用于成像系统的成像链和光谱边缘检测的制作方法

用于成像系统的成像链和光谱边缘检测
1.本技术要求于2020年4月6日提交的美国临时申请no.63/005,932的优先权权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
2.参考引用
3.本说明书中提及的所有出版物和专利申请的全部内容都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示以通过引用并入一样。
技术领域
4.本公开总体上涉及用于分析样品的显微成像系统。更具体地，本公开涉及减轻用于荧光显微镜的成像系统的光学像差。此外，本公开涉及用于自动化高通量成像系统的成像链。另外，本公开涉及用于顺序地检测多个检测基团(detection moieties)的方法和成像系统。

背景技术：

5.显微镜是用于对无机和有机样品进行检查和成像的强大技术。选定的样品可以包括具有一种或多种可以作为检测或成像目标的生物标志物或组分的生物样品。用于显微镜的当前成像链滤光器和成像系统可以仅许可在任何给定时间使用有限数量的标签。此外，成像系统可能遇到诸如像差、像散、焦点偏移和图像偏移等之类的图像质量问题。因此，从业者、研究人员和显微镜技术人员一直寻求更有效且准确地进行样本成像的系统和方法。

技术实现要素：

6.在第一方面，提供了一种成像系统的实施例。所述成像系统包括：至少一个可倾斜滤光器组件，所述至少一个可倾斜滤光器组件包括被配置为设置在所述成像系统的光路中的光学滤光器；动态校正光学器件，所述动态校正光学器件被配置为设置在所述成像系统的光路中；以及固定校正光学器件，所述固定校正光学器件被配置为设置在所述成像系统的光路中。
7.所述成像系统可以包括被配置为设置在所述成像系统的光路中的远心管透镜。
8.在一些实施例中，所述固定校正光学器件被配置为基本上减轻由所述光学滤光器和所述动态校正光学器件的组合引起的像散。
9.由所述固定校正光学器件、所述动态校正光学器件和所述光学滤光器的组合引起的任何残余像散可以近似为零(0)。
10.在一些实施例中，对于所述光学滤光器的选定的第一入射角，所述动态校正光学器件被配置为倾斜到第二入射角，并且其中，所述固定校正光学器件的入射角被配置为产生像散，以基本上减轻由处于选定的所述第一入射角的所述光学滤光器和处于所述第二入射角的所述动态校正光学器件的组合引起的像散。所述动态校正光学器件可以被配置为基本上稳定由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移。在一些实施例中，由所述动态校正光学器件引起的横向图像偏移与由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移的总和
大致恒定。对于所述光学滤光器的选定的第一入射角，所述动态校正光学器件可以被配置为倾斜到第二入射角，并且其中，由所述动态校正光学器件引起的横向图像偏移和由所述光学滤光器引起的横向图像偏移的总和大致恒定。
11.在一些实施例中，由所述至少一个可倾斜滤光器组件夹持的所述光学滤光器和所述动态校正光学器件被配置为在大致平行的x轴上倾斜，并且其中，所述固定校正光学器件在大致垂直的y轴上倾斜。所述远心管透镜可以位于所述成像系统的光路中的所述远心管透镜在图像空间和物体空间二者中都是远心的位置处。
12.在一些实施例中，所述系统包括被配置为夹持所述至少一个可倾斜滤光器组件的滤光器变换器。所述滤光器变换器可以是滤光器轮，并且所述至少一个可倾斜滤光器组件可以被配置为将所述光学滤光器倾斜到选自大致0
°
至89.9
°
的范围的入射角。在一些实施例中，所述滤光器变换器包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个可倾斜滤光器组件。
13.在一些实施例中，所述系统包括低入射滤光器，所述低入射滤光器选自由二滤光器、多滤光器、短通滤光器、长通滤光器、带通滤光器、带阻滤光器和多通滤光器组成的组中的至少一个，其中，所述低入射滤光器被配置为具有选自大致10.0
°
至30.0
°
范围的角度的激发光的入射角。所述低入射滤光器可以是多滤光器。
14.在一些实施例中，所述成像系统是荧光显微镜成像系统。
15.所述光学滤光器可以是干涉滤光器。
16.在一些实施例中，所述至少一个可倾斜滤光器组件被配置为将所述光学滤光器倾斜到选自大致0
°
至89.9
°
的范围的入射角。
17.在另一方面，提供了一种减轻成像系统中的像散的方法。所述方法包括以下步骤：将光学滤光器以第一入射角设置在所述成像系统的光路中；将动态校正光学器件以第二入射角设置在所述成像系统的光路中；将固定校正光学器件以第三入射角设置在所述成像系统的光路中；其中，所述固定校正光学器件的入射角被配置为产生像散，以基本上减轻处于所述第一入射角的所述光学滤光器的组合像散和处于所述第二入射角的所述动态校正光学器件的像散。
18.在又一方面，提供了一种稳定成像系统中的横向图像偏移的方法。所述方法包括以下步骤：将光学滤光器以第一入射角设置在所述成像系统的光路中；将动态校正光学器件以第二入射角设置在所述成像系统的光路中；其中，所述动态校正光学器件被配置为基本上稳定由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移。
附图说明
19.图1是示出了用于荧光显微镜成像系统的成像链的实施例的示意图。
20.图2a是滤光轮的一个实施例的立体图。
21.图2b是滤光组件的一个实施例的立体图。
22.图3是滤光组件、凸轮和电机的一个实施例的立体图。
23.图4a是示出了用于荧光显微镜成像系统的成像链的一个实施例的示意图。
24.图4b是用于荧光显微镜成像系统的成像链的选定的元件的立体图。
25.图5是示出了用于荧光显微镜成像系统的成像链的另一实施例的示意图。
26.图6是示出了用于荧光显微镜成像系统的成像链的其他实施例的示意图。
27.图7a是示出了第一检测基团的发射光谱的曲线图。
28.图7b是示出了第二检测基团的发射光谱的曲线图。
29.图7c是示出了第三检测基团的发射光谱的曲线图。
30.图8a是示出了发射光谱和背景信号的曲线图。
31.图8b在成像期间获得的信号。
32.图9a至图9d是示出了第一检测基团和第二检测基团的发射光谱和成像的曲线图。
33.图9e是示出了第一检测基团、第二检测基团和第三检测基团的发射光谱和成像的曲线图。
具体实施方式
34.在以下描述中，术语“原始图像”用于描述包括已由传感器或检测器捕获、尚未被处理的数据或至少一个信号的图像(无论是否视觉地显示给操作者或终端用户)。
35.在以下描述中，术语“最终图像”用于描述包括已被处理的数据或至少一个信号的图像(无论是否视觉地显示给操作者或终端用户)。“最终图像”还可以用于描述作为通过两个或更多个原始或其他最终图像的比较和/或分析得到的输出图像的图像(无论是否视觉地显示给操作者或终端用户)。
36.在以下描述中，术语“光”并不旨在限于描述电磁波谱的可见部分中的电磁辐射，而是还旨在描述电磁波谱的紫外部分和红外部分中的辐射。
37.在以下描述中，术语“样品”用于描述有机固体、有机流体、无机固体、无机流体、生物流体、生物半固体、生物固体(其可以保持诸如组织之类的固体，或者可以以任何适当的方式被液体化)、悬浮液、悬浮液的一部分、悬浮液的组分等。
38.在以下描述中，术语“目标分析物”或“目标材料”用于描述所关注的生物材料。
39.在以下描述中，术语“非目标分析物”用于描述不是目标分析物的生物材料。
40.在以下描述中，术语“生物标志物”用于描述存在于目标分析物或目标材料之上或之内的物质(即，目标分析物的细胞内或细胞外的；诸如通过吞噬作用在目标分析物内内化的；或类似物)。生物标志物包括但不限于肽、蛋白质、亚基、域、基序、表位、亚型、dna、rna等。生物标志物可以是用于药物递送的靶分子。
41.在以下描述中，术语“亲和分子”用于描述能够与另一分子结合或相互作用的任何分子。相互作用或结合可以是共价的或非共价的。亲和分子包括但不限于抗体、半抗原、蛋白质、适体、寡核苷酸、多核苷酸、或用于与另一分子相互作用或结合的任何合适的分子(例如，生物标志物；结合对分子或互补分子，包括但不限于生物素或亲和素；或类似物)。
42.在以下描述中，术语“通道”用于描述基于由荧光团的一个或多个检测基团提供的信号的颜或颜范围。基于所选择的干涉滤光器(即，激发滤光器、发射滤光器、多滤光器、二滤光器)和/或信号的波长来获得颜或颜范围。例如，通道可以是紫、蓝、绿、黄、橙、红、深红等。此外，当使用多个通道时，每个通道具有特定的颜或颜范围。例如，第一通道可以是绿的，并且第二通道可以是橙的。应该注意，尽管两个或更多个检测基团可以提供具有不同波长的信号，但基于所使用的滤光器组，信号可以处于同一通道中。例如，第一检测基团提供具有488nm波长的信号，并且第二检测基团提供具有
藻红蛋白；rsgfp(红移gfp(s65t))；s65a；s65c；s65l；s65t；蓝宝石gfp；sbfi；血清素；sevron亮红2b；sevron亮红4g；sevron亮红b；sevron橙；sevron黄l；sggfp
tm
(超级发光gfp；sits(primuline)；sits(异硫代磺酸二苯乙烯)；snafl钙黄绿素；snafl-1；snafl-2；snarf钙黄绿素；snarf1；钠绿；谱浅绿；谱绿；谱橙；谱红；spq(6-甲氧基-n-(3-磺丙基)喹啉)；芪；磺胺罗丹明b can c；磺胺罗丹明g extra；syto 11；syto12；syto 13；syto 14；syto15；syto 16；syto 17；syto 18；syto 20；syto 21；syto 22；syto 23；syto 24；syto 25；syto40；syto 41；syto 42；syto 43；syto 44；syto 45；syto 59；syto 60；syto 61；syto 62；syto 63；syto 64；syto 80；syto81；syto 82；syto 83；syto 84；syto 85；sytox蓝；sytox绿；sytox橙；sytox红；四环素；四甲基罗丹明(tritc)；texas红
tm
；texas红-x
tm
偶联物；硫代羰花青(disc3)；噻嗪红r；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素s；硫黄素tcn；硫电解液；噻唑橙；tinopol cbs(calcofluor白)；tmr；to-pro-1；to-pro-3；to-pro-5；toto-1；toto-3；三(pe-cy5)；四甲基罗丹明异硫氰酸盐；trueblue；trured；tubulin tracker
tm
绿；ultralite；铀b；uvitex sfc；wt gfp(野生型gfp)；ww 781；x-罗丹明；xritc；二甲苯橙；y66f；y66h；y66w；黄gfp(黄移)；绿荧光蛋白；yfp(黄荧光蛋白)；yo-pro-1；yo-pro-3；yoyo-1；yoyo-3；cf350、cf405s、cf405m、cf405l、cf430、cf440、cf450、cf488a、cf503r、cf514、cf532、cf543、cf550r、cf555、cf568、cf570、cf583、cf594、cf620r、cf633、cf640r、cf647、cf660c、cf660r、cf680、cf680r、cf700、cf750、cf770、cf790、cf800、cf820、dy-344in、dy-350xl、dy-360xl、dy-370xl、dy-376xl、dy-380xl、dy-395xl、dy-396xl、dy-480xl、dy-481xl、dy-485xl、dy-510xl、dy-511xl、dy-520xl、dy-521xl、dy-601xl、dy-350、dy-351、dy-405、dy-410、dy-415、dy-430、dy-431、dy-478、dy-488、dy-490、dy-495、dy-505、dy-530、dy-546、dy-547、dy-547p1、dy-548、dy-548p1、dy-549、dy-549p1、dy-550、dy-554、dy-555、dy-556、dy-557、dy-560、dy-580、dy-585、dy-590、dy-591、dy-594、dy-605、dy-610、dy-615、dy-630、dy-631、dy-632、dy-633、dy-634、dy-635、dy-636、dy-641、dy-643、dy-647、dy-647p1、dy-648、dy-648p1、dy-649、dy-649p1、dy-650、dy-651、dy-652、dy-654、dy-660p1、dy-675、dy-676、dy-677、dy-678、dy-679p1、dy-680、dy-681、dy-682、dy-684、dy-700、dy-701、dy-703、dy-704、dy-705、dy-706、dy-720、dy-730、dy-731、dy-732、dy-734、dy-736、dy-749、dy-747p1、dy-749p1、dy-750、dy-751、dy-752、dy-754、dy-765、dy-776、dy-777、dy-778、dy-780、dy-781、dy-782、dy-784、dy-800、dy-805、dy-820、dy-831、dy-845、dy-865；以及，它们的组合和衍生物。在一个实施例中，诸如有机荧光团之类的检测基团可以具有大致100道尔顿或更大的分子量，分子量包括但不限于至少1千道尔顿、至少10千道尔顿、至少25千道尔顿、至少50千道尔顿、至少75千道尔顿、至少100千道尔顿、至少150千道尔顿、至少200千道尔顿、至少250千道尔顿、至少300千道尔顿、至少340千道尔顿、至少350千道尔顿、至少500千道尔顿和至少750道尔顿。
46.在以下描述中，可互换使用的术语“染剂”或“标记”用于描述与检测基团结合或相互作用的亲和分子。结合或相互作用可以是直接的或间接的。直接结合或相互作用包括生物标志物与检测基团之间的共价或非共价相互作用。间接结合或相互作用包括使用形成结合对的至少第一互补分子和第二互补分子。第一互补分子和第二互补分子组合为结合对，其可以以下列方式中的至少一种结合或相互作用：疏水相互作用、离子相互作用、氢键结合相互作用、非共价相互作用、共价相互作用、亲和相互作用等。结合对包括但不限于：免
疫型结合对，诸如抗原-抗体、抗原-抗体片段、半抗原-抗-半抗原或第一抗体-第二抗体；非免疫型结合对，诸如生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、激素-激素受体、凝集素-特异性碳水化合物、酶-酶、酶-底物、酶-底物类似物，酶-假底物(不能被酶活性催化的底物类似物)、酶-辅因子、酶-调节剂、酶-抑制剂或维生素b12-内在因子。结合对的其他合适示例包括互补核酸片段(包括互补核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸)；蛋白a-抗体；蛋白g-抗体；核酸-核酸结合蛋白；聚合物接头(例如，聚乙二醇)；或多核苷酸-多核苷酸结合蛋白。结合对可以被包括在扩增技术内或用作扩增技术。还实现扩增技术以增加与生物标志物结合或相互作用的检测基团的数量，以增加信号。在一个实施例中，当使用结合对时，染剂可以是预结合的，使得在标记、染或添加步骤期间，亲和分子在添加到样品中时已与检测基团结合或相互作用。在一个实施例中，当使用结合对时，染剂可以在样品中缀合，使得标记、染或添加步骤包括引入(以任何期望或适当的顺序)亲和分子-第一结合分子偶联物和第二结合对分子-检测基团偶联物，其中，第一结合对分子和第二结合对分子是互补的并且彼此结合或相互作用。
47.此外，“多种染剂”可以用于描述其中亲和分子和/或检测基团不同的两种或更多种染剂。例如，抗-ck-alexa 647不同于抗-epcam-alexa647。作为另一示例，抗-ck-alexa 647不同于抗-ck-alexa 488。
48.在以下描述中，术语“缀合物”用于描述与第二化学物、分子、部分等结合或相互作用的第一化学物、分子、部分等。结合或相互作用是直接的或间接的。直接结合或相互作用包括生物标志物与检测基团之间的共价或非共价相互作用。间接结合或相互作用包括使用形成结合对的至少第一互补分子和第二互补分子。第一互补分子和第二互补分子组合为结合对，其以下列方式中的至少一种结合或相互作用：疏水相互作用、离子相互作用、氢键结合相互作用、非共价相互作用、共价相互作用、亲和相互作用等。结合对包括但不限于：免疫型结合对，诸如抗原-抗体、抗原-抗体片段、半抗原-抗-半抗原或第一抗体-第二抗体；非免疫型结合对，诸如生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、激素-激素受体、凝集素-特异性碳水化合物、酶-酶、酶-底物、酶-底物类似物，酶-假底物(不能被酶活性催化的底物类似物)、酶-辅因子、酶-调节剂、酶-抑制剂或维生素b12-内在因子。结合对的其他合适示例包括互补核酸片段(包括互补核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸)；蛋白a-抗体；蛋白g-抗体；核酸-核酸结合蛋白；聚合物接头(例如，聚乙二醇)；或多核苷酸-多核苷酸结合蛋白。
49.在以下描述中，术语“信号”用于描述将数据从一个地方或源传送到另一地方或检测器的电流或电磁场。例如，信号可以是检测基团发射的光，以传达检测基团在诸如细胞之类的样品或目标分析物之上或之内的存在。
50.在以下描述中，术语“复用”用于描述用多种染剂标记样品的过程或套件。检测基团中的每一个发射不同的波长。例如，可以使用至少两种染剂来标记样品。复用可以包括多达2种、4种、6种、8种、10种、12种、16种、20种、24种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种或更多种染剂。
51.讨论了用于在目标分析物上标记生物标志物的示例方法。在一个实施例中，获得怀疑包括至少一种目标分析物的样品。样品收集和/或处理的合适设备、系统和/或方法可以包括在以下美国专利和公开申请中的一个或多个中描述的那些，这些专利和申请中的每
一个在此通过引用整体并入：7,074,577；7,220,593；7,329,534；7,358,095；7,629,176；7,915,029；7,919,049；8,012,742；9,039,999；9,217,697；9,492,819；9,513,291；9,533,303；9,539,570；9,541,481；9,625,360；10,345,237；2014/0161688；2017/0014819；2017/0059552；2017/0074759；62/873,390。用于目标分析物回收、分离或挑选的合适设备、系统和/或方法可以包括在以下美国专利和公开申请中的一个或多个中描述的那些，这些专利和申请中的每一个在此通过引用整体并入：9,222,953；9,440,234；9,519,002；9,810,605；2017/0219463；2017/0276575。
52.在一个实施例中，可以在收集和或处理样品之后，使样品经历染。在一个实施例中，样品可以被复用。至少一种染剂被添加到样品以诸如由自动染机标记或由操作员手动地标记。在一个实施例中，至少一种目标分析物被染。在一个实施例中，至少一种非目标分析物或非目标材料被染。在一个实施例中，至少一种目标分析物和至少一种非目标分析物或材料被染。
53.在染之后，可以对样品进行成像，由此用来自光源(诸如激光器或发光二极管)的一种或更多种波长的激发光(诸如红外光、红光、蓝光、绿光和/或紫外光)照射被染的样品。可以使用流式细胞仪或显微镜(诸如荧光显微镜、扫描仪或任何其他适当的成像系统或方式)来完成成像。在一个实施例中，成像可以在以下的系统中执行：其检测基团在被成像时可以提供跨光谱的信号，包括但不限于明场和/或暗场照明、荧光等。当使用多个检测基团时，形成的图像可以是重叠的。发射、反射、衍射、散射及其组合用于检测/成像。可以分析图像，以诸如当期望检索或挑选目标分析物时检测、列举和/或定位目标分析物。成像在管中、在显微镜载玻片上或在任何合适的容器或底物中执行，以进行成像。
54.所述方法可以通过成像显微镜、扫描仪、流式细胞仪或微流体设备(诸如芯片或微通道)中的至少一种来执行，或者所述方法可以通过以上的任何组合来执行。所描述的方法可以在以下的系统中使用：其检测基团在被成像时可以提供跨光谱的信号，包括但不限于明场和/或暗场照明、荧光等。
55.用于成像系统的成像链
56.在荧光显微镜中，荧光团(或荧光染料)用于将诸如蛋白或所关注的其他分子、组织和细胞之类的样品染，以进行检查或研究。荧光团可以吸收一种波长的光，并发射另一种波长的光(荧光)。在典型的荧光显微镜装置中，使用了三个滤光器：激发滤光器、发射滤光器和二滤光器。每个荧光团具有特定的吸收或激发波长带，并且选择激发滤光器来透射激发波长范围。荧光团一旦被激发，就发射一定范围的波长。发射滤光器透射所期望的发射波长。专门被设计用于反射激发波长并透射发射波长的二滤光器用于分离激发通道与发射通道。二滤光器也可以被设计用于反射发射波长并透射激发波长。
57.图1示出了荧光显微镜成像系统的成像链的一个实施例。光路可以包括激发源102，激发源102发射至少一个激发光104，诸如可见光谱、红外(“ir”)光谱或紫外(“uv”)光谱中的光。激发源102可以包括激光光源、led光源、氙光源、卤素光源、白炽光源或其他适当的光源。在一些实施例中，激发光104包括多个波长，包括至少第一激发波长106和第二激发波长108。在这样的实施例中，激发光104可以与激发光谱选择器110相互作用，使得第一激发波长106经过激发光谱选择器110并且第二激发波长108被阻止经过激发光谱选择器110。在特定实施例中，激发光谱选择器110可以包括一个或多个光学滤光器或干涉滤光器，诸如
一个或多个可变激发滤光器。在一个这样的实施例中，在第一激发波长106离开激发光谱选择器110的激发滤光器之后，它接着被反射离开第二滤光器112。第二滤光器112将第一激发波长106重新引导到物镜114中。第二滤光器112可以是二、多、短通、长通、带通、带阻或任何适当的滤光器。
58.继续参考图1，物镜114接收由第二滤光器112反射的第一激发波长106，并将第一激发波长106聚焦在样品或其部分134之上、之内或附近的点或表面处。第一激发波长106刺激样品或其部分134之上或之内的第一检测基团(未示出)，由此使第一检测基团(未示出)能够发射第一发射波长信号116。第一发射波长信号116可以由物镜114捕获，通过被配置为通过第一发射波长的第二滤光器112透射，然后通过发射光谱选择器130透射，到发射检测器140上，在发射检测器140处捕获或获取原始图像。发射检测器140可以是电荷耦合器件(“ccd”)、cmos相机、科学cmos相机、光电二极管、光电倍增管等，用于捕获图像数据，图像数据接着可以由计算机或相关软件或程序编译成图像、进行处理和分析。在某些实施例中，第二滤光器112是二滤光器，其被配置为反射通常激发荧光团的较短波长并透射由荧光团发射的较长波长。第二滤光器112和发射光谱选择器130一起被配置为限制或防止非发射能量和杂散光到达发射检测器140的传感器。
59.在其他实施例中，激发源102发射激发光104，然后与激发光谱选择器110相互作用，使得第二激发波长108经过激发光谱选择器110并且第一激发波长106被阻止经过激发光谱选择器110。然后，第二激发波长108被反射离开第二滤光器112，由此将第二激发波长108重新引导到物镜114中。物镜114接收第二激发波长108，并将第二激发波长108聚焦在样品或其部分134之上、之内或附近的点或表面处。第二激发波长108刺激样品或其部分134之上或之内的第二检测基团(未示出)，由此使第二检测基团(未示出)能够发射第二发射波长信号118。第二发射波长信号118可以由物镜114捕获，通过第二滤光器112透射，经过发射光谱选择器130，到发射检测器140上，在发射检测器140处可以捕获原始图像。对于所期望数量的检测基团，所描述的过程可以被执行一次或更多次。
60.在替代实施例中，激发源102可以被配置为将激发光104作为一个或多个单独的波长(诸如第一激发波长106和第二激发波长108)发射。在其他实施例中，图1中示出的荧光显微镜的光路可选地不包括激发光谱选择器110。
61.继续参考图1，样品或其部分134可以位于基座132上或在盖136和基座132之间。盖136和基座132可以是光学清晰的或光学透明的以许可成像。在一些实施例中，基座132和盖136可由以下中的一种或更多种构成:玻璃；惰性金属；金属；准金属；有机或无机材料以及诸如聚合物之类的塑料材料；以及它们的组合。
62.样品134、盖136和基座132可以位于平台128上，以根据需要在x、y或z方向上移动样品134。平台128可以包括孔径138，孔径138使已经被物镜114聚焦的第一激发波长106能够到样品或其部分134之内、之上或附近。平台128可以由驱动器120驱动，驱动器120包括z方向驱动器124、x方向驱动器122和y方向驱动器126中的至少一个以定位样品134。驱动器120可以是诸如伺服电机或步进电机之类的电机、压电致动器、螺线管等。
63.光路还可以包括诸如在共聚焦显微镜中的截止孔(未示出)，以增加边界光信号的信噪比。
64.在一个实施例中，激发光谱选择器110或发射光谱选择器130可以是被配置为阻挡
或通过所期望波长的光的至少一个固定滤光器或至少一个可变或可倾斜滤光器。在一个实施例中，激发光谱选择器110或发射光谱选择器130可以是陷波滤光器、带阻滤光器、长通滤光器、短通滤光器、带通滤光器或多滤光器。在一个实施例中，激发光谱选择器110或发射光谱选择器130可以是衍射光栅。在另一实施例中，激发光谱选择器110或发射光谱选择器130可以包括可变角度或可变倾斜滤光器，其能够通过改变进入的激发或发射光线在滤光器上的相对入射角而重新成角度以阻挡或通过选定的波长。作为示例，第一激发波长106通过激发光谱选择器110，并且第二激发波长108至少部分地由于激发光谱选择器110的角度而被阻止通过激发光谱选择器110。可替换地，激发光谱选择器110可以选择性成角度以阻挡第一激发波长106并让第二激发波长108通过。如本文使用的，入射角是在入射点处入射到表面上的光线与垂直于表面的线之间的角度(θ)。
65.在另一实施例中，第一发射波长116通过发射光谱选择器130，并且第二发射波长信号118至少部分地由于发射光谱选择器130的角度而被阻止通过发射光谱选择器130。可替换地，发射光谱选择器130可以选择性成角度以阻挡第一发射波长信号116并让第二发射波长信号118通过。
66.继续参考图1，发射光谱选择器130可以包括至少一个或多个干涉滤光器，或者更具体地，包括发射滤光器，诸如第一发射滤光器142和第二发射滤光器144。第一发射滤光器142和第二发射滤光器144可以被配置为使得每一个都是能够在彼此平行或可替换地彼此垂直的轴上倾斜或成角度的可变滤光器。第一发射滤光器142可以倾斜或成角度以实现第一发射滤光器142与发射光线之间的所期望入射角(由较长的虚线滤光器142表示)。类似地，第二发射滤光器144可以倾斜或成角度以实现第二发射滤光器144与发射光线之间的所期望入射角(由较长的虚线滤光器144表示)。
67.第一发射滤光器142和第二发射滤光器144可以彼此独立地倾斜或成角度。在某些实施例中，第一发射滤光器142可以可变地定位到任何所期望位置(即，第一位置、第二位置、第三位置、第四位置等，直至第n位置)，其中每个位置对应于不同的角度θ。同样地，第二发射滤光器144可以可变地定位到任何所期望位置(即，第一位置、第二位置、第三位置、第四位置等，直至第n位置)，其中每个位置对应于不同的角度θ。第一发射滤光器142和第二发射滤光器144可以具有彼此独立的位置或角度，使得第一发射滤光器142和第二发射滤光器144中的一者或二者可以相对于一个或多个发射光线成角度或倾斜至相同的入射角或不同的入射角。在特定的实施例中，第一发射滤光器142和第二发射滤光器144可以成角度以通过或阻挡所期望波长的发射光。
68.例如，可以利用处于第一入射角的第一发射滤光器142并利用处于第三入射角的第二发射滤光器144获得第一原始图像。然后，第一发射滤光器142可以从第一入射角重新成角度为第二入射角，而第二发射滤光器144保持在第三入射角。然后，可以获得第二原始图像。另外，在捕获至少一个或多个原始图像时，第二发射滤光器144可以从第三入射角重新成角度为第四入射角。然后，可以获得第三原始图像。在一个实施例中，第一入射角、第二入射角、第三入射角和第四入射角中的至少两个是相同的。在一个实施例中，第一入射角、第二入射角、第三入射角和第四入射角都不相同。
69.在包括将至少一个滤光器倾斜或成角度的实施例中的任一个中，任何滤光器可以在任何所期望的时间或以任何所期望的顺序倾斜或成角度，以阻挡所期望的发射波长范围
或者让其通过。例如，利用处于第一入射角的第一发射滤光器142获得第一原始图像之后，第一发射滤光器142可以倾斜或成角度为第二入射角。然后，可以获得第二原始图像。然后，第一发射滤光器142可以被再次倾斜或成角度，然后可以获得第三原始图像。换句话说，每个滤光器可以独立于其他一个滤光器或多个滤光器在任何点处以任何量倾斜或成角度，以获得任何原始图像和/或发射波长范围的任何所期望范围。
70.此外，可以使用任何数量的滤光器，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、75个、80个、90个或100个。
71.激发光谱选择器110的一些特定示例和实施例可以包括一个或多个可变干涉滤光器，该一个或多个可变干涉滤光器被配置为使得可以通过倾斜滤光器并改变光路径在滤光器上的入射角来调谐波长阻挡和透射。在一些实施例中，激发光谱选择器110和/或发射光谱选择器130中的至少一个可以包括能够倾斜或成角度的至少一个可变干涉滤光器。在某些这样的实施例中，激发光谱选择器110和发射光谱选择器130二者可以包括至少一个可变干涉滤光器。在这样的实施例中，可变干涉滤光器可以是激发滤光器、发射滤光器、多滤光器，并被配置为与多通道荧光显微镜和高通量成像系统一起使用。
72.激发光谱选择器110或发射光谱选择器130的各个滤光器和/或滤光器与激发光线或发射光线之间的入射角可以被选定为提供用于在一个或多个检测基团的发射光谱的选定频带处捕获原始图像的所期望波长。例如，激发光谱选择器110和/或发射光谱选择器130中所包括的干涉滤光器被配置为沿着光路阻挡和/或发射所期望的波长，以在一个或多个发射光谱的光谱边缘的较低和较高边缘上的位置处捕获原始图像。例如，在一个实施例中，检测基团可以在其小于或等于50nm的峰值处具有光谱差异。在一个实施例中，在光谱中，检测基团可以在其小于或等于10nm的峰值处具有差异。在一个实施例中，在光谱中，检测基团在其1-50nm的峰值处具有差异。在一个实施例中，在光谱中，检测基团可以在峰值处分开几纳米，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90或100nm。在一个实施例中，连续光谱(诸如，在峰值处)之间的差值可以是相同的(例如，第一检测基团和第二检测基团分开10nm，并且第二检测基团和第三检测基团分开10nm)。在一个实施例中，连续光谱(诸如，在峰值处)之间的差值可以是不同的(例如，第一检测基团和第二检测基团分开10nm，并且第二检测基团和第三检测基团分开25nm)。
73.在一个实施例中，光在任何滤光器上的入射角θ可以是任何角度，包括但不限于大致0.0
°
、1.0
°
、2.0
°
、3.0
°
、4.0
°
、5.0
°
、6.0
°
、7.0
°
、8.0
°
、9.0
°
、10.0
°
、11.0
°
、12.0
°
、15.0
°
、20.0
°
、25.0
°
、30.0
°
、40.0
°
、45.0
°
、50.0
°
、60.0
°
、70.0
°
、75.0
°
、80.0
°
、85.0
°
或89.9
°
。在一个实施例中，光在任何滤光器上的近似入射角可以高达90
°
但不含90
°
。在一个实施例中，光在任何滤光器上的近似入射角可以小于90
°
。在一个实施例中，光在任何滤光器上的近似入射角可以是从0.0
°
至89.9
°
。在某些实施例中，当存在两个或更多个可倾斜的滤光器时，每个滤光器可以自由地独立于其他滤光器倾斜，使得两个或更多个滤光器可以具有相同的入射角，或者没有两个滤光器具有相同的入射角。在特定实施例中，基于要在滤光器的作用下通过或被阻挡的所期望波长来选择入射角。
74.滤光器变换器
75.本文公开的成像系统的成像链可以包括被配置为在多个光学滤光器之间快速且
容易地改变的滤光器变换器。在某些实施例中，滤光器变换器可以是被配置为夹持一个或多个光学滤光器的滤光器滑块或滤光器轮。本文公开的滤光器变换器可以被配置用于多通道荧光显微镜和自动化高通量成像系统的系统和方法中。在一些实施例中，激发光谱选择器110和/或发射光谱选择器130中的至少一个可以被配置为包括能够倾斜或成角度的具有诸如一个或多个可变干涉滤光器之类的一个或多个可变光学滤光器的至少一个滤光器变换器。例如，参考图1，第一或第二发射滤光器142、144中的一者或二者可以是由具有一个或多个可变干涉滤光器的滤光器变换器夹持的可变干涉滤光器。
76.参照图2a，滤光器变换器的一个实施例可以是旋转滤光器轮，滤光器轮200包括可以设置在成像链的光路中的一个或多个光学滤光器，诸如可变干涉滤光器242。滤光器轮200可以被配置为在轮毂250处的轴线或轴上或者围绕该轴线或轴在顺时针或逆时针方向上旋转。滤光器轮200可以被设计为具有位于滤光器轮200的所期望位置处的位置指示器或棘爪。例如，滤光器轮200可以被手动地旋转或由具有附接到轮毂250的轴的电机来旋转，以便将可变干涉滤光器242设置在任何所期望的滤光器位置，诸如滤光器位置252。在优选的实施例中，滤光器位置252位于行进通过成像链的光束的光路中，由此将可变干涉滤光器242定位在光束的光路中。例如，滤光器轮200由具有附接到轮毂250的轴的电机旋转，以将可变干涉滤光器242设置在第一发射波长信号116和第二发射波长信号118中的一者或二者的光路中(也参见图1和图4b)。
77.在一些实施例中，滤光器变换器(诸如滤光器滑块或滤光器轮200)可以包括被配置为夹持光学滤光器的至少一个滤光器组件。如图2a中所示，滤光器轮200可以包括被配置为夹持光学滤光器(诸如可变干涉滤光器242)的至少一个滤光器组件260。在某些实施例中，滤光器轮200可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个和更多个的滤光器组件260。在一个实施例中，滤光器轮200包括滤光器组件260中的两个或更多个，并且每个滤光器组件260包括光学滤光器，其中，没有两个光学滤光器具有全部相同的光学滤光器性质。在另一实施例中，滤光器组件260中的两个或更多个中的每一个包括光学滤光器，其中，至少两个滤光器具有相同的滤光器性质。在其他实施例中，滤光器变换器可以包括至少一个没有滤光器的滤光器组件260(诸如包括光学窗、透明玻璃的滤光器组件260)，或者滤光器组件260可以不夹持任何东西。
78.参照图2b，滤光器组件260的一些实施例被配置为将干涉滤光器(诸如可变干涉过滤器242)夹持在具有基座264和夹持器266的壳体内。在一个实施例中，基座264和夹持器266可以包括一个或多个压紧夹276，并设置被配置为许可光通过可变干涉滤光器242的窗274。在特定实施例中，基座264还可以包括被配置为使滤光器组件260在附接到滤光器轮200时倾斜、旋转和/或平移的至少一个轴承278。在一个实施例中，至少一个轴承278可以被配置为使包括可变干涉滤光器242、基座264和夹持器266的滤光器组件260在附接到滤光器轮200时能够倾斜和/或平移，以改变可变干涉滤光器242与成像链的光路中的激发或发射光线之间的入射角。
79.现在参照图3，在用于包括滤光器轮200的成像系统的成像链的某些实施例中，倾斜机构可以被配置为与滤光器组件接合并倾斜滤光器组件。例如，倾斜机构(诸如凸轮300)可以被配置为在滤光器组件260位于光路中时与滤光器组件260接合。在特定实施例中，倾
斜机构(诸如凸轮300)被配置为与滤光器组件260的轴承272接合并被配置为倾斜滤光器组件260和可变干涉滤光器242，由此改变可变干涉滤光器242与光路中的发射光线或激发光线之间的入射角。
80.凸轮300可以包括主体302和从主体302延伸的尾部304，尾部包括用于接合滤光器组件260的轴承272的接合表面308。凸轮300的尾部304可以是任何适当的形状或构造，例如，矩形、立方形、三角形、棱锥形、弯曲的、钩形、喇叭形或其组合等。此外，可以确定尾部304的大小和形状以使得在凸轮旋转时避免碰到任何其他部件。在凸轮300的一个实施例中，主体302包括至少部分地延伸通过主体302以与电机320或连接器配合以毗邻电机320和凸轮300的孔310。在一个实施例中，主体302包括用于与电机320配合的轴或其他连接器。在另一实施例中，凸轮300和电机320可以是集成单元或单件。
81.在滤光器轮200的一个实施例中，滤光器组件260和在滤光器位置252处的可变干涉滤光器242可以因轴承272与凸轮300的接合而倾斜，使得光在滤光器上的入射角可以是从大致0.0
°
至89.9
°
范围内的任何入射角。例如，光在所期望滤光器上的入射角可以大致是但不限于0.0
°
、1.0
°
、2.0
°
、3.0
°
、4.0
°
、5.0
°
、6.0
°
、7.0
°
、8.0
°
、9.0
°
、10.0
°
、11.0
°
、12.0
°
、15.0
°
、20.0
°
、25.0
°
、30.0
°
、40.0
°
、45.0
°
、50.0
°
、60.0
°
、70.0
°
、75.0
°
、80.0
°
、85.0
°
或89.9
°
。在某些实施例中，当存在位于光路中的两个或更多个可变干涉滤光器时，每个滤光器可以被配置为自由地独立于其他滤光器倾斜，使得两个或更多个滤光器可以具有相同的入射角，或者没有两个滤光器具有相同的入射角。可以基于要在滤光器的作用下被阻挡或通过的所期望波长来选择入射角。
82.光学像差的校正
83.在光线行进通过本文描述的荧光显微镜的成像链时，它们遇到诸如由玻璃和其他基板制成的光学窗口和光学滤光器之类的光学元件。入射到滤光器的玻璃表面上的光线将在它们被折射并从空气进入玻璃以及从玻璃回到空气中时变形。光被光学元件折射和变形引入可能导致光学系统性能和图像质量下降的光学像差。光学像差可以包括像散、横向图像偏移、焦点偏移、球面像差、差、彗形像差(慧差)、渐晕和整个视场的可变光谱选择。光学像差可造成图像配准误差、聚焦误差以及图像分辨率和准确性的损失。当使用依赖于从各种检测基团、不同荧光团和滤光器组捕获的多个图像的对准的多通道荧光显微镜系统时，引入光学像差特别成问题。本文描述了用于最小化、限制、消除和/或校正光学像差的荧光显微镜成像系统的成像链的实施例。
84.参考图4a和图4b，用于荧光显微镜系统的成像链的实施例可以包括可倾斜或可变光学滤光器，诸如由滤光器变换器400夹持并设置在光路中的可变干涉滤光器242。在一些实施例中，可变光学滤光器可以用于选择发射带光谱或发射波长，因为与诸如基于液晶的可变滤光器之类的替代方法相比，它通常提供显著更好的透射效率。激发光线或发射光线在其经过可变干涉滤光器242时被折射和变形，从而常常造成横向图像偏移和像散。当可变干涉滤光器242的入射角改变时，任何所得的横向图像偏移和像散也改变。如本文公开的，光学元件可以被放置在光路中，以减轻、最小化或校正由可变干涉滤光器242引起的变化的光学像差。例如，在某些实施例中，动态校正光学器件410可以被配置为与可变干涉滤光器242一起工作，以针对可变干涉滤光器242的任何所期望的入射角产生可预测的且大致恒定的横向图像偏移和像散。在其他实施例中，固定校正光学器件420可以设置在光路中并被配
置为基本上减轻或最小化由可变干涉滤光器242和动态校正光学器件410引起的任何像散。在其他实施例中，固定校正光学器件420、动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242可以设置在光路中并被配置为同时最小化像散、横向图像偏移和焦点偏移。
85.参照图4b，成像链的实施例可以包括能够在x轴412上倾斜的动态校正光学器件410，x轴412基本上垂直于固定校正光学器件420已在其上倾斜的y轴422。动态校正光学器件410可以是平坦的光学透明板，诸如由所期望的基板形成的光学窗。动态校正光学器件410可以定位在成像链的在可变干涉滤光器242之前或之后的光路中。
86.在一个实施例中，动态校正光学器件410由具有轮毂416的动态光学组件414支撑。在某些实施例中，轮毂416基本上沿着x轴412定位。动态校正光学器件410可以被手动地或由马达和/或轴与轮毂416的接合而可选择地绕x轴412倾斜。在特定实施例中，动态校正光学器件410的表面上的光路中的光的入射角可以是大致0.0
°
至89.9
°
范围内的任何入射角。例如，光在动态校正光学器件410上的入射角可以大致是但不限于0.0
°
、1.0
°
、2.0
°
、3.0
°
、4.0
°
、5.0
°
、6.0
°
、7.0
°
、8.0
°
、9.0
°
、10.0
°
、11.0
°
、12.0
°
、15.0
°
、20.0
°
、25.0
°
、30.0
°
、40.0
°
、45.0
°
、50.0
°
、60.0
°
、70.0
°
、75.0
°
、80.0
°
、85.0
°
或89.9
°
。
87.参照图4a和图4b，动态校正光学器件420可以是平坦的光学透明板，诸如由所期望的基板形成的光学窗。固定校正光学器件420以绕y轴422倾斜的固定角度放置在成像链的光路中，该角度选自范围大致是但不限于相对于成像链的光路的0
°
至90
°
、10
°
至80
°
、20
°
至70
°
、30
°
至60
°
和40
°
至50
°
的任何角度。在特定实施例中，固定校正光学器件420的固定角度是可以基本上补偿可由成像链中的一个或多个光学元件引入的光学像差中的一个或多个的任何角度。
88.如本文描述的，固定校正光学器件420在y轴422上倾斜，并且动态校正光学器件410在x轴412上倾斜。参考图4b，可变干涉滤光器242在大致平行于x轴412并大致垂直于y轴422的x轴上倾斜。如此，可变干涉滤光器242和动态校正光学器件410被配置为在大致平行的x轴上倾斜，其中x轴与固定校正光学器件420绕其倾斜的y轴422大致垂直。
89.动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242可以彼此独立地倾斜。在某些实施例中，可变干涉滤光器242可以可变地倾斜到让所期望波长的发射光通过或阻挡该发射光的任何所期望位置(即，第一位置、第二位置、第三位置、第四位置等，直至第n位置)，其中每个位置对应于不同的角度。同样地，动态校正光学器件410可以可变地倾斜到任何所期望位置(即，第一位置、第二位置、第三位置、第四位置等，直至第n位置)，其中每个位置对应于不同的角度。动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242可以具有彼此独立的位置或角度，使得其中的一者或二者可以相对于一个或多个发射光线倾斜至相同的入射角或不同的入射角。
90.例如，在多个原始图像的捕获期间，可以利用处于第一入射角的可变干涉滤光器242并利用处于对应的第三入射角的动态校正光学器件410获得第一原始图像。对于第二原始图像，可变干涉滤光器242可以从第一入射角重新成角度为第二入射角，而动态校正光学器件410倾斜为对应的第四入射角。以这种方式，动态校正光学器件410可以被配置为与可变干涉滤光器242一起工作，以针对可变干涉滤光器242的任何所期望的入射角产生可预测的且大致恒定的横向图像偏移和像散。
91.可变干涉滤光器242、动态校正光学器件410和固定校正光学器件420不需要以特
定顺序定位在成像链中。在一些实施例中，成像链的光路依次经过固定校正光学器件420、动态校正光学器件410和滤光器轮200。
92.a.像散
93.在荧光显微镜的操作期间，如本文描述的成像链被配置为基本上减轻、最小化、去除和/或消除由所包括的光学元件中的一个或多个产生的光学像差。继续参考图4a和4b，在一个实施例中，固定校正光学器件420被配置为基本上减轻和/或近似消除由动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242二者引入的像散。在另一实施例中，由固定校正光学器件420、动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242的组合引起或引入的残余像散近似为零(0)。
94.在这样的实施例中，由动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242引起的组合像散被配置为近似恒定值，即使可变干涉滤光器242绕x轴选择性倾斜。如此，对于可变干涉滤光器242的选定角度，动态校正光学器件410也倾斜，使得它们的组合像散大致抵消了由固定校正光学器件420引起的像散。
95.b.横向图像偏移
96.在另一实施例中，由动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242二者引入的横向图像偏移的总和对于可变干涉滤光器242的任何所期望的入射角保持大致恒定。例如，由动态校正光学器件410(lshft
410
)和可变干涉滤光器242(lshft
242
)引起的组合横向偏移大致恒定(lshft
constant
)。在另一种形式中：
97.lshft
constant
＝lshft
410
+lshft
242
。
98.因此，对于可变干涉滤光器242的选定的入射角，由动态校正光学器件410(lshft
410
)和可变干涉滤光器242(lshft
242
)引起的组合横向图像偏移是近似恒定的值，即使可变干涉滤光器242绕x轴选择性倾斜。
99.c.焦点偏移
100.在其他实施例中，本文描述的成像链被配置为使通过动态校正光学器件410和可变干涉滤光器242的折射引入的焦距引起的总焦点偏移基本上稳定。当焦点偏移稳定时，可以通过沿着光轴调整传感器或相机和/或物镜来偏移系统焦点，以实现所期望的像焦点。
101.远心管透镜
102.无穷远校正的物镜是聚焦在无穷远处的显微镜物镜。为了创建具有无穷远校正物镜的图像，可以使用管透镜将图像聚焦在像平面处。使用具有管透镜的无穷远校正物镜的一个优点是，在物镜和管透镜之间可以存在允许将额外光学部件(诸如光学滤光器)插入到系统中的空间。在本文描述的一些实施例中，被配置为与无穷远校正物镜一起使用的远心管透镜可以设置在荧光显微镜的光路中，以最小化、减轻、限制、消除或校正光学像差，诸如渐晕、差、球面像差和整个视场的可变光谱选择。使用远心管透镜还可以使对光学像差进行数字补偿的任何需求最小化，从而通过减少cpu负载来使图像处理能够更快地运行，由此造成更高的系统吞吐量。
103.参考图5，用于荧光显微镜系统的成像链的实施例可以包括双远心管透镜500。远心管透镜是入射光瞳或出射光瞳在无穷远处的复合透镜。远心管透镜产生与光路的光轴平行的主光线。平行主光线是所期望的，因为当它们经过倾斜或可变的光学滤光器(诸如可变干涉滤光器242(图4b))时，它们产生整个视场一致的选定的光谱。换句话说，由远心管透镜
产生的平行主光线在可变光学滤光器上具有相同的入射角，因此通常对可变光学滤光器具有相同的光谱响应。
104.在某些实施例中，双远心管透镜500被配置为位于倾斜或可变的干涉滤光器(诸如可变干涉滤光器242)上游的位置510处。位置510可以位于双远心管透镜500在图像空间和物体空间二者中都是远心的光路中。在这样的实施例中，双远心管透镜500产生基本上平行通过图像空间(透镜和检测器之间的空间)的主光线。在类似的这样的实施例中，双远心管透镜500被配置为产生基本上平行并且在发射检测器140处具有大致零(0)入射角的主光线。由于主光线是平行的，所以整个视场内的可变光谱选择、球面像差、差、彗形像差(慧差)和渐晕可以被最小化或受限制，由此提高图像分辨率和质量。
105.低入射滤光器
106.通常，二滤光器和多滤光器被配置为具有被设计为在标准的45
°
入射角处操作的所期望的通带和阻带。然而，较低的入射角使得能够有更好的滤光性能，包括改进的阻挡、透射、更陡峭的带通边缘和光束准直。本文公开了用于荧光显微镜的成像链的实施例，该成像链包括具有比标准45
°
入射角小或窄的激发光入射角的多激发滤光器。
107.参考图6，光路可以包括激发源102，激发源102发射指向激发光谱选择器110的激发光104，激发光谱选择器110包括被配置为透射所期望的激发波长(诸如第一激发波长106和/或第二激发波长108)的至少一个激发滤光器。在第一激发波长106和/或第二激发波长108被激发光谱选择器110的激发滤光器透射之后，其接着被朝向低入射滤光器600引导，低入射滤光器600被定位为与光学光路形成低入射角。在某些实施例中，低入射滤光器600的入射角可以是从大致10.0
°
至30.0
°
的范围的任何入射角。例如，光在低入射滤光器600上的入射角可以大致是但不限于10.0
°
、11.0
°
、12.0
°
、13.0
°
、14.0
°
、15.0
°
、16.0
°
、17.0
°
、18.0
°
、19.0
°
、20.0
°
、21.0
°
、22.0
°
、23.0
°
、24.0
°
、25.0
°
、26.0
°
、27.0
°
、28.0
°
、29.0
°
或30.0
°
。
108.在所选择的入射角θ处，低入射滤光器600被配置为将第一激发波长106和/或第二激发波长108反射到物镜114中，并使得能够透射第一发射波长信号116和/或第二发射波长信号118。窄入射滤光器600可以是二、多、短通、长通、带通、带阻、多通、或任何所期望的滤光器。
109.光谱边缘检测
110.当多个检测基团或荧光团用于多通道时，多荧光显微镜、光谱重叠或串扰可以限制区分各个检测基团信号的能力。如本文公开的，光谱边缘检测是一种这样的过程，通过该过程，可以诸如通过正交地区分检测基团来将各个检测基团与多个检测基团进行区分(即，在复用期间)——因为关于哪个检测基团正在被检测和/或成像不存在歧义。可以通过最小化、限制和/或消除用于多通道、多荧光显微镜的成像链中的光学像差来实现对光谱边缘检测性能的改进。
111.对于本文描述的荧光显微镜的一些实施例，由发射检测器在发射光谱的选定波长处获取原始图像。每个原始图像可以包括总选定发射光谱信号。每个总信号可以包括来自一个或多个检测基团的一个或多个信号。每个总信号还可以包括由于背景或自发荧光引起的信号。对于光谱边缘检测，可以在存在诸如来自背景、自发荧光或非期望的检测基团的无特征信号(即，信号具有未知值和/或结构)的情况下区分所关注信号的特征(诸如来自所关
注检测基团的信号)。换句话说，当检测基团的强度(因此相应的贡献)未知时，光谱边缘检测通过在由来自具有至少部分重叠的光谱的多个检测基团的贡献构成的多个信号(或图像)上消除来自非期望检测基团的贡献来确定所关注的检测基团在该多个信号(或图像)上的贡献。
112.光谱边缘检测还可以考虑信号的微小变化，例如，当针对参考检测基团检测检测基团时，或者当掺入具有基于一个或多个因素(无论是有意的(例如，检测包括例如氧浓度、金属离子浓度、环境变化、被内吞、被外吞等的样品变量的检测基团)或者无意的(例如，样品或试剂的可变ph值造成检测基团具有发射偏移))的发射偏移的检测基团时。
113.光谱边缘检测使用发射或激发光谱曲线(诸如用于检测基团的发射或激发光谱曲线)的边缘(例如，后缘或前缘)来识别多个光谱重叠的检测基团内的单个检测基团。例如，可以沿着检测基团发射光谱曲线的同一光谱前缘或后缘获得两个原始图像；可以沿着检测基团发射光谱曲线的不同光谱前缘和后缘获得两个原始图像；或者，可以沿着检测基团发射光谱曲线的光谱前缘或后缘获得一个原始图像，并且可以在检测基团发射光谱曲线的峰值发射处获得一个原始图像。
114.光谱边缘检测还可以针对单个检测基团或针对多个检测基团使用本文讨论的示例和方法的组合。例如，当使用多个检测基团时，第一检测基团可以用来自峰值和光谱前缘的信号来检测；第二检测基团可以用来自光谱前缘的信号来检测；第三检测基团可以用来自光谱前缘和光谱后缘的信号来检测。此外，光谱边缘检测可以利用针对第一检测基团的曲线和针对第二检测基团的直线，使得直线的至少一部分落在具有每个发射光谱(例如，在给定发射/激发波长处的信号)的数据点的曲线下方。
115.图7a示出了第一检测基团的发射光谱702。发射光谱702包括光谱前缘704和光谱后缘706。换句话说，光谱前缘704是发射光谱702的在峰值发射708的左侧或具有比峰值发射708短的波长的一部分；光谱后缘706是发射光谱702的在峰值发射708的右侧或具有比峰值发射708长的波长的一部分。尽管示出了发射光谱702，但该光谱也可以是激发光谱。
116.图7b示出了第二检测基团的发射光谱710。发射光谱710包括光谱前缘712和光谱后缘714。换句话说，光谱前缘712是发射光谱710的在峰值发射716的左侧或具有比峰值发射716短的波长的一部分；光谱后缘714是发射光谱710的在峰值发射716的右侧或具有比峰值发射716长的波长的一部分。尽管示出了发射光谱710，但该光谱也可以是激发光谱。
117.图7c示出了第三检测基团的发射光谱720。发射光谱720包括光谱前缘722和光谱后缘724。换句话说，光谱前缘722是发射光谱720的在峰值发射726的左侧或具有比峰值发射726短的波长的一部分；光谱后缘724是发射光谱720的在峰值发射726的右侧或具有比峰值发射726长的波长的一部分。尽管示出了发射光谱720，但该光谱也可以是激发光谱。
118.在一个实施例中，所述方法或所述系统中的任一种都可以用于在从图像或信号中去除背景或自发荧光时检测染剂或检测基团。例如，提供了第一检测基团的两个或更多个原始图像，使得图像中的至少一个位于第一检测基团的光谱边缘的较低端处，并且图像中的至少一个位于第一检测基团的光谱边缘的较高端处。原始图像中的至少一个包括由自发荧光或背景引起的信号。提供了第一检测基团的第一最终图像，使得第一最终图像基于来自第一检测基团的原始图像，并且第一最终图像不包括由自发荧光或背景引起的信号。这可以针对任何数量的检测基团执行，以从任何图像中去除背景或自发荧光。
119.在图8a和图8b中，第四检测基团(如发射光谱804所描绘的)用作用于在背景或自发荧光上区分出各个检测基团的方法的示例。然而，应该注意，本文讨论的方法不限于此，并也可以在第一、第二和/或第三检测基团(如发射光谱702、710、720所描绘的)或任何其他适当的检测基团上实现。
120.图8a示出了发射光谱804和背景信号802。背景信号802预计相对于所关注的信号相对不变，因此被描绘为具有已知值的常数(即，直线)。另外，发射光谱804与背景信号802之间的相对强度是未知的。
121.为了清楚起见，图8b至图9e描绘了从所指示的单个波长获得的图像i
1-i
18
。然而，图像i
1-i
18
可以在给定带宽(即，多达1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、75nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、或更多nm)上获得，使得图像(如双点划线所表示的)表示在相应带宽上的平均信号。此外，虽然获得了原始图像，但信号(例如，包括各个信号的总信号)来自原始图像中的与各个图像之中样品的相同位置对应的像素。例如，点a是被成像的样品之上或之内的给定位置。第一原始图像中的表示点a的第一像素包括第一总信号。第二原始图像中的表示点a的第二像素包括第二总信号。使用本文讨论的一种或更多种方法，分别评估和/或比较第一原始图像和第二原始图像的第一像素和第二像素的第一总信号和第二总信号，以确定(一个或多个)各个检测基团的(一个或多个)贡献。
122.图8b示出了分别包括在成像期间获得的第一信号s1和第二信号s2的原始图像i1和i2。信号s1和s2表示第四检测基团和背景802的总贡献。原始图像i1包括在光谱前缘的较低端上的第一信号s1；并且原始图像i2是在光谱前缘的较高端处拍摄的。为了识别第四检测基团(如发射光谱804所示出的)，分析原始图像i1和i2，并且通过用任何适当的数学、计算或代数过程或变换(包括但不限于减法、导数或其组合)处理、比较和/或分析信号的变化来确定第四检测基团在第一信号s1和第二信号s2之间的相对贡献。然后，可以基于该处理、比较和/或分析来提供描绘第四检测基团的最终图像。
123.可以针对多个检测基团内的每个检测基团实现光谱边缘检测，由此使样品或其部分能够与任何所期望数量的检测基团复用。在一个实施例中，至少两个检测基团可以被用于复用。在一个实施例中，可以使用任何适当数量的检测基团，包括但不限于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、16个、20个、24个、28个、30个、32个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个。
124.可以针对具有光谱偏移的检测基团实现光谱边缘检测，其中，光谱偏移是可比较的光谱边缘上或光谱峰值处的光谱差异。在一个实施例中，可以针对光谱偏移差异小于或等于50nm的检测基团实现该过程。在一个实施例中，可以针对光谱偏移差异小于或等于10nm的检测基团实现该过程。在一个实施例中，可以针对光谱偏移差异为1nm至50nm的检测基团实现该过程。在一个实施例中，可以针对光谱差异为10nm至50nm的检测基团实现该过程。在一个实施例中，可以针对光谱偏移差异大致是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90或100nm的检测基团实现该过程。在一个实施例中，连续光谱之间的差异(诸如，在峰值处)可以是相同的(例如，第一检测基团和第二检测基团分开10nm，并且第二检测基团和第三检测基团分开10nm)。在一个实施例中，连续光谱之间的差异(诸如，在峰值处)可以是不同的(例如，第一检测基团和第二检测基团分开
10nm，并且第二检测基团和第三检测基团分开25nm)。
125.在一个实施例中，每个检测基团的信号贡献(例如，通过贡献或减法系数)可以用至少两个原始图像来确定，诸如，通过抵消或消除由非关注检测基团(即，第一检测基团是非关注检测基团并且第二检测基团是所关注检测基团；和/或，第一检测基团是所关注检测基团并且第二检测基团是非关注检测基团)或背景/自发荧光提供的信号贡献。可以获得用于光谱边缘检测的等于或大于2个的任何数量的原始图像，包括但不限于3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、75个、80个、90个、100个或更多个。
126.为了清楚起见，关于图9a至图9e，第一检测基团的发射光谱702也由“a”表示；第二检测基团的发射光谱710也由“b”表示；并且，第三检测基团的发射光谱720也由“c”表示。在本说明书中，a、b或c后面的下标表示所关注的检测基团对其贡献强度的图像。例如，数据点a3表示原始图像i3内的a(或第一检测基团)的贡献，如发射光谱702上的数据点a3所示出的。因此，a3–a18
分别表示原始图像i3–i18
中的a(或第一检测基团)的贡献；b3–b18
分别表示原始图像i3–i18
中的b(或第二检测基团)的贡献；并且c3–c18
分别表示原始图像i3–i18
中的c(或第三检测基团)的贡献。
127.图9a示出了针对第一检测基团的发射光谱702和针对第二检测基团的发射光谱710。在发射光谱702和发射光谱710上所指示的波长位置，获得原始图像i3、i4和i5。在发射光谱702的光谱前缘704的较低端部处拍摄原始图像i3；在也与发射光谱710的光谱前缘712的较低端部重叠的发射光谱702的光谱前缘704的较高端部处拍摄原始图像i4；并且，在发射光谱710的光谱前缘712的较高端部处拍摄原始图像i5。尽管示出了发射光谱702、710，但该光谱也可以是激发光谱。
128.在一个实施例中，可以获得不止三个原始图像。在一个实施例中，使用原始图像中的每一个分析一个且仅一个检测基团。在一个实施例中，使用原始图像中的一个或多个来分析检测基团中的至少两个(即，存在重叠)。在一个实施例中，第一检测基团和第二检测基团之间的原始图像都不相同(即，所有图像都是不同的)。在一个实施例中，第一检测基团的原始图像中的至少一个和第二检测基团的原始图像中的至少一个是相同的图像。
129.在一个实施例中，在光谱后缘的较高端部处拍摄的原始图像可包括光谱前缘的较高端部，反之亦然(即，在光谱前缘的较高端部处拍摄的原始图像可包括光谱后缘的较高端部)。在一个实施例中，在特定光谱边缘的较高端部处拍摄的原始图像不包括相对光谱边缘的较高端部(即，在光谱后缘的较高端部处拍摄的原始图像不包括光谱前缘的较高端部；或者在光谱前缘的较高端部处的原始图像不包括光谱后缘的较高端部)。
130.为了识别第一检测基团(如发射光谱702所示出的)和第二检测基团(如发射光谱710所示出的)，分析原始图像i3、i4和i5并确定第一检测基团和第二检测基团的相对贡献。例如，相对贡献可以通过任何适当的数学、计算或代数过程或变换(包括但不限于减法、导数、积分等或其组合)来确定。然后，基于对原始图像i3和i4的分析(诸如第一检测基团在原始图像i3和i4上的相对贡献)，提供第一检测基团的最终图像。然后，基于对原始图像i4和i5的分析(诸如第二检测基团在原始图像i4和i5上的相对贡献)，提供第二检测基团的最终图像。
131.图9b示出了类似于图3a的第一发射光谱和第二发射光谱的示例第一发射光谱和
第二发射光谱，不同的是已获得原始图像i6、i7和i8。原始图像i6和i8是在这样的点处拍摄的：其中，第一检测基团的发射强度具有相同或基本上相同的值，并且对于各图像，第二检测基团的发射强度是不同的。在使得第二检测基团的至少三个数据点形成直线的点处拍摄原始图像i7。
132.图9c示出了类似于图9a的第一发射光谱和第二发射光谱的示例第一发射光谱和第二发射光谱，不同的是已获得原始图像i9和i
10
。在第一检测基团的光谱后缘的较高端部与第二检测基团的光谱前缘的较低端部重叠的点处拍摄原始图像i9。在第一检测基团的光谱后缘的较低端部与第二检测基团的光谱前缘的较高端部重叠的点处拍摄原始图像i
10
。如图9c中所示，第一检测基团的后缘与第二检测基团的前缘重叠，使得原始图像i9包括第一检测基团的光谱后缘的较高端部和第二检测基团的光谱前缘的较低端部，并且原始图像i
10
包括第一检测基团的光谱后缘的较低端部和第二检测基团的光谱前缘的较高端部。在一个实施例中，第一检测基团的前缘与第二检测基团的后缘重叠。
133.图9d示出了类似于图9c的第一发射光谱和第二发射光谱的示例第一发射光谱和第二发射光谱，不同的是已获得原始图像i
11-i
14
。原始图像i
12
和i
13
分别是在发射光谱702和发射光谱710的峰值处拍摄的。光谱的峰值发射可以用于确定检测基团在各个原始图像之间的相对贡献，其中，另一原始图像位于针对其获取发射峰值的检测基团的发射光谱的光谱边缘(前缘或后缘)。
134.在一个实施例中，获得第一发射光谱的两个或更多个原始图像，其中，图像中的至少一个位于第一发射光谱的光谱边缘的较低端部处，并且图像中的至少一个位于第一发射光谱的相同光谱边缘的较高端部处。获得第二发射光谱的两个或更多个原始图像，其中，图像中的至少一个位于第二发射光谱的光谱边缘的较低端部处，并且图像中的至少一个位于第二发射光谱的相同光谱边缘的较高端部处。提供了第一检测基团的第一最终图像(如第一发射光谱所描绘的)和第二检测基团的第二最终图像(如第二发射光谱所描绘的)，其中，第一最终图像和第二最终图像是基于来自第一检测基团和第二检测基团的原始图像。在一个实施例中，第一发射光谱和第二发射光谱的原始图像中的至少一个是相同的图像。例如，第一发射光谱(在第一发射光谱的光谱边缘的较高端部处)的第二图像是与第二发射光谱(在第二发射光谱的光谱边缘的较低端部处)的第一图像相同的图像。
135.尽管讨论了两个检测基团，但该过程可以用于任何数量的检测基团。换句话说，获得第n发射/激发光谱的两个或更多个原始图像，其中，图像中的至少一个位于第n发射/激发光谱的光谱边缘的较低端部处，并且至少一个图像位于第n发射/激发光谱的光谱边缘的较高端部处，并且其中，n大于或等于1(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、28、30、32、40、50、60、70、80、90、100或更多)。然后，针对至少一个或多个发射/激发光谱重复该过程。
136.在一个实施例中，为了确定具有重叠光谱的各个检测基团的信号贡献，要获得一个检测基团的至少三个数据点，使得这三个数据点形成曲线；并且，要获得另一检测基团的至少两个数据点，使得这两个数据点形成直线。基于相对光谱边缘确定哪个检测基团需要数据点来形成曲线或需要数据点来形成直线。换句话说，当使用不同发射光谱的相同光谱边缘(即，前缘或后缘)时，其中相同光谱边缘的至少一部分落在另一发射光谱的发射光谱之下的发射光谱只需要至少两个数据点。至少两个数据点(即，形成直线的那些数据点)可
以用于确定检测基团的贡献，无论由其他检测基团提供的曲线存在或不存在；并且，另外，至少三个数据点(即，形成曲线的那些数据点)可以用于确定其他检测基团的贡献，无论由初始检测基团提供的直线存在或不存在。
137.在一个实施例中，为了确定具有重叠光谱的各个检测基团的信号贡献，获取一个检测基团的至少三个数据点，使得这三个数据点形成曲线；并且，获取另一检测基团的至少三个数据点，使得这三个数据点形成曲线或直线。例如，返回参照图9d，b
12-b
14
的数据点可以被并入到下式中：
[0138][0139]
其中，cb是发射b的曲率(例如，二阶导数)，s
b12
是发射b在图像i
12
的波长处的信号强度，s
b13
是发射b在图像i
13
的波长处的信号强度，并且s
b14
是发射b在图像i
14
的波长处的信号强度。a
12-a
14
的数据点可以被并入到下式中：
[0140][0141]
其中，ca是发射a的曲率(例如，二阶导数)，s
a12
是发射a在图像i
12
的波长处的信号强度，s
a13
是发射a在图像i
13
的波长处的信号强度，并且s
a14
是发射a在图像i
14
的波长处的信号强度。由于与各个检测基团对应的这些发射波长处的更强的曲率(即，更正(例如，+5强于+2；作为另一示例，+4强于-1)或更负(例如，-6强于-1；作为另一示例，-5强于+2)，所以检测基团是可彼此区分的。换句话说，检测基团在不同的发射波长上具有更强的曲率。例如，在相同的发射波长上，alexa 647在660nm、670nm和680nm上的曲率比alexa 594更强。在相同的发射波长上，alexa 594在609nm、619nm和632nm上的曲率比alexa 647更强。因此，基于660nm、670nm和680nm上的曲率，可以将alexa 647与alexa 594区分开；并且，基于609nm、619nm和632nm的曲率，可以将alexa 594与alexa 647区分开。
[0142]
图9e描绘了四个图像i
15-i
18
内的三个发射光谱702、710、720(a、b、c)。发射b的前缘位于发射a的前缘下方。因此，获得了发射a的至少三个数据点(例如，a
15-a
17
；或a
15
、a
16
、a
18
)，并且获得了发射b的至少两个数据点(例如，b
15
和b
16
；或b
15
和b
17
；或b
16
和b
17
)。另外，发射c的前缘位于发射b的前缘下方。因此，获得了发射b的至少三个数据点(例如，b
15
、b
17
、b
18
；或b
16-b
18
)，并且获得了发射c的至少两个数据点(例如，c
16
和c
17
；或c
17
和c
18
；或c
16
和c
18
)。发射a-c的相应数据点可以用于确定检测基团的相应贡献。
[0143]
在一个实施例中，获得在第一发射光谱的两个不同发射波长处的两个或更多个原始图像，其中，图像中的至少一个位于第一发射光谱的光谱前缘或光谱后缘，并且图像中的至少一个位于第一发射光谱的光谱后缘或光谱前缘。换句话说，两个或更多个原始图像位于相同发射光谱的不同光谱边缘(即，光谱前缘中的至少一个原始图像和光谱后缘中的至少一个原始图像，其中，光谱前缘位于一个检测基团的发射光谱中)。
[0144]
如图9e中所示，经由其发射光谱的不同光谱边缘上的原始图像获取发射光谱a和b的信号(发射光谱a的a
15
和a
17
；以及发射光谱b的b
15
/b
16
/b
17
和b
18
)。不同光谱边缘上的信号的强度可以相等或不相等(例如，强度可以在一个光谱边缘上较大而在另一光谱边缘上较小)。
[0145]
在一个实施例中，获得第一发射光谱的两个或更多个原始图像，其中，原始图像中的至少一个位于第一发射光谱的光谱前缘或光谱后缘，原始图像中的至少一个位于第一发射光谱的光谱后缘或光谱前缘，并且原始图像中的至少一个位于峰值强度波长处。换句话说，两个或更多个原始图像位于相同发射光谱的不同光谱边缘，并且一个原始图像位于峰值强度波长处。如图9e中所示，发射光谱a提供其发射光谱的不同光谱边缘上的信号(发射光谱a的a
15
和a
17
)以及峰值强度波长处的信号(发射光谱a的a
16
)。
[0146]
尽管图9e示出了从发射光谱a在光谱前缘、峰值发射和光谱后缘中获取的原始图像，但这并不旨在仅限于一个发射光谱。可以根据期望为尽可能多的发射光谱获取相同类型的原始图像。
[0147]
在一个实施例中，信号强度(即，像素电平)的变化可以用于识别检测基团。
[0148]
在一个实施例中，诸如当获得发射光谱的代表性的点时，可以基于光谱的后缘来确定信号强度的变化率或变化。在一个实施例中，诸如当获得发射光谱的代表性的点时，可以基于光谱的前缘来确定信号强度的变化率或变化。
[0149]
在一个实施例中，诸如当获得激发光谱的代表性的点时，可以基于光谱的后缘来确定强度的变化率或变化。在一个实施例中，诸如当获得激发光谱的代表性的点时，可以基于光谱的前缘来确定强度的变化率或变化。
[0150]
在一个实施例中，可以将信号强度的变化与预期值进行比较。例如，强度变化可以是预期值+/-(加或减)高达0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施例中，可以将信号强度的变化与阈值进行比较。在一个实施例中，信号强度的变化可以是正的或负的，使得正的或负的变化识别所期望的检测基团。
[0151]
在一个实施例中，可以在诸如图像处理和分析期间应用阈值，以确定信号是由所期望的检测基团、非期望的检测基团、噪声还是背景引起的。
[0152]
在一个实施例中，当第一图像和第二图像之间的信号强度的变化(诸如，在所期望或预定的波长处)等于或大于第一阈值时，针对所得图像，“保持”像素或信号以进行分析；而当第一图像和第二图像之间的信号变化小于第一阈值时，针对所得图像，“关闭”像素或信号以进行分析。
[0153]
在一个实施例中，可以获得第一检测基团的发射光谱702的一阶发射导数；并且，可以获得第二检测基团的发射光谱710的第二发射导数。尽管讨论了一阶导数，但在期望这样做时可以计算任何更高阶导数。
[0154]
在一个实施例中，诸如当获得发射光谱的代表性的点时，变化率可以大于或等于阈值。在一个实施例中，诸如当获得发射光谱的代表性的点时，强度变化可以是正的、正至少阈值量、和/或正第一发射的某个倍数。在一个实施例中，诸如当获得激发光谱的代表性的点时，变化率可以小于或等于阈值(即，更负——例如，-5小于-3)。在一个实施例中，诸如当获得激发光谱的代表性的点时，强度变化可以是负的、负至少阈值量、和/或负第一激发的某个倍数。
[0155]
作为示例，δx(发射波长的变化)是10nm并且δy(发射强度的变化)是50％，斜率
是50％/10nm或5％/nm。当比较第一图像和第二图像时，相应像素之间的强度增加至少5倍可以归因于第一检测基团，并且像素被“保持”；而相应像素之间的强度增加小于5倍可以归因于除第一检测基团之外的其他因素(例如，背景)，并且像素被“关闭”。该示例不旨在限于值和/或百分比。第一阈值可以包括基于预期或预计的发射强度变化的范围。例如，第一阈值可以使斜率+/-(加或减)高达0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
[0156]
斜率满足下式给出的条件：
[0157][0158]
在一个实施例中，当激发第一检测基团(并由此获得第一图像)时，可以选择第一激发光的波长以不激发第二检测基团。然后，还可以选择第二激发光的波长以激发第一检测基团(由此提供第二图像)并且不激发第二检测基团。可以对第一图像和第二图像进行处理和比较，以获得基于第一检测基团的发射由于激发波长变化而导致的发射强度的变化(换句话说，斜率或y/x)。
[0159]
在一个实施例中，激发光中的至少一个可以刺激一个或多个检测基团。然而，如以下讨论的，所得斜率可以用于去除一个或多个非期望检测基团的信号。
[0160]
在一个实施例中，可以比较和处理由两个或更多个激发波长产生的两个或更多个图像以计算所期望的斜率。所得的斜率可以用于在最终图像中保持信号或关闭信号。在一个实施例中，可以比较和处理由两个或更多个激发波长产生的两个或更多个信号，以计算所期望的斜率。所得的斜率可以用于在最终图像中保持信号或关闭信号。
[0161]
在一个实施例中，可以针对每个检测基团光谱边缘计算一阶或更高阶导数。在一个实施例中，相应检测基团的光谱边缘可以用于区分不同检测基团的发射。
[0162]
在一个实施例中，原始图像的最小数量是n，其中，n是检测基团的数量。例如，可以在第一发射光谱的后缘的较高端部处和第二发射光谱的前缘的较低端部处获得第一原始图像。可以在第一发射光谱的后缘的较低端部处和第二发射光谱的前缘的较高端部处获得第二原始图像。可以处理和/或分析第一原始图像和第二原始图像，以提供第一检测基团的第一最终图像(如第一发射光谱所描绘的)和第二检测基团的第二最终图像(如第二发射光谱所描绘的)。尽管讨论了发射光谱，但该实施例可以在激发光谱上实现。
[0163]
在一个实施例中，原始图像的最小数量是n+1，其中，n是检测基团的数量。
[0164]
在一个实施例中，第一检测基团和第二检测基团的所有原始图像和最终图像诸如在屏幕(例如，电话、平板电脑、计算机、电视、pda、手持设备等中的至少一个的屏幕)上被显示给终端用户或操作者。在一个实施例中，显示第一检测基团和/或第二检测基团的原始图像中的至少一个。在一个实施例中，显示第一检测基团和/或第二检测基团的最终图像中的至少一个。在一个实施例中，不显示原始图像，但显示最终图像中的至少一个。在一个实施例中，不显示原始图像，但显示所有最终图像。
[0165]
用于获取信号(例如，相同光谱边缘、不同光谱边缘、峰值和一个光谱边缘、峰值和两个光谱边缘等)的实施例并不旨在限于针对示例获取具体讨论的发射光谱。相反，信号获
取可以应用于一个或多个发射光谱，其中，所有发射光谱具有相同的获取(例如，相同的光谱边缘、不同的光谱边缘、峰值和一个光谱边缘、峰值和两个光谱边缘等)，至少两个发射光谱具有相同的获取，或者没有发射光谱具有相同的获取。
[0166]
为了获得原始图像，可以用流式细胞仪或显微镜(诸如荧光显微镜、扫描仪等)进行成像。可以以常规落射荧光、光片显微术、超分辨率显微术和共聚焦显微术进行成像。
[0167]
任何图像或文件(无论是原始的还是经处理的)都可以在本发明的任何实施例执行期间的任何点存储在任何适当的存储介质中。存储介质包括但不限于硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、分布式计算系统的存储装置、光盘(诸如，光碟、数字多功能盘或蓝光盘)、闪存设备、存储卡等中的一种或多种。
[0168]
本发明的实施例包括非暂态计算机可读介质，该非暂态计算机可读介质可以存储用于执行上述方法及其任何步骤(包括其任何组合)的指令。例如，非暂态计算机可读介质可以存储由一个或多个处理器或类似设备执行的指令。
[0169]
本发明的实施例包括两个或更多个非暂态计算机可读介质，该非暂态计算机可读介质可以存储用于执行上述方法及其任何步骤(包括其任何组合)的指令。例如，供执行的指令可以被拆分到两个或更多个处理器或类似设备之中。
[0170]
本发明的其他实施例还可以包括计算机或诸如非暂态计算机可读介质之类的读取和执行记录或存储在存储介质(其可以与如以上讨论的用于存储图像或文件的存储介质相同或不同)上的计算机可执行指令以执行任何实施例的功能的装置(例如，电话、平板电脑、pda等)。计算机可以包括中央处理单元(cpu)、微处理单元(mpu)或其他电路中的一个或多个，并且可以包括单独的计算机或单独的计算机处理器的网络。计算机可执行指令可以例如从网络或存储介质提供到计算机。
[0171]
计算机或装置还可以被配置为诸如在显示器或屏幕上显示图像或文件中的任一个(无论是原始的还是经处理的)。
[0172]
当特征或元件在本文被称为“在”另一特征或元件“上”时，它可以直接在其他特征或元件上，或者还可以存在中间特征和/或元件。相比之下，当特征或元件被称为“直接在”另一特征或元件“上”时，不存在中间特征或元件。还将理解，当特征或元件被称为“连接”、“附接”或“耦接”到另一特征或元件时，它可以直接连接、附接或耦接到其他特征或元件，或者可以存在中间特征或元件。相比之下，当特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”到另一特征或元件时，不存在中间特征或元件。尽管相对于一个实施例进行描述或示出，但如此描述或示出的特征和元件可以应用于其他实施例。本领域中的技术人员还将理解，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其下方的部分。
[0173]
本文使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并不旨在是限制本发明。例如，如本文使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有清楚指示。还应该理解，术语“包括”和/或“包括有”当在本说明书中使用时指定存在所述特征、步骤、操作、元件和/或部件，但并不排除存在或附加一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、部件和/或其组。如本文使用的，术语“和/或”包括关联所列项中的一个或多个的任一个和全部组合，并可以被缩写为“/”。
[0174]
为了方便描述，可以在本文使用诸如“下方”、“下面”、“之下”、“上方”、“上面”、“较
高”等空间上、图形上或数字上的相对术语来描述如图中图示的一个元件或特征与其他(一个或多个)元件或(一个或多个)特征的关系。应该理解，空间上的相对术语旨在除了图中描绘的方位之外还涵盖使用或操作时的不同方位。例如，如果图中描绘的设备、系统或方法被颠倒，那么被描述为在其他元件或特征“下方”或“之下”的元件将被定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例性的术语“下方”可以涵盖上方和下方两种方位。设备可以被以其他方式定向(旋转90度或处于其他方位)，并且相应地解释本文使用的空间上的相对描述符。类似地，除非另有特别说明，否则本文使用的术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等仅用于解释的目的。另外，“较低”、“较高”等用于描绘这样的元件、特征、信息等，其相对于彼此或至少其他元件、特征、信息等在图表、图形或曲线上进一步向下或进一步向上，或在值或强度上更小或更大。
[0175]
虽然本文可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/元件(包括步骤)，但除非上下文另有指出，否则这些特征/元件不应该受这些术语的限制。这些术语可以用于将一个特征/元件与另一特征/元件区分开。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，以下讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，以下讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件。另外，尽管使用了“第一”和“第二”，但这些术语并不旨在将各种特征/元件限于仅一个或两个。确切地，在适当或期望这样做的情况下，可以包括或使用三个(即，第三)、四个(即，第四)或更多个。
[0176]
在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包括有”和“包括了”之类的变型意味着可以在方法和物品(例如，包括设备和方法的组合物和装置)中共同采用各种部件。例如，术语“包括”将被理解为暗示包含任何陈述的元件或步骤，但不排除任何其他元件或步骤。
[0177]
如本文在说明书和权利要求书中使用的，包括在示例中所使用的，并且除非另有明确说明，否则所有数字可以被读作好像由词语“约”或“大致”开头，即使该术语没有明确地出现。在描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大致”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值的值可以是所述值(或值范围)的+/-0.1％、所述值(或值范围)的+/-1％、所述值(或值范围)的+/-2％、所述值(或值范围)的+/-5％、所述值(或值范围)的+/-10％等。除非上下文另有指出，否则本文给定的任何数值也应该被理解为包括约该值或大致该值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开“约10”。本文陈述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还要理解，如本领域的技术人员适当理解的，当公开了一个值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“x”，那么也公开了“小于或等于x”以及“大于或等于x”(例如，其中，x是数值)。还要理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则要理解，大于10和15、大于或等于10和15、小于10和15、小于或等于10和15和等于10和15以及在10和15之间被视为公开。还要理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
[0178]
虽然以上描述了各种例示性实施例，但在不脱离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各种实施例进行多种变化中的任一种。例如，在替代实施例中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其他替代实施例中，一个或多个方法步骤
可以被一起跳过。在一些实施例中可以包括各种设备和系统实施例的可选特征，而在其他实施例中可以不包括。因此，前面的描述主要是为了示例性目的而提供，并不应该被解释为限制如权利要求中所阐述的本发明的范围。
[0179]
本文包括的示例和图示通过图示而非限制的方式示出了可以实践本主题的具体实施例。如所提及的，可以利用并从中推导其他实施例，使得可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑上的替换和改变。仅出于方便起见，本文可以单独地或共同地用术语“本发明”来指代本发明主题的这些实施例，而无意在事实上公开了不止一个发明或发明构思的情况下将本技术的范围自愿限制为任何单个发明或发明构思。因此，虽然本文已经图示和描述了具体实施例，但为实现相同目的而计算的任何布置都可以代替所示出的具体实施例。本公开旨在涵盖各种实施例的任何和所有的修改或变化。在阅读以上说明书后，以上实施例的组合以及本文未具体描述的其他实施例对于本领域的技术人员而言将是清楚的。
[0180]
出于解释的目的，前述说明书使用了特定的命名法来提供对本公开的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说清楚的是，为了实践本文描述的系统和方法不需要这些具体细节。出于说明和描述的目的，通过示例的方式呈现了具体实施例的前述描述。它们并非旨在是排他性的或将本公开限制为所描述的精确形式。依据以上教导，许多修改形式和变化形式是可能的。示出和描述实施例是为了最好地解释本公开的原理和实际应用，由此使本领域的其他技术人员能够最好地利用本公开和具有适合于预期的特定用途的各种修改形式的各种实施例。本公开的范围旨在由以下权利要求及其等同物定义。

技术特征：

1.一种成像系统，包括：至少一个可倾斜滤光器组件，所述至少一个可倾斜滤光器组件包括被配置为设置在所述成像系统的光路中的光学滤光器；动态校正光学器件，所述动态校正光学器件被配置为设置在所述成像系统的光路中；以及固定校正光学器件，所述固定校正光学器件被配置为设置在所述成像系统的光路中。2.根据权利要求1所述的成像系统，还包括被配置为设置在所述成像系统的光路中的远心管透镜。3.根据权利要求1所述的成像系统，其中，所述固定校正光学器件被配置为基本上减轻由所述光学滤光器和所述动态校正光学器件的组合引起的像散。4.根据权利要求1所述的成像系统，其中，由所述固定校正光学器件、所述动态校正光学器件和所述光学滤光器的组合引起的任何残余像散近似为零(0)。5.根据权利要求1所述的成像系统，其中，对于所述光学滤光器的选定的第一入射角，所述动态校正光学器件被配置为倾斜到第二入射角，并且其中，所述固定校正光学器件的入射角被配置为产生像散，以基本上减轻由处于选定的所述第一入射角的所述光学滤光器和处于所述第二入射角的所述动态校正光学器件的组合引起的像散。6.根据权利要求1所述的成像系统，其中，所述动态校正光学器件被配置为基本上稳定由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移。7.根据权利要求6所述的成像系统，其中，由所述动态校正光学器件引起的横向图像偏移与由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移的总和大致恒定。8.根据权利要求6所述的成像系统，其中，对于所述光学滤光器的选定的第一入射角，所述动态校正光学器件被配置为倾斜到第二入射角，并且其中，由所述动态校正光学器件引起的横向图像偏移和由所述光学滤光器引起的横向图像偏移的总和大致恒定。9.根据权利要求1所述的成像系统，其中，由所述至少一个可倾斜滤光器组件夹持的所述光学滤光器和所述动态校正光学器件被配置为在大致平行的x轴上倾斜，并且其中，所述固定校正光学器件在大致垂直的y轴上倾斜。10.根据权利要求2所述的成像系统，其中，所述远心管透镜位于所述成像系统的光路中的所述远心管透镜在图像和物体空间二者中都是远心的位置处。11.根据权利要求1所述的成像系统，还包括被配置为夹持所述至少一个可倾斜滤光器组件的滤光器变换器。12.根据权利要求11所述的成像系统，其中，所述滤光器变换器是滤光器轮，并且其中，所述至少一个可倾斜滤光器组件被配置为将所述光学滤光器倾斜到选自大致0
°
至89.9
°
的范围的入射角。13.根据权利要求11所述的成像系统，其中，所述滤光器变换器包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个可倾斜滤光器组件。14.根据权利要求1所述的成像系统，还包括低入射滤光器，所述低入射滤光器选自由二滤光器、多滤光器、短通滤光器、长通滤光器、带通滤光器、带阻滤光器和多通滤光器组成的组中的至少一个，其中，所述低入射滤光器被配置为具有选自大致10.0
°
至30.0
°
范
围的角度的激发光的入射角。15.根据权利要求14所述的成像系统，其中，所述低入射滤光器是多滤光器。16.根据权利要求1所述的成像系统，其中，所述成像系统是荧光显微镜成像系统。17.根据权利要求1所述的成像系统，其中，所述光学滤光器是干涉滤光器。18.根据权利要求1所述的成像系统，其中，所述至少一个可倾斜滤光器组件被配置为将所述光学滤光器倾斜到选自大致0
°
至89.9
°
的范围的入射角。19.一种减轻成像系统中的像散的方法，所述方法包括：将光学滤光器以第一入射角设置在所述成像系统的光路中；将动态校正光学器件以第二入射角设置在所述成像系统的光路中；将固定校正光学器件以第三入射角设置在所述成像系统的光路中，其中，所述固定校正光学器件的入射角被配置为产生像散，以基本上减轻处于所述第一入射角的所述光学滤光器的组合像散和处于所述第二入射角的所述动态校正光学器件的像散。20.一种稳定成像系统中的横向图像偏移的方法，所述方法包括：将光学滤光器以第一入射角设置在所述成像系统的光路中；将动态校正光学器件以第二入射角设置在所述成像系统的光路中；其中，所述动态校正光学器件被配置为基本上稳定由所述光学滤光器的倾斜引起的横向图像偏移。

技术总结

本公开总体上涉及用于成像系统的成像链。更具体地，本公开涉及被配置为限制光学像差的成像系统。此外，本公开涉及限制被配置用于对样品进行成像但更具体地用于检测多个检测基团内的各个检测基团的成像系统中的光学像差的方法。的方法。的方法。

技术研发人员：

J

受保护的技术使用者：

瑞尔赛特股份有限公司

技术研发日：

2020.12.23

技术公布日：

2022/11/24