一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物及其制备方法

1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种能靶向肿瘤糖酵解和线粒体代谢的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物及其制备方法。

背景技术：

2.胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)是中枢神经系统最常见的无法治愈的高侵袭性恶性肿瘤，占所有原发性cns肿瘤的14.3％和所有cns原发性恶性肿瘤的49.2％。尽管方式上取得一些进展，建立起stupp方案及电场等综合规范，但肿瘤的异质性限制各种方式的效果，肿瘤对化疗和放疗的抵抗使复发不可避免，导致肿瘤患者仍预后不良，一年生存率约40.9％五年生存率约6.6％。目前对高级别胶质瘤的包括肿瘤最大范围的安全切除及替莫唑胺同步放化疗。
3.基因组学研究对肿瘤的发病机制和靶向带来变革性改变，然而仅有少数具有某些特殊突变的肿瘤患者可能从靶向中获益。目前对胶质瘤异质性的认识取得显著进步，但除替莫唑胺外，没有证实对胶质瘤明确有效的新药。胶质瘤基因组学研究发现一些具有诊断和预后评估的分子标志物，可以很好第解释肿瘤形成过程中的复杂性。最近应用单细胞rna测序研究胶质瘤的异质性产生许多新认识，包括遗传异质性、表观遗传异质性、肿瘤微环境异质性。其中，代谢重编程是胶质瘤发生发展的重要一环，使得肿瘤细胞在微环境的剧烈变化中存活下来，在代谢适应方面表现出显著的可塑性。
4.异柠檬酸脱氢酶(idh)突变是胶质瘤发生的重要早期事件，具有诊断和预后评估价值。目前，靶向idh1突变的抑制剂已被批准用于急性髓系细胞白血病、软骨肉瘤和胆管癌，而在idh突变的胶质瘤中其临床疗效未得到肯定。idh1-r132h抑制剂agi-5198以剂量依赖性方式阻断突变酶产生2-羟戊二酸(2-hg),但用于胶质瘤时，却产生与放疗的矛盾作用，逆转辐射对肿瘤细胞的杀伤作用。2-脱氧葡萄糖是一种葡萄糖类似物，可以被磷酸化但不能进一步加工，竞争性地抑制己糖激酶并发挥负反馈作用，已在gbm和前列腺癌中进行临床试验，但由于神经毒性在gbm中受到剂量限制。研究发现多种药物靶向线粒体代谢抑制gbm，如尼日利亚菌素、二甲双胍、苯乙双胍、伊维菌素、等，但均未能发挥预期的杀伤肿瘤细胞作用，其中代谢重编程在其中发挥重要作用。靶向人血管内皮生长因子(vegf)的贝伐单抗可以促进葡萄糖摄取及转化为乳酸，减少葡萄糖流入三羧酸(tca)循环，临床研究中未取得实质性患者总生存期的延长，代谢重编程在贝伐单抗胶质瘤失败中有重要作用。gbm抗代谢面临诸多困难，肿瘤代谢重编程以及放化疗后的代谢性调节也为肿瘤的抗代谢提出更多挑战。

技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种能靶向肿瘤糖酵解和线粒体代谢的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物及其制备方法。本发明所述联合抗代谢药物，能够用于高级别胶质瘤，通过对肿瘤特异性细胞糖代谢靶点的多重抑制作用，在有
效杀死肿瘤细胞同时减少耐药性发生，副作用小，从而有效解决现有技术的抗代谢药物在肿瘤过程中，容易出现明显的代谢重编程，发生代偿等问题。
6.本发明所采用的技术方案为：
7.一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，原料组分包括：糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂。
8.进一步优选所述高级别胶质瘤的联合抗代谢药物的原料组分中，糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂的摩尔比为150：60：10000：15。
9.所述糖酵解抑制剂为3-溴丙酮酸、2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)、氯尼达明中的一种或几种。
10.所述乳酸代谢抑制剂为丙二酸衍生物、草氨酸钠、培黄素中的一种或几种。
11.所述线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂为二、tm-1、azd7545、pdhk-in中的一种或几种。
12.所述线粒体清除剂为氟桂利嗪中的一种或几种。
13.所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物的制备方法，包括以下步骤：
14.将糖酵解抑制剂、线粒体清除剂分别分散于有机溶剂中，将乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂分别分散于水中，之后将四种溶液进行混合均匀，即得所述高级别胶质瘤的联合抗代谢药物。
15.将乳酸代谢抑制剂分散于dmso中，配制得到5-20mm的乳酸代谢抑制剂原液。
16.将线粒体清除剂分散于dmso中，配制得到10-30mm的线粒体清除剂原液。
17.将糖酵解抑制剂分散于水中，配制得到25-100mm的糖酵解抑制剂原液；
18.将线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂分散于水中，配制得到100-400mm的线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂原液。
19.本技术发明人在长期研究中发现，3-溴丙酮酸能够抑制多种关键的糖酵解酶或相关代谢酶，如抑制糖酵解(如hk2、gapdh和3-pgk)、线粒体oxphos(如pdh、sdh、idh和αkd)、ppp(如g6pdh)等，还通过凋亡或坏死选择性地诱导细胞死亡。丙二酸衍生物az-33可逆转warburg效应，使得肿瘤oxphos增加和线粒体介导的细胞凋亡的重新激活。二(dichloroacetate,dca)能够激活癌细胞中的线粒体，抑制糖酵解，恢复线粒体oxphos功能，减少细胞内乳酸的产生并增加大量的活性氧，促进癌细胞凋亡，从而显示出对多种癌症的抗肿瘤作用，患者耐受性良好。氟桂利嗪对胶质母细胞瘤具有抑制生长和促进细胞凋亡作用，并与替莫唑胺、3-溴丙酮酸和二协同发挥抗肿瘤效应。
20.本发明的有益效果为：
21.本发明所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，原料组分包括糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂，通过联合糖酵解抑制、乳酸代谢抑制、线粒体氧化磷酸化抑制和线粒体清除四种不同机制起作用的药物，从而实现对高级别胶质瘤肿瘤细胞的主要供能方式糖代谢途径进行全面抑制，协同起到更好的杀伤肿瘤细胞的作用。本发明最终制备得到的联合抗代谢药物方案，能够用于高级别胶质瘤，通过对肿瘤特异性细胞糖代谢靶点的多重抑制作用，在有效杀死肿瘤细胞同时减少耐药性发生，副作用小，从而有效解决现有技术的抗代谢药物在肿瘤过程中，容易出
现明显的代谢重编程，发生代偿等问题。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1显示单抗代谢药物对u87mg细胞系的毒性检测结果；
24.图2显示单抗代谢药物对u251细胞系的毒性检测结果；
25.图3显示联合抗代谢药物对u87mg细胞系的毒性检测结果；
26.图4显示联合抗代谢药物对u251细胞系的毒性检测结果。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
28.实施例1
29.本实施例提供一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，原料组分包括：3-溴丙酮酸(3-brpa)、丙二酸衍生物(az-33)、二(dca)和氟桂利嗪(fnz)。其中，3-溴丙酮酸、丙二酸衍生物、二和氟桂利嗪的摩尔比为150：60：10000：15。
30.进一步，本实施例所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物的制备方法，包括以下步骤：
31.将3-溴丙酮酸3-brpa分散于水中，配制得到50mm的糖酵解抑制剂原液；将丙二酸衍生物az-33分散于dmso中，配制得到10mm的乳酸代谢抑制剂原液；将二dca分散于水中，配制得到200mm的线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂原液；将氟桂利嗪fnz分散于dmso中，配制得到15mm的线粒体清除剂原液；
32.最后将上述四种原液进行混合均匀，即得所述高级别胶质瘤的联合抗代谢药物。
33.实施例2
34.本实施例提供一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，与实施例1的区别仅在于：3-溴丙酮酸、丙二酸衍生物、二和氟桂利嗪的原液浓度不同，本实施例中，3-溴丙酮酸的原液浓度为25mm，丙二酸衍生物的原液浓度为5mm，二的原液浓度为100mm，氟桂利嗪的的原液浓度为10mm。
35.实施例3
36.本实施例提供一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，与实施例1的区别仅在于：3-溴丙酮酸、丙二酸衍生物、二和氟桂利嗪的原液浓度不同，本实施例中，3-溴丙酮酸的原液浓度为100mm，丙二酸衍生物的原液浓度为20mm，二的原液浓度为400mm，氟桂利嗪的的原液浓度为30mm。
37.对比例1
38.本对比例与实施例1的区别在于：没有添加氟桂利嗪，具体为：3-溴丙酮酸、丙二酸衍生物、二按照摩尔比为150：60：10000配制而成。
39.实验例
40.将实施例1和对比例所得联合抗代谢药物进行体外胶质瘤的试验方案如下：
41.(1)体外培养胶质瘤细胞系
42.本发明采用胶质瘤细胞系u87及u251作为实验对象。胶质瘤细胞系均购自于中国科学院典型培养物保藏委员会的上海细胞库购买，保存于液氮中。细胞复苏时，迅速从液氮中取出冻存细胞管，置入37℃恒温水浴锅中，不停晃动冻存管加速冻存细胞溶解，待冻存液完全融化后，于无菌条件下迅速将其转移至含10％胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基中，吹打均匀后离心(800rpm/4min)，弃上清，取dmem完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养皿，摇匀，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。根据生长情况每隔1/2天更换培养基，每日观察并记录细胞的生长状况，如状态、密度、形态等。
43.(2)铺药及加药处理
44.a.将对数生长期的u87或u251细胞分别消化收集细胞后，应用完全培养基稀释并精确计数，充分混匀，调整活细胞浓度至3
×
104个/ml；
45.b.将细胞铺板到96孔板，细胞铺板密度约为3000个(100μl)/孔，边缘孔内不加细胞，可加入pbs液以避免边缘效应的影响，置于37℃培养箱孵育。第二天，细胞贴壁后进行cck8细胞活力检测及药物实验。
46.(3)cck8细胞活力检测
47.第一次检测cck8时间记为0h，并按照表1(联合组，其中a代表az-33，b代表3-brpa，d代表dca，f代表fln)、表2(单药组)加药，后续每间隔24h至72h行cck8细胞活力检测及换液加药处理。
48.表1-联合抗代谢药物的组成、药物应用、cck8检测时间点
49.[0050][0051]
注：
“‑”
不应用，“+”应用。
[0052]
表2-单药组的药物组成和cck8检测时间点
[0053][0054]
其中，cck8细胞活力检测具体操作如下：
[0055]
(s1)避光下按cck8：10％完全dmem培养液＝1：9配制预混液(现配现用)，吸去原培养液，避光条件下，每个检测孔加入100μl预混液，每组3个复孔，以不加cck8的3孔为空白对照组，轻晃培养板混匀，置入培养箱；
[0056]
(s2)孵育90min后，可见加入cck8孔培养基颜变黄，去除孔中气泡，应用酶标仪设置波长为450nm检测吸光度值(od值)。检测过程注意避免污染，75％再酒精擦拭待干；
[0057]
(s3)配制加药预混液，换液处理后培养箱继续培养，直至第72h完成检测。
[0058]
(s4)数据处理：测量值减去空白对照组测量值作为该组细胞活力的检测值。重复实验三次，数据以第一次检测值作为1进行数据标准化，以检测时间点为x轴，标准化od值为y轴绘制各组细胞的增殖折线图(图1、图2)。统计检验采用方差分析，p＜0.05认为具有统计学差异。
[0059]
(4)实验数据描述
[0060]
cck8细胞毒性检测结果显示单药抗代谢对胶质瘤细胞系的作用不佳。图1和图2分别显示单抗代谢药物对u87mg细胞系和u251细胞系的毒性检测结果，需要更大剂量才能发挥杀伤细胞作用。
[0061]
联合抗代谢对胶质瘤细胞系具有显著毒性作用。图3和图4分别显示联合抗代谢药物对u87mg细胞系和u251细胞系的毒性检测结果。
[0062]
在u87mg细胞系中，abd及abdf组在处理第48h出现明确的肿瘤细胞毒性作用，细胞活力相比于空白组0和对照组dmso明显降低，在第72h时abd及abdf组均出现明显细胞毒性(n＝3)。其中abd组在24h以后仍有明显增殖，说明细胞出现代谢重编程或功能恢复，而abdf
联合用药方案组均出现细胞活力抑制，尤其是abdf72组细胞几乎全部发生死亡。
[0063]
在u251细胞系中，加药处理第72h时，abdf24及abdf72组出现明显细胞毒性(n＝3)，表明abdf联合应用对u251细胞具有较为满意的毒性作用。
[0064]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：

1.一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，原料组分包括：糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂。2.根据权利要求1所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，原料组分中，糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂的摩尔比为150：60：10000：15。3.根据权利要求1所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，所述糖酵解抑制剂为3-溴丙酮酸、2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)、氯尼达明中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，所述乳酸代谢抑制剂为丙二酸衍生物、草氨酸钠、培黄素中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，所述线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂为二、tm-1、azd7545、pdhk-in中的一种或几种。6.根据权利要求1所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，其特征在于，所述线粒体清除剂为氟桂利嗪。7.根据权利要求1-6任一项所述的高级别胶质瘤的联合抗代谢药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将糖酵解抑制剂、线粒体清除剂分别分散于有机溶剂中，将乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂分别分散于水中，之后将四种溶液进行混合均匀，即得所述高级别胶质瘤的联合抗代谢药物。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将乳酸代谢抑制剂分散于dmso中，配制得到5-20mm的乳酸代谢抑制剂原液。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将线粒体清除剂分散于dmso中，配制得到10-30mm的线粒体清除剂原液。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将糖酵解抑制剂分散于水中，配制得到25-100mm的糖酵解抑制剂原液；将线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂分散于水中，配制得到100-400mm的线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂原液。

技术总结

本发明涉及一种高级别胶质瘤的联合抗代谢药物，原料组分包括糖酵解抑制剂、乳酸代谢抑制剂、线粒体氧化磷酸化关键酶抑制剂和线粒体清除剂，通过联合糖酵解抑制、乳酸代谢抑制、线粒体氧化磷酸化抑制和线粒体清除四种不同机制起作用的药物，从而实现对高级别胶质瘤肿瘤细胞的主要供能方式糖代谢途径进行全面抑制，协同起到更好的杀伤肿瘤细胞的作用。本发明最终制备得到的联合抗代谢药物方案，能够用于高级别胶质瘤，通过对肿瘤特异性细胞糖代谢靶点的多重抑制作用，在有效杀死肿瘤细胞同时减少耐药性发生，副作用小，从而有效解决现有技术的抗代谢药物在肿瘤过程中，容易出现明显的代谢重编程，发生代偿等问题。发生代偿等问题。发生代偿等问题。