(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 101093225 A (43)申请公布日 2007.12.26 |
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(21)申请号 CN200710119213.6
(22)申请日 2007.07.18
(71)申请人 清华大学
地址 100084 北京市海淀区清华园
(72)发明人 何苗 盛建武 施汉昌
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人 关畅
(51)Int.CI
G01N33/577
G01N33/531
G01N33/53
C12N5/12
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒。该微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒，包括包被抗原、微囊藻毒素－LR多克隆抗体或单克隆抗体以及酶标二抗；所述包被抗原为完全抗原A；所述完全抗原A按照如下方法制备：在微囊藻毒素－LR的第七位氨基酸残基N－甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基，得到经氨基修饰的微囊藻毒素－LR；再将该经氨基修饰的微囊藻毒素－LR与载体蛋白偶联得到所述微囊藻毒素－LR与载体蛋白的偶联物，即完全抗原A。本发明的微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒检测范围在0.10μg/L－30.00μg/L之间，定量检测区间在0.30μg/L－10.00μg/L之间，平均回收率(100.3±5.9)％，批内误差小于15％，准确度和精密度符合要求，能进行环境样品中微囊藻毒素－LR的大规模快速筛查和预警监测。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1、微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒，包括包被抗原、微囊藻毒素-LR多克隆抗体或单克隆抗体以及酶标二抗；
所述包被抗原为完全抗原A；所述完全抗原A按照如下方法制备：在微囊藻毒素-LR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基，得到经氨基修饰的微囊藻毒素-LR；再将该经氨基修饰的微囊藻毒素-LR与载体蛋白偶联得到所述微囊藻毒素-LR与载体蛋白的偶联物，即完全抗原A。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微囊藻毒素-LR多克隆抗体或单克隆抗体是以所述完全抗原A为免疫原得到的抗体；
所述微囊藻毒素-LR单克隆抗体按照下述方法制备：用所述完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；培养所述阳性杂交瘤细胞株或将所述阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水，得到微囊藻毒素-LR的单克隆抗体。 3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白；所述偶联方法为戊二醛法。
4、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于免疫的小鼠为Balb/c小鼠；免疫方法为：每只小鼠每次免疫所用的所述完全抗原剂A量为15-40μg，两次免疫的间隔时间为20-40天；免疫方式为皮下多点注射；
所述步骤2)中的小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
5、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述筛选阳性杂交瘤细胞株的方法为：先用包被抗原筛选，再用微囊藻毒素-LR单体筛选至少1次；所述包被抗原为将所述步骤1)中的经氨基修饰的微囊藻毒素-LR多肽与载体蛋白偶联得到的完全抗原B；所述完全抗原B与所述完全抗原A中的载体蛋白不相同。
6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述完全抗原B中的载体蛋白为卵清白蛋白。
7、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性杂交瘤细胞株为能分泌抗Microcystin-LR单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC8C10，其保藏号为CGMCCNo.2101。
8、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微囊藻毒素-LR单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2101的能分泌抗Microcystin-LR单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC8C10产生的抗体。
9、根据权利要求1至8中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述还包括微囊藻毒素-LR标准品溶液、显剂、终止液、洗涤液和底物溶液。
10、权利要求1至9中任一所述的试剂盒在微囊藻毒素-LR检测中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及一种微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒，特别涉及一种微囊藻毒素-LR酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
水体富营养化致使藻类异常增殖并释放微囊藻毒素(Microcystins，MCs)，其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，MC-LR)是目前已知急性毒性最强、危害最大的一种淡水蓝藻毒素。微囊藻毒素-LR是一组环状七肽，其化学结构式如式I所示：
(式I)
微囊藻毒素水华的频繁暴发严重威胁着生态安全和人类的饮水安全，对水中微囊藻毒素及时准确的监测非常重要。目前对水体中藻毒素检测技术的研究开发非常活跃，主要有高效液相谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)以及蛋白磷酸酶抑制试验(Protein Phosphatase Inhibition Assay，PPIA)等。
常规的理化检测方法，特别是液相谱和质谱分析仪器体积庞大、价格昂贵、需要环境条件
较高的室内环境、而且还需要专门的技术人员操作、前处理复杂、检测费用昂贵；并且由于微囊藻毒素异构体众多，且性质近似，缺少相应标准品，成为微囊藻毒素大规模筛查的限制条件。而磷酸酶抑制试验和细胞试验虽然都能很好地检测出毒素，但是存在灵敏度不高或检测过程繁琐，样品通量小等不足。免疫检测是基于抗原-抗体特异性反应的分析方法，具有检测特异性强、灵敏度高、分析通量大、检测速度快、费用低廉等优点，能适应大规模样品的快速筛查和预警监测。研制微囊藻毒素的ELISA试剂盒，对于微囊藻毒素的大规模样品的快速筛查和预警监测具有非常重要的经济和社会意义。
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