(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210039938.9
(22)申请日 2022.01.13
(83)生物保藏信息
CCTCC NO. M20211517 2021.11.30
(71)申请人 中国科学院武汉病毒研究所
地址 430071 湖北省武汉市武昌区水果湖
街小洪山中区44号
(72)发明人 胡杨波 何丽娜 陈士云 唐薇
(74)专利代理机构 武汉世跃专利代理事务所
(普通合伙) 42273
专利代理师 倪娅
(51)Int.Cl.
C12N 15/62(2006.01)
C12N 9/06(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61K 38/44(2006.01)A61P 19/06(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
组菌株及应用
(57)摘要
本发明公开了一种降低血液尿酸水平的功
能基因片段、重组菌株及应用，该基因片段是由
基因组成。它能有效增强尿酸氧化酶活性，使其
显示出高效降解功能。以上述功能基因为基础，
将其引入大肠杆菌EcN基因组表达，构建并获得
稳定表达尿酸氧化酶的工程菌株EcN C6，在体内
和体外模型中均验证了其具备高效降尿酸的能
思路，拓宽了益生性大肠杆菌EcN在代谢疾病中
的应用价值。
权利要求书1页 说明书7页序列表5页 附图5页CN 114480455 A 2022.05.13
C N 114480455
A
1.一种降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述基因片段是由FtsP信号肽序列及位于其后的尿酸氧化酶编码基因组成。
2.根据权利要求1所述的降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述信号肽FtsP的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:001所示。
3.根据权利要求1所述的降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述尿酸氧化酶选自假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA，黑曲霉来源的尿酸氧化酶UaZ，球形节杆菌来源的尿酸氧化酶Uox。
4.根据权利要求1所述的降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:002所示。
5.一种整合有权利要求1所述功能基因片段的重组菌株。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株选自大肠杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热链球菌。
7.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌EcN，且是通过将权利要求1所述功能基因片段整合至大肠杆菌EcN基因组HIS ‑1位点获得。
8.一种降低血液尿酸水平的重组大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC NO.M 20211517。
9.权利要求8所述重组大肠杆菌在降低血液尿酸水平药物制备中的应用，其制剂的有效剂量为3×1010CFU菌数/天，或1×1010CFU菌数/3天。
权 利 要 求 书1/1页CN 114480455 A
一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物合成生物学领域，具体地指一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用。
背景技术
[0002]尿酸是嘌呤代谢途径中的关键产物，嘌呤降解到尿酸生成的途径在生物界中高度保守。大多数哺乳动物在肝脏表达尿酸氧化酶，可将尿酸进一步水解为可溶性较高，更易排泄的尿囊素。而高等灵长类动物体内编码尿酸氧化酶的基因则在长期进化过程中失活，因此高等灵长类动物体内尿酸浓度远高于其他哺乳动物水平。
[0003]高尿酸血症是机体嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或肾脏排泄功能障碍，导致尿酸在血液中积累的代谢性疾病，当血尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度，则诱发尿酸盐晶体沉积在局部关节处引起风湿性关节炎，即痛风。根据2021年中国高尿酸及痛风趋势白皮书统计，中国高尿酸血症整体发病率达到13.3％，约1.77亿人，痛风患者约1.1％，类似的，痛风病比例在美国达到3.9％，在欧洲达到4.75％，澳大利亚达部分地区达到3.8％，且痛风病的流行率和发生率在世界范围内正在升高，发达国家高于发展
中国家，已成为继高血糖、高血压、高血脂之后的“第四高”代谢性疾病，且诸多证据表明高尿酸血症与高血压，糖尿病，代谢综合症密切相关，甚至会加速肾脏疾病及心血管疾病的发生。
[0004]肾脏和肠道主要负责尿酸的排泄，尿酸排泄的减少是造成高尿酸血症发展成痛风病的主要原因。人体内大约2/3的尿酸由肾脏负责代谢，其余1/3由肠道微生物清除，又称作尿酸降解过程。一些肠道有机体可将嘌呤作为氮源使用，如酵母，枯草芽孢杆菌，肺炎克雷伯等菌，都有依赖氧的尿酸分解代谢途径，可以将尿酸降解为氨。近年来随着高尿酸血症致病机理的深入研究，揭示了肠道微生物在高尿酸高血症发生发展中起到关键作用，肠道不仅是尿酸的重要合成池，更尿酸的降解池。研究表明，血清中尿酸水平与肠道中尿酸水平呈现明显正相关，降低肠道中尿酸水平可有效缓解高尿酸血症。
[0005]目前针对痛风的药物主要还是靶向肾脏和肝脏，通过抑制黄嘌呤氧化酶减少体内尿酸的生成，例如别嘌呤醇和非布索坦；或促进尿酸随尿液排泄，减少肾小管重吸收，例如丙磺舒等；但这些药物还存在较大的副作用，且仅限于少部分痛风患者使用，对于占据大比例的无症状高尿酸血症人依然无法周顾，因此目前依旧缺乏一套安全的另辟蹊径的降尿酸方式。在此背景下，针对高尿酸血症的生物疗法应运而生，外源引入有活性的尿酸氧化酶，成为了高尿酸血症的新思路。临床数据表明，培戈洛酶，拉布立酶，普瑞凯希等改造后的尿酸氧化酶，以注射的方式在顽固性痛风疾病方面表现卓越，但是蛋白所造成的严重过敏反应和注射反应是限制其使用的根本因素，被FDA给与黑框警告，因此，针对尿酸氧化酶生物疗法的递送方式还存在较大的挑战。近年来，随着肠道微生物在尿酸降解过程
中发挥作用的深入研究，有研究发现通过口服尿酸氧化酶的方式就可降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸值(SUA)，且此类递送方式较注射更为安全，但如此方式需要大量的尿酸氧化酶蛋白，成本较高，且尿酸氧化酶在肠道复杂微生态中发挥功能并未达到最大化，因此
如何在肠道环境递送尿酸氧化酶依旧有待解决。
[0006]肠道益生菌，以大肠杆菌Nissle 1917(EcN)为代表，可作为生物大分子的“活工厂”，作为药用菌株已具备上百年应用历史，安全性较高且在肠道中具备良好定殖特性，使用益生菌递呈尿酸氧化酶可达利用活体达到更好效果并降低成本。前期有专利指出EcN本身存在尿酸氧化酶同源基因ygfT和aegA，具备尿酸降解活性，动物实验表明口服野生型EcN可轻微缓解高尿酸血症(中国专利CN 111778224)，其自身来源的同源酶降解尿酸效果甚微。目前，还未见关于改造肠道益生菌应用于降低尿酸水平的报道，已有专利(CN 108103080)构建了一种重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列和表达载体，主要实现了大肠杆菌中高水平表达纯化尿酸氧化酶，而不能实现重组菌直接应用于降低血液尿酸水平。因此关于有效表达尿酸氧化酶实现降低血液尿酸水平的重组肠道益生菌还有待进一步研发。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提高尿酸氧化酶在细菌中的表达效率，提供一种降低血液尿酸水平的功能基因片段、重组菌株及应用，实现重组菌株体外和体内降解尿酸的能力，开发高尿酸血症新型方法。
[0008]为实现上述目的，本发明提供了一种降低血液尿酸水平的功能基因片段，其特征在于，所述基因片段是由FtsP信号肽序列及位于其后的尿酸氧化酶编码基因组成。[0009]上述方案中，所述FtsP信号肽的氨基酸序列优选如SEQ.ID.NO:001所示。[0010]上述方案中的酶为尿酸氧化酶(又名尿酸盐羟化酶、尿酸盐‑NADH氧化酶)或其同源酶，且这些酶可以来源于不同物种，主要具有将尿酸代谢为更容易排泄的其他代谢产物的功能。本发明提供了三种不同来源的尿酸氧化酶：UA(SEQ.ID.NO:002)、UaZ(SEQ.ID.NO: 003)、Uox(SEQ.ID.NO:004)，并提供其氨基酸序列。优选为假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA。[0011]本发明还提供了一种整合有上述功能基因片段的重组菌株。
[0012]重组菌株在本发明中是肠道益生菌的改造，肠道益生菌的选择依据受试者种中肠道益生菌定殖情况而定。常用的肠道益生菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等。本发明中，优选肠道益生性大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)。
[0013]优选地，重组大肠杆菌是通过将上述功能基因片段整合至大肠杆菌EcN基因组HIS‑1位点(SEQ.ID.NO:005)获得。
[0014]具体地，本发明提供了一种降低血液尿酸水平的重组大肠杆菌，命名为肠道益生菌EcN C6，于2021年11月30日在中国典型培养物保藏中心(中国、武汉)保藏，其保藏编号为CCTCC NO.M 20211517。该重组大肠杆菌是在EcN基因组上绝缘位点HIS‑1(SEQ.ID.NO:005)处整合了分泌信号肽FtsP融合的假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA，并使用人工优化启动子P6 (SEQ.ID.NO:006)及强终止子rrnBT(SEQ.ID.NO:007)分别起始和终止转录。
[0015]上述重组大肠杆菌EcN C6在降低血液尿酸水平药物制备中的应用，其制剂的有效
剂量为3×1010CFU菌数/天，或1×1010CFU菌数/3天。
[0016]制剂的剂型为口服或口部施与剂。
[0017]本发明的有益效果：
[0018]本发明通过分子生物学技术改造技术，提供了一种新的功能基因，能有效增强尿酸氧化酶活性，使其显示出高效降解功能。以上述功能基因为基础，将其引入大肠杆菌EcN 基因组表达，构建并获得稳定表达尿酸氧化酶的工程菌株EcN C6，在体内和体外模型中均验证了其具备高效降尿酸的能力，从肠道微生态角度为高尿酸血症提供新思路，拓宽了益生性大肠杆菌EcN在代谢疾病中的应用价值。
附图说明
[0019]图1为不同定位下质粒表达尿酸氧化酶的活性测试结果。
[0020]图2为FtsP信号肽定位下质粒表达不同尿酸氧化酶结果。
[0021]图3为EcN C6体外降解尿酸的酶活性测试结果。
[0022]图4为EcN C6在高尿酸血症大鼠体内降尿酸结果。
[0023]图5为EcN C6高尿酸血症最小剂量测试结果。
[0024]图6为EcN C6在高尿酸大鼠体内定殖能力测试结果。
具体实施方式
[0025]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0026]本发明实施例中所列尿酸代谢酶可以是尿酸氧化酶(又名尿酸盐羟化酶、尿酸盐‑NADH氧化酶)。所述尿酸代谢酶可以来自动物、植物、微生物等不同来源，如：食蟹猴(Macacafascicularis)、小鼠(Mus
musculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、非洲爪蟾(X e n o p u s t r o p i c a l i s)、果蝇(D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r)、绿藻(Chlamydomonasreinhardtii)、酵母菌(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、黏菌(Cavenderiafasciculata)、根瘤菌属(Neorhizobium)、游动放线菌(Actinoplanes)、芽孢杆菌(Bacillus beveridgei)、肺炎克雷伯(Klebsiellapneumoniae)、嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus)、链霉菌(Streptomyces davaonensis)等。在一些实施例中，优选假丝酵母来源的尿酸氧化酶UA(SEQ.ID.NO:002)，黑曲霉来源的尿酸氧化酶UaZ (SEQ.ID.NO:003)，球形节杆菌来源的Uox(SEQ.ID.NO:004)。
[0027]本发明在肠道益生菌中表达尿酸代谢酶。在一些实施方式中，可以通过质粒将尿酸代谢酶编码基因导入到肠道益生菌，也可以通过基因工程技术(包括同源重组、基因编辑等)将尿酸代谢酶编码基因整合到肠道益生菌基因组中，为了实现外源基因在基因组上稳定表达，本发明优选在EcN基因组HIS‑1位点(SEQ.ID.NO:005)插入外源基因元件。[0028]本发明采用不同定位信号肽带动尿酸氧化酶分泌表达，在一些实施例中，包括大肠杆菌Sec系统识别信号肽，TAT系统识别信号肽以及表面展示信号肽等，优选TAT分泌系统识别的FtsP信号肽(SEQ.ID.NO:001)。
[0029]本发明在肠道益生菌中表达尿酸代谢酶。在一些实施方式中，尿酸代谢酶基因前
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