(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011014184.9
(22)申请日 2020.09.24
(71)申请人 奥锐特药业股份有限公司
地址 317200 浙江省台州市天台县八都工
业园区
申请人 浙江工业大学
(72)发明人 陈小龙 熊志刚 朱林江 褚定军
陆跃乐 冯佳程 马爽
(74)专利代理机构 浙江千克知识产权代理有限
公司 33246
代理人 冷红梅
(51)Int.Cl.
C12P 17/10(2006.01)
C12P 41/00(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 9/02(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种生物酶催化制备布瓦西坦
物结构如式(I)所示，所述方法以化合物(II)为
底物，以N ‑乙基马来酰亚胺还原酶为催化剂，经
马来酰亚胺还原酶的氨基酸序列如S E Q I D
NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。本发明
的有益效果主要体现在：(1)本发明选择化合物
(II)作为布瓦西塔合成的手性中间体，其易于制
备，且酶催化的加氢反应速率快，转化率高，易于
进行下一步反应；(2)本发明使用采用N ‑乙基马
来酰亚胺还原酶shiNEMR、camNEMR、cfrNEMR，可
实现一步法的高效率和高对映体选择性生产化
合物I，底物转化率>99％，
对映体选择>98％。权利要求书2页 说明书13页序列表8页 附图7页CN 112143764 A 2020.12.29
C N 112143764
A
1.一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法，所述布瓦西坦中间体化合物结构如式(I)所示，其特征在于，所述方法以化合物(II)为底物，以N-乙基马来酰亚胺还原酶为催化剂，经不对称加氢反应制得到化合物(I)；所述N-乙基马来酰亚胺还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示；
式(I)、(II)中，所述R为C1～C8烷基，C2～C8烯基，C2～C8炔基，C3～C8环烷基，芳香基或芳杂基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述不对称加氢反应以NAD+或NADP+为辅酶底物，以NAD(P)依赖的脱氢酶及其底物为辅酶循环系统，在25～45℃、pH 7.0～9.0的条件下进行。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述NAD(P)依赖的脱氢酶为醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶，对应的底物分别为异丙醇、葡萄糖或甲酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：构建表达所述N-乙基马来酰亚胺还原酶的重组大肠杆菌，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液或粗酶液为催化剂，以化合物(II)为底物，在25～40℃、pH7.0～9.0条件下反应10～24h，反应液经分离纯化获得所述化合物
(I)。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：构建分别表达所述N-乙基马来酰亚胺还原酶和所述NAD(P)依赖的脱氢酶的重组大肠杆菌，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的含有N-乙基马来酰亚胺还原酶的发酵液或粗酶液为催化剂，以NAD+或NADP+为辅酶底物，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的含有NAD(P)依赖的脱氢酶的发酵液或菌悬液及NAD(P)依赖的脱氢酶底物为辅酶循环系统，在25～45℃、pH 7.0～9.0的条件下反应10～24h，反应液经分离纯化获得所述化合物(I)。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：构建同时表达所述N-乙基马来酰亚胺还原酶和所述NAD(P)依赖的脱氢酶的重组大肠杆菌，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液或粗酶液为催化剂，以NAD+或NADP+为辅酶底物，并添加NAD(P)依赖的脱氢酶底物组成辅酶循环系统，在25～45℃、pH
7.0～9.0的条件下反应10～24h，反应液经分离纯化获得所述化合物(I)。
7.如权利要求1～6之一所述的方法，其特征在于所述布瓦西坦中间体化合物结构如式(I-1)所示：
8.如权利要求4～6之一所述的方法，其特征在于所述发酵培养方法如下：
(1)种子培养：将重组大肠杆菌接种在含50mg/L卡那霉素的种子培养基中，30～37℃、180～250rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉3～6g/L、蛋白胨5～10g/L、NaHPO4·12H2O 6～10g/L、KH2PO4 2～5g/L、NH4Cl 2～4g/L、Na2SO40.5～1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.3～1.0g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0；
(2)发酵培养：将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的发酵培养基中，在30～37℃培养4～6h后，加入终浓度为18～22g/L的α-乳糖，在22～25℃继续发酵12～18h，得到发酵液，或者取发酵液离心，收集湿菌体细胞用pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液；所述发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉10～15g/L、蛋白胨10～20g/L、甘油8
～12g/L、Na2HPO4·12H2O 6～10g/L、KH2PO4 2～5g/L、NH4Cl 1～4g/L、Na2SO4 0.2～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述种子培养基终浓度组成如下：酵母粉5g/ L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0；所述发酵培养基质量终浓度组成如下：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0。
一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法
(一)技术领域
[0001]本发明涉及一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法，具体是采用N- 乙基马来酰亚胺还原酶对布瓦西坦中间体进行不对称加氢的。
(二)背景技术
[0002]布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(2S)-2-[(4R)-2-氧代-4-丙基-1-吡咯烷基]丁酰胺，化学结构式如下所示)是左乙拉西坦的结构衍生物，为比利时优时比 (UCB)最新开发的第三代抗癫痫药物(商品名为)。
能与突触囊泡糖蛋白 2a结合，亲和力较左乙拉西坦强15～30倍，更有效地降低部分性癫痫发作的频率。分别于2016年1月和2月被欧洲EMEA和美国FDA批准上市，用于成人和16岁以上青少年癫痫患者的部分发作、伴有或不伴有继发全身发作的辅助。据统计， 2011-2015年间左乙拉西坦的平均年销售额超过10亿美元，预计布瓦西坦产品的应用前景较好。
[0003]
[0004]对布瓦西坦的合成方法已有较多研究，涉及化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法不对称合成和酶法手性拆分。原研药公司UCB的专利CN 1882535 B和发表的论文(Org.Process Res.Dev.2016,20,1566-1575)分别报道了化学合成法和酶法不对拆分的应用。国内也有多种新的合成方法被陆续公开，如专利CN 106279074 B、CN105646319 B、CN 106588741 B、CN 108503573 B、C
N 108101824 A等的化学合成方法和CN 109266630 A、CN 109852644 A、CN 110358752 A等的酶法手性拆分。由于布瓦西坦存在两个手性中心，化学合成法往往涉及复杂的对映体分离与纯化，成本较高；酶法手性拆分具备温和条件，降低手性化合物纯化成本，但其理论转化率只有 50％。
[0005]近几年，生物酶法的不对称合成技术不断地被开发应用，其中碳碳双键(C＝C) 不对称加氢已被应用于一些工业产品的合成(Curr Opin Chem Biol 2018,43:97–105)，具有反应条件温和，立体选择性好，催化活性高等特点。目前通过C＝C酶法不对称加氢合成的布瓦西坦中间体也已有报道，例如(R)-4-正丙基二氢呋喃-2(5H)-酮(化合物III)，其相关专利申请包括CN107604018A、CN109852644A、CN111154735A等。其中CN107604018A虽然公开了烯酮还原酶对底物4-正丙基呋喃-2(3H)-酮(化合物IV)的C＝C不对称加氢而制备化合物III的应用，但是缺乏关键酶信息，实际应用效果未知；CN109852644A公开通过醇脱氢酶不对称还原5-羟基-4-丙基二氢呋喃-2 (3H)-酮从而制备中间体化合物III；CN111154735A公开应用烯酮还原酶制备化合物III的方法，虽然公开了酶的相关信息和产物的对映体选择性，但是底物转化率未知。
(三)发明内容
[0006]本发明目的是提供一种生物酶催化高效制备布瓦西坦中间体化合物的方法。[0007]本发明采用的技术方案是：
[0008]一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法，所述布瓦西坦中间体化合物结构如式(I)所示，其特征在于，所述方法以化合物(II)为底物，以N-乙基马来酰亚胺还原酶为催化剂，经不对称加氢反应制得到化合物(I)；所述N-乙基马来酰亚胺还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示；
[0009]
[0010]上述N-乙基马来酰亚胺还原酶为源于宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的 N-乙基马来酰亚胺还原酶shiNEMR(NCBI登录号为Q3Z206)、camNEMR(NCBI 登录号为QMD62121)、cfrNEMR(NCBI登录号为
AHY13194)，将其克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)，可构建相应的重组大肠杆菌工程菌，用于后续生物酶催化反应。
[0011]所述的N-乙基马来酰亚胺还原酶shiNEMR、camNEMR、cfrNEMR基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示，编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。
[0012]与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6中所示氨基酸序列≥90％同源性(优选地，≥95％的同源性；更优选地≥97％的同源性；最优选地，≥98％的同源性，如≥99％的同源性)、且具有N-乙基马来酰亚胺还原酶催化活性的多肽；以及将SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6中所示氨基酸序列经过1～5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽，均属于本发明保护的范围。
[0013]式(I)、(II)中，所述R为C1～C8烷基，C2～C8烯基，C2～C8炔基，C3～C8环烷基，芳香基或芳杂基。
[0014]优选的，所述不对称加氢反应以NAD+或NADP+为辅酶底物，以NAD(P)依赖的脱氢酶及其底物为辅酶循环系统，在25～45℃、pH 7.0～9.0的条件下进行。
[0015]
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