用于细胞内细菌感染的组合物和方法与流程

用于细胞内细菌感染的组合物和方法

背景技术：

1.细菌病原体是感染性疾病的主要原因。许多细菌被人免疫系统成功检测到，并在感染发作前迅速清除。然而，许多细菌病原体通过驻留在宿主细胞内而逃避宿主免疫系统。这些细胞内细菌通过在宿主细胞如免疫细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)和宿主细胞内的正确细胞内区室(例如，内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)内驻留和繁殖而进化出多种免疫逃避技术。由于感染的亚细胞定位可及性的缺乏，所以在宿主细胞内繁殖的细菌感染通常呈现困难障碍。虽然某些抗菌组合物可感染(例如，体外)，但将递送至细菌所驻留的正确亚细胞定位已被证明是具有挑战性的工作。
2.一组具有挑战性的细胞内细菌感染由分枝杆菌引起。分枝杆菌是由富含分枝菌酸的厚细胞壁表示的放线菌。分枝杆菌含有包膜，所述包膜含有由脂质双层和细胞壁组成的细胞膜，所述细胞壁包括肽聚糖层和阿拉伯半乳聚糖层；和外膜，所述外膜含有疏水性分枝菌酸酯(mycolate)层。许多分枝杆菌还含有由多糖(如d-葡聚糖、d-阿拉伯-d-甘露聚糖和d-甘露聚糖)组成的外荚膜(outer capsule)。这种复杂细胞包膜有助于分枝杆菌的抗寒性，并且特别难以穿透和破坏。病原性分枝杆菌通常分为两组：结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(ntm)。与结核病相比，ntm的人际传播罕见。尽管如此，ntm感染的数量是日益严重的健康问题，特别是在患有肺病的人中。
3.需要用于靶向和细胞内细菌感染(如由分枝杆菌引起的那些)的改进的组合物和方法。

技术实现要素：

4.在一个方面，本发明的特征是一种将抗菌裂解蛋白递送至受试者中的专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)中的靶向细胞内区室的方法。所述靶向细胞内区室可在其内包括细菌细胞(例如，分枝杆菌细胞)。所述方法包括向所述受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构含有所述抗菌裂解蛋白。在施用步骤之后，所述抗菌裂解蛋白被递送至所述靶向细胞内区室。所述超分子结构还可包含靶向部分。优选地，所述抗菌裂解蛋白是抗菌噬菌体蛋白。
5.在另一个方面，本发明的特征是一种将抗菌裂解蛋白递送至受试者中的专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)中的靶向细胞内区室的方法。所述靶向细胞内区室可在其内包括细菌细胞(例如，分枝杆菌细胞)。所述方法包括向所述受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含靶向部分和货物，所述货物包含所述抗菌裂解蛋白。在施用步骤之后，所述抗菌裂解蛋白被递送至所述靶向细胞内区室。
6.在另一个方面，本发明的特征是一种受试者中由细菌细胞引起的细胞内细菌感染的方法。所述方法包括施用包含超分子结构和货物的组合物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。可以足以所述细菌感染的量和持续时间向所述受试者施用所述组合物。所述超分子结构还可包含靶向部分。
7.在另一个方面，本发明的特征是一种受试者中由细菌细胞引起的细胞内细菌
感染的方法。所述方法包括施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含靶向部分和货物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。可以足以所述细菌感染的量和持续时间向所述受试者施用所述组合物。
8.在另一个方面，本发明的特征是一种组合物，所述组合物包含超分子结构和货物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。所述超分子结构还可包含靶向部分。
9.在另一个方面，本发明的特征是一种包含超分子结构的组合物，所述超分子结构具有靶向部分和货物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。
10.在任何上述方面的一些实施方案中，所述超分子结构的z-平均粒径是约75nm至约750nm(例如，约250nm至约750nm，或约75nm至约250nm)。优选地，当所述超分子结构为lnp或胶束时，z-平均粒径是约75nm至约250nm。优选地，当所述超分子结构为囊泡(例如，脂质体)时，z-平均粒径是约250nm至约750nm。z-平均粒径的非限制性实例包括例如约75nm至约100nm，例如75nm至约85nm，例如约80nm，例如约80nm至约140nm、约90nm至约130nm或约110nm至约130nm，例如约120nm，例如约200nm至约300nm，例如约250nm至约300nm、约260nm至约290nm、约260nm至约280nm、约265nm至约275nm，例如约270nm，例如约300nm至约400nm、约400nm至约600nm，例如约450nm至约550nm、约475nm至约525nm、约480nm至约520nm、约490nm至约510nm、约495nm至约505nm，例如约500nm，例如约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm、约150nm、约155nm、约160nm、约165nm、约170nm、约175nm、约180nm、约185nm、约190nm、约195nm、约200nm、约205nm、约210nm、约215nm、约220nm、约225nm、约230nm、约235nm、约240nm、约245nm、约250nm、约255nm、约260nm、约265nm、约270nm、约275nm、约280nm、约285nm、约290nm、约295nm、约300nm、约305nm、约310nm、约315nm、约320nm、约325nm、约330nm、约335nm、约340nm、约345nm、约350nm、约355nm、约360nm、约365nm、约370nm、约375nm、约380nm、约385nm、约390nm、约395nm、约400nm、约405nm、约410nm、约415nm、约420nm、约425nm、约430nm、约435nm、约440nm、约445nm、约450nm、约455nm、约460nm、约465nm、约470nm、约475nm、约480nm、约485nm、约490nm、约495nm、约500nm、约505nm、约510nm、约515nm、约520nm、约525nm、约530nm、约535nm、约540nm、约545nm、约550nm、约555nm、约560nm、约565nm、约570nm、约575nm、约580nm、约585nm、约590nm、约595nm、约600nm、约605nm、约610nm、约615nm、约620nm、约625nm、约630nm、约635nm、约640nm、约645nm、约650nm、约655nm、约660nm、约665nm、约670nm、约675nm、约680nm、约685nm、约690nm、约695nm、约700nm、约705nm、约710nm、约715nm、约720nm、约725nm、约730nm、约735nm、约740nm、约745nm或约750nm。在一些实施方案中，所述超分子结构的z-平均粒径是约80nm、约270nm或约500nm。
11.在任何上述方面的一些实施方案中，所述细菌细胞是分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属物种，或者所述抗菌裂解蛋白能够杀死分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属物种。
12.在一些实施方案中，所述分枝杆菌属物种是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌(m.lepromatosis)、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆
菌、海洋分枝杆菌或脓肿分枝杆菌；所述沙门氏菌属物种是肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或邦戈沙门氏菌；所述奈瑟氏菌属物种是淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌；所述布鲁氏菌属物种是羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌或犬布鲁氏菌；所述埃希氏菌属物种是大肠杆菌；所述李斯特氏菌属物种是单核细胞增多性李斯特氏菌；所述弗朗西斯氏菌属物种是土拉弗朗西斯氏菌、新凶手弗朗西斯氏菌或蜃楼弗朗西斯氏菌(f.philomiragia)；所述军团菌属物种是嗜肺军团菌；所述耶尔森氏菌属物种是鼠疫耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌；所述葡萄球菌属物种是金黄葡萄球菌；所述梭菌属物种是肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌或索氏梭菌；所述志贺氏菌属物种是痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌或宋内志贺氏菌；或者所述链球菌属物种是酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、缓症链球菌、变异链球菌或肺炎链球菌。
13.在一些实施方案中，所述超分子结构可具有约0.05至约0.3的多分散性指数(pdi)。在一些实施方案中，所述超分子结构还可包含一种或多种脂质，例如可电离脂质。在一些实施方案中，所述超分子结构还可包含至少一个靶向部分。
14.在一些实施方案中，所述靶向部分是专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)的细胞外靶向部分。
15.在一些实施方案中，所述靶向部分包磷脂酰丝氨酸。
16.在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可选自由以下组成的组：抗cd163、抗cd40、抗cd74、抗cd206、抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可选自由以下组成的组：抗dec205、抗cd304、抗cd303、抗cd40、抗cd74、抗bdca2和抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。
17.在一些实施方案中，所述靶向部分包含病原体相关分子模式(pamp)。
18.在一些实施方案中，所述靶向部分是甘露糖簇或叶酸。
19.在一些实施方案中，所述靶向部分是tlr2激动剂。例如，所述tlr2激动剂可选自由以下组成的组：malp-2脂蛋白、malp-404脂蛋白、外表面脂蛋白a(ospa)、孔蛋白、lcrv、hsp60、糖蛋白gh/gl或糖蛋白gb。
20.在一些实施方案中，所述超分子结构是脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述超分子结构是胶束。在一些实施方案中，所述超分子结构是脂质体。所述脂质体可以是单层的或多层的(例如，2、3、4、5个或更多个层)。所述超分子结构可具有约0.05至约0.3的多分散性指数。
21.所述超分子结构还可包含一种或多种脂质(例如，可电离脂质)。
22.在一些实施方案中，所述方法还包括施用抗生素。在一些实施方案中，所述抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素类和氟喹诺酮类。在一些实施方案中，所述抗生素选自由以下组成的组：氨硫脲(thiacetazone)、sq-109、贝达喹啉、德拉马尼(delamanid)、吡嗪酰胺和。例如，所述抗生素可以是阿奇霉素、克拉霉素、乙胺丁醇、利福平或阿米卡星，例如阿米卡星。
23.在一些实施方案中，所述抗菌裂解蛋白能够杀死所述细菌细胞(例如，分枝杆菌细胞，例如，ntm细胞)。
24.在一些实施方案中，所述抗菌裂解蛋白是荚膜解聚酶、淀粉酶或溶素。例如，所述荚膜解聚酶可以是例如，水解酶、金属水解酶、环氧化物水解酶、肽聚糖水解酶、多糖酶、多
糖裂解酶、内切唾液酸酶、透明质酸裂解酶或海藻酸裂解酶。所述溶素可以是例如，溶素a或溶素b。所述淀粉酶可以是例如异淀粉酶或α-淀粉酶。所述抗菌裂解蛋白可以是抗菌分枝杆菌噬菌体蛋白。
25.在一些实施方案中，静脉内、经口、局部或通过吸入施用所述组合物。
26.定义
27.如本文所使用，术语“约”是指所列举的值的+/-10％。
28.如本文所用，“组合疗法”或“组合施用”是指将两种(或更多种)剂或作为针对特定疾病或疾患的限定方案的一部分施用于受试者。方案定义了每种剂的剂量和施用周期，以使单独剂对受试者的作用重叠和/或允许协同作用。在一些实施方案中，两种或更多种剂的递送是同时或并行的，并且所述剂可共同配制。在一些实施方案中，两种或更多种剂不是共同配制的，并且作为处方方案的一部分以顺序方式施用。在一些实施方案中，两种或更多种剂或的组合施用使得与疾病相关的症状或其它参数的减少大于在单独递送的一种剂或或在不存在另一者的情况下观察到的减少。两种的作用可部分累加、完全累加或大于累加，例如，协同作用。顺序或实质上同时施用每种剂可通过包括但不限于经口途径、静脉内途径、肌内途径、局部途径以及通过粘膜组织直接吸收的任何适当的途径进行。可通过相同途径或通过不同途径施用剂。例如，可通过静脉内注射施用组合的第一剂，同时可经口施用组合的第二剂。
29.如本文所用，术语本文所述的例如，在细胞、样品或受试者中产生作用的剂的“有效量”、“有效量”和“足够量”是指当施用至所述细胞、样品或包括人的受试者时足以产生有益或所需的结果(包括临床前或临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其所应用的背景。例如，在病症的情况下，其是与未施用剂的情况下所获得的应答相比，足以实现应答的剂的量。给定剂的量将根据各种因素而变化，诸如给定剂、药物制剂、施用途径、细菌感染的严重程度、生物标志物、所的受试者的例如年龄、性别和/或体重、样品或宿主细胞(例如，哺乳动物免疫细胞)等，但是仍然可由本领域的普通技术人员常规地确定。同样，如本文所用，术语剂的“有效量”是与对照相比，在细胞或受试者中产生有益或所需的结果的量。如本文所定义，剂的有效量可由普通技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。可调整剂量方案以提供最佳应答。
30.如本文所用，术语“抗菌裂解蛋白”是指与噬菌体相关或由噬菌体分泌的具有针对细菌的杀菌和/或溶菌活性的蛋白质。抗菌裂解蛋白的非限制性实例包括穿孔素(holin)、溶素(例如，溶素a和/或溶素b)、淀粉酶(例如，异淀粉酶或α-淀粉酶)和荚膜解聚酶(例如，水解酶、金属水解酶、环氧化物水解酶、肽聚糖水解酶、多糖酶、多糖裂解酶、内切唾液酸酶、透明质酸裂解酶或海藻酸裂解酶)。
31.如本文所用，术语“内体逃逸部分”表示如与不同之处仅在于缺乏内体逃逸部分的参考分子相比，增强内体内容物的释放或促进分子从内部细胞区室(例如，内体、吞噬体或溶酶体)逃逸的部分。
32.如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“lnp”是包括脂质层的囊泡，所述脂质层包封基本上固体的脂质核心；所述脂质核心可含有药物活性分子。lnp通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，peg-脂质缀合物)。
33.如本文所用，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双
层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层和多层(例如，2、3、4、5个或更多个层)囊泡，所述囊泡具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有抗菌裂解蛋白或抗菌裂解蛋白和其它组分的混合物。亲脂性材料从通常不包括噬菌体蛋白的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离水性内部。脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，其是如本文所用的指包含一种或多种专门化脂质的脂质体的术语，当并入脂质体中时所述专门化脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言增加的循环寿命。
[0034]“胶束”在本文中被定义为特定类型的基本上球形的超分子结构，其中两亲性分子(例如，脂质)被设置成使得所述分子的疏水性部分朝向核心向内定向，从而使亲水性部分与周围的水相接触。如果周围环境是疏水性的，则存在相反的排列。胶束核心可含有抗菌裂解蛋白或蛋白质的混合物。
[0035]
如本文所用，术语“靶向部分”表示与受体或与给定靶细胞体(例如，专职抗原呈递洗白(例如，巨噬细胞或树突细胞))相关的其它接受部分特异性地结合或反应性缔合或络合的部分(例如，小分子，例如碳水化合物)。因此，靶向部分可用于使本文所述的超分子结构靶向例如专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)。
[0036]
如本文所用，术语“受试者”是指可例如出于实验、诊断、预防和/或目的向其施用根据本发明的组合物的任何生物体。典型的受试者包括任何动物，例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人。受试者可寻求或需要、要求、正在接受、将接受、或者是针对特定疾病或疾患在受过训练的专业人员护理下的人或动物。
[0037]
如本文所用，术语“超分子结构”是指通过非共价键如氢键、范德华力、静电相互作用、疏水效应和π-π相互作用保持在一起的分子复合物。超分子结构可包括形成例如球状结构的大的分子复合物。超分子结构包括例如基于脂质的超分子结构，如脂质体和脂质纳米颗粒(例如，胶束)。
[0038]
如本文所用，术语“靶向细胞内区室”是指内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质。
[0039]
如本文所用，术语“靶向部分”表示与受体或与给定靶细胞体(例如，专职抗原呈递洗白(例如，巨噬细胞或树突细胞))相关的其它接受部分特异性地结合或反应性缔合或络合的部分(例如，小分子，例如碳水化合物)。因此，靶向部分可用于使本文所述的超分子结构靶向例如专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)。
[0040]“囊泡”在本文中被定义为一种类型的超分子结构，其中两亲性分子(例如，脂质)共同定义体积，例如，基本上球形的体积。两亲性分子(例如，脂质)通常构成囊泡的至少一个壳。在这种壳中，两亲性分子设置在双层中，其中所述两亲性分子的亲水性部分相对于双层平面向外定向并且所述两亲性分子的疏水性部分主要设置在双层内。如果周围介质是疏水性的，则存在相反的排列。
附图说明
[0041]
图1是用于筛选和定量细胞(包括感染分枝杆菌并且分别用抗菌裂解蛋白或具有性有效载荷的噬菌体处理的分枝杆菌细胞或巨噬细胞)的生长连续稀释(gosd)中的酶抗生素(enzybiotic)反应水平的实验设计的示意图。例如，插图描绘感染分枝杆菌并用抗菌裂解蛋白(abiα)或稀释缓冲液(db)处理的ecl55细胞的gosd板。
[0042]
图2a和2b是一组图，其示出脓肿分枝杆菌细胞的gosd-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8
对分别一个(10μl)、两个(20μl)或三个(30μl)剂量的溶素a(a)、溶素b(b)、异淀粉酶(i)和α-淀粉酶(α)(abiα)的酶混合物的剂量依赖性反应。图2a是abiα处理对培养物光密度(od590)/检测下限(llod)的剂量依赖性影响的定量，而图2b是处理对脓肿分枝杆菌细胞数量的影响的定量。
[0043]
图3是示出在分别用3.2μg、1.6μg、0.8μg、0.4μg、0.2μg和0.1μg的abiα/孔或无abiα处理后，脓肿分枝杆菌细胞的数量的图。
[0044]
图4a和4b是描绘分别用或不用一个剂量的abiα处理并培养3或6天的胞内分枝杆菌细胞的gosd(-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8)的od590/llod的图(图4a)和代表性图像(图4b)。
[0045]
图5是描绘分别用abiα和抗生素阿米卡星、比阿培南、头孢西丁、乙胺丁醇、莫西沙星、利福平或克拉霉素处理的脓肿分枝杆菌细胞的生长的分数抑制浓度指数(fici)的表格数据集。
[0046]
图6是用于评估通过用未包封的(游离酶)或包封的抗菌裂解蛋白(包封的酶)处理对减弱受感染巨噬细胞中的分枝杆菌生长的不同作用的实验设计的示意图。
[0047]
图7是描绘从分别用未包封(游离)或包封(enc)a、b、i和α(abiα、ab、iα、biα、encabiα、encab、enciα和encbiα)的组合处理的受感染巨噬细胞中提取后，脓肿分枝杆菌的gosd(-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8)的od590/llod的图。
[0048]
图8是示出在如图7中描述的实验中，脓肿分枝杆菌细胞数量的定量的表。
[0049]
图9是用于评估减弱用未包封的(游离噬菌体)或包封的噬菌体处理的受感染巨噬细胞中的分枝杆菌生长的不同作用的实验设计的示意图。
[0050]
图10是描绘从分别用未包封(噬菌体)或包封(encphage)志贺氏菌属噬菌体eph34处理的受感染巨噬细胞中提取后，弗氏志贺氏菌的gosd(-1、-2、-3、-4、-5和-6)的od590/llod的图。
具体实施方式
[0051]
噬菌体是在细菌内感染和复制的病毒。裂解性噬菌体感染宿主细菌，利用宿主机器来复制病毒粒子。复制后，噬菌体裂解宿主细胞，从而释放噬菌体后代以寻新的细菌宿主进行感染。噬菌体被编程为具有杀死靶向细胞的所有基本机器。因此，噬菌体的蛋白质组分代表有吸引力的抗菌疗法，因为它们能够特异性地靶向和破坏细菌宿主细胞。
[0052]
驻留在宿主细胞内的若干细菌病原体难以靶向。这些细胞内细菌在宿主细胞内驻留并繁殖，以逃避免疫系统的检测。为了有效地靶向细胞内细菌，必须不仅使性有效载荷靶向细菌，而且靶向所述细菌所驻留的正确亚细胞定位。本发明通过提供用于靶向抗菌疗法以细胞内细菌感染的组合物及其使用方法来解决这些问题。一般而言，所述组合物的特征是靶向宿主细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)和正确的靶向细胞内区室(内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)的超分子结构，例如，基于脂质的超分子结构，例如，脂质体、胶束、脂质纳米颗粒(lnp)。同时，超分子结构预先负载有被引发以杀死细菌细胞的至少一种抗菌裂解蛋白(例如，抗菌分枝杆菌噬菌体蛋白)。超分子结构将有效载荷引导至正确细胞类型和细胞内区室，而抗菌裂解蛋白由于其独特的表面识别特性而可直接结合至细菌。
[0053]
抗菌裂解蛋白
[0054]
裂解性噬菌体含有识别靶细菌所需的机制，并由于噬菌体感染周期而使所述靶细菌裂解。一些估计表明存在超过10
30
种噬菌体，说明了为开发剂提供一批抗菌剂的巨大多样性。
[0055]
分枝杆菌噬菌体是特异性地感染分枝杆菌、最终导致分枝杆菌细胞在裂解感染周期结束时死亡的双链dna病毒。分枝杆菌噬菌体已经进化为具有特异性裂解系统，所述系统包含专门用于靶向和裂解高度疏水性和复杂分枝杆菌细胞包膜的特定层中的特定类型键的抗菌蛋白，例如，裂解酶，例如脂肪分解酶，所述细胞包膜包含以共价连接的magp复合物作为其核心的细胞壁，和包含非共价连接的多糖和蛋白质的外层，例如细胞荚膜或粘液型荚膜。
[0056]
抗菌裂解蛋白(例如裂解性噬菌体蛋白)可负载至超分子结构中以形成超分子复合物，所述超分子复合物可施用于细胞、样品或受试者。超分子复合物被哺乳动物免疫细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)内吞，并且抗菌裂解蛋白被递送至细菌所驻留的一个或多个靶向细胞内区室(内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)。在一些实施方案中，抗菌裂解蛋白附着至细菌表面。抗菌裂解蛋白通过裂解特定键来使细菌的细胞包膜穿孔和/或使细菌的细胞包膜的组分分解，从而导致细菌的渗透性破裂和死亡。分枝杆菌噬菌体蛋白包括溶素(例如，溶素a和溶素b)，淀粉酶(例如，异淀粉酶和α-淀粉酶)以及荚膜解聚酶。溶素和荚膜解聚酶分别负责裂解细胞包膜的含有分枝杆菌magp复合物的细胞壁和外细胞荚膜中的不同键。分枝杆菌噬菌体蛋白还包括穿孔素，所述穿孔素是寡聚化并使分枝杆菌细胞膜穿孔以允许非成孔溶素接近其底物并裂解细胞壁的膜结合蛋白。
[0057]
在一些实施方案中，抗菌裂解蛋白是例如裂解性噬菌体蛋白，例如分枝杆菌噬菌体蛋白。在一些实施方案中，噬菌体蛋白能够杀死细胞或者来源于感染细胞的噬菌体，所述细胞选自由以下组成的组：分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属。在一些实施方案中，分枝杆菌属物种是选自由以下组成的组的物种：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海洋分枝杆菌和脓肿分枝杆菌；沙门氏菌属物种是肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或邦戈沙门氏菌；奈瑟氏菌属物种是淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌；布鲁氏菌属物种是羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌或犬布鲁氏菌；埃希氏菌属物种是大肠杆菌；李斯特氏菌属物种是单核细胞增多性李斯特氏菌；弗朗西斯氏菌属物种是土拉弗朗西斯氏菌、新凶手弗朗西斯氏菌或蜃楼弗朗西斯氏菌；军团菌属物种是嗜肺军团菌；耶尔森氏菌属物种是鼠疫耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌；葡萄球菌属物种是金黄葡萄球菌；梭菌属物种是肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌或索氏梭菌；志贺氏菌属物种是痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌或宋内志贺氏菌；或者链球菌属物种是酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、缓症链球菌、变异链球菌或肺炎链球菌。在一些实施方案中，分枝杆菌噬菌体蛋白是溶素或荚膜解聚酶，例如荚膜酶(capsulase)。在一些实施方案中，溶素是溶素a或溶素b。荚膜解聚酶是分解分枝杆菌细胞的外细胞荚膜(例如，粘液型荚膜)的酶。外荚膜通常由多糖和蛋白质组成，具有少量脂质。在一些实施方案中，荚膜解聚酶是水解酶、金属水解酶、环氧化物水解酶、肽聚糖水解酶、多糖酶、多糖裂解酶、内切唾液酸酶、透明质酸裂解酶或海藻酸裂解酶。外荚膜中的荚膜多糖
包括例如d-葡聚糖、d-阿拉伯-d-甘露聚糖和d-甘露聚糖。此外，荚膜解聚酶是分解这些和其它荚膜多糖的酶。
[0058]
在一些实施方案中，抗菌裂解蛋白是天然存在的蛋白质。在其它实施方案中，抗菌裂解蛋白是工程化的蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含两种或更多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)不同的蛋白质，例如以杀死多于一种细菌物种或菌株。
[0059]
抗菌裂解蛋白的非限制性实例提供于表1中。
[0060]
表1
[0061][0062]
细胞内细菌
[0063]
细胞内细菌驻留在宿主细胞内，在所述宿主细胞内所述细胞内细菌繁殖并引起感染。细胞内细菌可驻留在免疫细胞(如专职抗原细胞)内。专职抗原呈递细胞(apc)包括巨噬细胞、b细胞和树突细胞。apc在其表面上加工和展示与主要组织相容性复合物(mhc)复合的抗原。t细胞使用t细胞受体识别这些抗原呈递复合物，这是对于有效适应性免疫应答至关重要的过程。某些细菌通过隐藏在免疫细胞内来逃避这种免疫应答。
[0064]
本文所述的组合物和方法可用于靶向任何细胞内细菌，如驻留在专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞)中的细胞内细菌。在一些实施方案中，细菌细胞是分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属物种。分枝杆菌属物种的实例包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海洋分枝杆菌或脓肿分枝杆菌。在特定实施方案中，分枝杆菌属是ntm。在一些实施方案中，ntm是鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌。在一些实施方案中，感染由ntm，如鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的组合引起。
[0065]
其它细胞内细菌是本领域已知的。沙门氏菌属物种可以是例如，肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或邦戈沙门氏菌。奈瑟氏菌属物种可以是例如，淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌大肠杆菌。布鲁氏菌属物种可以是例如，羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌或犬
布鲁氏菌。埃希氏菌属物种可以是例如，大肠杆菌。李斯特氏菌属物种可以是例如，单核细胞增多性李斯特氏菌。弗朗西斯氏菌属物种可以是例如，土拉弗朗西斯氏菌、新凶手弗朗西斯氏菌或蜃楼弗朗西斯氏菌。军团菌属物种可以是例如，嗜肺军团菌。耶尔森氏菌属物种可以是例如，鼠疫耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌。葡萄球菌属物种可以是例如，金黄葡萄球菌。梭菌属物种可以是例如，肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌或索氏梭菌。志贺氏菌属物种可以是例如，痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌或宋内志贺氏菌。链球菌属物种可以是例如，酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、缓症链球菌、变异链球菌或肺炎链球菌。
[0066]
超分子结构
[0067]
超分子结构可用于配制用于递送的抗菌剂，例如抗菌裂解蛋白，例如分枝杆菌噬菌体蛋白。超分子结构包括通过非共价键如氢键、范德华力、静电相互作用、离子-偶极力、疏水效应和π-π相互作用保持在一起的限定分子(例如，脂质)复合物。超分子结构可包括形成球状、棒状、螺旋状或片状结构的大的分子复合物。超分子结构包括例如基于脂质的超分子结构，如胶束、脂质体和lnp。超分子结构可具有预定大小。结构的大小可基于所述结构内包装的组分(例如，蛋白质的大小)而变化。超分子复合物被细胞，例如专职抗原呈递细胞如巨噬细胞或树突细胞内吞，并且抗菌裂解蛋白被递送至细菌所驻留的靶向细胞内区室(内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)。
[0068]
在一些实施方案中，使用特定粒度来接近某种内吞途径以将结构引导至适当的靶向细胞内区室。超分子结构可例如通过网格蛋白依赖性内吞作用或通过小窝蛋白依赖性内吞作用被内吞并递送至靶向细胞内区室。超分子结构的粒度(例如，z-平均粒径)可从约75nm至约750nm(例如，从约250nm至约750nm，或从约75nm至约250nm)变化。优选地，当所述超分子结构为lnp或胶束时，z-平均粒径是约75nm至约250nm。优选地，当所述超分子结构为囊泡(例如，脂质体)时，z-平均粒径是约250nm至约750nm。z-平均粒径的非限制性实例包括例如约75nm至约100nm，例如75nm至约85nm，例如约80nm，例如约80nm至约140nm、约90nm至约130nm或约110nm至约130nm，例如约120nm，例如约200nm至约300nm，例如约250nm至约300nm、约260nm至约290nm、约260nm至约280nm、约265nm至约275nm，例如约270nm，例如约300nm至约400nm、约400nm至约600nm，例如约450nm至约550nm、约475nm至约525nm、约480nm至约520nm、约490nm至约510nm、约495nm至约505nm，例如约500nm，例如约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm、约150nm、约155nm、约160nm、约165nm、约170nm、约175nm、约180nm、约185nm、约190nm、约195nm、约200nm、约205nm、约210nm、约215nm、约220nm、约225nm、约230nm、约235nm、约240nm、约245nm、约250nm、约255nm、约260nm、约265nm、约270nm、约275nm、约280nm、约285nm、约290nm、约295nm、约300nm、约305nm、约310nm、约315nm、约320nm、约325nm、约330nm、约335nm、约340nm、约345nm、约350nm、约355nm、约360nm、约365nm、约370nm、约375nm、约380nm、约385nm、约390nm、约395nm、约400nm、约405nm、约410nm、约415nm、约420nm、约425nm、约430nm、约435nm、约440nm、约445nm、约450nm、约455nm、约460nm、约465nm、约470nm、约475nm、约480nm、约485nm、约490nm、约495nm、约500nm、约505nm、约510nm、约515nm、约520nm、约525nm、约530nm、约535nm、约540nm、约545nm、约550nm、约555nm、约560nm、约565nm、约570nm、约575nm、约580nm、约
585nm、约590nm、约595nm、约600nm、约605nm、约610nm、约615nm、约620nm、约625nm、约630nm、约635nm、约640nm、约645nm、约650nm、约655nm、约660nm、约665nm、约670nm、约675nm、约680nm、约685nm、约690nm、约695nm、约700nm、约705nm、约710nm、约715nm、约720nm、约725nm、约730nm、约735nm、约740nm、约745nm或约750nm。在特定实施方案中，超分子结构的z-平均粒径可以是约75nm至约250nm。在一些实施方案中，超分子结构的z-平均粒径是约80nm、约270nm或约500nm。
[0069]
平均粒径可通过ζ电位、动态光散射(dls)、电泳光散射(els)、静态光散射(sls)、分子量、电泳迁移率、尺寸排阻谱法(sec)、场流分级法或本领域已知的其它方法来测量。在特定实施方案中，平均粒径是通过来测量。在特定实施方案中，超分子结构含有约75nm至约250nm的z-平均粒径。在特定实施方案中，超分子结构含有约250nm至约750nm的z-平均粒径。在特定实施方案中，超分子结构含有约500nm的z-平均粒径。在特定实施方案中，超分子结构含有约270nm的z-平均粒径。在特定实施方案中，超分子结构含有约80nm的z-平均粒径。本领域技术人员将了解，超分子结构体(例如，脂质体、lnp或胶束)可在体内具有一系列z-平均粒径。因此，体可能是多分散的。体可具有0.3或更小(例如，0.05至0.3)的多分散性指数。多分散性指数可使用dls确定(参见例如，iso 22412:2017)。
[0070]
超分子结构可每个超分子结构负载有预定数量的抗菌裂解蛋白或平均数量的抗菌裂解蛋白。例如，超分子结构可含有约一种蛋白质至约106种蛋白质(例如，约1至约105、约1至约104、约1至约103、约1至约102、约1至约10、约10至约106、约10至约105、10至约104、约10至约103、约10至约102、约103至约106、约103至约105、约103至约104种)。每个结构的蛋白质数量可取决于蛋白质的大小和结构的大小。
[0071]
超分子结构可包含内体逃逸部分。包含内体逃逸部分的超分子结构可提供超分子结构中所包含的货物(例如，剂)的改进的细胞溶质递送。内体逃逸部分是本领域已知的。优选地，内体逃逸部分是可电离脂质。可电离脂质通常是。可电离脂质也可充当形成超分子结构层的脂质。可电离脂质的非限制性实例包括在例如wo 2019/067875；wo 2018/191750；和us 9,999,671中描述的那些、。其它示例性内体逃逸部分包括融合脂质(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺(dope))；以及聚合物，如聚乙烯亚胺(pei)；聚(β-氨基酯)；多肽，如聚精氨酸(例如，八聚精氨酸)和聚赖氨酸(例如，八聚赖氨酸)；质子海绵、病毒衣壳以及如本文所述的肽转导结构域。例如，融合肽可源自甲型流感病毒的m2蛋白；流感病毒血凝素的肽类似物；丙型流感病毒的hef蛋白；线状病毒的跨膜糖蛋白；狂犬病毒的跨膜糖蛋白；水疱性口炎病毒的跨膜糖蛋白(g)；仙台病毒的融合蛋白；塞姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白；人呼吸道合胞病毒(rsv)的融合蛋白；麻疹病毒的融合蛋白；新城疫病毒的融合蛋白；绵羊髓鞘脱落病毒的融合蛋白；鼠白血病病毒的融合蛋白；htl病毒的融合蛋白；以及猿免疫缺陷病毒(siv)的融合蛋白。可用于促进内体逃逸的其它部分在dominska等人,journal of cell science,123(8):1183-1189,2010中进行了描述。包含适合包含在本文公开的超分子结构中或与本文公开的超分子结构缀合的部分的内体逃逸部分的具体实例提供于例如wo 2015/188197中；这些内体逃逸部分的公开内容以引用的方式并入本文。
[0072]
脂质体
[0073]
脂质体可用于将抗菌蛋白转移并递送至作用位点。因为脂质体膜与生物膜在结构上类似，所以当脂质体被施加至组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细
胞的融合进行，包含抗菌蛋白的内部水性内容物被递送至细胞中，其中抗菌蛋白可特异性地靶向并裂解驻留在哺乳动物免疫细胞内的细菌细胞(例如，分枝杆菌细胞，例如ntm细胞)。在一些情况下，脂质体也被特异性靶向，例如，以将蛋白质引导至特定哺乳动物免疫细胞类型和/或至在感染期间通常含有细菌(例如，分枝杆菌)的特定细胞内区室(内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇如胆固醇组合。也可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于ph、离子强度和二价阳离子的存在。
[0074]
优选地，本文所述的脂质体包含磷脂，更优选地甘油磷脂，例如磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸是具有两个被脂肪酸酯部分取代的羟基和一个被与丝氨酸侧链共价键合的磷酸二酯部分取代的羟基的甘油分子。磷脂酰丝氨酸的典型结构是ro-ch
2-ch(or)-ch
2-op(o)(oh)-och2ch(cooh)nh2或其盐，其中每个r独立地是脂肪酸酰基。另外或可替代地，本文所述的脂质体可包含例如溶血磷脂，例如溶血磷脂酰丝氨酸。溶血磷脂酰丝氨酸是缺失其两个脂肪酸酯部分之一的磷脂酰丝氨酸。溶血磷脂酰丝氨酸的典型结构是ro-ch
2-ch(or)-ch
2-op(o)(oh)-och2ch(cooh)nh2或其盐，其中一个r是脂肪酸酰基，并且另一个r是h。因此，在某些优选的实施方案中，本文所述的脂质体包含ro-ch
2-ch(or)-ch
2-op(o)(oh)-och2ch(cooh)nh2或其盐，其中每个r是h或脂肪酸酰基，条件是至少一个r是脂肪酸酰基。
[0075]
脂质体组合物的一种主要类型包含除天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。中性脂质体组合物例如可由二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)形成。阳离子脂质体具有能够融合至细胞膜的优点。阳离子脂质的非限制性实例包括n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、n,n-二硬脂酰基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n
‑‑
(i-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(i-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(dodma)、1,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tma.cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tap.cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(n-甲基哌嗪并)丙烷(dlin-mpz)或3-(n,n-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-n,n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物、(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八-9,12-二烯基四氢-3ah-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(aln100)、4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(mc3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基乙基氮杂环丁基二十二烷-2-醇(tech g1)或它们的混合物。阳离子脂质可占例如颗粒中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％或约40mol％。
[0076]
非阳离子脂质体尽管不能一样有效地与质膜融合，但是被体内巨噬细胞摄取，并且可用于将抗菌蛋白递送至巨噬细胞。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰基磷脂酰甘
油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)形成。可电离/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)、胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐，dops)或它们的混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可例如占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％或约58mol％。在一些实施方案中，可电离/非阳离子脂质可以是上述脂质的组合，例如包括dopc、dops、chol和dope的脂质的组合。
[0077]
抑制脂质体颗粒聚集的缀合脂质可以是例如，聚乙二醇(peg)-脂质，包括但不限于peg-二酰基甘油(dag)、peg-二烷基氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)或它们的混合物。peg-daa缀合物可以是例如，peg-二月桂基氧基丙基(c
12
)、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c
14
)、peg-二棕榈基氧基丙基(c
16
)或peg-二硬脂基氧基丙基(c
18
)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。在一些实施方案中，脂质体组合物还包含例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约50mol％的胆固醇。
[0078]
另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(pc)，例如像大豆pc和卵pc形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。在体外和体内将脂质体引入细胞中的其它方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；wo 94/00569；wo93/24640；wo 91/16024；feigner,(1994)j.biol.chem.269:2550；nabel,(1993)proc.natl.acad.sci.90:11307；nabel,(1992)human gene ther.3:649；gershon,(1993)biochem.32:7143；和strauss,(1992)embo j.11:417。
[0079]
基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，脂质体的靶向也是可能的，并且是本领域已知的。在脂质体靶向递送系统的情况下，脂质基团可并入到脂质体的脂质双层中，以保持靶向配体与脂质体双层稳定缔合。各种连接基团可用于将脂质链连接至靶向配体。另外的方法在本领域中是已知的并且例如描述于美国公布号20060058255中，其连接基团以引用的方式并入本文。
[0080]
可裂解的连接基团易于受到裂解因子(例如ph、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。通常，裂解因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解剂的实例包括：被选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中、可通过还原而降解氧化还原可裂解连接基团的氧化性或还原性酶或还原剂如硫醇；酯酶；可产生酸性环境的内体或剂，例如产生5或更低的ph的那些；可通过充当广义酸来水解或降解酸可裂解连接基团的酶；肽酶(其可以是底物特异性的)；和磷酸酶。
[0081]
可裂解连接基团如二硫键可能对ph敏感。人血清的ph是7.4，而平均细胞内ph略低，在约7.1-7.3的范围内。内体具有更酸性的ph，在5.5-6.0的范围内，并且溶酶体具有在约5.0的甚至更酸性的ph。一些接头将具有在优选的ph下裂解的可裂解连接基团，从而使阳离子脂质从细胞内的配体中释放，或释放至所需的细胞区室中。
[0082]
接头可包括可被特定酶裂解的可裂解连接基团。并入接头中的可裂解连接基团的类型可取决于待靶向的细胞。一般而言，候选可裂解连接基团的适合性可通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来进行评估。还将希望的是也测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其它非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可确定在第一条件与第二条件之间进行裂解的相对敏感性，其中所述第一条件被选择成指示在靶细胞中的裂解并且所述第二条件被选择成指示在其它组织或生物流体(例如血液或血清)中的裂解。所述评估可在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。可以有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确认。在优选的实施方案中，与血液或血清(或在被选择成模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选接头在细胞中(或在选择成模拟细胞内条件的体外条件下)裂解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
[0083]
脂质纳米颗粒
[0084]
本发明的抗菌剂可完全包封在脂质制剂，例如脂质纳米颗粒(lnp)中。lnp对于合成应用是极其有用的，因为它们表现出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点(例如，在与施用位点物理分开的位点)累积。lnp包括“psplp”，所述psplp包括如在pct公布号wo 2000/003683中列举的包封的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒通常具有约50nm至约150nm，更通常约60nm至约130nm，更通常约70nm至约110nm，最通常约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国公布号2010/0324120以及pct公布号wo 96/40964中公开。
[0085]
在一个实施方案中，脂质与药物比率(质量/质量比率)(例如，脂质与寡核苷酸比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。以上列举的范围的范围中间值也被考虑为本发明的部分。
[0086]
阳离子脂质的非限制性实例包括dodac、ddab、dotap、dotma、dodma、dlindma、dlendma、dlin-c-dap、dlin-dac、dlin-ma、dlindap、dlin-s-dma、dlin-2-dmap、dlin-tma.cl、dlin-tap.cl、1dlin-mpz、dlinap、doap、dlin-eg-dma、(dlin-k-dma或其类似物、aln100、mc3、tech g1或它们的混合物。阳离子脂质可占例如颗粒中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％或约40mol％。
[0087]
可电离/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于dspc、dopc、dops、dppc、dopg、dppg、dope、popc、pope、dope-mal、dppe、dmpe、dspe、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、sope、胆固醇或它们的混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可例如占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％或约60mol％。
[0088]
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如聚乙二醇(peg)-脂质，包括但不限于peg-二酰基甘油(dag)、peg-二烷基氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)或它们的混合物。peg-daa缀合物可以是例如，peg-二月桂基氧基丙基(c
12
)、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c
14
)、peg-二棕榈基氧基丙基(c
16
)或peg-二硬脂基氧基丙基(c
18
)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是例如颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。
[0089]
在一些实施方案中，lnp还包含例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约
60mol％或约50mol％的胆固醇。
[0090]
胶束
[0091]“胶束”是特定类型的分子集合体，其中两亲性分子布置在球形结构中，使得所述分子的所有疏水性部分向内定向，从而使亲水性部分与周围的水相接触。胶束可由脂质制成。胶束相由单尾脂质在双层中的堆积行为引起。难以填充双层内部的所有体积、同时通过脂质头基的水合来适应强加在分子上的每个头基的面积导致胶束的形成。这种类型的胶束被称为正相胶束(水包油胶束)。反胶束在中心具有头基，尾部向外延伸(油包水胶束)。
[0092]
胶束大致呈球形。其它相(包括诸如椭圆体、圆柱体和双层的形状)也是可能的。胶束的形状和大小随其表面活性剂分子的分子几何形状和溶液条件(如表面活性剂浓度、温度、ph和离子强度)而变化。形成胶束的过程被称为胶束化并根据它们的多态性形成许多脂质的相行为的一部分。
[0093]
靶向部分
[0094]
本文所述的超分子结构可包含例如靶向部分。靶向部分可用于将超分子结构引导至特定细胞类型(例如，专职抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞或树突细胞))。某些脂质(例如，磷脂酰丝氨酸)可作为超分子结构层形成脂质和作为靶向部分两者用于超分子结构(例如，囊泡)中。靶向部分可以是例如抗体或其抗原结合片段或工程化衍生物(例如，fcab或融合蛋白(例如，scfv))。靶向部分可以是例如多肽。可替代地，靶向部分可以是例如，小分子(例如，甘露糖或叶酸)或小分子簇(例如，甘露糖簇)。靶向部分可与超分子结构共价或非共价缔合。
[0095]
小分子
[0096]
靶向部分可以是能够复合在靶向细胞表面上表达的受体的小分子。可用作本文所述的超分子结构中的靶向部分的小分子的非限制性实例是磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸叶酸、甘露糖和甘露糖簇。
[0097]
优选地，靶向部分是磷脂酰丝氨酸或溶血磷脂酰丝氨酸。更优选地，靶向部分是磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸和/或溶血磷脂酰丝氨酸可作为与超分子结构的其余部分非共价键合的超分子结构层形成脂质存在。
[0098]
叶酸可用作靶向部分。在本文所述的超分子结构中，叶酸可具有以下结构：
[0099][0100]
甘露糖或甘露糖簇可用于使本文所述的超分子结构靶向树突细胞和巨噬细胞。甘露糖簇是本领域已知的。
[0101]
叶酸、甘露糖和甘露糖簇可与超分子结构共价连接。用于连接叶酸、甘露糖和甘露糖簇的缀合技术是本领域已知的，例如，如us2014/0045919、us 9,725,479、us 8,758,810、us 8,450,467、us6,525,031、us 6,335,434和us 5,759,572中所描述。
[0102]
抗原结合部分
[0103]
本文所述的超分子结构中的抗原结合部分可以是抗体或其抗原结合片段，例如，f
(ab)2或fab，或其工程化衍生物，例如，fcab或融合蛋白(例如，scfv)。人或嵌合(例如，人源化)抗体可用作本文所述的超分子结构中的抗体。
[0104]
抗原结合部分靶向具有由抗原结合部分识别的表面抗原的apc。树突细胞可通过抗dec205、抗cd304、抗cd303、抗cd40、抗cd74、抗bdca2或抗cd123抗体或其抗原结合片段或其工程化衍生物靶向。巨噬细胞可通过抗cd163、抗cd40、抗cd74、抗cd206或抗cd123抗体或其抗原结合片段或其工程化衍生物靶向。
[0105]
抗cd38抗体的非限制性实例是达雷木单抗(daratumumab)、sar650984、mor202或wo 2012/092616中公开的抗体ab79、ab19、ab43、ab72和ab110中的任一种,这些抗体的公开内容以引用的方式并入本文。抗cd79b抗体的非限制性实例是wo 2014/011521中公开的huma79b v28。抗cd22抗体的非限制性实例是us 2014/0127197中公开的10f4。抗cd20抗体的非限制性实例是利妥昔单抗。抗dec205抗体的非限制性实例提供于us 2010/0098704中，其抗体以引用的方式并入本文。抗cd40抗体的非限制性实例是鲁卡木单抗(lucatumumab)和达西珠单抗(dacetuzumab)。抗cd304抗体的非限制性实例是维森库单抗(vesencumab)。
[0106]
用于连接抗原结合部分的缀合技术是本领域已知的，例如，如ansell等人,methods mol.med.,25:51-68,2000；us 2002/0025313；us 6,379,699；和us 5,059,421中所描述。
[0107]
多肽
[0108]
靶向部分可以是对细胞具有亲和力(例如，对细胞类型，例如树突细胞具有亲和力)的多肽。多肽的非限制性实例是rgd肽、狂犬病病毒糖蛋白(rvg)和dc3肽。可替代地，多肽可以是tlr2激动剂，例如malp-2脂蛋白、malp-404脂蛋白、ospa、孔蛋白、lcrv、hsp60、糖蛋白gh/gl或糖蛋白gb。
[0109]
用于连接肽的缀合技术是本领域已知的，例如，如ansell等人,methods mol.med.,25:51-68,2000；us 2002/0025313；us 6,379,699；和us 5,059,421中所描述。
[0110]
pamp
[0111]
靶向部分可以是pamp。pamp是本领域已知的，例如cpg odn。cpg odn通常分为三类：a类、b类和c类。a类cpg odn通常含有在3'-和5'-末端具有硫代磷酸酯主链的poly-g尾和包含磷酸主链的中心回文序列。a类cpg odn通常在中心回文序列中含有cpg。b类cpg odn通常包含完全硫代磷酸酯化的主链，并且b类cpg odn的5'端的序列通常对tlr9激活至关重要。c类cpg odn包含完全硫代磷酸酯化的主链，其中3'端序列能够形成双链体。可使用本领域已知的技术和方法将pamp共价连接至超分子结构。
[0112]
方法
[0113]
本文所述的抗菌裂解蛋白优选地被配制成药物组合物，用于施用于人受试者以疾病或疾患，如细菌感染(例如，细胞内细菌感染，例如分枝杆菌感染，例如ntm感染)。细菌感染可在其它方面健康的受试者中发生。可替代地，细菌感染可在患有另一种合并症或疾病的受试者中发生。例如，免疫系统减弱的受试者可能更容易受到细菌感染。
[0114]
由ntm引起的分枝杆菌感染是通常存在于环境中的细菌。吸入这些细菌可在健康患者和免疫系统受损的患者中引起疾病。ntm疾病最常影响成人的肺部，但它也可能影响任何身体部位。一些受试者感染ntm和发展疾病的风险更高。患有诸如支气管扩张(气道扩大)、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏症的现有肺部疾病的人或患
有先前感染如结核病的人肺部ntm疾病的风险增加。患有晚期hiv感染(cd4《50)或免疫相关遗传病症(例如，干扰素-γ缺乏症或受体缺乏症、白细胞介素-12缺乏症)的受试者可作为播散性(例如，在体内广泛存在的)ntm感染的一部分而发展肺部疾病。待的受试者例如除了细菌感染外还可能患有任何前述适应症。
[0115]
本文所述的方法组合物和方法可用于降低感染水平。例如，与参考相比，所述方法可降低感染水平(例如，细菌数量或感染大小)。例如，感染可降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
[0116]
药物组合物
[0117]
本文所述的抗菌剂优选地配制成以适于体内施用的生物相容性形式向人受试者施用的药物组合物。
[0118]
如本领域技术人员将理解的，本文所述的组合物可取决于所选施用途径以多种形式施用于受试者。本文所述的组合物可例如通过允许组合物(例如，超分子结构，例如脂质体、胶束或lnp)到达靶细胞的任何途径施用。组合物可例如通过经口、肠胃外、鞘内、脑室内、脑实质内、经颊、舌下、经鼻、直肠、贴剂、泵或透皮施用来施用，并且相应地配制药物组合物。肠胃外施用包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、脑室内、脑实质内、直肠和局部施用模式。在一个实施方案中，组合物经由气雾剂施用。肠胃外施用可通过在选定时间段内连续输注来进行。在一些优选的实施方案中，本文所述的组合物通过吸入施用。
[0119]
多于一种抗菌剂的施用可通过相同的途径或通过不同的途径进行，并且可依次或基本上同时发生。例如，可通过静脉内注射施用组合的第一抗菌剂，同时可经口施用组合的第二剂。
[0120]
本文所述的某些组合物可例如通过吸入施用。吸入可以是经口吸入或经鼻吸入。本文所述的可吸入组合物可以液体剂型或干粉剂型提供。干粉组合物可例如通过按原样或在媒介物(例如盐水(例如等渗盐水)、磷酸盐缓冲盐水或水)中重构后吸入而施用。
[0121]
可吸入干粉剂型可通过干燥(例如，通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾-冷冻干燥或超临界流体技术)由本文所述的液体组合物制备。本文所述的可吸入干粉剂型可包含载体(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇等)、冷冻保护剂(例如，海藻糖、甘露醇等)和/或抗粘附剂(例如，甘氨酸、l-亮氨酸、丝氨酸等)。本文所述的可吸入干粉剂型可使用干粉吸入器施用。干粉吸入器是本领域已知的并且可包括或可不包括推进剂。干粉吸入器的非限制性实例可在newman,expert opin.biol.ther.,4:23-33,2004中到，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0122]
本文所述的可吸入液体剂型(例如，气雾剂制剂)可使用可用于制备含有超分子结构的液体组合物的技术和方法来制备。可吸入液体剂型通常包括本文所述的超分子结构在生理上可接受的水性或非水性溶剂中的悬浮液，并且通常以无菌形式以单剂量或多剂量形式存在于密封容器中，所述密封容器可采用与雾化装置一起使用的药筒或再填充的形式。可替代地，密封容器可以是一体式分配装置，例如单剂量鼻吸入器或配备有意图在使用后丢弃的计量阀的气雾剂分配器。当剂型含有气雾剂分配器时，它将含有推进剂，所述推进剂可以是压缩气体(例如压缩空气)或有机推进剂(例如，氟代烷烃)。可吸入液体剂型可使用
雾化器施用。将散装液体气动转化为小液滴的过程被称为雾化。气动雾化器的操作需要推进剂作为液体雾化的驱动力。各种类型的雾化器描述于respiratory care,45:609-622,2000中，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。可替代地，本文所述的可吸入液体剂型可使用计量剂量吸入器施用。计量剂量吸入器是本领域已知的并且通常包括罐、致动器和计量阀。
[0123]
本文所述的组合物可例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一起经口施用，或者所述组合物可被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者所述组合物可被压制成片剂，或者所述组合物可直接与饮食的食物一起并入。对于经口性施用，本文所述的组合物可与赋形剂一起并入并以可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆和糯米纸囊剂的形式使用。本文所述的组合物也可肠胃外施用。本文所述的组合物的溶液可在合适地与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇、dmso及其有或无醇的混合物中以及在油中制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分描述于例如remington’s pharmaceutical sciences(2012,第22版)和2018年出版的the united states pharmacopeia:the national formulary(usp 41nf 36)中。适于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式都必须是无菌的，并且必须是流动的以达到可由注射器容易施用的程度。适用于经颊或舌下施用的组合物包括片剂、锭剂和糖果锭剂，其中活性成分与载体如糖、阿拉伯胶、黄芪胶、明胶和甘油一起配制。用于直肠施用的组合物方便地呈含有常规栓剂基质如可可脂的栓剂形式。
[0124]
如本文所述，本文所述的组合物可单独或与药学上可接受的载体组合施用于动物(例如人)，其比例由组合物的溶解度和化学性质、所选择的施用途径以及标准药学实践确定。
[0125]
本文所述的组合物(例如，包含抗微生物噬菌体蛋白的组合物)的剂量可根据许多因素而变化，所述因素如抗菌裂解蛋白的药效学性质；施用方式；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；的频率和同时的类型(如果有的话)；以及组合物在待动物中的清除率。本文所述的组合物可最初以合适的剂量施用，所述剂量可根据临床反应根据需要进行调整。在一些实施方案中，组合物(例如，包含噬菌体的组合物)的剂量是预防或有效量。此外，应理解所有剂量可连续给予或分成每个给定时间范围给予的剂量。例如，可每小时、每天、每周、每月或每年施用组合物。在一些实施方案中，组合物可连续或全身施用。
[0126]
组合疗法
[0127]
本文所述的药物组合物可作为组合疗法的一部分施用。组合疗法是指将两种(或更多种)不同的剂或作为针对特定疾病或疾患的限定方案的一部分施用于受试者。方案定义了每种剂的剂量和施用周期，以使单独剂对受试者的作用重叠。在一些实施方案中，两种或更多种剂的递送是同时或并行的，并且所述剂可共同配制。在一些实施方案中，两种或更多种剂不是共同配制的，并且作为处方方案的一部分以顺序方式施用。顺序或实质上同时施用每种剂可通过包括但不限于经口途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收的任何适当的途径来实现。可通过相同途径或通过不同途径施用
剂。例如，可通过静脉内注射或通过雾化施用组合的第一剂，同时可经口施用组合的第二剂。
[0128]
在本文所述的任何组合实施方案中，第一剂和第二剂可以任一顺序同时或顺序施用。第一剂可在第二剂之前或之后立即、至多15分钟、至多30分钟、至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多11小时、至多12小时、至多13小时、14小时、至多16小时、至多17小时、至多18小时、至多19小时、至多20小时、至多21小时、至多22小时、至多23小时、至多24小时或至多1-7、1-14、1-21或1-30天施用。
[0129]
本文所述的药物组合物还可包含与超分子结构联合施用的另外抗菌剂，所述超分子结构包含抗菌裂解蛋白。
[0130]
本文所述的组合物和方法还可包括潜在肺部疾患，例如，可能因细菌感染(例如，ntm感染)而恶化的肺部疾患。合适的肺部疗法包括但不限于气道清除、雾化器、呼吸器和吸入器(例如，类固醇吸入器)。
[0131]
抗生素
[0132]
另外的抗菌剂可以是抗生素。合适的抗生素包括但不限于青霉素g、青霉素v、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、阿洛西林、替莫西林、头孢噻吩(cepalothin)、头孢匹林、头孢拉定、头孢噻啶、头孢唑啉、头孢孟多、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、氯碳头孢、头孢西丁、头孢美唑(cefmatozole)、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢布烯、头孢地尼、头孢匹罗、头孢吡肟、氯己定、bal5788、bal9141、亚胺培南、厄他培南、美罗培南、氨曲南(astreonam)、克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、链霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素(paromycin)、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、壮观霉素、西索米星、地贝卡林(dibekalin)、异帕米星、四环素、氯四环素、地美环素、米诺环素、土霉素、美他环素、强力霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、泰利霉素、abt-773、林可霉素、克林霉素、万古霉素、奥利万星(oritavancin)、达巴万星、拉宁、奎奴普丁和达福普丁、磺胺，对氨基苯甲酸、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑、磺胺杀利定(sulfathalidine)、利奈唑胺、萘啶酸、噁唑酸、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、替马沙星、洛美沙星、氟罗沙星、格雷沙星、司帕沙星、曲伐沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、西他沙星、甲硝唑、达托霉素、加雷沙星、雷莫拉宁、法洛培南、多粘菌素、替加环素、azd2563、甲氧苄啶、乙胺丁醇和利福平。在一些实施方案中，多种抗生素与本文所述的组合物组合施用。在一些实施方案中，抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素类和氟喹诺酮类。在一些实施方案中，抗生素选自由以下组成的组：氨硫脲、sq-109、贝达喹啉、德拉马尼、吡嗪酰胺和。
[0133]
有利地，在一些实施方案中，如果在没有其它剂的情况下施用，则与共同施用的剂的协同作用可允许以将是亚的剂量施用抗生素。
[0134]
抗生素可与含有抗菌裂解蛋白的超分子结构一起配制。抗生素可作为单独的药物组合物施用。可在与含有具有噬菌体的超分子结构的药物组合物不同的时间施用抗生素。在一些优选的实施方案中，另外的抗生素是阿米卡星。阿米卡星可以是被配制用于例如吸入的脂质体阿米卡星。
[0135]
以下实施例旨在说明本发明。它们并不意味着以任何方式限制本发明。
[0136]
实施例
[0137]
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供可如何使用、制备和评价本文所述的组合物和方法的描述，并且所述实施例仅旨在作为本公开的示例而不旨在限制发明人认为是他们的公开内容的范围。
[0138]
实施例1：材料和方法
[0139]
克隆
[0140]
i.溶素a的克隆
[0141]
噬菌体halo lysa(gp 10(登录#nc_001900)的开放阅读框由genscript合成，pet21a质粒的ndei至xhoi位点中没有终止密码子。
[0142]
ii.溶素b的克隆
[0143]
bd29 lysb(gp12登录#nc_001900)的开放阅读框由genscript合成，具有衔接子以通过基于gibson的同源克隆在pet21质粒的t7标签下游的位置5237处克隆。
[0144]
蛋白质的制备
[0145]
i.表达
[0146]
用包含有效载荷的pet21a质粒转导大肠杆菌bl21(de3)细胞，并在胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)培养基中培养。所有培养物在37℃下生长大约3.5小时，或者直到达到0.4的光密度(od)600。将生长培养物在冰上孵育30分钟，然后用40mm iptg诱导。将培养物在降低的温度下孵育过夜以进行表达。从孵育箱中取出后，将培养物在浮桶式转子中以4,000转/分钟(rpm)离心20分钟，以使细胞与上清液分离。
[0147]
为了纯化性蛋白质，用含有细菌蛋白质提取试剂(b-per)、benzonasem和溶菌酶的溶液进行裂解。快速蛋白质液相谱(fplc)运行缓冲液由50mm tris ph 8、250mm nacl、50mm咪唑(ph 8)、0.5mm mgcl2和10％甘氨酸(glyc)组成。洗脱缓冲液由50mm tris ph8、250mm nacl、700mm咪唑(ph 8)、0.5mm mgcl2和10％甘油组成。5ml的cytiva histrap ff 5与aktapurifier一起使用，在4℃下用10kda透析袋进行洗脱级分的透析过夜。透析缓冲液由50mm tris ph 8、250mm nacl、0.5mm mgcl2和20％甘油组成。
[0148]
ii.有效载荷的脂质体包封
[0149]
为了用nanoassemblr ignite(precision nanosystems)组装脂质体，将1mg/ml总脂质浓度的1:0.3:0.4:1比率的1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc):1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐，dops):胆固醇(chol):1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)与有机溶剂乙醇和水性缓冲液1m tris ph 7.4合并。
[0150]
为了介导向脂质体添加有效载荷：将2-4mg/ml的蛋白质有效载荷添加至水性缓冲液，然后将1x10
8-1x10
10 pfu/ml噬菌体添加至水性缓冲液。这以15ml/min总流速和1:1流量比以及1ml总体积发生。为了通过两步透析纯化脂质体，在室温下在100mm或10mm tris ph7.4 5％甘油中通过10kda slide-a-lyzer进行透析30分钟。使用动态光散射(dls)装置分析样品的大小，以确定包封样品的大小和多分散性。选择产生介于0.5与1.5微米之间大小的样品用于细胞上测定。
[0151]
因此，制备了abiα(溶素a、溶素b、异淀粉酶和α-淀粉酶)和biα(溶素b、异淀粉酶和α-淀粉酶)。
[0152]
用abiα的给药杀死非结核分枝杆菌
[0153]
在第0天，通过在middlebrook 7h9肉汤+tween(约1x108cfu/ml)中经由mcfarland标准将细胞的对数生长调节至0.5并在7h9肉汤+tween中以1:5的比率稀释经调整的悬浮液来制备脓肿分枝杆菌细菌细胞的悬浮液。用于测定的培养基溶液包含30ml middlebrook 7h9、adc和tween；3.3ml 12x pm添加剂(biolog,inc)、3.3ml if-01a流体(biolog,inc)和400μl的100x染料g(biolog,inc)。通过以下方式来制备测定板：将90μl制备的培养基溶液吸移至96孔板的孔中，添加5μl制备的细胞悬浮液并添加10μl的酶，最终浓度为各自3.2μg。对照包括只有透析缓冲液或没有透析缓冲液的细胞。在制备步骤之后，通过用盖子覆盖板并用封口膜包裹来孵育测定板。然后将板置于37℃静态孵育箱中。
[0154]
在第1天，通过将10μl酶混合物添加至指定为剂量2x和3x的孔中来制备给药测定板。在第2天，将10μl的abiα(溶素a、溶素b、异淀粉酶和α-淀粉酶)或biα(溶素b、异淀粉酶和α-淀粉酶)混合物添加至指定为剂量3x的孔中。在第3天，用50ml的middlebrook7h9、adc和tween以及500μl的100x染料g制备用于连续稀释的染料培养基。通过以下方式来制备生长连续稀释液(gosd，例如-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8)：将90μl的培养基等分到96孔板中的孔中，从孵育箱中取出测定板，将10μl的反应物吸移至96孔板的顶行，并通过吸移10μl从a
–
h行进行10倍连续稀释(例如，在稀释到下一行之前，充分吸移以混合)。然后将板用盖子覆盖并用封口膜包裹且置于37℃、co2孵育箱中，静置72小时。孵育后，读取培养物光密度(od590)。实验数据以直方图的形式呈现，其中y轴描绘培养物光密度(od590)590除以检测下限(llod)(od590/llod)。llod是在没有用于背景测定的细胞对照的情况下计算的，因此任何高于1的值对于所述稀释度下的生长都是显著的。
[0155]
杀死缓慢生长分枝杆菌胞内分枝杆菌
[0156]
用5ml的12x pm添加剂溶液(biolog,inc)、45ml middlebrook7h9(含adc补充剂)和500ul 100x染料g(biolog,inc)制备培养基溶液。胞内分枝杆菌的处理如下进行：将90μl制备的培养基溶液添加至96孔板的a行。将胞内分枝杆菌的生长菌株的细胞密度调整至0.5mcfarland标准(约1x 108cfu/ml)并将10μl细胞添加至96孔板中，以达到1x10
5 cfu/孔的输入细胞浓度。作为对照，一些孔留下和/或添加10ul透析缓冲液(db)。10μl的abiα混合物的最终浓度为3.2μg/孔并将板在37℃下孵育3天。如前所述，读取od590并将板放回孵育箱中。在第6天，将板在37℃下孵育并定量od590。在最终步骤中，对单独细胞、细胞+db和细胞+abiα进行gosd反应。为此，将90μl培养基溶液添加至新的96孔板中，然后将10μl反应物添加质顶行，并从a行向下至h行进行10倍系列稀释。将板在37℃下孵育6天并读取od590。
[0157]
脓肿分枝杆菌上abiα混合物的mic测定
[0158]
将一管脓肿分枝杆菌稀释至macfarland标准0.5，稀释至1x105个细胞并根据板图添加至孔中。然后，将10μl的abiα混合物(3.2μg)添加至每个孔中。在未处理的对照中，添加相等体积的db。接下来，将比阿培南以2倍稀释系列添加至孔中。使用1x染料培养基将所有孔带至适当的体积和缓冲条件。具体地，在50ml falcon管中：添加30ml middlebrook 7h9、adc和tween；3.3ml 12x pm添加剂、3.3ml if-01a流体和400ul 100x染料g。
[0159]
将板在37℃下孵育24小时，用盖子和封口膜包裹两侧持续24小时。在所有连续稀释之前，将静态板振荡至少10分钟，并且还上下吸移以分解聚集体。复制gosd实验在omnilog biolog,inc中在37℃下进行96小时。在这些实验中，进行稀释至1x10-6
。
[0160]
分枝杆菌摄取至巨噬细胞中
[0161]
在第1天，如下制备巨噬细胞：将t-75烧瓶中的巨噬细胞的汇合培养物倾析出培养基并补充新鲜c-dmem(10ml)。用细胞刮棒从烧瓶底部刮下细胞，汇合度为大约8x106个细胞，并在c-dmem中稀释至1x105个细胞/ml的浓度。将100μl经稀释的细胞添加至96孔组织培养板的孔中(接种密度为1x104个细胞/孔)并将板在37℃下在5％co2中孵育过夜。
[0162]
在第2天，如下进行脓肿分枝杆菌摄取至巨噬细胞中：将脓肿分枝杆菌菌株的生长培养物调整至0.5mcfarland标准，在middlebrook7h9中1:5稀释，并且取出96孔组织培养板并用100μl磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤孔3次。向孔中添加100μl新鲜、预热的c-dmem、5μl的1x105个脓肿分枝杆菌细胞。然后将板在37℃下在5％ co2中孵育三小时。孵育后，用100μl的pbs洗涤细胞3次。接下来，添加100μl的c-dmem与250μg/ml的阿米卡星并将板孵育1小时。用100μl的pbs洗涤细胞3次，并用85μl含50μg/ml阿米卡星的c-dmem补充。为了用酶处理，将15μl制备的酶混合物添加至组织培养板的指定孔中。用3.2μg的abiα混合物的每种组分(例如，仅溶素a、仅溶素b、仅异淀粉酶和仅α-淀粉酶)进行游离酶处理。添加类似量的包封abiα，具有平均50％有效载荷包封。将板在37℃下在5％co2中孵育72小时。
[0163]
在第5天，如下进行巨噬细胞提取：孵育后，除去培养基，并用pbs洗涤细胞3次。添加100μl的0.5％ sds并通过上下吸移进行混合。将板在37℃下孵育10分钟，并且从孵育箱中取出。上下吸移孔以混合，并将培养基转移至新的96孔板。将板添加至biotek振荡器孵育箱中以使细胞解聚，并对所有反应孔进行gosd以进行cfu定量。
[0164]
志贺氏菌属噬菌体捕获方案和噬菌体制备
[0165]
如下进行志贺氏菌属噬菌体捕获方案和噬菌体制备。收集来自鹿岛废水处理设施的500ml激活的污泥样品。收到后，将样品经triton x-100处理，最终浓度为0.1％。将瓶倒置5次并静置5分钟。将样品等分到50ml falcon管中并以4000x g离心10分钟。将上清液收集到干中，并再用triton x 100处理一次，最终浓度为0.1％。为了储存，将40％甘油添加至上清液中，最终浓度为20％。将上清液以40ml体积等分在50ml falcon管中，并储存在-80℃冰箱中直至使用。
[0166]
将40ml在-80下储存于20％甘油中的经triton处理的污水上清液解冻。向250ml烧瓶中添加50ml tsb和1mm氯化镁以及500μl的过夜弗氏志贺氏菌菌株(atcc 29903)。用innovaprep中空纤维移液器浓缩污水上清液以提供富集。接下来，用一泵洗脱液(0.075％tween 20+25mm tris ph 8.0)洗脱含有tsb和细胞的烧瓶。将烧瓶在37℃下在振荡下孵育过夜。孵育后，将细胞以4000x g离心10分钟。通过0.2μm过滤器过滤上清液。为了进行噬菌斑测定，将100μl的细胞添加至100μl的富集，并将与3ml的0.5％ tsb顶部琼脂混合的富集连续稀释液涂铺到tsa板上。将板在37℃下孵育过夜。之后，将噬菌斑在5ml含1mm cacl2的tsb中生长24小时。将细胞和碎片以4000x g沉淀10分钟，并将上清液如前所述在innovaprep上纯化，并在含有50mm tris ph 8.0、150mm nacl、10mm mgcl2、2mm cacl2和0.1％明胶的1.5ml噬菌体缓冲液中培养。
[0167]
用志贺氏菌属噬菌体杀死细胞内志贺氏菌
[0168]
如下进行用志贺氏菌数噬菌体杀死细胞内志贺氏菌。在第1天，巨噬细胞的制备从t-75烧瓶中的巨噬细胞的汇合培养物开始，将所述汇合培养物倾析出培养基并用新鲜c-dmem(10ml)补充。用细胞刮棒从烧瓶底部刮下细胞(汇合度＝约8x106个细胞)，并在c-dmem
中稀释至1x105个细胞/ml的浓度。将100μl经稀释的细胞添加至96孔组织培养板的孔中(接种密度为1x104个细胞/孔)并将板在37℃下在5％ co2中孵育过夜。为了组成用于abiα和志贺氏菌属实验的脂质体，所有脂质体都使用标准脂质组成，包括dopc、dops、dope和chol。这种组成以1:1流量比和15ml/min流速发生。所使用的脂质溶剂包括etoh和水性缓冲液1m tris ph 8。所有脂质体在10kda膜中透析1小时。具体地，在100mm tris ph 8 5％甘油中进行30分钟透析并且在10mm tris ph 8 5％甘油中进行30分钟透析。在添加细胞之前通过以下方式测量蛋白质的浓度：取得样品，将样品1:1稀释在50％ ipa 50％ pbs中，涡旋，并在nanodrop上读取280nm处的吸光度。
[0169]
在第2天，通过以下方式来进行细菌摄取到巨噬细胞中：使用弗氏志贺氏菌的生长培养物将，将所述培养物调整至0.5mcfarland标准并用浊度计确认，1:5稀释于middlebrook 7h9中并取出96孔组织培养板，并且用100μl pbs洗涤孔3次。向孔中添加100μl新鲜、预热的c-dmem和5μ制备的培养物。将板在37℃下在5％ co2中孵育3小时。孵育后，用100μl的pbs洗涤细胞3次。添加100μl含250μg/ml阿米卡星的c-dmem并孵育1小时。之后，用100μl的pbs洗涤细胞，并用85μl含50ug/ml阿米卡星的c-dmem补充。对照不添加阿米卡星。为了用未包封(例如，游离)或包封的有效载荷进行后处理，将10μl制备的有效载荷添加至组织培养板的指定孔中。
[0170]
实施例2：抗菌裂解蛋白的递送介导分枝杆菌细胞的有效杀死
[0171]
此实施例描述能够减弱分枝杆菌细胞的繁殖的剂量依赖性酶混合物的证明。
[0172]
材料和方法
[0173]
实施例1中描述了材料和方法以及细胞系。
[0174]
结果
[0175]
对一系列生长连续稀释液(gosd)中的细菌细胞的生长的筛选(图1)表明，当用单剂量或多剂量的溶素a(a)、溶素b(b)、异淀粉酶(i)和α-淀粉酶(α)的酶混合物(abiα)处理时，与未处理的对照相比以及如通过光密度(od；图2a)和细胞计数(图2b)所评估，脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessus/m.abscessus)被剂量依赖性地杀死。为了鉴定不同剂量的abiα处理是否会引发脓肿分枝杆菌无菌性，进行了剂量反应实验。图3描绘剂量反应实验，据此观察到3.2μg的abiα处理消除了脓肿分枝杆菌。当对缓慢生长分枝杆菌属物种胞内分枝杆菌进行类似实验并在数天内监测细胞生长(图4b)时，发现abiα处理导致细胞生长的持续减弱(图4a)。在类似的研究中，证明了abiα混合物有效地减弱了鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、古德分枝杆菌、马赛分枝杆菌(m.masiliense)、博莱分枝杆菌(m.boletti)、奇美拉分枝杆菌(m.chimera)和耻垢分枝杆菌的细胞生长(数据未示出)。综上所述，这些结果表明abiα在体外死亡/生长测定中对分枝杆菌的剂量依赖性灭菌。
[0176]
实施例3：抗菌裂解蛋白和抗生素的递送介导分枝杆菌细胞的协同杀死
[0177]
此实施例描述abiα酶混合物与抗生素的组合对分枝杆菌繁殖的减弱的协同作用。
[0178]
材料和方法
[0179]
实施例1中描述了材料和方法以及细胞系。
[0180]
结果
[0181]
图5是分别用abiα和抗生素阿米卡星、比阿培南、头孢西丁、乙胺丁醇、莫西沙星、利福平或克拉霉素处理后，脓肿分枝杆菌的细胞生长测定的表格定量。使用分数抑制浓度
(fic)指数进行定量揭示，abiα与阿米卡星、比阿培南、头孢西丁或莫西沙星的组合引发对脓肿分枝杆菌生长的减弱的协同作用。总之，这些结果证明，abiα的酶混合物与多种化学抗生素的组合引发对分枝杆菌细胞的死亡的协同作用。
[0182]
实施例4：包封的抗菌裂解蛋白的递送介导受感染巨噬细胞中分枝杆菌细胞的高度有效杀死
[0183]
此实施例描述包封的酶混合物在减弱受感染巨噬细胞中细胞内定位的分枝杆菌的繁殖中的功效增强。
[0184]
材料和方法
[0185]
实施例1中描述了材料和方法以及细胞系。
[0186]
结果
[0187]
为了鉴定最有效的酶组合(溶素a(a)、溶素b(b)、异淀粉酶(i)或α-淀粉酶(α))以及它们的包封是否将增强减弱分枝杆菌繁殖的功效(图6)，测量了脓肿分枝杆菌在它们从用未包封的abiα、ab、iα或biα或包封的abiα、ab、iα或biα(分别encabiα、encab、enciα和encbiα；图7)处理的受感染巨噬细胞中提取后的光密度。观察到，与未包封的abiα和所有其它部分混合物相比，包封的abiα混合物展现增强的脓肿分枝杆菌杀死(图8)。综上所述，这些结果证明单剂量的包封abiα混合物杀死99％的细胞内脓肿分枝杆菌，相比之下未包封的abiα杀死90％。
[0188]
实施例5：包封的噬菌体的递送介导受感染巨噬细胞中分枝杆菌细胞的高度有效杀死
[0189]
此实施例描述包封的志贺氏菌属噬菌体在减弱受感染巨噬细胞中细胞内定位的弗氏志贺氏菌(shigella flexneri/s.flexneri)的繁殖中的功效。
[0190]
材料和方法
[0191]
实施例1中描述了材料和方法以及细胞系。
[0192]
结果
[0193]
为了鉴定志贺氏菌属噬菌体是否可用于减弱受感染巨噬细胞中弗氏志贺氏菌的繁殖，进行了一项实验，其中将巨噬细胞用弗氏志贺氏菌和编码性有效载荷(eph34)的未包封或包封的志贺氏菌属噬菌体处理(图9)。在48小时孵育期后，提取细胞并定量gosd过夜。观察到包封的志贺氏菌属噬菌体eph34(encphage)在从巨噬细胞中提取后未展示生长，而未包封的噬菌体eph34在-1稀释度下显示出生长(图10)。总而言之，这些结果证明encphage在受感染巨噬细胞中产生了最有效的弗氏志贺氏菌减少，如通过光密度的10倍降低所指示。
[0194]
其它实施方案
[0195]
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式整体并入本文，其程度就如同特定地和个别地指示将每一个别公布、专利或专利申请以引用的方式整体并入本文一般。在以引用的方式并入本文的文献中发现本技术中的术语被不同地定义时，本文提供的定义将用作所述术语的定义。
[0196]
尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但应了解能够对本发明进行进一步的修改并且本技术意图涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的改变、用途或改编，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或常规实践的和属于上
文所述的实质特征的以及符合权利要求书范围之内的变更。

技术特征：

1.一种将抗菌裂解蛋白递送至受试者中的专职抗原呈递细胞中包含细菌细胞的靶向细胞内区室的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含所述抗菌裂解蛋白，其中所述超分子结构包含约75nm至约750nm的z-平均粒径，其中，在所述施用步骤之后，所述抗菌裂解蛋白被递送至所述靶向细胞内区室。2.如权利要求1所述的方法，其中所述专职抗原呈递细胞是巨噬细胞或树突细胞。3.一种由细菌细胞引起的细胞内细菌感染的方法，所述方法包括以足以所述细菌感染的量和持续时间向受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含抗菌裂解蛋白，其中所述超分子结构包含约75nm至约750nm的z-平均粒径。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含约250nm至约750nm的z-平均粒径。5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含约75nm至约250nm的z-平均粒径。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述超分子结构还包含靶向部分。7.一种将抗菌裂解蛋白递送至受试者中的专职抗原呈递细胞中包含细菌细胞的靶向细胞内区室的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含靶向部分和货物，所述货物包含所述抗菌裂解蛋白，其中，在所述施用步骤之后，所述抗菌裂解蛋白被递送至所述靶向细胞内区室。8.如权利要求7所述的方法，其中所述专职抗原呈递细胞是巨噬细胞或树突细胞。9.一种由细菌细胞引起的细胞内细菌感染的方法，所述方法包括以足以所述细菌感染的量和持续时间向受试者施用包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含靶向部分和货物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含约250nm至约750nm的z-平均粒径。11.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含约75nm至约250nm的z-平均粒径。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞是分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属物种。13.如权利要求12所述的方法，其中：(a)所述分枝杆菌属物种是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海洋分枝杆菌或脓肿分枝杆菌；(b)所述沙门氏菌属物种是肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或邦戈沙门氏菌；(c)所述奈瑟氏菌属物种是淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌；(d)所述布鲁氏菌属物种是羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌或犬布鲁氏菌；(e)所述埃希氏菌属物种是大肠杆菌；(f)所述李斯特氏菌属物种是单核细胞增多性李斯特氏菌；(g)所述弗朗西斯氏菌属物种是土拉弗朗西斯氏菌、新凶手弗朗西斯氏菌或蜃楼弗朗西斯氏菌；(h)所述军团菌属物种是嗜肺军团菌；
(i)所述耶尔森氏菌属物种是鼠疫耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌；(j)所述葡萄球菌属物种是金黄葡萄球菌；(k)所述梭菌属物种是肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌或索氏梭菌，(l)所述志贺氏菌属物种是痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌或宋内志贺氏菌；或者(m)所述链球菌属物种是酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、缓症链球菌、变异链球菌或肺炎链球菌。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其所述抗菌裂解蛋白是荚膜解聚酶、淀粉酶或溶素。15.如权利要求14所述的方法，其中所述荚膜解聚酶是水解酶、金属水解酶、环氧化物水解酶、肽聚糖水解酶、多糖酶、多糖裂解酶、内切唾液酸酶、透明质酸裂解酶或海藻酸裂解酶。16.如权利要求14所述的方法，其中：(a)所述溶素是溶素a或溶素b；并且/或者(b)所述淀粉酶是α-淀粉酶或异淀粉酶。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抗菌裂解蛋白是抗菌分枝杆菌噬菌体蛋白。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述抗菌裂解蛋白能够杀死所述细菌细胞。19.如权利要求6至18中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是靶向专职抗原呈递细胞的细胞外靶向部分。20.如权利要求19所述的方法，其中所述专职抗原呈递细胞是巨噬细胞或树突细胞。21.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中所述靶向部分包含磷脂酰丝氨酸。22.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗cd163、抗cd40、抗cd74、抗cd206、抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗dec205、抗cd304、抗cd303、抗cd40、抗cd74、抗bdca2和抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。25.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中所述靶向部分包含病原体相关分子模式(pamp)。26.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是甘露糖簇或叶酸。27.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是tlr2激动剂。28.如权利要求27所述的方法，其中所述tlr2激动剂选自由以下组成的组：malp-2脂蛋白、malp-404脂蛋白、外表面脂蛋白a(ospa)、孔蛋白、lcrv、hsp60、糖蛋白gh/gl或糖蛋白gb。29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述超分子结构是脂质纳米颗粒。30.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述超分子结构是胶束。
31.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述超分子结构是脂质体。32.如权利要求31所述的方法，其中所述脂质体是单层的。33.如权利要求31所述的方法，其中所述脂质体是多层的。34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含约0.05至约0.3的多分散性指数。35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述超分子结构包含一种或多种脂质。36.如权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种脂质中的至少一种是可电离脂质。37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，所述方法还包括施用抗生素。38.如权利要求37所述的方法，其中所述抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素类和氟喹诺酮类。39.如权利要求37所述的方法，其中所述抗生素选自由以下组成的组：氨硫脲、sq-109、贝达喹啉、德拉马尼、吡嗪酰胺和。40.如权利要求37所述的方法，其中所述抗生素选自由以下组成的组：阿奇霉素、克拉霉素、乙胺丁醇、利福平和阿米卡星。41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中静脉内、经口或通过吸入施用所述组合物。42.一种包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含抗菌裂解蛋白，其中所述超分子结构包含约75nm至约750nm的z-平均粒径。43.如权利要求42所述的组合物，所述组合物还包含靶向部分。44.一种包含超分子结构的组合物，所述超分子结构包含靶向部分和货物，所述货物包含抗菌裂解蛋白。45.如权利要求42至44中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构包含约250nm至约750nm的z-平均粒径。46.如权利要求42至44中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构包含约75nm至约250nm的z-平均粒径。47.如权利要求42至46中任一项所述的组合物，其中所述噬菌体蛋白是荚膜解聚酶、淀粉酶或溶素。48.如权利要求47所述的组合物，其中所述荚膜解聚酶是水解酶、金属水解酶、环氧化物水解酶、肽聚糖水解酶、多糖酶、多糖裂解酶、内切唾液酸酶、透明质酸裂解酶或海藻酸裂解酶。49.如权利要求47所述的组合物，其中：(a)所述溶素是溶素a或溶素b；并且/或者(b)所述淀粉酶是α-淀粉酶或异淀粉酶。50.如权利要求42至49中任一项所述的组合物，其中所述抗菌裂解蛋白是抗菌分枝杆菌噬菌体蛋白。51.如权利要求43至50中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是靶向专职抗原呈递细胞的细胞外靶向部分。52.如权利要求51所述的组合物，其中所述专职抗原呈递细胞是巨噬细胞或树突细胞。
53.如权利要求43至52中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包含磷脂酰丝氨酸。54.如权利要求43至52中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。55.如权利要求54所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗cd163、抗cd40、抗cd74、抗cd206、抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。56.如权利要求54所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：抗dec205、抗cd304、抗cd303、抗cd40、抗cd74、抗bdca2和抗cd123抗体以及它们的抗原结合片段。57.如权利要求43至52中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分包含pamp。58.如权利要求43至52中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是甘露糖簇或叶酸。59.如权利要求43至52中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是tlr2激动剂。60.如权利要求59所述的组合物，其中所述tlr2激动剂选自由以下组成的组：malp-2脂蛋白、malp-404脂蛋白、ospa、孔蛋白、lcrv、hsp60、糖蛋白gh/gl或糖蛋白gb。61.如权利要求42至60中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构是脂质纳米颗粒。62.如权利要求42至60中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构是胶束。63.如权利要求42至60中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构是脂质体。64.如权利要求63所述的组合物，其中所述脂质体是单层的。65.如权利要求63所述的组合物，其中所述脂质体是多层的。66.如权利要求42至65中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构包含约0.05至约0.3的多分散性指数。67.如权利要求42至65中任一项所述的组合物，其中所述超分子结构包含一种或多种脂质。68.如权利要求67所述的组合物，其中所述一种或多种脂质中的至少一种是可电离脂质。69.如权利要求42至68中任一项所述的组合物，所述组合物还包含抗生素。70.如权利要求69所述的组合物，其中所述抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素类和氟喹诺酮类。71.如权利要求69所述的组合物，其中所述抗生素选自由以下组成的组：氨硫脲、sq-109、贝达喹啉、德拉马尼、吡嗪酰胺和。72.如权利要求71所述的组合物，其中所述抗生素选自由以下组成的组：阿奇霉素、克拉霉素、乙胺丁醇、利福平和阿米卡星。73.如权利要求42至72中任一项所述的组合物，其中所述抗菌裂解蛋白能够杀死分枝杆菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、布鲁氏菌属、埃希氏菌属、李斯特氏菌属、弗朗西斯氏菌属、军团菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、梭菌属、志贺氏菌属或链球菌属物种。74.如权利要求69所述的组合物，其中：(a)所述分枝杆菌属物种是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、海洋分枝杆菌或脓肿分枝杆菌；(b)所述沙门氏菌属物种是肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或邦戈沙门氏菌；(c)所述奈瑟氏菌属物种是淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌；
(d)所述布鲁氏菌属物种是羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌或犬布鲁氏菌；(e)所述埃希氏菌属物种是大肠杆菌；(f)所述李斯特氏菌属物种是单核细胞增多性李斯特氏菌；(g)所述弗朗西斯氏菌属物种是土拉弗朗西斯氏菌、新凶手弗朗西斯氏菌或蜃楼弗朗西斯氏菌；(h)所述军团菌属物种是嗜肺军团菌；(i)所述耶尔森氏菌属物种是鼠疫耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌；(j)所述葡萄球菌属物种是金黄葡萄球菌；(k)所述梭菌属物种是肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌或索氏梭菌；(l)所述志贺氏菌属物种是痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌或宋内志贺氏菌；或者(m)所述链球菌属物种是酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、缓症链球菌、变异链球菌或肺炎链球菌。

技术总结

本公开的特征是用于细菌感染，如由驻留在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞，例如免疫细胞，例如巨噬细胞或树突细胞)内的细菌细胞引起的细菌感染的组合物和方法。所述组合物和方法包括递送抗微生物剂以特异性地靶向所述细菌细胞所驻留的细胞内区室(内体、吞噬体、溶酶体或细胞溶质)。体或细胞溶质)。体或细胞溶质)。

技术研发人员：

J

受保护的技术使用者：

安度利体技术公司

技术研发日：

2021.03.08

技术公布日：

2022/12/29