2b5c)和ygrkkrrqrrrietdv(seq id no:77)。
[0053]
本发明还包括活性剂，该活性剂包含与抑制psd-95与nos结合的抑制肽连接的内化肽，例如作为融合肽，其中内化肽具有包含ygrkkrrqrrr(seq id no:2)、grkkrrqrrr(seq id no:32)或rkkrrqrrr(seq id no:11)的氨基酸序列，并且抑制肽具有包含klssiesdv(seq id no：9)或其变体的序列，在内化肽和抑制肽中总共具有多达1、2、3、4或5个取代或缺失。在这样的活性剂中，抑制肽的至少四个或五个c端氨基酸是l氨基酸，并且包括所有r和k残基的连续氨基酸片段和紧邻c端至最c端r或k残基的残基是d氨基酸。因此，在具有序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：3)的肽中，从第一个r到l残基的连续片段是d氨基酸。
[0054]
允许替换的一个例子由在抑制肽的c端的基序[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:1)。例如，从c端开始的第三个氨基酸可以是s或t。优选地，抑制肽的五个c端氨基酸中的每一个都是l氨基酸。优选每隔一个氨基酸是d氨基酸，如在活性剂ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：78)中，其中小写字母是d氨基酸并且大写字母是l氨基酸。
[0055]
与tat-nr2b9c或其他相同的全部l活性剂相比，优选的具有d氨基酸的活性剂在大鼠或人血浆中具有增强的稳定性(例如，半衰期)。可以如实施例中那样测量稳定性。与tat-nr2b9c或其他相同的全部l活性剂相比，优选的活性剂具有增强的纤溶酶抗性。可以如实施例中测量纤溶酶抗性。优选地，活性剂在tat-nr2b9c(全部l)或其它相同的全部l肽的1.5倍、2倍、3倍或5倍范围内结合psd-95，或在实验误差内具有无法区分的结合。优选的活性剂与tat-nr2b9c或含有nmda受体亚基2序列的最后15-20个氨基酸的肽竞争结合，该肽含有用于与psd-95(例如，十倍过量的活性剂会降低tat-nr2b9c结合)结合至少10％、25％或50％的pdz结合域。竞争表明活性剂结合到与tat-nr2b9c相同或重叠的结合位点。psd-95的丙氨酸发生突变也可以表明拥有相同或重叠的结合位点。如果相同或重叠残基组的突变发生降低了活性剂与tat-nr2b9c的结合，则活性剂和tat-nr2b9c与psd-95上的相同或重叠位点结合。
[0056]
本发明的活性剂可以含有修饰的氨基酸残基，例如n-烷基化的残基。n端烷基修饰可以包括例如n-甲基、n-乙基、n-丙基、n-丁基、n-环己基甲基、n-环己基乙基、n-苄基、n-苯乙基、n-苯丙基、n-(3,4-二氯苯基)丙基、n-(3,4-二氟苯基)丙基和n-(萘-2-基)乙基)。活性剂还可以包括逆向肽。逆向肽具有反向氨基酸序列。模拟肽还包括逆反(retro inverso)肽，其中氨基酸的顺序是相反的，因此最初的c端氨基酸出现在n端，并且使用d氨基酸代替l氨基(例如，酸vdseisslkrrrqrrkkrgy(seq id no:79)，也称为ri-na-1)。
[0057]
如果需要，可以在本技术中描述的灵长类动物和临床试验中测试之前使用先前描述的中风大鼠模型来确认肽、模拟肽或其他药剂的适当药理学活性。也可以使用例如us 20050059597中描述的测定来筛选肽或模拟肽抑制psd-95和nmdar 2b之间相互作用的能力，该专利以引用的方式并入本文。在这种测定中，有用的肽或其他药剂通常具有小于50μ
m、25μm、10μm、0.1μm或0.01μm的ic50值。优选的肽或其他药剂通常具有0.001-1μm的ic50值，更优选0.001-0.05、0.05-0.5或0.05-0.1μm。当肽或其他药剂被表征为抑制一种相互作用的结合时，例如，psd-95与nmdar2b的相互作用，这种描述不排除该肽或药剂也抑制另一种相互作用，例如，抑制psd-95与nnos的结合。
[0058]
诸如刚刚描述的那些肽可以任选地衍生(例如，乙酰化、磷酸化、肉豆蔻酰化、香叶基化、聚乙二醇化和/或糖基化)以提高抑制剂的结合亲和力，提高抑制剂跨细胞膜转运的能力或提高稳定性。作为一个具体的例子，对于其中从c端开始的第三个残基是s或t的抑制剂，该残基可以在使用肽之前被磷酸化。
[0059]
内化肽可以通过常规方法连接到抑制肽上。例如，药剂可以通过化学键连接到内化肽，例如通过偶联剂或缀合剂。许多这样的药剂是可商购的，并且由s.s.wong，蛋白质缀合和交联化学，crc press(1991)进行了评论。交联剂的一些例子包括j-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)或n,n'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺；n,n'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或其他具有6至11个碳亚甲基桥(其对于巯基相对特异)的药剂；和1,5-二氟-2,4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的键)。其他交联剂包括p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；己二酸二甲酯(其对氨基有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯基-对-二异氰酸酯(主要与氨基反应)；戊二醛(其与几种不同的侧链反应)和二重氮联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。
[0060]
接头，例如聚乙二醇接头，可用于使肽或肽模拟物的活性部分二聚化，以增强其对含有串联pdz结构域的蛋白质的亲和力和选择性。参见，例如bach et al.,(2009)angew.chem.int.ed.48:9685-9689和wo 2010/004003。包含pl基序的肽优选通过连接两个这样的分子的n端而二聚化，使c端游离。bach进一步报道了来自nmdar 2b c端的五聚体肽iesdv(seq id no:20)可有效抑制nmdar 2b与psd-95的结合。也可以使用ietdv(seq id no:22)代替iesdv(seq id no:20)。可选地，可以串联连接约2-10个peg拷贝作为接头。可选地，接头也可以连接到内化肽或脂化以增强细胞摄取。示例性二聚体抑制剂的例子如下所示(参见bach et al.,pnas 109(2012)3317-3322)。可以使用本文公开的任何psd-95抑制剂代替ietdv(seq id no：22)，并且可以使用任何内化肽或脂化部分代替tat。也可以使用所示的其他接头。
[0061]
内化肽也可以作为融合肽与抑制肽连接，优选内化肽的c端与抑制肽的n端连接，使抑制肽具有游离的c端。
[0062]
代替肽或将肽与内化肽连接，这样的肽可以与脂质连接(脂化)以增加缀合物相对于单独的肽的疏水性，从而促进连接的肽穿过细胞膜和/或穿过脑屏障。脂质化优选在n端氨基酸上进行，但也可以在内部氨基酸上进行，前提是肽抑制psd-95和nmdar 2b之间相互作用的能力不降低超过50％。优选地，脂化在除了五个最c端氨基酸之一之外的氨基酸上进行。脂质是比水更易溶于醚的有机分子，包括脂肪酸、甘油酯和甾醇。合适的脂化形式包括肉豆蔻酰化、棕榈酰化或链长优选为10-20个碳的其他脂肪酸的连接，例如月桂酸和硬脂酸，以及香叶基化、香叶酰香叶酰化和异戊二烯化。优选在天然蛋白质的翻译后修饰中发生类型的脂质化。通过与肽的n端氨基酸的α-氨基形成酰胺键，用脂肪酸进行脂化也是优选的。脂化可以通过包括预脂化氨基酸的肽合成、体外酶促进行或通过重组表达、通过肽的化
140mm，更优选120mm)。所述ph为5.5至7.5，更优选6-7，更优选6.5。所述活性剂的浓度为20-200mg/ml，优选50-150mg/ml，更优选70-120mg/ml或90mg/ml。因此，示例性的预干燥制剂是20mm组氨酸、120mm海藻糖和90mg/ml活性剂氯化物盐。可选地，可以包括乙酰化清除剂，例如赖氨酸，如us 10,206,878中所述，以进一步减少制剂中任何残留的乙酸盐或三氟乙酸盐。
[0069]
冻干后，冻干制剂具有低水含量，优选约0重量％-5重量％的水，更优选低于2.5重量％的水。冻干制剂可以储存在冰箱(例如，-20℃或-70℃)、冰箱(0-40℃)或室温(20-25℃)中。
[0070]
活性剂可以在水溶液中重构，优选注射用水或可选生理盐水(0.8-1.0％盐水，优选0.9％盐水)。重构可以是与预冻干制剂相同或更小或更大的体积。优选地，重构后的体积比重构前大(例如，大3-6倍)。例如，3-5ml的预冻干体积可以重构为10ml、12ml、13.5ml、15ml或20ml或10-20ml等的体积。重构后，组氨酸的浓度优选为2-20mm，例如2-7mm、4.0-6.5mm、4.5mm或6mm；海藻糖的浓度优选为15-45mm、20-40mm、25-27mm、或35-37mm。赖氨酸的浓度优选为100-300mm，例如150-250mm、150-170mm或210-220mm。活性剂的浓度优选为10-30mg/ml，例如15-30、18-20、20mg/ml的活性剂或25-30、26-28或27mg/ml的活性剂。重构后的示例性制剂具有4-5mm组氨酸、26-27mm海藻糖、150-170mm赖氨酸和20mg/ml活性剂(浓度四舍五入到最接近的整数)。重构后的第二个示例性制剂具有5-7mm组氨酸、35-37mm海藻糖、210-220mm赖氨酸和26-28mg/ml活性剂(浓度四舍五入到最接近的整数)。重构的制剂可以在给药前进一步稀释，例如通过添加到含有生理盐水的流体袋中。v.病
[0071]
本发明的方法可用于由缺血引起的病，特别是中枢神经系统(cns)缺血，更特别是缺血性中风，例如急性缺血性中风。用溶栓剂或机械再灌注可消除引起局部缺血的血管阻塞。用抑制psd-95的活性剂可减少局部缺血的破坏作用。
[0072]
中风是一种由中枢神经系统(cns)血流受损引起的病，无论原因如何。潜在原因包括栓塞、出血和血栓形成。由于血流受损，一些神经元细胞会立即死亡。这些细胞释放其成分分子，包括谷氨酸，其反过来激活nmda受体，提高细胞内钙水平，以及导致进一步神经元细胞死亡的细胞内酶水平(兴奋毒性级联)。中枢神经系统(cns)组织的死亡称为梗塞。梗塞体积(即脑中风导致的死亡神经元细胞的体积)可用作中风导致的病理损伤程度的指标。症状的影响取决于梗塞的体积和它在大脑中的位置。残疾指数可用作症状性损伤的量度，例如rankin中风结果量表(rankin,scott med j；2:200-15(1957))和barthel指数。rankin量表基于直接评估受试者的整体状况，如下所示。0：完全没有症状。1：尽管有症状，但没有明显的残疾；能够执行所有日常职责和活动。2：轻度残疾；不能进行以前的所有活动，但可以在没有帮助的情况下照顾自己的事务。3：需要一些帮助的中度残疾，但能够在没有帮助的情况下行走。4：中度至重度残疾；在没有帮助的情况下无法行走，在没有帮助的情况下无法满足自己的身体需求。5：重度残疾；卧床不起，大小便失禁，需要不断的护理和关注。
[0073]
barthel指数基于一系列关于受试者进行10项基本日常生活活动的能力的问题，得分在0到100之间，分数越低表示残疾越严重(mahoney et al,maryland state medical journal 14:56-61(1965))。
[0074]
或者，可以使用nih中风量表来测量中风严重程度/结果，该量表可在万维网ninds.nih.gov/doctors/nih stroke scalejbooklet.pdf上获得。
[0075]
该量表基于受试者执行11组功能的能力，包括评估受试者的意识水平、运动、感觉和语言功能。
[0076]
缺血性中风更具体地指由流向大脑的血流阻塞引起的中风类型。这种阻塞的潜在条件最常见的是血管壁内脂肪沉积物的发展。这种病称为动脉粥样硬化。这些脂肪沉积物会导致两种类型的阻塞。脑血栓形成是指在血管阻塞部分形成的血栓(血凝块)。“脑栓塞”通常是指在循环系统的另一个位置形成的血凝块，通常是心脏和上胸部和颈部的大动脉。然后一部分血凝块摆脱，进入血液并穿过大脑的血管，直到到达太小而无法通过的血管。栓塞的第二个重要原因是心律不齐，称为心房颤动。它创造了凝块可以在心脏中形成、脱落并进入大脑的条件。缺血性中风的其他潜在原因是出血、血栓形成、动脉或静脉解剖、心脏骤停、包括出血在内的任何原因引起的休克和医源性原因，例如直接手术损伤脑血管或导致脑或心脏手术的血管。缺血性中风约占所有中风病例的83％。
[0077]
短暂性脑缺血发作(tia)是轻微或警告性中风。在tia中，存在表明缺血性中风的状况，并出现典型的中风警告信号。然而，阻塞(血凝块)发生的时间很短，往往会通过正常机制自行消退。接受心脏手术的患者特别容易发生短暂性脑缺血发作。
[0078]
出血性中风约占中风病例的17％。它是由变弱的血管破裂并流血到周围的大脑造成的。血液积聚并压缩周围的脑组织。出血性中风的两种一般类型是脑内出血和蛛网膜下腔出血。出血性中风是由变弱的血管破裂引起的。变弱的血管破裂的潜在原因包括高血压出血，其中高血压导致血管破裂，或其他导致血管变弱的根本原因，例如破裂的脑血管畸形，包括脑动脉瘤、动静脉畸形(avm)或海绵状血管瘤。出血性中风也可由缺血性中风的出血性转化引起，该缺血性中风削弱了梗塞中的血管，或由中枢神经系统中包含异常弱血管的原发性或转移性肿瘤引起的出血引起。出血性中风也可能由医源性原因引起，例如对脑血管的直接手术损伤。动脉瘤是血管薄弱区域的膨胀。如果不及时，动脉瘤会继续变弱，直到它破裂并流血到大脑中。动静脉畸形(avm)是一组异常形成的血管。海绵状血管瘤是一种静脉异常，可导致静脉结构变弱而出血。这些血管中的任何一个都可能破裂，也会导致大脑出血。出血性中风也可能由身体创伤引起。由于出血性中风中失血不足，大脑某一部分的出血性中风可导致另一部分的缺血性中风。
[0079]
一个适合的受试者类别是接受外科手术的受试者，该外科手术涉及或可能涉及供应大脑、在大脑上或中枢神经系统(cns)上的血管。一些例子是接受心肺分流术、颈动脉支架置入术、大脑或主动脉弓冠状动脉的诊断性血管造影、血管外科手术和神经外科手术的受试者。上述第四节讨论了此类主题的其他示例。患有脑动脉瘤的患者尤其适合。此类受试者可以通过多种外科手术进行，包括夹闭动脉瘤以切断血液，或进行血管内手术以用小线圈阻塞动脉瘤或将支架引入动脉瘤从中出现的血管中，或插入微导管。血管内手术比夹闭动脉瘤的侵入性更小，并且与更好的受试者结果相关，但结果仍然包括小梗死的高发生率。此类受试者可以用psd95与nmdar 2b相互作用的抑制剂，特别是上述活性剂进行
。相对于进行手术的给药时间可以如上文针对临床试验所述。
[0080]
另一类受试者是缺血性中风患者，他们适合血管内血栓切除术以去除凝块，例如escape-na1试验(nct02930018)。可以在手术之前或之后施用药物以去除凝块，并且预期可以改善中风本身和与上述程序相关的任何潜在医源性中风的结果。另一个例子是那些在未使用影像学标准的情况下被诊断为潜在中风并在中风后数小时内接受的人，优选在中风发作后的前3小时内，但可选在中风发作后的前6、9或12小时内接受(类似于nct02315443)。vi.抑制psd-95的活性剂与再灌注的共同给药
[0081]
引起局部缺血的斑块和血栓(也称为栓子)可以通过药理学和物理手段溶解、去除或绕过。溶解、去除斑块和血凝块以及随之而来的血流恢复被称为再灌注。一类药剂通过溶栓起作用。溶栓剂通过促进纤溶酶原产生纤溶酶起作用。纤溶酶清除交联的纤维蛋白网(血凝块的骨架)，使血凝块可溶，并受到其他酶的进一步蛋白水解，并恢复闭塞血管中的血流。溶栓剂的例子包括组织纤溶酶原激活剂t-pa、阿替普酶(activase
°
)、瑞替普酶(retavase
°
)、替奈普酶(tnkase
°
)、阿尼普酶(eminase
°
)、链激酶(kabikinase
°
、streptase
°
)和尿激酶
[0082]
另一类可用于再灌注的药物是血管扩张剂。这些药物通过放松和打开血管起作用，从而使血液在阻塞周围流动。血管扩张剂类型的一些例子包括α-肾上腺素受体拮抗剂(α-阻滞剂)、血管紧张素受体阻滞剂(arb)、β2-肾上腺素受体激动剂、钙通道阻滞剂(ccb)、中枢作用的交感神经阻滞剂、直接作用的血管扩张剂、内皮素受体拮抗剂、神经节阻滞剂、硝基扩张剂、磷酸二酯酶抑制剂、钾通道开放剂和肾素抑制剂。
[0083]
另一类可用于再灌注的药物是高血压药物(即升压药物)，如肾上腺素、苯肾上腺素、、去甲肾上腺素；；特布他林；沙丁胺醇；和甲基麻黄碱。增加的灌注压可以增加阻塞周围的血流。
[0084]
再灌注的机械方法包括血管成形术、导管插入术和动脉旁路移植手术、支架植入术、栓子切除术、动脉内膜切除术或血管内血栓切除术。这种程序通过机械去除斑块来恢复斑块流动，使血管保持开放，因此血液可以在斑块周围流动或绕过斑块。
[0085]
其他机械再灌注方法包括使用将血液从身体其他区域转移到大脑的装置。一个例子是部分阻塞主动脉的导管，例如coaxia neuroflo
tm
导管装置，它最近接受了一项随机试验，可能会获得fda批准用于中风。该装置已用于缺血发作后14小时内出现中风的受试者。
[0086]
本方法提供了用于施用再灌注和抑制psd-95的活性剂的方案，使得它们都可以有助于。这样的方案避免施用对纤溶酶切割敏感的抑制psd-95的活性剂(例如，所有l氨基酸)和时间上足够近的溶栓剂，以使抑制psd-95和由溶栓剂诱导的纤溶酶的活性剂两者在血浆中存在实质性共存，从而导致抑制psd-95的活性剂的裂解，并降低或消除抑制psd-95的活性剂的活性。尽管在tat-nr2b9c之后的许多描述中将其称为示例性的，但应将相同的方法理解为提及如本文所述的抑制psd-95的其他活性剂。
[0087]
tat-nr2b9c在人血浆中的血浆半衰期约为10分钟。这并不意味着tat-nr2b9c通常在血浆中十分钟后半降解，而是tat-nr2b9c以十分钟的半衰期移出血浆。阿替普酶(tpa的一种重组形式)在人血浆中的半衰期仅为约5分钟。但对于目前的目的而言，更重要的是纤
溶酶的半衰期，它由阿替普酶和其他溶栓剂诱导并负责切割tat-nr2b9c。据报道，纤溶酶在人血浆中的半衰期约为4-8小时。
[0088]
从tat-nr2b9c和纤溶酶各自的半衰期可以看出，在给予溶栓剂之前，通过给予tat-nr2b9c至少一个tat-nr2b9c的血浆半衰期(即约十分钟)，可以避免两者之间的相互作用。更大的2或3个半衰期间隔，使得在溶栓剂之前至少20或30分钟施用tat-nr2b9c仍进一步降低血浆中的共存和随后的tat-nr2b9c和溶栓剂失活的可能性。甚至在溶栓剂之前进一步施用tat-nr2b9c，例如至少45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时之前，进一步降低了tat-nr2b9c失活的可能性。对于通常在10分钟内施用tat-nr2b9c，从tat-nr2b9c施用开始20分钟的时间相当于从tat-nr2b9c施用结束后10分钟，并且tat-nr2b9c给药开始后30分钟的时间相当于结束后的20分钟。对于典型的在10分钟内施用tat-nr2b9c，从tat-nr2b9c施用开始20分钟的时间相当于从tat-nr2b9c施用结束后10分钟，从tat-nr2b9c施用开始30分钟的时间相当于从tat-nr2b9c施用结束后20分钟。
[0089]
抑制psd-95的纤溶酶敏感性活性剂和溶栓剂不应作为单一组合物一起施用或作为单独成分同时共同施用。
[0090]
如果首先施用溶栓剂，那么在施用抑制对纤溶酶裂解敏感的psd-95的活性剂之前应允许经过足够的时间，以使溶栓剂诱导的血浆纤溶酶浓度显著降低。例如，间隔可以是至少3小时、4小时、8小时、12小时或24小时。
[0091]
对于抑制psd-95的活性剂的施用，可以在任何时间进行再灌注或由除溶栓剂以外的药物类别诱导的再灌注的机械方法，而不会发生活性剂的任何失活。这也是施用抑制抗纤溶酶切割的psd-95的活性剂的d-变体的情况。抑制psd-95的活性剂的裂解也可以通过允许其到达大脑而不通过血液的途径给药来减少，例如，非静脉内给药，例如通过鼻内或鞘内给药。
[0092]
在患有或疑似患有缺血、尚未接受任何且的相对顺序可以控制的受试者中，通常优选首先用抑制psd-95的活性剂进行，然后如上所述等待合适的时间间隔以施用溶栓剂，尽管该领域的传统观念认为应尽快施用溶栓剂以减轻正在进行的神经元细胞死亡，并且至少在中风发作后3小时或4.5小时之前。给予抑制psd-95的活性剂和溶栓剂之间的间隔可用于进行额外的测试，以确认缺血性中风的存在，并消除出血性中风或其他出血的存在或风险，对于这些出血，不建议施用溶栓剂。预先施用抑制psd-95的活性剂还具有延长溶栓剂在缺血发作后可能有效的窗口的优点。在不存在抑制psd-95的活性剂的情况下，该窗口仅为约3-4.5小时，但可通过抑制psd-95的活性剂将其延长至少5、6、9、12或24小时。
[0093]
即使已经确定受试者患有缺血性中风并且有资格接受溶栓剂(例如，没有出血)，那么仍然优选在溶栓剂之前至少10、20、30、40、50、60、120或180分钟的时间间隔施用抑制psd-95并对纤溶酶裂解敏感的活性剂，即使这意味着溶栓剂是在3或4.5小时的时间点之后施用的，超过该时间点传统观点认为它无效。
[0094]
然而，如果等待再灌注被认为存在降低其功效的不可接受的风险，则可以通过机械再灌注或使用除溶栓剂以外的一类药物(例如血管扩张剂或高血压剂)来实现再灌注。
[0095]
在已经接受溶栓剂的缺血受试者中，在施用抑制经纤溶酶切割的psd-95的活性剂之前，应有至少约3小时的合适间隔，如上所述。或者，如果这个间隔被认为是不可接受的，
例如，在间隔期间受试者的状况会恶化，然后可以使用抑制对纤溶酶切割具有抗性的psd-95的活性剂。
[0096]
因此，接受抑制psd-95的活性剂和再灌注的局部缺血的受试者体可以包括接受不同形式的个体。这样的体可以代表例如由同一医师或同一机构的受试者。这样的体可以包括至少10、50、100或500名受试者。此类人中的一些受试者接受抑制psd-95的活性剂和机械再灌注，或用血管扩张剂或高血压剂以实现再灌注。这种形式的再灌注可以以任何顺序进行，同时施用抑制psd-95的活性剂。人中的一些受试者接受抑制对纤溶酶裂解敏感的psd-95的活性剂和溶栓剂，其中在溶栓剂之前至少10、20、30、40、50、60、120或180分钟施用抑制psd-95的活性剂。在此类人中，没有受试者在接受抑制psd-95的活性剂之前少于3小时或之后少于10、20、30、40、50、60、120或180分钟接受溶栓剂。一些人没有在抑制psd-95的活性剂之前施用溶栓剂的受试者。一些人缺乏在施用抑制抑制剂的活性剂后不到30分钟给予溶栓剂的受试者。一些人包括在未接受溶栓剂的情况下施用抑制psd-95的活性剂和机械再灌注的受试者。一些人由(a)施用抑制psd-95的活性剂和机械再灌注而没有溶栓剂的受试者；以及(b)施用抑制psd-95的活性剂和溶栓剂的受试者组成，其中所述溶栓剂在抑制psd-95的活性剂后至少10分钟施用。可选地，(b)的至少一些受试者也被施用机械再灌注。
[0097]
或者，如果抑制对纤溶酶裂解敏感的psd-95的活性剂和对纤溶酶裂解有抗性的抑制psd-95的不同活性剂可用，患有局部缺血或有局部缺血风险的个体体可以包括施用抑制可被纤溶酶切割的psd-95的第一活性剂和溶栓剂的受试者，其中在溶栓剂之前至少10、20、30、40、50、60、120或180分钟的间隔施用抑制psd-95的第一活性剂；和施用抑制抗纤溶酶裂解的psd-95的第二活性剂和溶栓剂的受试者，其中所述溶栓剂在抑制psd-95的第二活性剂之前或之后的间隔内施用。
[0098]
活性剂和再灌注均独立地具有减少因缺血引起的梗塞面积和功能缺陷的能力。当根据本发明方法联合使用时，梗塞面积和/或功能缺陷的减少优选大于单独使用任一药剂或程序在组合以外的可比方案下施用的效果(即合作)。更优选地，梗塞侧和/或功能缺陷的减少至少是累加的，或优选地，超过在除组合之外的可比方案下单独使用药剂(或再灌注程序)实现的减少的累加(即协同作用)。在一些方案中，再灌注疗法在缺血发作后(例如，超过4.5小时)有效减少梗塞面积和/或功能时间，除非同时或在先施用抑制psd-95的活性剂，否则无效。换句话说，当给受试者施用活性剂和再灌注疗法时，再灌注疗法优选地至少与在没有活性剂的较早时间施用时一样有效。因此，所述活性剂通过在再灌注疗法生效之前或之时减少缺血的一种或多种破坏作用而有效地增加再灌注疗法的功效。由此，活性剂可以补偿再灌注的延迟，无论所述延迟是由于受试者认识到其初始症状的危险的延迟、将受试者运送到医院或其他医疗机构的延迟、或执行诊断程序以确定缺血和/或不存在出血或其中不可接受的风险的延迟。可以在临床试验中的人之间或临床前工作中的动物模型人之间证明活性剂和再灌注疗法的统计学显著的组合效应，包括相加或协同效应。vii.有效的给药方案
[0099]
活性剂以有效治愈、减少或抑制疾病的至少一种体征或症状的进一步恶化的给药量、频率和途径给药，所述疾病的受试者患有正在的疾病。有效量(给药前)或给药
后有效血浆浓度是指，相对于未用药物的患该疾病或病患者的对照体(或动物模型)中的损伤，活性剂的量或水平足以显著治愈、减少、或抑制患本发明药物的疾病的受试者(或动物模型)体中待的疾病或病的至少一种体征或症状的进一步恶化。如果个体接受的受试者获得的结果比未通过本发明的方法的可比受试者的对照体中的平均结果更有利，则该量或水平也被认为是有效的。有效方案包括以实现预期目的所需的给药频率和途径给予上有效剂量的药。
[0100]
对于患有中风或其他缺血性病的受试者，活性剂以包括有效减少中风或其他缺血性病的破坏作用的量、频率和给药途径的方案给药。当需要的病是中风时，结果可以通过梗塞体积或残疾指数来确定，并且如果个体接受的受试者在rankin量表上显示出2或更少的残疾并且在barthel量表上显示出75或更多，或者，如果接受的受试者体在残疾量表上的得分分布比可比较的未人显著改善(即，残疾程度较低)，则认为剂量是有效的，参见lees et al.,n.engl.j.med.2006；354：588-600。单剂量的药物足以中风。
[0101]
本发明还提供了用于在有患该疾病风险的受试者中预防该疾病的方法和制剂。通常这样的受试者相对于对照体具有增加的发生失调(例如，病、大病、紊乱或疾病)的可能性。例如，对照人可以包括从普通人中随机选择的一个或多个个体(例如，与年龄、性别、人种、和/或种族相匹配)，这些个体尚未被诊断或具有该病症的家族史。如果发现与该疾病相关的“风险因素”与该受试者相关，则可以认为该受试者处于该疾病的风险中。风险因素可以包括与给定病症相关的任何活动、特征、事件或性质，例如，通过对受试者体的统计或流行病学研究。因此，即使确定潜在风险因素的研究并未明确包括受试者，受试者也可以被归类为处于疾病风险中。例如，接受心脏手术的受试者有短暂性脑缺血发作的风险，因为与未接受过心脏手术的受试者体相比，经历过心脏手术的受试者体中短暂性脑缺血发作的频率增加。
[0102]
其他常见的中风危险因素包括年龄、家族史、性别、既往中风发病率、短暂性脑缺血发作或心脏病发作、高血压、吸烟、糖尿病、颈动脉或其他动脉疾病、心房颤动、其他心脏疾病如心脏病、心力衰竭、扩张型心肌病、心脏瓣膜病和/或先天性心脏缺陷；高血胆固醇，以及高饱和脂肪、反式脂肪或胆固醇的饮食。
[0103]
在预防中，以足以预防、延迟或抑制疾病的至少一种体征或症状的发展的量、频率和途径向处于疾病风险但尚未患有疾病的受试者施用活性剂或步骤。给药前的预防有效量或给药后的血浆水平是指，与未用本发明活性剂的处于疾病风险的受试者(或动物模型)的对照体相比，药剂的量或水平足以显著预防、抑制或延迟与药剂相关的疾病风险受试者(或动物模型)体中疾病的至少一种体征或症状。如果个体接受的受试者获得的结果比未通过本发明方法的可比受试者的对照体中的平均结果更有利，则该量或水平也被认为是预防有效的。预防有效方案涉及以达到预期目的所需的给药频率和给药途径给药预防有效剂量。为预防即将发生中风的受试者(例如，接受心脏手术的受试者)的中风，单剂量的药剂通常就足够了。
[0104]
取决于药剂，给药可以是肠胃外的、静脉内的、肺内的、鼻内的、口服的、皮下的、动脉内的、颅内的、鞘内的、腹膜内的、外用的、鼻内的或肌肉内的。
[0105]
对于静脉内给药，要求保护的药剂可以在没有抗炎药的情况下给药，例如高达
3mg/kg、0.1-3mg/kg、2-3mg/kg或2.6mg/kg，或以更高的剂量，例如至少5、10,15,20或25mg/kg与抗炎药一起给药(参见图11a、b，其显示在至少0.25mg/kg至25mg/kg范围内的功效)。对于皮下、鼻内、肺内或肌肉内等途径，剂量可高达10、15、20或25mg/kg，含或不含抗炎药。可替代地，通过在较长时间段内施用活性剂来减少或消除对较高剂量的消炎药的需要(例如，在少于1分钟、1-10分钟和多于10分钟内给药构成替代方案，其中对于恒定剂量组胺释放和抗炎药的需要随着时间的增加而减少或消除)。
[0106]
活性剂可以作为单剂量或多剂量方案给药。单剂量方案可用于急性病，例如急性缺血性中风，以减少梗塞和认知缺陷。如果病的时间是可预测的，例如对于接受神经血管手术的受试者，可以在病发作之前施用这样的剂量，或者在病发展后的窗口内(例如，最多1、3、6或12小时后)。
[0107]
可以设计多剂量方案以在延长的时间段内，例如至少1、3、5或10天，或至少一个月、三个月、六个月或无限期，将血浆中的活性剂维持在可检测的水平。例如，可以每小时、每天2、3、4、6或12次、每天、每隔一天、每周等施用活性剂。这样的方案可以减少来自急性病的初始缺陷，如单剂量给药，然后促进从仍在发展的这种缺陷中恢复。这种方案也可用于慢性病，如阿尔茨海默病和帕金森病。有时将活性剂掺入控释制剂中以用于多剂量方案。或者，可以在较短的时间内给予多个较小的剂量以实现神经保护而不触发组胺释放，或者如果静脉内给药，则作为缓慢输注给药。
[0108]
活性剂可以与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，例如受控制剂或涂层。此类载体(也称为改良、延迟、延长或缓释或胃滞留剂型，例如depomed gr
tm
系统，其中药物被聚合物包裹，在胃中膨胀并保留约8小时，足以满足许多药物的日常给药)。控释系统包括微囊化递送系统、植入物和可生物降解的生物相容性聚合物，例如胶原蛋白、乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸、基质控释装置、渗透控释装置、多颗粒控释装置、离子交换树脂、肠溶衣、多层涂层、微球、纳米颗粒、脂质体及其组合。活性剂的释放速率也可以通过改变活性剂的粒度来改变：改良释放的例子包括，例如，在编号为3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,639,480；5,733,566；5,739,108；5,891,474；5,922,356；5,972,891；5,980,945；5,993,855；6,045,830；6,087,324；6,113,943；6,197,350；6,248,363；6,264,970；6,267,981；6,376,461；6,419,961；6,589,548；6,613,358和6,699,500的美国专利中描述的那些。viii.与抗炎药合用
[0109]
根据给药的剂量和途径，本发明的活性剂可以诱导以肥大细胞脱颗粒和组胺释放及其后遗症为特征的炎症反应。例如，对于iv给药，至少3mg/kg的剂量与组胺释放有关，对于其他途径，至少10mg/kg的剂量与组胺释放有关。
[0110]
多种抗炎剂可容易地用于抑制炎症反应的一个或多个方面。一类优选的抗炎剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂。此类化合物包括甘酸(5,5
’‑
(2-羟基丙烷-1,3-diyl)双(氧)双(4-氧代-4h-烯-2-羧酸)(也称为甘酸盐)和2-carboxylatochromon-5
’‑
yl-2-羟基丙烷衍生物，例如，双(乙酰氧基甲基)、甘酸二钠，奈多罗米(9-乙基-4,6-二氧基-10-丙基-6,9-二氢-4h-吡喃[3,2-g]喹啉-2,8-二羧酸)和曲尼司特(2-{[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰基]氨基})和洛多酰胺(2-[2-氯-5-氰基-3-(草酰胺基)苯胺基]-2-氧乙酸)。
提及特定化合物包括该化合物的药学上可接受的盐。甘酸很容易以鼻、口服、吸入或静脉内给药的制剂形式获得。尽管本发明的实施不依赖于对机制的理解，但是相信这些药物在由内化肽诱导的炎症反应的早期发挥作用，因此在抑制其后遗症的发展方面最为有效，包括血压的短暂降低。下面讨论的其他类型的抗炎剂用于抑制由肥大细胞脱颗粒引起的一种或多种下游事件，例如抑制组胺与h1或h2受体结合，但可能不会抑制肥大细胞脱颗粒的所有后遗症，或者可能需要更高的剂量或组合使用才能做到这一点。下表4总结了可用于本发明的几种肥大细胞脱颗粒抑制剂的名称、化学式和fda状态。表4
[0111]
另一类抗炎剂是抗组胺化合物。此类药剂抑制组胺与其受体的相互作用，从而抑制上述炎症的后遗症。许多抗组胺药是市售的，有些是非处方药。抗组胺药的实例是azatadine(阿扎他定),azelastine(氮卓斯汀),burfroline,cetirizine(西替利嗪),cyproheptadine(赛庚啶),doxantrozole,etodroxizine(依托羟嗪),forskolin(佛司可林),hydroxyzine(羟嗪),ketotifen(酮替芬),oxatomide(奥沙米特),pizotifen(苯噻啶),proxicromil(普昔罗米),n,n'-取代哌嗪或terfenadine(特非那定)。抗组胺药阻断中枢神经系统(cns)和外周受体的抗组胺能力各不相同，第二代和第三代抗组胺药对外周受体具有选择性。acrivastine(阿克伐斯汀)、astemizole(阿司咪唑)、cetirizine(西替利嗪)、loratadine(氯雷他定)、mizolastine(咪唑斯汀)、levocetirizine(左西替利嗪)、desloratadine(地氯雷他定)和fexofenadine(非索非那定)是第二代和第三代抗组胺药的例子。抗组胺药广泛存在于口服和外用制剂中。可以使用的一些其他抗组胺药总结在下表5中。表5
[0112]
另一类可用于抑制炎症反应的抗炎剂是皮质类固醇。这些化合物是转录调节剂，并且是通过释放组胺和肥大细胞脱颗粒引起的其他化合物而引发的炎症症状的强效抑制剂。皮质类固醇的例子是cortisone(可的松)、氢化可的松(cortef)、强的松(deltasone、meticorten、orasone)、泼尼松龙(delta-cortef、pediapred、prelone)、去炎松(aristocort、kenacort)、甲基强的松龙(medrol)、地塞米松(decadron、dexone、hexadrol)、和倍他米松(celestone)。皮质类固醇广泛存在于口服、静脉内和外用制剂中。
[0113]
也可以使用非类固醇抗炎药(nsaid)。此类药物包括aspirin(阿司匹林)化合物(acetylsalicylates，乙酰水杨酸盐),non-aspirin salicylates(非阿司匹林水杨酸盐),diclofenac(双氯芬酸),diflunisal(二氟尼柳),etodolac(依托度酸),fenoprofen(非诺
洛芬),flurbiprofen(氟比洛芬),ibuprofen(布洛芬),indomethacin(吲哚美辛),ketoprofen(酪洛芬),meclofenamate(甲氯芬那酸),naproxen(萘普生),naproxen sodium(萘普生钠),phenylbutazone(苯基丁氮酮),sulindac(苏灵大),和tometin。然而，此类药物的抗炎作用不如抗组胺药或皮质类固醇有效。也可以使用更强的抗炎药，例如azathioprine(硫唑嘌呤)、cyclophosphamide(环磷酰胺)、leukeran(瘤可宁)和cyclosporine(环孢菌素)，但不优选，因为它们作用较慢和/或与副作用有关。也可以使用生物抗炎剂，例如或但出于同样的原因，不推荐使用。
[0114]
不同类别的药物可以组合使用以抑制炎症反应。优选的组合是肥大细胞脱颗粒抑制剂和抗组胺剂。
[0115]
在与内化肽连接的psd-95抑制剂与抗炎剂一起施用的方法中，两种实体在时间上足够接近地施用，使得抗炎剂可以抑制内化肽诱导的炎症反应。抗炎剂可以在活性剂之前、同时或之后施用。优选的时间部分取决于抗炎剂的药代动力学和药效学。抗炎剂可以在活性剂之前的一定时间间隔施用，使得抗炎剂在施用活性剂时接近最大血清浓度。通常，在活性剂之前6小时和之后1小时之间施用抗炎剂。例如，抗炎剂可以在活性剂之前1小时和之后30分钟之间施用。优选地，抗炎剂在活性剂之前30分钟和之后15分钟之间施用，更优选地，在活性剂之前15分钟内和与活性剂同时施用。在一些方法中，在施用活性剂之前的15、10或5分钟内，在施用活性剂之前施用抗炎剂。在一些方法中，抗炎剂在活性剂之前1-15、1-10或1-5分钟施用。
[0116]
当抗炎剂被称为能够抑制与内化肽连接的抑制肽的炎症反应时，这意味着这两种药物在时间上足够接近，使得如果发生这种反应，抗炎剂将抑制由与内化肽连接的抑制肽诱导的炎症反应并且不一定意味着这种反应发生在该受试者中。在对照临床或非临床试验中，一些受试者用与内化肽连接的抑制肽剂量，该内化肽与统计显著数目的受试者的炎症反应相关。可以合理地假设，尽管并非所有受试者都对与内化肽相连的内化肽产生抗炎反应，但其中相当一部分受试者具有抗炎反应。在一些受试者中，检测到或可检测到对与内化肽连接的抑制肽的炎症反应的体征或症状。
[0117]
在个体受试者的临床中，通常不可能比较在存在和不存在抗炎剂的情况下来自与内化肽连接的抑制肽的炎症反应。然而，如果在对照临床或临床前试验中，在相同或相似的共给药条件下观察到显著抑制，则可以合理地得出结论，抗炎剂抑制肽诱导的抗炎反应。受试者的结果(例如，血压、心率、荨麻疹)也可以与临床试验中对照组的典型结果进行比较，作为个体受试者是否发生抑制的指标。通常，抗炎剂在给药后一小时内的某个时间点以可检测的血清浓度存在。许多抗炎剂的药代动力学是众所周知的，并且可以相应地调节抗炎剂的相对给药时间。抗炎剂通常在外周施用，即通过血脑屏障与大脑隔离。例如，取决于所讨论的药剂，抗炎剂可以口服、经鼻、静脉内或局部给药。如果抗炎剂与药理剂同时给药，则两者可以作为联合制剂或单独给药。
[0118]
在一些方法中，抗炎剂是当口服或静脉注射至少足够量以在大脑中发挥可检测的药理活性时不穿过血脑屏障的药物。这种药剂可以抑制肥大细胞脱颗粒及其在外周施用活剂引起的后遗症，而自身不会在大脑中产生任何可检测的效果。在一些方法中，在不进行任何共处理的情况下施用抗炎剂，以增加血脑屏障的通透性或衍生或配制抗炎剂，从而增加其穿过血脑屏障能力。然而，在其他方法中，抗炎剂通过其性质、衍生化、制剂或给
药途径，可通过进入大脑或以其他方式影响大脑中的炎症，在抑制肥大细胞脱颗粒和/或其由于内化肽引起的周边后遗症和抑制大脑中的炎症方面发挥双重作用。strbian et al.，wo 04/071531报道了一种肥大细胞脱颗粒抑制剂，甘酸盐，通过i.c.v.给药但不是静脉注射，在动物模型中具有抑制梗死的直接活性。
[0119]
在一些方法中，在与活性剂共同给药之前和/或之后的一天、一周或一个月内，受试者也不用与活性剂共同给药的相同抗炎剂进行。在一些方法中，如果受试者以循环方案(例如，相同的量、递送途径、给药频率、给药日期的时间)用与活性剂共同给药的相同抗炎剂，抗炎剂与活性剂的联合给药在任何或所有剂量、给药途径、给药频率或给药时间方面均不符合循环方案。在一些方法中，不知道受试者患有需要施用与本方法中的活性剂共同施用的抗炎剂的炎症疾病或病。在一些方法中，受试者没有患有可用肥大细胞脱颗粒抑制剂的哮喘或过敏性疾病。在一些方法中，抗炎剂和活性剂在如上定义的窗口内每次疾病发作给药一次且仅一次，发作是出现疾病症状的相对较短时期，两侧是症状消失或减少的较长时期。
[0120]
在已知在不存在抗炎剂的情况下发生炎症反应的条件下，以有效抑制对内化肽的炎症反应的量、频率和途径的方案施用抗炎剂。如果抗炎剂导致炎症症状或体征的任何减少，则抑制炎症反应。炎症反应的症状可能包括发红、皮疹(如荨麻疹)、发热、肿胀、疼痛、刺痛感、瘙痒、恶心、皮疹、口干、麻木、气道充血。炎症反应也可以通过测量诸如血压或心率等体征来监测。或者，可以通过测量肥大细胞脱颗粒释放的组胺或其他化合物的血浆浓度来评估炎症反应。肥大细胞脱颗粒释放的组胺或其他化合物水平升高、血压降低、皮疹(如荨麻疹)或心率降低是肥大细胞脱颗粒的指标。作为一个实际问题，上文讨论的大多数抗炎剂的剂量、方案和给药途径可在医生桌上参考和/或从制造商处获得，并且此类抗炎剂可用于符合此类一般指南的本方法中。
[0121]
尽管为了清楚理解的目的已经详细描述了本发明，但是可以在所附权利要求的范围内实施某些修改。本技术中引用的所有出版物、登录号和专利文件在此以引用的方式整体并入以用于所有目的，就好像每一个单独表示一样。在多于一个序列在不同时间与登录号相关联的范围内，是指截至本技术的有效申请日与登录号相关联的序列。有效申请日是最早披露相关登录号的优先权申请日期。除非从上下文中另外明显看出，本发明的任何元素、实施例、步骤、特征或方面可以与任何其他组合来执行。实施例实施例1
[0122]
我们试图确定，在血管内血栓切除术(evt)可实现快速再灌注的情况下，使用nerinetide，加上或不加常规静脉注射alteplase(阿替普酶)，是否会改善因大血管闭塞导致的缺血性中风受试者的预后，该受试者具有通过成像标准确定的潜在可挽救脑。方法研究方案设计
[0123]
escape-na1是一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照、平行组、单剂量研究，旨在确定静脉注射nerinetide对选择接受血栓切除术的急性缺血性中风患者的疗效和安全性。患者以1:1的比例随机接受单次2.6mg/kg(最大剂量为270mg)静脉内给药的nerinetide或生
理盐水安慰剂，给药时间为10+1分钟。nerinetide和安慰剂在编号的冷藏小瓶中制备为无溶液。随机化和掩蔽
[0124]
使用实时、动态、基于互联网的分层随机最小化程序以1:1的比例对nerinetide或安慰剂进行随机化。使用静脉内阿替普酶(是/否)和宣布的初始血栓切除装置(支架回收器或抽吸装置)发生分层。分层的选择是基于药物-药物或药物-器械相互作用的可能性。分层内发生的随机最小化旨在实现关于年龄、性别、基线美国国立卫生研究院中风量表(nihss)评分(范围为0至42，评分越高表明中风严重程度越高)、动脉闭塞部位、基线alberta中风计划早期计算机断层扫描评分(aspects；范围，0到10，对于ct扫描上每个定义区域的早期缺血性变化的任何证据减去1分)和临床部位的分布平衡。参与者
[0125]
符合条件的患者为随机化时患有致残性缺血性中风的18岁或以上的成年人(基线nihss》5)，他们在中风前在社区中独立发挥功能(barthel指数得分》90[范围为0到100，得分越高表明完成日常生活活动的能力越强])1。中风症状发作(最近正常时间)后最多12小时内进行登记。在血栓切除中心进行了非对比ct和多期cta，以识别确认有颅内动脉近端闭塞的患者，定义为颅内颈内动脉或大脑中动脉的第一段或两者兼有。患者有小到中度的缺血核心(定义为5到10的aspects，范围：0-10；alberta中风项目早期ct评分；aspectsinstroke；较低的分数表明更大程度的急性缺血性变化)和中度至良好的侧支循环(aspectsinstroke/collateral-scoring)，定义为cta上大脑中动脉软脑膜动脉循环填充50％或更多。规程
[0126]
在合格的成像后，使用当前可用的设备对患者进行快速evt。一些患者在evt之前或期间，在转移前的初级医院或血管内中心，根据国家或地区指南的常规护理，接受静脉注射阿替普酶。指南的解释由团队自行决定。仅仅因为这个原因，在中风发作超过4.5小时后接受阿替普酶的患者并未被排除在试验之外。患者必须符合evt医院的纳入和排除标准。患者接受试验药物，单剂量为2.6mg/kg，最大剂量为270mg，基于估计或实际体重(如果已知)，使用专用静脉输液管。试验药物在随机化后尽快给药。
[0127]
时间目标是成像到随机化≤30分钟，成像到研究药物给药≤60分钟，以及成像到动脉通路/穿刺≤60分钟。从成像到再灌注的目标是第90个百分位数≤90分钟，中位数≤75分钟。一般来说，事件的顺序是成像以确定evt的资格、研究随机化、阿替普酶的给药(在某些患者中)、nerinetide的给药和evt的执行。临床评估和结果
[0128]
所有患者都对人口学特征、病史、实验室值和中风严重程度(nihss评分)进行了标准评估。在一些患者中，在定量给药后抽取多达6个连续的血样，用于nerinetide水平的药代动力学分析。
[0129]
主要结果为良好结果，其定义为改良rankin量表(mrs)评分为0-2(范围为0[无症状]至6[死亡])，用于评估神经功能障碍2，亲自评估，或如果无法亲自访问，则在随机分组后90天，由mrs评分中认证的人员通过电话进行评估。次要疗效结果是由nihss定义为0-2的神经系统结果，由barthel指数评分≥95定义的日常生活活动的功能独立性，根据mrs和死
亡率0-1分定义的出功能结果。第三结果包括在24小时成像(mr或ct脑部)上评估心搏量。预先设定的安全性结果都是严重的不良事件和死亡率。影像解释在中心核心实验室进行，临床数据由独立监测员进行验证。梗死体积通过轴向成像上的手动平面测量梗死边界的总和来测量(ct上的636/1099(57.9％)和mri上的463/1099(42.1％))。统计分析
[0130]
该试验设计为具有80％的能力，以检测nerinetide组和安慰剂组在随机分组后90天达到mrs 0-2的患者比例之间的8.7％绝对差异。因为我们使用了随机最小化，所以使用了5000次模拟的事后置换检验，并确认了随机化过程的完整性，该过程在组之间产生了协变量平衡。样本量采用双侧α水平0.05，并在600名患者完成90天随访时进行了一次中期分析，使用o'brien-fleming边界计算α支出(z＝2.784，p＝0.003)。
[0131]
主要分析是对意向(itt)人进行的，是对影响大小的调整估计，包括和静脉注射阿替普酶的分层变量和宣布的初始血管内途径，以及年龄、性别、基线nihss评分、基线aspects、闭塞位置和临床部位的基线协变量。我们报告了使用具有huber-white稳健方差估计函数的多变量泊松回归得出的风险比。这允许与未调整的效果估计进行直接比较，并提供更直观地理解的效果大小的表示。分层方法用于控制多重比较，从主要结果开始，按以下顺序进行次要结果：在跨mrs量表的比例优势模型下对90天mrs进行移位分析，90天时nihss 0-2vs.3或更高，95-100vs.0-90时的bi，90天时的死亡率，以及第90天mrs评分为0-1的受试者比例。证明两侧p》0.05没有差异时和之后的所有结果都被认为是探索性的，没有针对多重性进行调整。对阿替普酶使用和宣布的初始血管内装置选择的两个分层变量进行了效果异质性的探索性分析，以评估药物-药物和药物-装置的相互作用。对统计分析计划中预先确定的另外11个感兴趣的子组进行了探索性分析。梗死体积呈偏态分布，报告为中位数和四分位间距；使用立方根转换体积的t检验比较组的梗塞体积。cox比例风险模型通过分配提供了相对死亡时间的调整风险比。
[0132]
对意向(itt)人进行了分析，该人定义为随机进入试验的所有患者，无论接受何种。已故患者被纳入itt人，mrs评分为6，barthel指数为0，nihss为42。缺失的主要结果(n＝9)被认为是最差的得分，被认为是不良结果(mrs 3-6二分法)，而对于死亡率分析，被认为是死亡。所有分析均使用sas软件(v9.4,sas institute)或stata(v16.0)进行。发现患者
[0133]
在2017年3月1日至2019年8月12日期间，共招募了1105名患者，其中549人分配接受nerinetide，556人接受安慰剂。9名患者的主要结果数据缺失(0.81％；失访：2；撤回同意：7)。这些患者被认为是无反应者。两组的基线特征相似(表1)。
[0134]
在1105名入组患者中，4名(0.4％；每组2名)患者未接受任何研究药物，25名(2.3％；14名安慰剂，11名nerinetide)患者接受了正确的药物，但剂量或持续时间不正确。没有交叉。所有患者均尝试了evt；8例未完成选择性脑血管造影；1例在evt之前撤回同意。nerinetide患者330例(60.1％)和安慰剂患者329例(59.2％)接受了常规的静脉注射阿替普酶。公布的第一个设备是用于850名(76.9％)患者的支架取回器，在nerinetide和安慰剂患者之间平均分配。除了阿替普酶组的起效至时间较长外，两组的总体工作流程
(成像至随机化、成像至研究药物、研究药物至再灌注)和再灌注质量(在脑缺血扩大溶栓(etici)量表上)相似(表1)。在无阿替普酶安慰剂组、无阿替普酶nerinetide组、阿替普司安慰剂组和阿替普普酶nerinetide层中，中风发作至随机化时间分别为160-537分钟(平均275分钟)、142-541分钟(平均270分钟)、112-228分钟(平均161分钟)和109-240分钟(平均152分钟)。换言之，与阿替普酶层相比，中风发作后约两小时用nerinetide无阿替普酶层。在以谚语“时间意味着大脑”为特征的病中，无阿替普酶层代表比阿替普酶层更难的患者子集。
[0135]
从escpae-na1中的22名受试者获得了nerinetide血浆水平，之前从接受单剂量2.6mg/kg nerinetide静脉注射的8名健康志愿者受试者中获得了数据。时间0是预输注时间点。在接受阿替普酶的escape-na-1患者中，与未接受阿替普酶的患者和未接受阿替普酶的历史非中风患者相比，nerinetide血浆浓度降低。条形代表平均值的标准误差。图1显示在不存在阿替普酶的情况下，nerinetide在10分钟后达到峰值水平，并在约120分钟后降至背景水平。在阿替普酶存在的情况下，nerinetide的最大水平降低了50％以上，并在60分钟内降至背景水平。auc也同样降低。(p＝0.0119，混合效应线性回归)。结果
[0136]
在90天时达到mrs 0-2的患者比例的主要结果是nerinetide组为61.4％，安慰剂组为59.2％(adj rr＝1.04；ci95 0.96-1.14；p＝0.350)。次要结果显示在表2a中，探索性亚组显示在图2a、b和图3中。
[0137]
除了未接受阿替普酶的受试者从中风发作到随机分组的平均时间较长外，参与者特征在装置和阿替普酶各层中均得到很好的平衡。这是因为接受阿替普酶的受试者通常在阿替普酶指南规定的窗口内登记(窗口距离上次已知时间《4.5小时)，而那些未接受阿替普酶的人则在方案允许的整个12小时登记窗口内登记。没有证据表明选择第一个血管内装置会改变效果。相比之下，有证据表明常规护理静脉内使用阿替普酶会改变效果(表2b，图2b)。
[0138]
在未接受阿替普酶的层中，接受nerinetide的患者中有59.3％达到了mrs 0-2，与之相比，接受安慰剂的患者中有49.8％达到了mrs 0-2(adj rr 1.18,ci95 1.01-1.38)。90天死亡率的绝对风险降低了7.5％。这导致死亡风险大约减半(adj hr 0.56，ci95 0.35-0.95)。在接受阿替普酶的层中，达到mrs 0-2的患者比例相似(62.7％nerinetide vs 65.7％安慰剂(adj rr 0.97,ci95 0.87-1.08)。观察到的阿替普酶对效果的改变得到了阿替普酶层中血浆nerinetide峰值水平降低的支持(图1)。其他预先指定的感兴趣的探索性亚组没有显示出不同效果的证据(图3)。
[0139]
nerinetide组的中位梗死体积为26.0(iqr 6.6-101.5)ml，安慰剂组为23.7(iqr 6.4-78.9)ml。按公布的血管内装置分层，nerinetide组和安慰剂组之间的梗死体积没有差异。在阿替普酶层中，组之间的中位梗死体积(21.1 vs 22.7ml)没有差异。在无阿替普酶层中，nerinetide组的中位梗死体积减少(39.2 vs 26.7ml)(表2b)。安全性
[0140]
安全人包括接受任何数量研究药物的所有患者(n＝1101)。重要的安全结果没有差异。(表3)。解释
[0141]
在无阿替普酶层中，nerinetide与改善结果相关，而在阿替普酶层中，没有观察到益处，绝对风险差异略微(非显著)有利于安慰剂。
[0142]
观察到阿替普酶对nerinetide的效果改变是出乎意料的。来自临床前动物研究的现有数据表明，当在阿替普酶后使用nerinetide时，nerinetide的效果得以保留。没有预测到阿替普酶对人的nerinetide反应的巨大影响。这一发现可以通过阿替普酶和nerinetide之间的药物-药物相互作用来解释，使nerinetide在阿替普酶层中的效果无效，而在无阿替普酶层中9.4％绝对获益(10-11名患者需要)。nerinetide在阿替普酶层中缺乏有效性在生物学上是合理的。nerinetide不影响阿替普酶3的活性。然而，nerinetide具有被纤溶酶切割的氨基酸序列，纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，由组织纤溶酶原激活剂(如阿替普酶)从循环的纤溶酶原产生，并在动物体内被阿替普酶切割。nerinetide在阿替普酶层中缺乏益处可能是由于纤溶酶对nerinetide的酶促切割导致nerinetide的亚浓度，这得到了来自一部分试验参与者的药代动力学数据的支持。由于nerinetide的裂解是阿替普酶的间接作用，因此与活性持续时间和正在进行的纤溶酶生成相比，阿替普酶输注和nerinetide给药之间的持续时间可能不太重要。无阿替普酶层中临床结果的改善、死亡率的降低和梗塞体积的减少与药代动力学观察相结合，提供了令人信服的证据，表明效果改变的临床观察不是偶然发现。
[0143]
阿替普酶层的患者通常在阿替普酶的窗口内(中风发病后最多4.5小时)入组，而无阿替普酶层的患者则在试验的12小时中风发病至随机化窗口内入组。总的来说，阿替普酶的使用与时间存在共线性；无阿替普酶层更有可能包括起病至随机化时间较长的患者。
[0144]
nerinetide组和安慰剂组发生的严重不良事件数量相同。在动物中高剂量时，nerinetide会导致循环组胺的短暂升高，这被认为是由于非免疫介导的肥大细胞脱颗粒，类似于由高电荷阳离子分子(如鱼精蛋白和万古霉素)引起的脱颗粒。这可能导致不良的组胺触发反应，例如低血压、潮红、荨麻疹和瘙痒。与安慰剂相比，nerinetide患者的不良事件发生率没有显著差异。然而，与安慰剂相比，使用该药物的短暂性低血压、肺炎和充血性心力衰竭的病例数量更多。在无阿替普酶层中，与安慰剂相比，nerinetide组的中风进展、复发性中风和出血性转化的病例数少于安慰剂组。表1
–
基线特征
*n＝546(3个缺失数据)；**n＝1090，因为影像缺失或无法评分；
§
在没有目击到中风的情况下，中风发作被定义为最近一次观察到健康的时间。这通常意味着患者在醒来时中风的情况下上床睡觉的时间。
所有值显示为中位数(iqr)或n(％)；nihss＝美国国立卫生研究院中风量表；ecg＝心电图；aspects＝阿尔伯塔中风计划早期ct评分；ica＝颈内动脉；evt＝血管内血栓切除术；etici＝扩大脑缺血溶栓。表2a
–
总体结果*中位数的绝对体积差。**β系数表示与对照相比，nerinetide(na-1)的立方根体积(ml
1/3
)的调整减少。n＝1099，因为成像时体积缺失或无法测量。平均体积为73.1ml(安慰剂)和71.1ml(nerinetide)。
§
未对9名死亡结局缺失的患者进行插补，安慰剂组有74/550(13.5％)例死亡，nerinetide组有64/546(11.7％)例死亡；rr 0.87(ci95 0.64-1.19)mrs＝改良rankin量表；nihss＝国家卫生研究院中风量表；bi＝修正的barthel指数；rr＝风险比；ci
95
＝95％置信区间注：风险比率是使用具有huber-white稳健方差估计函数的多变量泊松回归得出的。这种方法不同于我们的sap(它声明我们将通过多变量逻辑回归报告优势比)，因为它是在同行评审时由审稿人和编辑推荐的。不满足比例优势假设(分数测试)，因此未报告修改后的rankin量表中“转变”的共同优势比。调整：年龄(y)、性别、基线nihss评分、核心实验室读取的aspects评分、mca vs ica的闭塞位置、公布的血管内方法和部位。
表2b
–
阿替普酶的结果阿替普酶的结果*中位数的绝对体积差。**β系数表示与对照相比，nerinetide(na-1)的立方根体积(ml
1/3
)的调整减少。阿替普酶对nerinetide对梗死体积结果的影响修改，p
相互作用
＝0.0400。在无阿替普酶组中，平均体积为87.2ml(安慰剂)和67.8ml(nerinetide)。在阿替普酶组，平均体积为63.3ml(安慰剂)和73.3ml(nerinetide)。
§
未对9名死亡结局缺失的患者进行插补：(1)无阿替普酶层-安慰剂组有43/224(19.2％)人死亡，nerinetide组有25/216(11.6％)人死亡；rr 0.60(ci95 0.38-0.95)；(2)阿替普酶层—安慰剂组有31/326(9.5％)人死亡，nerinetide组有39/330(11.8％)人死亡；
rr 1.24(ci95 0.80-1.94)。注：对于mrs 0-2结果，阿替普酶对nerinetide的影响修改，p
相互作用
＝0.0330。以最差可能得分估算的二元结果的缺失数据(无阿替普酶层，对照组3分，nerinetide 3分；阿替普酶层，控制组3分，nerinetide 0分)。风险比率是使用带有huber-white稳健方差估计函数的多变量泊松回归得出的。这种方法不同于我们的sap(它声明我们将通过多变量逻辑回归报告优势比)，因为它是在同行评审时由审稿人和编辑推荐的。不满足比例优势假设(分数测试)，因此未报告修改后的rankin量表中“转变”的共同优势比。调整：年龄(y)、性别、基线nihss评分、核心实验室读取的aspects评分、mca vs ica的闭塞位置、公布的血管内方法和部位。mrs＝改良rankin量表；nihss＝美国国立卫生研究院中风量表；bi＝修正的barthel指数；rr＝风险比；ci
95
＝95％置信区间。表3
–
按meddra首选术语紧急严重不良事件按meddra首选术语紧急严重不良事件*未调整注：安全人仅包括接受任何剂量研究药物的患者(n＝1101)；rr＝风险比。症状性颅内出血(ich)包括meddra pt代码：血管手术并发症、中风出血性转化、出血性中风、颅内出血、脑出血、蛛网膜下腔出血。肺炎包括meddra pt代码：肺炎、吸入性肺炎、细菌性肺炎。尿路感染包括meddra pt代码：尿路感染和尿脓毒症。**nerinetide组中的1例发生在给药后11天，其余低血压事件发生在给药的同一天。实施例2
[0145]
该实施例研究了纤溶酶对nerinetide的裂解，并描述了抑制抗纤溶酶裂解的psd-95的变体活性剂。
结果nerinetide被纤溶酶切割
[0146]
nerinetide不具有任何内在的纤维蛋白溶解活性，并且不影响溶栓剂(例如阿替普酶或替奈普酶)的活性，但反之则不同。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，被溶栓剂激活以溶解纤维蛋白血栓并持续数小时(chandler et al.,haemostasis 30,204-218(2000)。纤溶酶在碱性残基的c端侧具有切割特异性，因此可能发生在来自nerinetide n端的残基3、4、5、6、7、9、11和12之后。在37℃磷酸盐缓冲盐水中孵育nerinetide(18mg/ml)和纤溶酶(1mg/ml)并通过lc/ms分析样品后，观察到与这些切割位点一致的切割产物(图4a)。通过在37℃血浆中孵育65μg/ml nerinetide和阿替普酶并通过hplc测试nerinetide水平，我们直接在大鼠和人血浆中测试了这一点(图4b，c)。65μg/ml nerinetide的浓度代表接受2.6mg/kg剂量作为推注的75kg人的理论峰值浓度。在60分钟内添加阿替普酶以模拟临床给药方法(研究方法)。选择阿替普酶浓度(如图4b[大鼠]和图4c[人]所示)模拟人在初始10％推注0.9mg/kg剂量(22.5μg/ml)，以及大鼠中该剂量的3倍和6倍，因为大鼠纤溶系统可能对人重组tpa不太敏感(korninger,thromb haemost 46,561-565(1981))。添加阿替普酶以浓度依赖性方式降低大鼠血浆中的nerinetide含量(图4b)，并且“人当量”剂量22.5μg/ml阿替普酶的作用在大鼠和人血浆中相似(图4b和4c)。
[0147]
由于escape-na1试验中nerinetide的作用被阿替普酶否定，我们接下来评估了阿替普酶对大鼠nerinetide药代动力学(pk)的影响。阿替普酶以0.9mg/kg(人体剂量)和5.4mg/kg(人体剂量的6倍)在模拟临床方案的输注中给药(10％推注，然后60分钟输注剩余部分)。在阿替普酶输注开始时，以7.6mg/kg的剂量静脉推注nerinetide。这是先前中风研究中最常用于大鼠的剂量(5,7,15)，导致大鼠的c
max
与接受escape-na1中使用的剂量2.6mg/kg的人类产生的相似。nerinetide与人剂量的阿替普酶共同给药导致nerinetide的c
max
和auc不显著降低(图4d，e)。然而，在六倍于人体剂量(5.4mg/kg)时，阿替普酶导致nerinetide的平均c
max
和auc显著降低(分别为49.5％和44％)。在动物中的这一发现支持来自escape-na1试验的pk数据，在该试验中，阿替普酶的患者表现出较低的nerinetide血浆水平。
[0148]
高剂量阿替普酶对全长nerinetide的切割是不完全的，增加了一些活物仍然可以实现神经保护的可能性。大鼠短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)模型中nerinetide的剂量反应研究支持了这一点。在tmcao后60分钟，将nerinetide和lodoxamide以推注方式静脉内给予大鼠。图11a显示了tmcao后24小时的半球梗塞体积测量值。a中的条形代表平均值
±
sd，绘制了所有单独的数据点。a中的星号表示与载体组(单因素方差分析事后tukey对多重比较检验的校正)n＝12-14只动物/组相比时p《0.01。图11b显示了tmcao后24小时的神经学评分。与载体组相比时，显著差异用星号表示(kruskal-wallis等级方差分析，以及多重比较检验的事后dunn校正，*p《0.01)。媒介：仅pbs。加扰：不能结合psd-95的ada肽。低至0.25mg/kg的剂量可显著减少梗塞体积(p＝0.01)并改善神经功能。低至0.025mg/kg的剂量也是有效的。高达至少25mg/kg的剂量也是有效的，最高效力约为15mg/kg。观察到的宽范围归因于nerinetide，而不是肥大细胞脱颗粒抑制剂lodoxamide，它存在于所有溶液中以避免由于组胺释放引起的潜在低血压。剂量分离恢复了nerinetide的益处
[0149]
在人等效浓度的大鼠和人中，nerinetide的半衰期约为5-10分钟(图4d)，这与健康人志愿者中nerinetide的半衰期相似(图9)。nerinetide在大鼠和人中的短半衰期不能用降解来解释，因为血浆中的降解很慢(比较图4b和4d)。这表明，nerinetide在进入其他组织时会迅速离开血管内隔室。如果是这样，那么在给予阿替普酶之前给予nerinetide可以消除其在血流中的裂解并保持其神经保护益处。
[0150]
为了测试这一点，雄性sprague-dawley大鼠(10-12周大；270-310克；查尔斯河，蒙特利尔，qc，加拿大)接受了大脑中动脉栓塞(emcao)，这是通过将自体血血栓引入大脑中动脉而产生的。在缺血发作后90分钟开始用总剂量为5.4mg/kg的静脉内阿替普酶实现再灌注。阿替普酶使用人体注射方案给药，其中总剂量的10％以推注方式给药，其余90％的剂量在60分钟内输注。阿替普酶的剂量是人剂量的6倍，预计大鼠纤溶系统可能对人重组tpa不太敏感。选择该剂量是因为在试点研究中，较高剂量的阿替普酶(10倍人体剂量)会因中风出血性转化而产生不可接受的死亡率。在阿替普酶给药开始前30分钟或同时给药nerinetide(图5a)，剂量为7.6mg/kg。该剂量导致的pk参数(cmax和auc)与接受2.6mg/kg临床有效剂量的人所达到的相似(比较图4d和图9)。在24小时评估梗塞体积、半球肿胀和神经系统评分。
[0151]
单独使用nerinetide，在emcao后60分钟给药，梗死体积减少59.2％(从427
±
27mm3到175
±
40mm3)，而在emcao后60分钟给药时，单独使用阿替普酶可使梗死体积减少26％，而在emcao后90分钟给药时，梗死体积减少18％(图5b)。在emcao后60分钟与阿替普酶同时给药时，nerinetide的有益作用完全消除。相比之下，nerinetide在60分钟给药后在30分钟后使用阿替普酶时非常有效(70％的梗塞体积减少)。nerinetide和阿替普酶之间30分钟剂量分离的这种有益效果同样反映在减少半球肿胀(图5c)和改善emcao后的神经系统评分上(图5d)。各组之间在生理参数、死亡率或排除方面没有差异。
[0152]
我们进行了进一步的pk研究，以探索必要的剂量分离间隔以减轻降解。这些研究是在食蟹猴(macaca fascicularis)中进行的，以最大限度地提高它们与人类的相关性。nerinetide以2.6mg/kg的剂量静脉输注10分钟。这种给药方案对遭受lvo中风的猕猴具有神经保护作用(cook et al.，nature 483,213-217(2012))，并用于2期enact试验(lancet neurol 11,942-950(2012))以及escape-na1试验(lancet 395,878-887(2020))。我们检查了在nerinetide输注开始时、在10分钟nerinetide输注结束时或在nerinetide输注结束后10分钟开始服用阿替普酶的情况。阿替普酶(1mg/kg)通过单独的静脉注射管以10％推注给药，然后根据其临床用途在1小时内输注剩余的90％。
[0153]
nerinetide与阿替普酶的共同给药导致nerinetide的c
max
降低47.4％和auc降低53.9％(图10a-c)。在nerinetide输注结束时开始使用阿替普酶导致c
max
适度降低23.1％和auc降低32.3％，但仍达到基于动物模型可能有效的血浆浓度。在10分钟nerinetide输注结束后等待10分钟(或等效地从输注开始后等待20分钟)消除了由阿替普酶引起的c
max
或auc下降到由误差条指示的测量误差范围内(图10a-c)。
[0154]
基于这些结果，剂量分离方法是一种实用的策略，可以在用阿替普酶的动物中通过nerinetide保持神经保护作用。d氨基酸使nerinetide对溶栓剂的裂解不敏感
[0155]
我们推断，虽然与psd-95pdz2的特异性结合可能需要c端氨基酸的l-对映体构型，
但通过用l代替d氨基酸可以使tat部分抵抗蛋白酶降解。在此过程中，我们生成了一种称为d-tat-l-2b9c的肽，它包含与glun2b c端的9个l氨基酸融合的tat的11个d氨基酸(ygrkkrrqrrrklssiesdv seq id no:89)。在elisa测定中，如同nerinetide与psd95的靶pdz2结构域的结合，该肽具有基本相似的结合(图6a)。结合是特异性的，因为在最后3个c端残基中包含双点突变的相同d-tat-l-2b9c构建体(lys-leu-ser-ser-ile-glu-ala-asp-ala(seq id no:90)；称为d-tat-l-2b9caa)未能结合。
[0156]
单独的nerinetide或d-tat-l-2b9c在37℃的磷酸盐缓冲盐水中是稳定的，但将nerinetide与纤溶酶一起孵育会导致其快速降解(图6b)。相比之下，d-tat-l-2b9c在相同条件下没有表现出明显的降解。两者都不受与阿替普酶共孵育的影响(图6b)，因为不是nerinetide，而是纤溶酶原是阿替普酶的直接底物。类似地，在没有阿替普酶的情况下，单独的nerinetide和d-tat-l-2b9c在大鼠和人血浆中都是稳定的(图6c，d)。然而，添加阿替普酶(rt-pa；135μg/ml)导致nerinetide快速降解，但d-tat-l-2b9c没有(图6c，d)。我们还用替奈普酶(tnk，tenecteplase)进行了类似的实验，这是一种组织纤溶酶原激活剂，目前用于可能因中风而流行的急性心肌梗塞。向大鼠和人血浆中添加tnk导致nerinetide的快速消除，但不是d-tat-l-2b9c(图6e，f)。
[0157]
当对大鼠进行静脉推注时，nerinetide和d-tat-l-2b9c均表现出基本相似的药代动力学特征，略微偏向于d-tat-l-2b9c(更高的c
max
和auc)。在没有溶栓剂的情况下，尽管它们具有相对的血浆稳定性(图6c-f)，但两者都从血管内隔室迅速消失(图7a-c)，这支持了这样一种假设，即两者的药代动力学更多地受快速分布到组织中而非蛋白水解分解的支配。d-tat-l-2b9c与阿替普酶合用时是一种有效的神经保护剂
[0158]
在tmcao大鼠模型中，d-tat-l-2b9c和nerinetide在减少梗塞体积、减少半球肿胀和改善神经系统评分方面同样有效。因此，我们检查了d-tat-l-2b9c的有效性是否会随着阿替普酶的同时给药而得以保留。
[0159]
如已经描述的那样，雄性sprague-dawley大鼠接受了emcao。在60分钟时以推注方式给予nerinetide(7.6mg/kg)或d-tat-l-2b9c(7.6mg/kg)。在emcao后60分钟也开始使用阿替普酶(60分钟内5.4mg/kg)，同时使用抑制psd-95的活性剂。在24小时评估了神经学评分，梗塞量和半球肿胀(图8a)。
[0160]
单独使用nerinetide，在emcao后60分钟给药，在没有阿替普酶的情况下显著减少梗死体积(从458
±
39mm3到296
±
66mm3)。当同时给予nerinetide和阿替普酶时，这种作用完全消除(图8b)。相比之下，在没有阿替普酶的情况下，用d-tat-l-2b9c与单独使用nerinetide一样有效，并且当同时给予d-tat-l-2b9c和阿替普酶时，这种效果持续存在(图8b)。当测量梗塞体积(图8b)、半球肿胀(图8c)和神经系统评分(图8d)时，d-tat-l-2b9c的有益效果是显而易见的。各组之间的生理参数、死亡率或排除没有差异。讨论
[0161]
我们已经表明，在开始阿替普酶之前短时间给予nerinetide可完全消除阿替普酶对nerinetide的失活(图6a-f)。这种方法是由人和大鼠之间相似的pk考虑驱动的(图4d)，并且与纤维蛋白溶解生物学的物种间差异无关。由于其在血浆中的半衰期短，nerinetide离开血管内隔室并且在阿替普酶给药30分钟后不再受到阿替普酶的实质性裂
解。
[0162]
作为剂量分离的替代方法，psd-95的蛋白质-蛋白质相互作用可以用蛋白酶不敏感的抑制剂来解决。我们已经表明，使nerinetide对溶栓剂的切割不敏感的一种实用方法是将纤溶酶敏感残基(即，至少是tat蛋白转导结构域)转化为d氨基酸。保留了以pdz域结合[t/s]-xv基序终止的共有序列，导致nerinetide和d-tat-l-2b9c都具有与psd-95的等效结合和神经保护功效。
[0163]
d-tat-l-2b9c等药物可能在确定中风后立即给药，甚至在到达医院之前就可以使用，目前frontier试验中的nerinetide就是这种情况。如果的医疗专业人员认为合适，它也可以在中风患者的护理路径中的任何其他时间，在给予溶栓剂之前、同时或之后给予。材料和方法动物
[0164]
实验是在10-12周龄且体重在270-320克之间的麻醉雄性sprague-dawley大鼠(查尔斯河；蒙特利尔，qc，加拿大)上进行的。将大鼠圈养在无菌笼子中，在整个实验过程中允许自由活动并随意获取食物和水。研究药物
[0165]
nerinetide由nono inc.(多伦多,加拿大)合成并配制为18mg/ml。安慰剂由在视觉上相同的小瓶中提供的磷酸盐缓冲盐水组成。冻干的d-tat-l-2b9c由genscript(中国)合成，并进行肽水解和氨基酸液相谱分析，以获得肽含量的精确测量。重构的肽在-20℃下储存直至使用。将人rt-pa(阿替普酶/cathflo；roche,旧金山,美国)在无菌注射用水(usp 3ml,airlife,al7023)中复溶至终浓度为1mg/ml，并在2至8℃下储存直至使用。将用于稳定性研究的tnk(用于溶液的50mg粉末，hoffmann-la roche limited)在无菌注射用水(swfi)中重新配制至最终浓度为37.5μg/ml或6.25μg/m，并储存在2至8℃直至使用。在所有动物实验中，nerinetide或d-tat-l-2b9c作为推注给药。肥大细胞脱颗粒抑制剂lodoxamide(洛多沙胺)与两者共同给药(0.1mg/kg)以避免由于组胺释放引起的潜在低血压，这是阳离子肽的潜在影响。所有实验中的rt-pa均在60分钟内给药(10％作为推注，随后60分钟输注剩余的90％)。其它试剂
[0166]
除非另有说明，否则所有产品均购自sigma-aldrich(oakville,on,加拿大)。hplc级乙腈、三氟乙酸和水购自fisher scientific(fair lawn,nj,美国)。tris、高氯酸和磷酸盐缓冲盐水购自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。使用商业大鼠血浆(innovative research inc，带有na-edta的大鼠sprague dawley血浆[目录号：irtsdplanae10ml])和人血浆(innovative research inc，带有na-edta的合并人血浆[目录号：iplanae10ml])。中风研究
[0167]
这些研究设计为在p＝0.05时，具有80％的能力来检测对照组和组之间40％的绝对差异。动物随机化、药物分配和药物制备由不直接参与手术或结果评估的研究助理进行。nerinetide和d-tat-l-2b9c在500μl等分试样中以7.6mg/ml的浓度新鲜制备。阿替普酶由冻干药物制备，与匹配的安慰剂一样，储存在相同的玻璃管中。药物保持在4℃直到使用前10分钟。外科医生和负责手术、心搏量测量、行为评估和统计分析的研究人员对分配不知情。
终止反应。使用synergy h1读数器在450nm处测定吸光度。统计信息
[0174]
使用双因素重复测量方差分析分析肽浓度的变化，然后进行sidak校正以进行多重比较。通过使用非隔室分析并采用线性插值的pksolver软件(美国)，获得峰值血浆浓度(c
max
)的药代动力学(pk)参数和从0到最后测量浓度(auc)的血浆浓度-时间曲线下的面积。对于中风研究，组间差异使用单因素方差分析和tukey校正进行多重比较测试。使用非参数kruskal-wallis方差分析和事后dunn校正来分析组间神经系统评分评估的差异。对因任何原因(包括蛛网膜下腔出血或出血转化)而过早死亡的动物的值进行估算，以反映所有动物的最差神经评分和最大心搏量。

技术特征：

1.一种患有局部缺血或有局部缺血风险的受试者体的方法，包括向受试者施用抑制psd-95、可被纤溶酶切割的活性剂，和再灌注，其中所述受试者体包括：被给予抑制psd-95的活性剂和机械再灌注或血管扩张剂或高血压剂以实现再灌注的受试者；和/或被给予抑制psd-95的所述活性剂和溶栓剂以实现再灌注的受试者，其中抑制psd-95的所述活性剂在所述溶栓剂之前至少10分钟施用，并且所述受试者体缺少：在给予抑制psd-95的所述活性剂之前不到3小时或之后不到10分钟给予溶栓剂的受试者。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有缺血性中风。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前少于4小时或在抑制psd-95的所述活性剂之后少于10分钟给予所述溶栓剂的受试者。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前少于8小时和在给予抑制psd-95的所述活性剂之后少于10分钟给予所述溶栓剂的受试者。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到10分钟给予所述溶栓剂的受试者。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到20分钟给予所述溶栓剂的受试者。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到30分钟给予所述溶栓剂的受试者。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体缺少在抑制psd-95的所述活性剂之前或在给予抑制psd-95的所述活性剂之后不到60分钟给予所述溶栓剂的受试者。9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述受试者体包括被给予抑制psd-95的所述活性剂和机械再灌注而不接受溶栓剂的受试者。10.根据权利要求1或2所述的方法，其中接受的所述受试者体包括：(a)被给予抑制psd-95的所述活性剂和机械再灌注、血管扩张剂、或高血压剂，但不使用溶栓剂的受试者；和(b)被给予抑制psd-95的活性剂和溶栓剂的受试者，其中所述溶栓剂在抑制psd-95的所述活性剂之后至少10、20、30、40、50、60或120分钟施用。11.根据权利要求10所述的方法，其中至少一些根据项目(b)的受试者也被给予机械再灌注。12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体包括当受试者在中风发作后不到3小时内被确定有资格接受所述溶栓剂时，在中风发作后超过3或4.5小时被给予所述溶栓剂的受试者。13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述体包括通过鼻内或鞘内注射给予抑制psd-95的所述活性剂的受试者。14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述体包括至少100个受试者。15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述体包括在10分钟内被给予抑制psd-95的所述活性剂，并且在开始被给予所述活性剂至少20分钟后被给予所述溶栓剂的受
试者。16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。17.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述活性剂是nerinetide。18.一种接受血管内血栓切除术以缺血性中风的受试者体的方法，包括：向一些所述受试者给予抑制psd-95、可被纤溶酶切割的活性剂和溶栓剂，其中在所述溶栓剂之前至少10、20、30、40、50、60或120分钟给予抑制psd-95的所述活性剂，以及将抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂给予所述体中的其他受试者，但不能同时给予两者。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者在接受血管内血栓切除术之前，接受抑制psd-95的所述活性剂和所述溶栓剂。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述受试者在接受血管内血栓切除术之前，接受抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂，但不能同时接受两者。21.根据权利要求18-20任一项所述的方法，其中在接受抑制psd-95的所述活性剂和溶栓剂的受试者中，抑制psd-95的所述活性剂在所述溶栓剂之前至少10分钟给药，并且将抑制psd-95的所述活性剂或所述溶栓剂但不是两者都给予其他受试者。22.一种患有局部缺血或有局部缺血风险的受试者体的方法，包括向所述受试者给予抑制psd-95的活性剂和溶栓剂，其中所述受试者体包括：被给予抑制psd-95、可被纤溶酶切割的第一活性剂和溶栓剂的受试者，其中抑制psd-95的所述第一活性剂以选自所述溶栓剂之前至少10、20、30、40、50、60或120分钟的间隔给予；和被给予抑制psd-95、抗纤溶酶裂解的第二活性剂和溶栓剂的受试者，其中在抑制psd-95的所述活性剂之前或之后的间隔内给予所述溶栓剂。23.一种怀疑患有缺血性中风的受试者的方法，包括：确定所述受试者接受溶栓剂的资格；给予抑制psd-95、可被纤溶酶裂解的活性剂；以及至少10、20、30、40、50、60或120分钟后，给予所述溶栓剂。24.根据权利要求23所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内给药，并且所述溶栓剂在开始给予所述活性剂至少20分钟后给药。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述活性剂是nerinetide。27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中成像确定缺血性中风的存在和脑出血的不存在。28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在缺血性中风发作后3小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后3小时以上给予所述溶栓剂。29.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在缺血性中风发作后4.5小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后4.5小时以上给予所述溶栓剂。30.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在缺血性中风发作后3小时内确定资格，并且在缺血性中风发作后4.5小时以上给予所述溶栓剂。
31.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂包括在c端包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:1)的肽或在c端包含x
1-[t/s]-x2v(seq id no:2)的肽，其中[t/s]是备选氨基酸，x1选自e、q和a，或其类似物，x2选自a、q、d、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d和n-me-n或其类似物，以及与所述肽的n端连接的内化肽。32.根据权利要求31所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂是nerinetide。33.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述溶栓剂是tpa。34.一种用抑制psd-95、可被纤溶酶裂解的活性剂中风受试者的方法，其中所述活性剂是：在溶栓剂前至少10分钟给药，或在溶栓剂给药后至少2、3、4小时或更长时间给药，或在没有溶栓剂的情况下给药。35.根据权利要求34所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内给药，并且所述溶栓剂在开始给予所述活性剂至少20分钟后给药。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述活性剂是nerinetide。38.一种使抑制psd-95、可被纤溶酶裂解的活性剂被溶栓剂降解最小化的方法，包括：在所述溶栓剂前至少10分钟给予抑制psd-95的所述活性剂，或在给予所述溶栓剂后至少2、3、4小时或更长时间给予抑制psd-95的所述活性剂，或在没有所述溶栓剂的情况下给予抑制psd-95的所述活性剂，或通过鼻内或鞘内给予抑制psd-95的所述活性剂。39.根据权利要求38所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内给药，并且所述溶栓剂在开始给予所述活性剂后至少20分钟给药。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述活性剂是全部由l氨基酸组成的肽。41.根据权利要求38所述的方法，其中所述活性剂是nerinetide。42.一种缺血性中风的方法，包括向患有缺血性中风的受试者给予抑制psd-95、可被纤溶酶裂解的活性剂，并且在开始给予所述活性剂后20-40分钟给予溶栓剂。43.根据权利要求42所述的方法，其中抑制psd-95的所述活性剂在10分钟内被抑制，并且在开始给予所述活性剂后20-30分钟给予所述溶栓剂。

技术总结

PSD-95的肽抑制剂Tat-NR2B9c被溶栓剂诱导的血清蛋白酶(纤溶酶)切割。相反，Tat-NR2B9c对溶栓剂的活性没有不利影响。可以通过几种方法减少或避免溶栓剂对Tat-NR2B9c的失活，包括间隔施用相应的药物以避免Tat-NR2B9c和纤溶酶之间血浆停留的实质性重叠，使用机械而不是溶栓再灌注或使用抑制PSD-95、不受纤溶酶裂解的活性剂，例如Tat-NR2B9c的D氨基酸变体。体。体。