一种肝靶向型虾青素复合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及功能食品制备及动物模型技术领域，更具体地说，涉及一种肝靶向型虾青素复合物及其制备方法和应用

背景技术：

2.虾青素(3,3
’‑
二羟基-4,4
’‑
二酮基-β,β
’‑
胡萝卜素)，它具有13个共轭双键，是类胡萝卜素的酮式含氧衍生物，分子式为c
40h52
o4，相对分子质量为596，主要存在于藻类、酵母、甲壳类动物和鲑科鱼类体内。虾青素的特殊分子结构赋予其多种生物活性，如：抗氧化性、抗炎活性、调节脂质代谢、抗糖尿病及调节免疫等多种生物功效。然而虾青素在人体内无法合成，只能通过膳食摄取。虾青素在贮藏过程中会受到如光照、温度、盐离子及金属离子等诸多环境因素的影响，使其性质不稳定，结构遭受破坏，容易发生降解；虾青素在消化液中的溶解度以及与肠道中胆碱、脂类等的结合过程影响虾青素的生物利用度，难被机体吸收进入体循环参加生理功能；由于其在胃肠道中的稳定性差，最终导致虾青素的生物利用度低，限制了虾青素在功能食品及医药行业中的应用。
3.因此，针对虾青素的载运体系设计构建是近年来重点发展的技术之一，通过利用载运包埋的技术来抵御外界环境对虾青素的不利影响，进一步实现控制虾青素的释放速率及在生物体内的定点释放功能，充分提升虾青素的生物利用度，发挥其生物学功效。

技术实现要素：

4.为以解决现有技术中虾青素稳定性差，且功能活性成分易受到损失的问题，以及虾青素功能食品预处理对过氧化氢介导的heparg细胞损伤的保护和缓解由酒精诱导的肝脏损伤方面的应用，本技术提供了一种肝靶向型虾青素复合物的制备方法。
5.本发明第一个目的是提供一种肝靶向型虾青素复合物的制备方法，包括以下步骤：
6.s1:乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将乳糖酸添加到dmso中，然后添加1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺作为偶联剂，进行活化；活化完成后将混合物溶于含有羟丙基-β-环糊精的dmso溶液中并搅拌反应；反应结束将产品透析并冷冻干燥，即得乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物；
7.s2:虾青素功能复合物的制备：将乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物复溶至水中，然后缓慢加入虾青素乙醇溶液，搅拌反应，反应完成将反应物干燥，即得虾青素功能复合物。
8.在本发明一种实施方式中，所述乳糖酸和dmso的质量体积比为1～3:100(w/v，g/ml)。
9.在本发明一种实施方式中，所述1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和dmso的质量体积比为1～5:100(w/v，g/ml)。
10.在本发明一种实施方式中，1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:10～10:1。
11.在本发明一种实施方式中，所述s1活化的时间为0～10h。
12.在本发明一种实施方式中，所述步骤s1中乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物的取用量为5-100mg，复溶至1-100ml去离子水；虾青素乙醇溶液是将0.1-1g虾青素粗品溶解于50-500ml的乙醇溶液，5000-20000rpm离心5-50分钟所得上清液，添加量为0.5-50ml。所述搅拌时间为1-10小时；最后，所得样品冻干时间为1-10天。
13.在本发明一种实施方式中，所述步骤s2中乳糖酸-海藻酸复合物的取用量为5-500mg,复溶至1-100ml去离子水，虾青素乙醇溶液添加量为0.5-50ml，5000-20000rpm离心5-50分钟所得上清液，；最后，所得样品冻干1-10天。
14.在本发明一种实施方式中，所述虾青素乙醇溶液是将粗虾青素溶解于的乙醇溶液，然后离心取上清液，即得虾青素乙醇溶液。
15.在本发明一种实施方式中，所述粗虾青素和乙醇的质量体积比为1:100～1000(w/v，g/ml)
16.在本发明一种实施方式中，所述步骤s2中虾青素乙醇溶液添加量为15ml。
17.在本发明一种实施方式中，一种ph响应肝靶向型虾青素复合物的制备方法，包括以下步骤：
18.s1、乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将150mg海藻酸钠溶解在10ml去离子水中搅拌过夜后，加入10ml dmso，添加216mg 1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(edc)和129mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，添加85mg羟丙基-β-环糊精，室温下均匀搅拌8小时后，加入59.2mg乳糖酸继续反应18小时。所得到的产物利用去离子水透析并冷冻干燥，得到乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物。
19.s2、虾青素功能食品的制备：取冻干的乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物80mg复溶至20ml去离子水，加入1ml的1mg/ml虾青素乙醇溶液，进一步搅拌反应5小时，所得样品进行冻干。
20.本发明利用上述方法制得的一种肝靶向型虾青素复合物。
21.本发明第二个目的是利用所述制得的肝靶向型虾青素复合物应用到保健食品中。
22.本发明第三个目的是利用所述制得的肝靶向型虾青素复合物应用到缓解由酒精诱导的肝脏损伤。
23.有益效果：
24.本发明采用靶向分子乳糖酸、环糊精衍生物作为虾青素的复合载体原料。相较于现有技术，本发明中设计的载体兼具多种优点，能进一步减少环境因素，如ph造成的虾青素分子结构的破坏，本方法制备的虾青素功能食品相对于其他方法制备的载体而言，本方法提高了虾青素在酸性条件下稳定性。本方法还具有靶向递送的特性，能做到精准控制虾青素肝靶向释放。
25.本发明对于过氧化氢诱导的heparg细胞损伤具有更好地缓解作用，并且本发明的虾青素功能食品可以靶向递送至c57bl/6小鼠肝脏部位，能够进一步缓解由酒精诱导的肝脏损伤，调节小鼠的肠道菌。
附图说明
26.图1是实施例1中制备的虾青素功能食品的扫描电镜(sem)的照片。
27.图2是实施例2中制备的虾青素功能食品的扫描电镜(sem)的照片。
28.图3是实施例2中制备的乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的红外光谱。
29.图4是实施例2中制备的虾青素功能食品的ph稳定性图谱。
30.图5是实施例4中过氧化氢诱导heparg细胞损伤的荧光成像图。
31.图6是对比例1中虾青素功能食品对实施例4中过氧化氢诱导heparg细胞损伤的保护作用的荧光成像图。
32.图7是实施例1中虾青素功能食品对实施例4中过氧化氢诱导heparg细胞损伤的保护作用的荧光成像图。
33.图8是对比例2中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入4小时后在肝脏的荧光分布图。
34.图9是对比例3中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入4小时后在肝脏的荧光分布图。
35.图10是对比例2中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入12小时后在肝脏的荧光分布图。
36.图11是对比例3中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入12小时后在肝脏的荧光分布图。
37.图12是实例6中酒精处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图。
38.图13是实例6中未封装的虾青素处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图。
39.图14是实例6中虾青素功能食品处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图。
40.图15是实例6中空白组、酒精处理组、载体处理组、虾青素处理组、商品化虾青素处理组、虾青素功能食品处理组小鼠肝脏内丙二醛含量图。
41.图16是实例6中小鼠肠道毛螺菌科水平的变化。
具体实施方式
42.为了使本技术领域的人员更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
43.实施例1:一种具有肝靶向型虾青素功能食品的制备方法，包括步骤；
44.s1:乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将209mg乳糖酸添加到10ml dmso中。添加1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(edc)(336mg)和202mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)作为偶联剂，活化时间为2小时。将混合物溶于含有300mg羟丙基-β-环糊精的5ml dmso溶液中并搅拌22小时。然后，将产品用去离子水透析并冷冻干燥5天。
45.s2:虾青素功能食品的制备：将冻干的40mg乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物复溶至20ml去离子水，缓慢加入虾青素乙醇溶液，虾青素乙醇溶液是将500mg粗虾青素溶解于200ml的乙醇溶液，10000rpm离心15分钟所得上清液，添加量为15ml。进一步搅拌反应4小时，所得样品进行冻干。
46.对比例1:非靶向型虾青素功能食品的制备方法，包括步骤；
47.将40mg羟丙基-β-环糊精溶解于至20ml去离子水，缓慢加入虾青素乙醇溶液。虾青素乙醇溶液是将500mg粗虾青素溶解于200ml的乙醇溶液，10000rpm离心15分钟所得上清液，添加量为15ml。进一步搅拌反应4小时，所得样品进行冻干。
48.实施例2：一种具有ph响应型肝靶向虾青素功能食品的制备方法，包括步骤；
49.s1、乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将150mg海藻酸钠溶解在10ml去离子水中搅拌过夜后，加入10ml dmso，添加216mg 1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(edc)和129mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，添加85mg羟丙基-β-环糊精，室温下均匀搅拌8小时后，加入59.2mg乳糖酸继续反应18小时。所得到的产物利用去离子水透析并冷冻干燥，得到乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物。
50.s2、虾青素功能食品的制备：取冻干的乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物80mg复溶至20ml去离子水，加入1ml的1mg/ml虾青素乙醇溶液，进一步搅拌反应5小时，所得样品进行冻干。
51.对比例2：一种负载尼罗红具有ph响应型载运体系的制备方法，包括步骤；
52.s1、海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将150mg海藻酸钠溶解在10ml去离子水中搅拌过夜后，加入10ml dmso，添加216mg 1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(edc)和129mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，添加85mg羟丙基-β-环糊精，室温下均匀搅拌26小时。所得到的产物利用去离子水透析并冷冻干燥，得到复合物。
53.s2、尼罗红载运体系的制备：取冻干的复合物41.1mg复溶至12ml去离子水，加入1mg/ml尼罗红乙醇溶液，进一步搅拌反应5小时，所得样品进行冷冻干燥处理。
54.对比例3：一种负载尼罗红具有ph响应型肝靶向载运体系的制备方法，包括步骤；
55.s1、乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将150mg海藻酸钠溶解在10ml去离子水中搅拌过夜后，加入10ml dmso，添加216mg 1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(edc)和129mg n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，添加85mg羟丙基-β-环糊精，室温下均匀搅拌8小时后，加入59.2mg乳糖酸继续反应18小时。所得到的产物利用去离子水透析并冷冻干燥，得到乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物。
56.s2、尼罗红载运体系的制备：取冻干的乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物41.1mg复溶至12ml去离子水，加入1mg/ml尼罗红乙醇溶液，进一步搅拌反应5小时，所得样品进行冷冻干燥处理。
57.实施例3：虾青素功能食品的表征
58.s1、实施例1中制备的虾青素功能食品的形貌
59.图1是实施例1中制备的虾青素功能食品的扫描电镜(sem)的照片，结果显示，制备的功能食品以球形呈现。
60.s2、实施例2中制备的虾青素功能食品的形貌
61.图2是实施例2中制备的虾青素功能食品的扫描电镜(sem)的照片，结果显示，制备的功能食品形态似椭球形。
62.s3、实施例2中制备的乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的傅立叶变换红外光谱表征
63.图3是乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物的红外光谱图，757、818、883、947、1614和1736cm-1
的峰表明壁材的成功合成。
64.s4、实施例2中制备的虾青素功能食品的ph稳定性实验
65.图4是实施例2中制备的虾青素功能食品ph稳定性图谱。将未封装虾青素与虾青素功能食品分别放在ph 2，37度条件下，结果显示，与未封装的虾青素相比，虾青素功能食品
显著提高了虾青素的保留率。
66.实施例4:虾青素功能食品对过氧化氢诱导的heparg细胞损伤的保护作用
67.将heparg细胞以1.5
×
104个细胞/孔接种在96孔板中。15小时后，加入100μl培养基，其中含有对比例1中虾青素功能食品(27.7μg/ml，相当于含有147μg/l虾青素)或实施例1中虾青素功能食品(50μg/ml，相当于147μg/l ast)。12小时后，弃去培养基，用含有h2o2(50μm)的培养基培养heparg细胞10小时。之后，弃去培养基，将heparg细胞与100μl含有10μm dcfh-da的dmem培养基一起培养。孵育30分钟后，用pbs清洗细胞。然后，使用ti-s荧光倒置显微镜观察细胞。
68.图5是实施例4过氧化氢诱导heparg细胞损伤的荧光成像图。
69.图6是对比例1中虾青素功能食品对实施例4中过氧化氢诱导heparg细胞损伤的保护作用的荧光成像图，可以观察到对比例1中虾青素功能食品显著缓解了由h2o2诱导的氧化损伤。
70.图7是实施例1中虾青素功能食品对实施例4中过氧化氢诱导heparg细胞损伤的保护作用的荧光成像图，可以观察到实施例1中虾青素功能食品显著缓解了由h2o2诱导的氧化损伤，并且效果好于对比例1中虾青素功能食品，推测是由于乳糖酸的靶向功效，使得heparg(肝细胞株)摄取了更多的虾青素功能食品，更好地发挥了抗氧化功效。
71.实施例5：尼罗红载运体系在肝脏荧光成像
72.选用c57bl/6小鼠，体重20-30g。将所有成年雄性小鼠喂食一周以适应环境，并将它们随机分为两组。一组小鼠灌胃对比例2负载尼罗红具有ph响应型载运体系溶液。另一组小鼠灌胃100μl对比例3负载尼罗红具有ph响应型肝靶向载运体系溶液。4h和12h后对小鼠实施安乐死，采集肝脏并进行荧光成像。
73.图8是对比例2中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入4小时后在肝脏的荧光分布图。
74.图9是对比例3中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入4小时后在肝脏的荧光分布图，可以观察到图5的荧光强度大于图4，说明所设计的载运体系在4小时内的肝靶向效果较好。
75.图10是对比例2中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入12小时后在肝脏的荧光分布图。
76.图11是对比例3中负载尼罗红的载运体系在小鼠摄入12小时后在肝脏的荧光分布图，可以观察到图7的荧光强度大于图6，说明所设计的载运体系在12小时内的肝靶向效果较好。
77.实施例6：虾青素功能食品在小鼠体内缓解由酒精诱导肝脏损伤与调节肠道菌的作用
78.酒精性肝损伤小鼠模型的构建：小鼠随机分为6组，正常对照组、酒精损伤处理组、未封装的虾青素处理组、载体处理组，商品化虾青素处理组，虾青素功能食品组。
79.将c57bl/6小鼠(spf,20
±
0.75g)随机分为六组，每笼10只小鼠，并适应环境7天。小鼠采用niaaa模型。简而言之，对照组的小鼠喂食lieber-decarli对照饮食(tp4030c，南通特洛菲饲料科技有限公司)16天。其他五组在第1天和第2天喂食混合饮食(5％乙醇(v/v)lieber-decarli饮食：对照饮食＝1:2(v/v))，然后在第3天和第4天是1:1混合饮食，然后在
第5天和第6天进行2:1混合饲料，然后是在第7-16天采用5％乙醇(v/v)lieber-decarli饲料。5％乙醇(v/v)lieber-decarli饲料由tp4030d(南通特洛菲饲料科技有限公司)配制而成。未封装的虾青素处理组在第1、3、5、7-16天给小鼠喂食3％粗虾青素(1.67mg粗饲料＝50μg虾青素/20g/d)。载体组在第1、3、5、7-16天给小鼠喂食实施例2中乳糖酸-海藻酸-羟丙基-β-环糊精复合物(4.12mg/20g/d)。在商品化虾青素处理组中，在第1、3、5、7-16天给小鼠喂食商品化虾青素处理组的稀释样品(相当于50μg虾青素/20g/d)。在虾青素功能食品组中，小鼠在第1、3、5、7-16天喂食实施例2中虾青素功能食品(4.12mg虾青素功能食品＝50μg虾青素/20g/d)。此外，收集小鼠粪便用于后续肠道菌分析。第17天清晨，对照组小鼠灌胃45％(w/v)糊精溶液(400μl/20g)，其他五组小鼠灌胃31.5％(v/v)乙醇灌胃(400μl/20g)。然后，六组小鼠在灌胃9小时后实施安乐死。在每组的实验方案结束时从收集小鼠肝脏组织。并将部分肝脏样本固定在4％多聚甲醛溶液中，用于苏木精和伊红(h&e)组织学分析。
80.图12是实例6中酒精处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图；
81.图13是实例6中未封装的虾青素处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图；
82.图14是实例6中虾青素功能食品处理组的小鼠肝脏组织切片h&e染图，可以观察到乙醇处理显着增加了肝脂肪变性的数量和坏死细胞的数量。未封装的虾青素处理组稍微缓解了这种情况，但是虾青素功能食品组效果最好。
83.图15是实例6中正常对照组、酒精损伤处理组、未封装的虾青素处理组、载体处理组，商品化虾青素处理组，虾青素功能食品组小鼠肝脏内丙二醛含量图，可以观察到乙醇处理增加了肝脏中丙二醛的水平，而虾青素功能食品显着降低了肝脏中的丙二醛水平，并且优于未封装的虾青素和商品化虾青素。
84.图16是实例6中小鼠肠道毛螺菌科水平的变化，可以观察到虾青素功能食品在很大程度上提高了毛螺菌科的丰度，并且虾青素功能食品组中毛螺菌科的相对丰度显着高于商品化虾青素组，表明虾青素功能食品有助于增加有益细菌的丰度。
85.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种肝靶向型虾青素复合物的制备方法，包括以下步骤：s1:乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物的制备：将乳糖酸添加到dmso中，然后添加1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺作为偶联剂，进行活化；活化完成后将混合物溶于含有羟丙基-β-环糊精的dmso溶液中并搅拌反应；反应结束将产品透析并冷冻干燥，即得乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物；s2:虾青素功能复合物的制备：将乳糖酸-羟丙基-β-环糊精复合物复溶至水中，然后缓慢加入虾青素乙醇溶液，搅拌反应，反应完成将反应物干燥，即得虾青素功能复合物。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乳糖酸和dmso的质量体积比为1～3:100(w/v，g/ml)。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和dmso的质量体积比为1～3:100(w/v，g/ml)。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:10～10:1。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述s1活化的时间为0～10h。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述虾青素乙醇溶液是将粗虾青素溶解于的乙醇溶液，然后离心取上清液，即得虾青素乙醇溶液。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将虾青素功能复合物复溶至去离子水，加入尼罗红乙醇溶液，搅拌反应，所得样品进行冷冻干燥处理。8.根据权利要求1～7任一项所述本发明利用上述方法制得的一种肝靶向型虾青素复合物。9.权利要求8所述肝靶向型虾青素复合物在到保健食品领域的应用。10.权利要求8所述肝靶向型虾青素复合物在缓解由酒精诱导的肝脏损伤中的应用。

技术总结

本发明公开了一种肝靶向型虾青素复合物及其制备方法和应用，具体涉及功能食品制备及动物模型技术领域。本方法以羟丙基-β-环糊精为载体担载虾青素，以提高虾青素的稳定性，修饰乳糖酸对于肝脏组织进行靶向递送，形成虾青素功能性食品。所述的肝靶向型虾青素功能性食品预处理对过氧化氢介导的HepaRG细胞具有良好的抗氧化性。虾青素功能性食品可靶向递送至小鼠肝脏部位，缓解酒精诱导的酒精性肝损伤，调节肠道菌。调节肠道菌。调节肠道菌。